专利名称：Clk－肽和slk－肽的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及医学领域，更具体地涉及使用包含变性胶原IV型的选择性拮抗物的活性剂，来抑制或检测血管发生、肿瘤生长和转移的方法和组合物。
背景技术：
肿瘤生长和转移每年影响许多人。据估计美国每年确诊超过600,000例癌症的新病例(Varner，J.，等人，Cell Adh.Commun.1995；3367-374)。
转移，即恶性肿瘤细胞从原发肿瘤群向远距离部位的扩散，涉及一系列复杂的互相联系的事件。(Liotta，等人，Cell 1991；64327-336；Wyckoff，等人，.Cancer Res.2000；602504-2511；Kurschat，等人，Clinc.Exp.Dermatol.2000；25482-489.)转移的级联始于导致细胞间相互作用变化的一系列遗传改变，其允许肿瘤细胞从原发肿瘤群分离开来。分离的细胞局部地侵袭并迁移通过蛋白水解修饰的胞外基质(ECM)。该分离的细胞进入循环系统。为了形成转移沉积，循环的肿瘤细胞必须逃避宿主的免疫防御、微脉管系统的捕获，并避免从循环中溢出。肿瘤细胞然后在新的部位侵袭ECM，增殖，诱导血管发生，并继续生长。
设计用于阻断血管发生的治疗可以显著地影响实体瘤的生长和转移。在不同的动物模型中阻断肿瘤新血管形成能显著地抑制肿瘤生长，而且人类临床数据也开始支持这一论点(Varner，J.，等人，Cell Adh.Commun.1995；3367-374)。这些以及其它的研究表明，实体瘤的生长需要新血管生长用于肿瘤的继续扩展以超过最小大小(Varner等人，1995；Blood，C.H.，等人，Biochim.Biophys.Acta.1990；103289-118；Weidner，N.等人J Natl.Cancer Inst.1992；841875-1887；Weidner，N.等人，N.Engl.J Med.1991；3241-7；Brooks，P.C.等人J Clin.Invest.1995；961815-1822；Brooks，P.C.等人，Cell 1994；791157-1164；Brooks，P.C.等人Cell1996；85683-693；Brooks，P.C.等人，Cell 1998；92391-400).血管发生的抑制因此是癌症和转移性疾病的一种有希望的疗法。
血管发生是通过该生理过程从已存在的血管产生新血管的生理过程(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992)。这种复杂过程需要包括生长因子、细胞粘附受体、基质降解酶和胞外基质成分在内的多种分子的协作(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992)。
血管发生的抑制还可用于治疗其特征在于无限制的血管发生的其他疾病，包括，例如，眼睛疾病(例如，黄斑变性和糖尿病性视网膜病)和炎性疾病(例如，关节炎和牛皮癣)(Varner等人，1995)。
许多研究者已经把他们的抗血管生成方法集中在能启动血管发生的生长因子和细胞因子上(Varner等人，1995；Blood等人，1990；Weidner等人，1992；Weidner等人，1991；Brooks等人，1995；Brooks等人，1994；Brooks等人，1997)。然而，有许多生长因子和细胞因子具有刺激血管发生的能力。因此，由于这种丰余性，阻断单个细胞因子的治疗可能只有有限的好处。很少关注其他的抗血管生成靶。
最近的研究表明，血管发生需要血管周围胞外基质(ECM)的蛋白水解重建，以提供有助于新血管发生的微环境(Varner等人(1995)；Blood等人(1990)；Weidner等人(1992)；Weidner等人(1991)；Brooks等人(1995)；Brooks等人(1994)；Brooks等人(1997))。胞外基质蛋白质胶原占动物中总蛋白质量的25％以上，并且是ECM内的占多数的蛋白质。
抑制血管发生是一种限制肿瘤生长和转移的有用疗法。血管发生的抑制将受到下述因素的影响(1)“生血管分子”例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)释放的抑制，(2)生血管分子的中和，(例如，抗-bFGF抗体)，和(3)内皮细胞对生血管刺激应答的抑制。(Folkman等人，Cancer Biology，389-96(1992))。已经描述了几种可能的内皮细胞应答抑制剂可用于抑制血管发生，例如，胶原酶抑制剂、基底膜更新抑制剂、血管抑制类固醇(angiostatic steroids)、真菌来源的血管发生抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物例如D-青霉胺和硫代苹果酸金、维生素D3类似物、α-干扰素。文献中还描述了另外的建议的血管发生抑制剂。(Blood，等人(1990)；Moses等人(1990)Science2481408-1410；Ingber，等人(1988)Lab.Invest.，5944-51；和美国专利Nos.5,092,885；5,112,946；5,192,744；和5,202,352.)胶原是包含[Gly-Xaa-Xaal]n基序的胞外基质蛋白质。胶原的类型是本领域熟知的(参见，例如，Olsen，B.R.(1995)Curr.Op.Cell.Biol.5720-727；Kucharz，E.J.The CollagensBiochemistry and Pathophysiology.Springer-Verlag，Berlin，1992；Kunn，K.in Structure and Function ofCollagen Types，eds.R.Mayne and R.E.Burgeson，Academic Press，Orlando).胶原是以多种形式存在的纤维性多链三股螺旋蛋白质(Olsen，B.R.(1995)Curr.Opin.Cell Biol 7，720-727；Van der Rest，M.，等人(1991)FASEB 5，2814-2823).已经鉴定了至少18种在遗传学上不同的胶原类型，其中很多具有不同的组织分布与功能(Olsen(1995)；Van der Rest，等人(1991))。胶原I型是胞外基质中最丰富的胶原。胶原I型胶原III型、胶原IV型和胶原V型已经显示与体内所有预先存在的血管相关。
成熟的胶原分子由扭转成三股螺旋的2个α1和1个α2链组成。胶原I型和IV型，例如，分别由命名为α1(I)和α2(I)与α1(IV)和α2(IV)的主链组成。在体内，发现胶原通常以成熟的三股螺旋形式存在。
成熟三股螺旋胶原的天然三维结构的变性可暴露隐蔽的控制血管发生的调节区。用抗体破坏细胞与变性胶原IV型的相互作用可阻断肿瘤生长和血管发生(Xu，J.，等人(2001)J.Cell Biol.Vol.1541069-1079；Hangia，等人(2002)Am.J.Pathol.Vol.1611429-1437)。Brooks等人(PCT WO 00/40597)公开了能与不同的变性胶原类型内的隐蔽区域结合的抗体。
目前意外地发现，选择用于变性胶原IV型的肽拮抗物能抑制血管发生和肿瘤生长。可特异性结合变性胶原IV型的肽拮抗物为治疗癌症、炎性疾病及其他血管发生相关疾病的有效的新化合物提供了基础。
发明概述本发明提供了一种通过对哺乳动物施用包含血管发生抑制量的变性胶原IV型选择性拮抗物的活性剂，来抑制哺乳动物组织中的血管发生、肿瘤生长和转移的方法。
本发明还提供了一种通过对哺乳动物施用包含肿瘤细胞粘着抑制量的变性胶原IV型选择性拮抗物的活性剂，来抑制哺乳动物组织中的肿瘤生长和转移的方法。
本发明还提供了可特异性结合变性胶原IV型，并可用于抑制哺乳动物中血管发生、肿瘤生长和转移的肽拮抗物。更具体地，本发明提供了包含能抑制血管发生、肿瘤生长和转移的变性胶原IV型选择性拮抗物的生物活性剂。本发明肽拮抗物与变性胶原IV型的结合亲和力大大高于该拮抗物与天然形式的胶原IV型的结合亲和力。
用于本发明的变性胶原IV型选择性拮抗物具有核心氨基酸序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
用于本发明的一种优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH的肽(CLK-肽)。
用于本发明的另一种优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH的肽(SLK肽)。
用于本发明的另一种优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是具有氨基酸序列NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-A-COOH的肽(KGGCLK肽)。
在本发明的另一个实施方案中，变性胶原IV选择性拮抗物与细胞毒剂或细胞生长抑制剂偶联。
另一个方面，本发明提供了通过把组织暴露给可检测标记的变性胶原IV型选择性拮抗物，来检测哺乳动物组织中血管发生的方法。
在更进一步的实施方案中，本发明包括一种方法，该方法通过把待测组织暴露给可检测标记的变性胶原IV型选择性拮抗物，来检测哺乳动物组织中的肿瘤组织、转移、肿瘤侵入、细菌侵入、关节炎、炎症或特征在于胶原IV型变性或与胶原IV型变性相关的其他任何疾病或状态(condition)。
附图简述
图1显示了M21人类黑素瘤细胞向未经处理的变性IV型胶原(NT)、CLK-肽处理的变性胶原IV型、SLK-肽处理的变性胶原IV型和SDR-肽处理的变性胶原IV型上的粘附。
图2显示了B16鼠黑素瘤细胞向未经处理的变性胶原IV型(NT)、CLK-肽处理的变性胶原IV型和SHR-肽处理的变性胶原IV型上的粘附。
图3(a)，(b)和(c)分别显示了没有bFGF诱导的血管发生的鸡尿囊绒膜(CAM)，bFGF-诱导的血管发生之后的CAM，以及bFGF-诱导血管发生之后用CLK-肽处理的CAM。
图4显示了两组CAM生血管的血管的定量，其中一组经bFGF诱导血管发生，但随后未进行CLK-肽处理，，另一组经bFGF诱导血管发生，并随后进行CLK-肽处理。
图5显示了未用CLK-肽处理的鸡胚肺(NT)与用CLK-肽处理的鸡胚肺上的B16黑素瘤转移的定量。
发明详述本发明提供了用于抑制哺乳动物中的血管发生、肿瘤生长、转移、细菌侵入、关节炎、炎症或特征在于胶原IV型变性或与胶原IV型变性相关的其他任何疾病或状态的组合物和方法，以及用于通过使用变性胶原IV型选择性拮抗物检测哺乳动物组织中的血管发生、肿瘤生长、转移、细菌侵入、关节炎、炎症或特征在于胶原IV型变性或与胶原IV型变性相关的其他任何疾病或状态的组合物和方法。具有氨基酸核心L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L的肽选择性结合变性的胶原IV型。
本发明的方法提供了抑制形成与维持癌细胞所需的新血管形成的生物活性剂。另外，本发明还提供了直接抑制肿瘤生长、转移、炎症及其他与细胞与变性胶原IV型间相互作用相关的疾病或状态的方法和组合物。本发明的活性剂选择性结合变性的胶原IV型，从而防止血管发生、肿瘤生长、转移、关节炎、炎性疾病及其他与细胞与这种胶原的相互作用相关的疾病或状态。
定义如这里使用的，术语“血管发生”包括涉及组织的新血管形成的多个过程，包括“萌发”、血管发生或血管增大。所有的血管发生过程都涉及血管中胞外基质胶原的破坏。在创伤的伤口愈合、黄体形成和胚胎发生期间发生的血管发生是正常生理学的一部分。然而大多数血管发生情况与疾病过程相关。
如这里使用的，“拮抗物”指抑制天然存在的生物活性的化合物。
如这里使用的，胶原内的“隐蔽表位”是在天然胶原内不被暴露识别，但是能够被变性胶原的拮抗物识别的序列。在天然结构中不暴露于溶剂或仅仅部分暴露于溶剂的肽序列是可能的隐蔽表位。隐蔽表位的序列可以通过测定拮抗物的特异性来鉴定。还可以例如通过检验天然的三股螺旋胶原的三维结构来鉴定候选的隐蔽表位。
如这里使用的，“天然胶原”指主要以三股螺旋形式存在的胶原。
如这里使用的，“变性胶原”指不再主要以天然的三股螺旋形式存在的胶原。变性胶原可以是变性的全长胶原或胶原的片段。胶原的片段可以是短于全长胶原序列的任何胶原序列。对于具有基本天然结构的胶原的片段，可以象天然的全长胶原一样实现变性。片段还可以具有一定的大小，从而使其不具有显著的天然结构或具有没有显著的天然三股螺旋形式的区域。术语“变性胶原”包括“蛋白水解的胶原”。“蛋白水解的胶原”指通过蛋白水解酶的作用而结构上改变的胶原。
如这里使用的，“变性胶原IV型选择性拮抗物”是与变性胶原IV型的结合亲和力大大高于与天然胶原IV型的结合亲和力的物质。
如这里使用的，“表位”是能被本发明的拮抗物识别的氨基酸序列。表位可以是线性的肽序列或可以由不连续的氨基酸序列组成。一种拮抗物可以识别一个或多个序列，因此一个表位可以限定一个以上的不同氨基酸序列靶标。拮抗物识别的表位可以通过本领域技术人员熟知的肽作图和序列分析技术来确定。
这里使用的术语“肽”指一系列两个或更多共价连接的氨基酸。线性的、环状的或分枝的肽都可用于实施本发明。
这里使用的术语“核心氨基酸序列”指可始于肽的N-末端，可以是肽的内部序列，或者可止于肽的C-末端的氨基酸序列。
如这里使用的，术语“拟肽”用于指模拟肽的活性的化合物。拟肽不是肽，但是可包含通过非肽键连接的氨基酸。在一种拟肽中，与隐蔽的三维结构特异性相互作用的肽的三维结构被一种非肽分子复制。
如这里使用的“新血管形成”指新血管的发生。新血管形成可指血管发生的过程和/或血管发生的结果，其为新血管形成。
如这里定义的，“患者”是需要治疗生血管疾病、肿瘤生长或转移的任何哺乳动物。优选的患者包括农业上的或驯养的哺乳动物；例如猪、母牛、马、山羊、绵羊、骡、驴、狗、猫、兔、小鼠和大鼠。尤其优选的患者是人类。
短语“药学上可接受的”指“通常被认为是安全的”分子实体和组合物，例如，当施用给人类时，在生理学上可耐受，并且一般不产生变应性反应或类似的不良反应，例如胃不适、头晕等等。优选地，如这里使用的，术语“药学上可接受的”指联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典或其他公认的药典中列出的，用于动物，更特别地用于人类。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这些药用载体可以是无菌的液体，例如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油类，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等等。水或水溶液、盐溶液和含水右旋糖以及甘油溶液优选用作载体，特别地用于可注射的溶液。E.W.Martin在《Remington药物科学)》中描述了合适的药用载体。
“大大提高的亲和力”指靶化合物的结合亲和力比标准化合物高至少1.5倍，更优选至少高10倍，最优选至少高100倍。选择性拮抗物对于变性胶原IV型(靶化合物)是特异的，而且比较了该选择性拮抗物与天然胶原(标准化合物)的结合亲和力。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟知的其他技术，例如，表面等离振子共振技术(在BIOCORE 2000系统上进行分析)(Liljeblad，等人(2000)Glyco.J.，Vol.17323-329)，和标准测量以及传统的结合分析(Heeley，R.P.(2002)Endocr.Res.，Vol.28217-229)，可进行表观结合亲和力测量。
“治疗有效量”指足以在被处理的组织中产生可测量的血管发生减少的选择性变性胶原拮抗物的量，也即，抑制血管发生的量；或足以产生可测量的肿瘤生长、转移、关节炎、炎性疾病或与变性胶原IV型有关的疾病减少的选择性变性胶原拮抗物的量。
这里使用的术语“治疗”指，施用变性胶原IV型的选择性拮抗物来预防血管发生、肿瘤生长、转移、细菌侵入、关节炎、炎症或特征在于胶原IV型变性或与胶原IV型变性相关的其它任何疾病或状态，或者抑制患有这种疾病或状态的患者中已存在的血管发生、肿瘤生长、转移、细菌侵入、关节炎、炎症或特征在于胶原IV型变性或与胶原IV型变性相关的其它任何疾病或状态的进展，和/或改善与这种疾病或状态相关的症状。
术语“单位剂量”当用于本发明的治疗组合物时，指适合作为用于个体的单次剂量的物理学上离散的单元，每个单位包含预先确定的量的活性物质，经计算其单独或在含有适当稀释剂、载体(carrier)、载体(vehicle)或其他赋形剂的组合物中产生所需的治疗效果。
变性胶原IV型拮抗物本发明的生物活性剂包含对变性胶原IV型具有强结合亲和力的化合物。本发明的变性胶原IV型选择性拮抗物具有氨基酸核心序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
一种优选用于本发明的变性胶原IV型选择性拮抗物为CLK-肽。CLK-肽高特异性地结合变性的胶原IV型。CLK肽的氨基酸序列为NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH。CLK-肽与变性胶原IV型内的区域结合，并抑制细胞与变性胶原IV型间的相互作用。粘着细胞与胞外基质内功能性表位的相互作用具有调节体内血管发生、肿瘤生长和转移的作用。(Xu，J.，等人(2001)J.Cell Biol.Vol.1541069-1079；Hangia，等人(2002)Am.J.Pathol.Vol.1611429-1437)。CLK-肽显示有效地阻断体内的血管发生(下面的实施例4)和肿瘤生长以及转移(下面的另一种优选用于本发明的选择性变性胶原IV型拮抗物为SLK-肽。SLK-肽高特异性地结合变性的胶原IV型，并抑制细胞与变性胶原IV型间的相互作用。SLK-肽的氨基酸序列为NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH。
另一种优选用于本发明的选择性变性胶原IV型拮抗物为KGGCLK肽。KGGCLK肽高特异性地结合变性的胶原IV型，并抑制细胞与变性的胶原IV型间的相互作用。KGGCLK肽的氨基酸序列为NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-COOH。
例如，连续固相结合测定可用于鉴定变性胶原IV型选择性拮抗物。鉴定变性胶原IV型拮抗物的优选方法为扣除免疫(Xu，J.等人(2000)Hybridoma，Vol.19375-385)和扣除噬菌体展示(实施例1)(Amstutz P.，等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.，vol.12400-405)。
一种优选的变性方法为热变性，因为热变性产生较少在体内具有极低免疫原性的小片段。胶原IV型可以通过例如加热胶原IV型到100℃保持15分钟来进行热变性。变性还可以通过用离液剂处理胶原来完成。合适的离液剂包括，例如，胍盐。胶原还可以通过电离辐射、非电离辐射(紫外线)、热损伤和机械应力或机械力来进行变性。胶原可以通过蛋白水解作用进行变性。特别地，可以通过用金属蛋白酶例如MMP-1、MMP-2或MMP-9处理胶原，或通过用包含胶原降解活性的细胞提取物处理胶原，来制备蛋白水解的胶原。蛋白水解的胶原还可能天然存在于组织中的新血管形成、肿瘤生长、转移、细菌侵入、关节炎和炎症部位。
例如，可以根据蛋白质的光学性质例如吸光度、圆二色性或荧光的光谱改变，通过核磁共振，通过拉曼光谱测定法，或通过任何其他的适用技术，来监测胶原的变性。
得到的变性胶原IV型片段然后可固定到固体基质上。已知结合胶原的肽可以获自肽文库。(Amstutz P.，等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.，vol.12400-405)。胶原-结合肽可以通过该固体基质。结合变性胶原IV型的肽粘附于该固体基质上。粘附的肽然后从该固体基质上洗下，并通过固定有天然胶原IV型的第二个固体基质。不与第二个固体基质结合的肽为变性胶原IV型选择性拮抗物。
用于本发明的选择性肽与多肽拮抗物可以使用本领域技术人员熟知的几种不同的技术来制备。例如，双杂交系统(例如，Fields，S.(1989)Nature 340245-6)使用胶原片段作为“饵”用于从与胶原肽结合的文库中筛选蛋白质拮抗物。该系统及其操作描述于Green，D.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1001010-1015(2003)与Gyuris，J.等人(1993)Cell，Vol.75791-803中。可能的拮抗物的文库可以源自于例如cDNA文库。在另一个实施方案中，可能的拮抗物可以是已知胶原结合蛋白质例如整联蛋白与纤连蛋白的变体。(Hynes，R.O.(1992)Cell，Vol.6911-25；Steffensen，B.，等人(2002)Matrix Biol.，Vol.21399-414；Ingham，K.C.，等人(2002)Arch.Biochem.Biophys.，Vol.407217-223)。这些蛋白质可以进行随机诱变处理或经受基因改组，或其它用于产生序列多样性的熟知技术(Tani，P.H.，等人(2002)Biochm.J.，Vol.365287-294；Stephanopoulos，G.(2002)Nat.Biotechnol.，Vol.20666-668)。
本发明的肽拮抗物还可以使用Zhao，H.等人(2002)Cur.Opin.Biotechnol.，Vol.13104-110与Guo，Z.，等人(2002)Biochemistry，Vol.4110603-10607中所述的分子进化技术产生。蛋白质文库可以通过诱变、基因改组或其他用于产生分子多样性的熟知技术来产生。例如，可以通过使代表许多变体的蛋白质库(pool)通过附着有变性胶原质的固体基质，来根据其结合变性胶原的能力筛选这种蛋白质库。用盐梯度进行洗脱，例如，可以提供与变性胶原具有亲和力的变体的纯化。还可以包括使该库通过附着有天然胶原的固体基质的负选择步骤。滤液包含该库中与天然形式的胶原的亲和力降低的那些变体。
本发明的肽与多肽拮抗物还可以通过噬菌体展示产生。噬菌体展示是一种其中肽表达为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白的筛选技术。结果是融合蛋白展示在病毒体表面，编码融合蛋白的DNA位于病毒体内。(Smith G.P.(1985)Filamentous fusion phageNovel expressionvectors that display cloned antigens on the viron surface.Science.2281315-1317；Smith G.P.，等人(1993)Libraries of peptides and proteins displayedon filamentous phage.Methods Enzymol.217228-257)。噬菌体展示可以使用称为淘选的体外方法迅速鉴定多种靶分子的肽配体。例如，如下进行淘选将噬菌体展示的肽文库与用靶包被的微量滴定板一起孵育，洗掉未结合的噬菌体，并洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体然后扩增，并通过另外的结合/扩增循环以富集有利于结合序列的库。3-4轮淘选之后，通过DNA测序鉴定单个克隆。
随机化的肽或蛋白质可以作为与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白表达于噬菌粒(该术语表示噬菌体和质粒的组合)颗粒表面。单价噬菌体展示技术是广泛可用的(参加，例如，Lowman H.B.等人(1991)Biochemistry 3010832-8.)。表达随机化肽或蛋白质文库的噬菌体可以用附着有天然胶原分子的固体基质进行淘选。剩余的噬菌体不与天然胶原结合，或者以大大降低的亲和力与天然胶原结合。然后用附着有变性胶原的固体基质淘选噬菌体。通过溶液条件的改变，或者对于适当设计的构建体，通过蛋白水解裂解连接噬菌体外壳蛋白与随机化肽或蛋白质文库的接头区，来从固体基质上分离结合的噬菌体。可以对分离的噬菌体进行测序以确定选择的拮抗物的身份。
熟知的ELISA检测可用于鉴定用于实施本发明的胶原IV型的选择性拮抗物。
使用固相ELISA来测定肽或多肽是否能结合变性的或天然的胶原，可以鉴定作为拮抗物的肽或多肽。ELISA测定可与多种胶原类型一起使用；例如，ELISA测定可与胶原I、II、III、IV和V型一起使用，以及用于其他的胞外基质组分。结合亲和力的水平可以通过表面等离振子共振技术(在BIOCORE 2000系统上进行分析)(Liljeblad，等人(2000)Glyco.J.，vol.17323-329)和通过传统斯卡查德结合分析的标准测量(Heeley，R.P.(2002)Endocr.Res.，Vol.28217-229)来进行测定。
固相ELISA还可用于鉴定显示对变性形式的胶原的特异性，而对天然胶原无特异性的化合物。通过进行平行ELISA进行特异性测定，其中在分离的测定室中根据结合变性与天然胶原的能力同时筛选可能的拮抗物。
拮抗物还可以根据它们结合包含变性胶原的固体基质的能力来进行鉴定。在改变溶液条件如盐浓度、pH、温度等之后收集假定的拮抗物。该假定的拮抗物可根据它们在适当的溶液条件下通过附着有天然胶原的固体基质的能力来进一步鉴定。
本发明的拮抗物可与来自任何无脊椎动物或包括人类在内的任何脊椎动物的胶原IV型分子一起使用。在Engel，J.(1997)Science，Vol.2771785-1786和Gordon，M.K.，等人(1990)Curr.Opin.Cell Biol.，Vol.2833-838中可见胶原IV型分子的实例。优选地，所述胶原IV型是哺乳动物胶原IV型。更优选地，所述哺乳动物是猪、母牛、山羊、兔、小鼠、大鼠、狗、猫、绵羊、驴、马或骡。在一个特别优选的实施方案中，胶原是人胶原IV型。
本发明中使用的活性剂包含一种或多种变性胶原IV型拮抗物。变性胶原IV型的拮抗物可以是与变性胶原IV型的结合亲和力大大高于与天然形式的胶原IV型的结合亲和力的任何肽、多肽或拟肽。
本发明的肽拮抗物可以通过例如磷酸化作用、羟基化作用或甲基化作用进行修饰。可增强活性的另外的修饰包括肽环化和肽稳定化。
在另一个实施方案中，本发明包括这里显示了其氨基酸残基序列的多肽的类似物、片段或化学衍生物，只要该肽是变性胶原IV型的拮抗物而不是天然胶原的拮抗物。因此，肽可以进行多种变化、取代、插入和缺失，其中这些变化在使用中提供了某些优点。在这点上，本发明的变性胶原IV型拮抗物肽包括所述肽的序列，其中对该肽进行了一个或多个序列变化，而且在此处所述的一种或多种检测中，该肽保持用作变性胶原IV型选择性拮抗物的能力。
KGGCLK-肽是一种这样修饰的肽，KGGCLK-肽是具有添加到N-末端的序列KGG与添加到C-末端的GKA的CLK-肽。氨基酸的偶联可以通过本领域技术人员熟知的技术来完成，例如，提供于Stewart和Young，1984，固相合成，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL。
拮抗物可以与细胞毒素例如顺铂、长春花碱和吉西他滨偶联，用于输送到正经受血管发生、肿瘤生长、转移、关节炎或与细胞与变性胶原IV型间相互作用相关的其他疾病或状态的肿瘤或其他组织中。可以用溶细胞素或外毒素，例如蓖麻毒素A、白喉毒素A或假单胞菌外毒素及其片段制备这种偶联物。细胞毒剂还可以用同位素进行放射性标记，以便局部传递毒性剂量的放射性给生血管组织、肿瘤生长、转移或经受细胞与变性胶原IV型的相互作用的其它组织。
拮抗物可以与细胞生长抑制剂例如抗血管生成化合物偶联，以输送到正经受血管发生、肿瘤生长、转移、关节炎或与细胞与变性胶原IV型间相互作用相关的其他疾病或状态的肿瘤或其他组织中。一种优选的细胞生长抑制剂是基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。一种优选的MMP抑制剂是Marimistat(British Biotech，Oxford，United Kingdom)。
体内血管发生抑制测定可以分析本发明的选择性肽拮抗物调节组织中血管发生的能力。本领域技术人员熟知的任何合适的试验，例如鸡尿囊绒膜(CAM)测定，或兔眼测定，或嵌合小鼠测定，可用于监测这种作用。这里描述了几种非限制性技术。
一种血管发生试验检测鸡尿囊绒膜(CAM)中的血管发生，其被称为CAM测定。CAM测定是本领域普通技术人员所熟知的，用于检测肿瘤组织的血管发生和新血管形成(Ausprunk等人，Am.J.Pathol.，79597-618(1975)和Ossonski等人，Cancer Res.，402300-2309(1980))。
在CAM测定期间，整个组织出现血管发生。该试验检测鸡胚血管向CAM内或向生长于CAM上的组织内的生长。因此，CAM测定是一种用于体内血管发生的有效模型。
CAM测定根据新血管生长的量和程度检测血管发生的抑制。此外，监测移植到CAM上的任何组织例如肿瘤组织的生长也是可能的。
最后，CAM测定是特别有用的，因为在该测定系统中存在对毒性的内部控制。在该测定期间，把活的、发育的鸡胚暴露于测试试剂。胚胎的健康是毒性的指示。
在另一种测定中，用体内兔眼模型检测血管发生，其被称为“兔眼测定”。兔眼测定是本领域普通技术人员所熟知的，用于在存在生血管抑制剂例如沙利度胺时检测血管发生和新血管形成。(D′Amato等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.914082-4085).
兔眼测定是用于体内血管发生的非常公认的分析模型，因为以从角膜边缘向角膜内生长的兔血管为例说明的血管发生，很容易通过天然透明的眼角膜目测到。另外，血管发生的刺激或抑制程度和量，或血管发生的消退，都可以随时间很容易地监测。
兔暴露于使用的任何测试试剂，因此兔的健康是测试试剂毒性的指示。
另一种试验在嵌合小鼠人模型中检测血管发生，其被称为嵌合小鼠试验。(Yan，等人(1993)J Clin.Invest.91986-996)。嵌合小鼠试验是一种用于体内血管发生的有用的分析模型，因为移植的皮肤移植物在组织学上极其类似于正常人皮肤，而且整个组织发生新血管形成，其中实际的人血管从移植的人皮肤向移植的人皮肤表面上的人肿瘤组织内生长。人移植物的新血管形成的来源可以通过用人特异性的内皮细胞标记进行新血管系统的免疫组织化学染色来证明。
根据新血管生长消退的量和程度，嵌合小鼠试验证明了新血管形成的消退。此外，也可以监测对移植到移植皮肤上的任何组织例如肿瘤组织的生长的作用。最后，该试验是有用的，因为在该试验系统中存在对毒性的内部控制。嵌合小鼠暴露于使用的任何测试试剂，因此小鼠的健康是毒性的指示。
疾病治疗本发明通常涉及如下发现变性胶原IV型的某些表位与选择性拮抗物的结合能抑制包括人和其他动物在内的哺乳动物的组织中的血管发生、肿瘤生长、转移、关节炎及其他与细胞与变性胶原IV型间相互作用相关的状态或疾病，而天然胶原IV型则不能。多种疾病过程中都需要血管发生。通过抑制血管发生可以干预疾病，改善症状，有时候能治愈疾病。
在需要新血管生长来支持异常组织生长时，抑制血管发生将减少向组织的血液供给，从而有助于基于血液供给需要的组织块的缩小。实例包括肿瘤生长，其中新血管形成是肿瘤生长超过几毫米厚度并且形成实体瘤转移所持续需要的。在新血管生长是与疾病相关的病理学的原因或促进了与疾病相关的病理学时，抑制血管发生将降低疾病的有害作用。实例包括牛皮癣、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、炎性疾病、再狭窄、黄斑变性等等。
本发明的方法是有效的，部分因为该治疗对于血管发生及其他与细胞与变性IV型胶原间相互作用相关的过程，而不是其他生物学过程，有高度选择性。单独的变性胶原结合就可以有效地抑制血管发生及其他与细胞与变性IV型胶原间相互作用相关的过程，这一发现使得可以开发具有可能的高特异性，并因此具有相对低毒性的治疗组合物。
用于抑制组织中的血管发生，并因此用于实施治疗血管发生相关疾病的方法的本方法包括对需要生血管治疗的患者施用包含治疗有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物的组合物，与结合天然胶原IV型相比，该选择性拮抗物能选择性结合变性的或蛋白水解的胶原IV型。因此，该方法包括对患者施用治疗有效量的包含本发明的变性胶原IV型选择性拮抗物的药物组合物。
本发明提供了一种方法，用于抑制在需要这种治疗的动物(包括哺乳动物和人)的组织中的血管发生、肿瘤生长、转移、关节炎、炎性疾病及其他与细胞与变性胶原IV型间相互作用相关的疾病或状态，从而抑制组织中依赖于血管发生的事件。通常，该方法包括对动物施用包含有效血管发生抑制量的变性胶原IV型选择性拮抗物的组合物。
本发明还提供了一种通过抑制肿瘤血管发生来抑制肿瘤新血管形成的方法。在某些实施方案中，待处理的组织为患有实体(恶性)肿瘤、转移、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤等癌症的患者的肿瘤组织；将被抑制的血管发生是其中有肿瘤组织的新血管形成的肿瘤组织血管发生。通过本方法可以治疗的典型实体瘤组织包括肺、胰腺、乳房、结肠、喉、卵巢、卡波西肉瘤和类似的组织。
抑制肿瘤组织血管发生是一个显著的进展，因为新血管形成在肿瘤生长中起重要作用。在缺乏新血管形成时，肿瘤组织不能获得所需的养分，生长减慢，停止另外的生长，消退，并最终坏死，导致杀死或消除该肿瘤。另外一个显著的进展是通过阻断肿瘤细胞向变性胶原IV型上的附着，从而防止肿瘤细胞在该组织中建立，而直接抑制肿瘤生长和转移。
本发明还包括通过阻止肿瘤中的血管发生来抑制肿瘤生长的方法。
另一个方面，本发明提供了通过施用包含变性胶原IV型的拮抗物的生物学活性组合物，来抑制肿瘤生长和转移形成的方法。本方法是特别有效的，因为(1)转移的形成需要胶原变性和原发肿瘤的血管形成，以便转移性的癌细胞可以退出原发肿瘤，(2)肿瘤在继发部位的建立需要胶原变性和新血管形成来支持转移瘤的生长。
另外，本发明提供了通过直接抑制肿瘤细胞与变性胶原IV型的相互作用来抑制肿瘤生长和转移的方法。肿瘤细胞必须附着于组织上以在该组织中确立自己，并接着生长。本发明的方法和组合物可通过阻断肿瘤细胞与变性胶原IV型的相互作用而直接抑制肿瘤细胞向组织上的附着。
在更进一步的实施方案中，本发明使任何前述的方法可与其它的疗法如直接针对实体瘤的化学疗法组合进行。可以在化学治疗之前、期间或者之后把血管发生抑制剂施用给需要这种治疗的患者。优选在化学治疗方案之后对患者施用血管发生抑制剂。这时，肿瘤组织通过诱导血管发生来对毒性攻击产生应答，以通过向肿瘤组织供给血和养分来恢复。还优选在对患者进行外科手术以切除实体瘤之后，给患者施用血管发生抑制剂以预防转移。
因此，本申请中所述的抑制肿瘤生长、转移和新血管形成的方法可被用于抑制肿瘤组织生长、抑制肿瘤转移形成和促使形成的肿瘤消退。
除癌症之外还有多种疾病其中血管发生被认为是重要的。这些被称为生血管疾病，包括但不限于，炎性紊乱，例如免疫和非免疫性的炎症、慢性关节风湿病和牛皮癣；与血管的不适当的或不合时宜的侵入相关的紊乱，例如糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑块和骨质疏松症中的毛细血管增生；和与癌症相关的紊乱，例如实体瘤、实体瘤转移、血管纤维瘤、晶状体后纤维增生症、血管瘤、卡波西肉瘤等需要新血管形成以支持肿瘤生长的癌症。其他适合的肿瘤包括黑素瘤、癌、肉瘤、纤维肉瘤、神经胶质瘤和星形细胞瘤。
因此，抑制疾病组织中的血管发生的方法治疗并改善该疾病的症状，并取决于该疾病，有助于治愈。
在一个实施方案中，本发明涉及一种通过施用变性胶原IV型选择性拮抗物，来抑制哺乳动物例如人组织中的血管发生的方法。
如这里所述的，多种组织或由有组织的组织组成的器官中的任何一种，可支持疾病条件中的血管发生，其包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、关节、骨等组织，其中血管可在生血管刺激后侵入。如这里所用的组织包括所有体液、分泌物等，例如，血清、血液、脑脊液、血浆、尿、滑膜液、玻璃体液。
因此，在一个相关的实施方案中，待处理的组织是发炎的组织，将被抑制的血管发生是发炎组织的血管发生，其中存在发炎组织的新血管形成。在该类中，该方法企图抑制关节炎组织(例如，在患有慢性关节风湿病的患者中)、免疫或非免疫发炎组织(例如，牛皮癣组织)中的血管发生。
在另一个实施方案中，待处理的组织是患有糖尿病性视网膜病、黄斑变性或新生血管性青光眼的患者的视网膜组织，将被抑制的血管发生是其中视网膜组织存在新血管形成的视网膜组织的血管发生。
再狭窄是平滑肌细胞(SMC)迁移并在血管中以前狭窄的部位增殖的过程。再狭窄过程中与血管相关的SMC迁移与增殖与可被本方法和组合物抑制的血管发生过程有关。本发明还涉及按照矫正血管狭窄的程序，根据本方法和组合物在患者中通过抑制与生血管相关的过程来抑制再狭窄。因此，这里所述的方法和组合物可用于经皮经腔冠状动脉成形术、冠状动脉旁路术、外周动脉旁路术、肠系膜动脉旁路术和颈动脉内膜切除术或血管成形术的部位。
施用变性胶原IV型选择性拮抗物的剂量范围取决于拮抗物的形式和它的效力，而且是大得足以产生预期效果的量，其中血管发生和血管发生介导的疾病症状得到改善。该剂量不应大到引起不良副作用，例如高粘滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等等。通常，该剂量随患者的年龄、状况、性别和疾病的程度而变化，而且可由本领域的技术人员确定。如果发生并发症，该剂量还可由医生进行调整。
变性胶原IV型选择性拮抗物的效力可通过多种方法测定，包括例如，这里所述的CAM测定、体内兔眼测定、体内嵌合小鼠人试验中的血管发生抑制。
治疗有效量的本发明的变性胶原IV型拮抗物一般为如下肽量当在药学上可接受的组合物中施用时，足以达到大约每毫升(ml)0.1微克(μg)到大约200μg/ml，优选大约1μg/ml到大约150μg/ml的血浆浓度。以质量为大约每摩尔500克的多肽计，优选的血浆浓度其摩尔浓度为大约2微摩尔(μM)到大约5毫摩尔(mM)，优选大约100μM到1mM的多肽拮抗物。换句话说，每体重的剂量可以从大约0.1mg/kg到大约300mg/kg，优选从大约0.2mg/kg到大约200mg/kg，每天施用一次或多次，共施用一天或几天。
变性胶原IV型选择性拮抗物可以例如肠胃外、通过注射或通过随时间逐渐输注施用。预防血管发生的一种优选施用模式是通过静脉内施用包含本发明的一种或多种生物活性剂的治疗组合物。因此，拮抗物和其衍生物可静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、局部、眼内、口服、鼻内施用，并可通过蠕动方式输送。本发明的治疗组合物可以静脉内施用，例如通过单位剂量注射。
在一个优选的实施方案中，变性胶原IV型选择性拮抗物单次静脉内施用。
组合物以与剂量制剂相适应的方式，并以治疗有效量施用。施用的量和时间取决于将被治疗的患者、患者系统利用该活性成分的能力和所希望的治疗效果的程度。施用所需的活性成分的精确量取决于医生的判断并为每个个体所特有。不过，这里描述了系统应用的合适剂量范围，而且其取决于给药途径。合适的给药方案也是可变的，但是其代表为最初时施用，接着通过随后的注射或其他施用方式以一个或几个小时的间隔重复施用。可选地，足以将血液中的浓度保持在用于体内治疗的指定范围内的连续静脉内输注是期待的。
血管发生的抑制和肿瘤消退可以在早至最初施用拮抗物7天后发生。优选地，重复施用拮抗物，使组织暴露于拮抗物7天至6周，更优选大约14至28天。
为了抑制再狭窄，变性胶原IV型选择性拮抗物一般在狭窄缓解操作之后施用大约2天到大约28天，更通常地在该操作之后的大约前14天内施用。
治疗组合物本发明涉及可用于实施这里所述的治疗方法的治疗组合物。本发明的治疗组合物包含药学上可接受的载体以及这里所述的溶解或分散在其中作为活性成分的变性胶原IV型的选择性拮抗物。在一个优选的实施方案中，治疗性的变性胶原IV型选择性拮抗物组合物当施用给哺乳动物或人类患者用于治疗目的时，其不是免疫原性的。一种尤其优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是CLK肽。另一种优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是SLK肽。另一种优选的变性胶原IV型选择性拮抗物是KGGCLK肽。
包含溶解或分散在其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域所熟知的，而且不必根据制剂作出限制。这些组合物一般制备为可注射的，作为液体溶液或悬浮液，但是也可以制备使用之前适合在液体中形成溶液或者悬浮液的固体形式。制品还可以是乳化的。
活性成分可与药学上可接受的，并与活性成分相容的赋形剂混合，而且以适合用于这里所述的治疗方法的量使用。适合的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要，组合物可包含少量的辅助物质，例如能增强活性成分的有效性的润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等等。
本发明的治疗组合物可包含此处所述组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与诸如盐酸或磷酸的无机酸或与诸如乙酸、酒石酸、苦杏仁酸等的有机酸形成的酸加成盐(与多肽的自由氨基形成的)。与自由羧基形成的盐还可源自于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等。尤其优选的是TFA(三氟乙酸)和盐酸盐。
药学上可接受的载体是本领域所熟知的。液体载体的实例有如下的无菌水溶液其除了活性成分和水之外不包含其它物质，或包含缓冲液，如生理pH值的磷酸钠，生理盐水或二者，例如磷酸缓冲盐溶液。更进一步地，水性载体可包含一种以上的缓冲盐，以及例如氯化钠和氯化钾的盐、右旋糖、聚乙二醇及其他溶质。
液体组合物在含有水以及不含水的情况下还可包含液相。这种另外的液相的实例有甘油、植物油例如棉籽油以及水-油乳化液。
一种治疗组合物包含抑制血管发生、抑制肿瘤生长或抑制转移的量的本发明的变性胶原IV型选择性拮抗物，其配制成以总治疗组合物重量计包含0.01到90重量百分数的拮抗物。一种优选的治疗组合物制剂以总治疗组合物重量计包含0.05到50重量百分数的拮抗物。一种最优选的治疗组合物制剂以总治疗组合物重量计包含0.1到20重量百分数的拮抗物。重量百分数是抑制剂与总组合物的重量比。因此，例如，0.1重量百分数是每100克总组合物含0.1克抑制剂。
检测方法本发明的变性胶原IV型拮抗物还适于检测组织中的血管发生、肿瘤生长、关节炎或其他与细胞与变性胶原IV型的相互作用相关的疾病或状态。这些检测方法可以在体外和体内使用。例如，一种体外方法是检测活检标本中的血管发生、肿瘤生长或转移。
可直接或者间接检测可检测标记的变性胶原选择性拮抗物与靶组织的结合。直接检测可以在包含可检测标记例如荧光染料、放射性标志、顺磁性重金属或诊断染料的所述拮抗物上进行。
间接检测可使用能与变性胶原IV型选择性拮抗物相互作用的可检测的第二试剂进行。例如可使用能识别所述拮抗物的可检测标记的抗体来显示拮抗物的位置。其他的间接检测方法也是本领域普通技术人员已知的。
体内成像方法容许检测个体体内能特异性结合变性胶原IV型的标记拮抗物。把标记的拮抗物例如静脉内或肌内施用给患者。体内检测方法包括磁共振波谱技术、正电子发射断层扫描术(PET)和单光子发射断层扫描术(SPECT)。为了体内成像的目的，可用的探测仪类型是选择给定标记中的主要因素。例如，放射性同位素和顺磁性同位素特别适于体内成像。使用的仪器类型将指导放射性核素的选择。例如，选择的放射性核素必须具有一种给定类型的仪器可检测的衰变类型。然而，根据本发明可使用任何用于显示诊断成像的常规方法。在一个实施方案中，放射性核素可以利用中间官能团直接或者间接地与抗体结合。经常用于结合以金属离子形式存在的放射性同位素与抗体的中间官能团为二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。适于作为放射性同位素的金属离子的实例有99mTc、123I、131I、111In、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr和201Tl。特别可用于磁共振成像(“MRI”)的顺磁性同位素的实例包括157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
实施例下面的实施例说明本发明，但是不是限制性的。
实施例1-能特异性结合变性胶原IV型表位的肽的生产扣除噬菌体展示用于产生能特异性结合变性胶原IV型的肽。肽在病毒体表面上表达为与噬菌体的外壳蛋白的融合蛋白。如下进行淘选把噬菌体展示肽文库与靶标(1-4孔中为天然的胶原IV型，5孔为变性的胶原IV型)包被的微量滴定板一起孵育，洗掉未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合的噬菌体。使洗脱的噬菌体进行重复淘选来富集有利于结合序列的库。
第一天，胶原IV型以25μg/ml的浓度溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)中，然后把溶液煮沸15分钟，从而产生热变性的胶原。接着，使溶液冷却到室温。
添加100微升天然胶原IV型(未煮沸的)到4个孔中(Nunc-ImmunTMMaxisorpTM，获自Nalge Nunc International，Rochester，NewYork)，并添加100微升变性胶原IV型(煮沸的)到第5个孔中。反复旋动平板直到它的表面湿润。上面密封的平板在4℃温度下轻轻摇晃孵育过夜。
在第2天，向10ml的LB/tet培养基中接种ER2738大肠杆菌菌株单菌落。LB/tet培养基如下制备由10g/l细菌用胰蛋白胨和5g/l NaCl制备1升LB培养基。混合物于121℃高压灭菌15分钟，然后贮存于室温。使用20mg/ml四环素乙醇溶液制备四环素原液，该四环素乙醇溶液在黑暗中贮存于-20℃，然后在使用前涡旋。LB/tet平板如下制备用LB培养基和15g/l琼脂，于121℃高压灭菌15分钟，并冷却至低于70℃。然后添加1ml四环素原液，并把混合物倒在平板上。平板在黑暗中贮存于4℃。
倒出第一个孔的包被溶液，该孔用TBST(TBS+0.1％(v/v)Tween-20)洗涤两次。用50mM Tris-HCl(pH7.5)和150mM NaCl制备TBS，其于121℃高压灭菌15分钟并在室温下贮存。
接着，2×1011噬菌体(10微升原始文库，获自New England BioLabs，Inc)用100微升TBST进行稀释，并移液到第一个孔。第一个孔然后于4℃轻轻地摇晃60分钟。
倒出第二个孔的包被溶液，该孔用TBST洗涤两次。然后把第一个孔的上清液移液到第二个孔。第二孔于4℃轻轻摇晃60分钟。
倒出第三个孔的包被溶液，该孔用TBST洗涤两次。然后把第二个孔的上清液移液到第三个孔。第三个孔于4℃轻轻摇晃60分钟。
倒出第四个孔的包被溶液，该孔用TBST洗涤两次。然后把第三个孔的上清液移液到第四个孔。第四个孔于4℃轻轻摇晃60分钟。
倒出第五个孔的包被溶液，该孔用封闭缓冲液填充(0.1MNaHCO3(pH8.6)，5mg/ml BSA，0.02％NaN3，过滤除菌并贮存于4℃)。接着，第五个孔于4℃孵育60分钟。然后弃去封闭缓冲液溶液，第五个孔用TBST洗涤6次。然后把第四孔的上清液移液到第五个孔，第五个孔于室温孵育60分钟。接着，倒出第五个孔的溶液，第五个孔用TBST洗涤10次。
与第五个平板结合的噬菌体用0.2M盐酸甘氨酸(pH2.2)进行洗脱。
洗脱之后，对噬菌体进行扩增并滴定。噬菌体然后用于下一轮的淘选。重复第二天的过程3次，每次都使用前一轮结尾所产生的噬菌体。
最后一步是分离并通过序列来鉴定肽，其产生CLK与SLK肽。
实施例2-变性胶原IV型的肽拮抗物阻断肿瘤细胞向变性胶原IV型上的粘附。
进行体外细胞粘附试验以测定CLK与SLK肽是否与调节细胞粘附的变性胶原IV型内的功能性表位结合。未用组织培养物处理的48-孔平板用变性胶原IV型进行包被。在存在或缺乏合成肽CLK、SLK与SDR的情况下，使人黑素瘤细胞M21(Scripps Research Institute，LaJolla，CA)粘附于包被的孔中，每个肽的浓度为250μg/ml。SDR肽是可以购得的一种肽，其用作对照(QED Bioscience，Inc.，San Diego，California)。
把人变性胶原IV型(25μg/ml)固定在未用组织培养物处理的48孔平板上。对孔进行洗涤并用1％溶于PBS(磷酸缓冲盐溶液)的BSA(牛血清蛋白)一起于37℃孵育1小时。收获亚会合的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)，洗涤，并重悬于包含RPMI-1640培养基、1mM MgCl2、0.2mM MnCl2和0.5％BSA的粘附缓冲液中。在存在或缺乏上述每种合成肽的情况下，将HUVEC(105)重悬于200μl粘附缓冲液中，并添加到每个孔中，使之于37℃附着30分钟。除去未附着的细胞，附着细胞如Petitclerc等人(1999)Integrinαvβ3 promotes M21 melanoma growth inhuman skin by regulating tumor cell survival.Cancer Res.592724-2730所述的用结晶紫染色10分钟。孔用PBS洗涤3次，与细胞缔合的结晶紫通过添加100μl的10％乙酸进行洗脱。通过测量洗脱的结晶紫在600nm波长处的光密度来对细胞粘附进行定量。
CLK-肽对黑素瘤细胞粘附的阻断超过95％(图1)。SLK-肽阻断大约50％的黑素瘤细胞粘附。
实施例3-CLK-肽阻断B16黑素瘤细胞向变性胶原IV型上的粘附。
未用组织培养物处理的48-孔平板用天然的(三股螺旋)或变性的胶原IV型进行包被。在存在或缺乏CLK或者SHR(对照)肽的情况下，使转移性的B16鼠黑素瘤细胞附着于包被的孔上。CLK-肽对B16细胞向变性IV型胶原上粘附的阻断超过95％(图2)。CLK-肽对B16黑素瘤细胞向天然胶原IV型上的粘附只有很小的影响。
实施例4-在鸡CAM模型中CLK-肽阻断bFGF-诱导的血管发生。
用bFGF在10天大的鸡胚的尿囊绒膜(CAM)内诱导血管发生。24小时后，8-10个胚胎通过单次静脉内注射CLK-肽(100μg/胚)进行处理。在3天的孵育期结束时，移出CAM组织进行分析。注射CLK-肽导致滤盘(filter disc)的限制区(confined area)内分支血管数目显著减少。(图3(a)，(b)，(c))单次注射CLK-肽抑制bFGF超过95％。(图4)注射该肽之后没有注意到不良作用。两组中的每组都测试8到10个鸡胚，并重复该实验3次达到总共测试24-30个鸡胚。
实施例5-CLK-肽抑制B16黑素瘤的体内转移。
在存在或缺乏CLK-肽(100μg/胚)的情况下，对12天大的鸡胚(获自SPAFAS，North Franklin，CT)静脉内注射转移性的B16黑素瘤细胞(Chambers，等人(1992)J.Natl.Cancer Inst.，Vol.84797-803)。对于每个实验，在每组条件下，测试8到10只鸡胚，并重复该实验3次。鸡胚孵育7天然后处死。分析鸡肺的转移。B16黑素瘤转移以不连续的黑色病灶出现。通过计算有CLK组与无CLK组的鸡肺表面上的B16肿瘤病变来对转移进行定量。与无CLK组相比，在CLK组中B16黑素瘤转移被抑制大约70％。(图5)实施例6-转移性乳腺癌患者的治疗对60公斤的乳腺癌肝转移患者抽血进行肝功能试验。患者进行腹部CT扫描以记录肝转移的大小与数目。患者的总体医学状况由卫生专业人员使用体格检查、血液检验例如全血细胞计数、BUN、肌酸酐与EKG进行评定。
把患者的体重(60公斤)乘以每体重的剂量(每公斤150毫克)计算出9000毫克的CLK-肽剂量。该CLK-肽剂量混合于水溶液中，并通过外周静脉导管静脉内施用2小时。输注CLK-肽之后，卫生专业人员对患者监控2小时观察不良反应的出现。如果不出现这些反应，则让患者回家。
CLK-肽输注2周后，患者重新做肝功能试验与CT扫描。肝功能试验值的降低可能指示肿瘤转移消退。CT扫描显示转移瘤大小缩小和/或数量减少指示转移的成功治疗。
本说明书内引用的所有专利和出版物在此以其全部内容引入作为参考。
还应当理解，本发明的上述描述是为了例证与说明的目的，而不是试图限制本发明到这里的精确实施方式。因此应当理解，本领域的技术人员可以进行改变而不背离本发明的精神，而且本发明的范围应当根据以下的权利要求进行解释。
权利要求
1.一种变性胶原IV型的选择性肽拮抗物。
2.一种变性胶原IV型的选择性肽拮抗物，其包括核心氨基酸序列L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L。
3.权利要求2的拮抗物，其中该拮抗物是包含氨基酸序列NH2-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-COOH的肽。
4.权利要求2的拮抗物，其中该拮抗物是包含氨基酸序列NH2-S-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-C-COOH的肽。
5.权利要求2的拮抗物，其中该拮抗物是由氨基酸序列NH2-K-G-G-C-L-K-Q-N-G-G-N-F-S-L-G-G-K-A-COOH组成的肽。
6.权利要求2的拮抗物，其中变性胶原IV型选择性肽拮抗物与变性IV型胶原的结合亲和力大大高于所述拮抗物与天然胶原IV型的结合亲和力。
7.权利要求2的拮抗物，其中选择性变性胶原IV型拮抗物与变性IV型胶原的结合亲和力比所述拮抗物与天然胶原的结合亲和力高100倍。
8.权利要求2的拮抗物，其中选择性变性胶原IV型拮抗物抑制细胞与变性胶原IV型的相互作用。
9.一种药物组合物，其包含选择性变性胶原IV型拮抗物和药学上可接受的赋形剂。
10.权利要求9的药物组合物，其中该组合物包含细胞毒剂。
11.权利要求9的药物组合物，其中该组合物包含放射性物质。
12.权利要求9的药物组合物，其中该组合物包含细胞生长抑制剂。
13.一种抑制患者中血管发生的方法，其包括对患者施用血管发生抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
14.一种检测患者中血管发生的方法，其包括对患者施用变性胶原IV型选择性拮抗物，并检测患者中已经被结合的选择性变性胶原IV型拮抗物。
15.一种治疗患者的肿瘤的方法，其包括对患者施用血管发生抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
16.一种治疗患者的转移的方法，其包括对患者施用血管发生抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
17.一种治疗患者的生血管疾病的方法，其包括对患者施用血管发生抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
18.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物以下述方式施用静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、局部、眼内、口服、鼻内或通过蠕动方式。
19.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物的剂量范围为每天每公斤0.1毫克到每公斤300毫克。
20.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物的剂量范围为10毫克到3000毫克。
21.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与化疗剂组合施用。
22.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与放射性物质组合施用。
23.权利要求13的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与细胞生长抑制剂一起施用。
24.权利要求13的方法，其中所述患者是哺乳动物。
25.权利要求13的方法，其中所述患者是人类。
26.一种抑制患者中肿瘤细胞粘着的方法，其包括对患者施用肿瘤细胞粘着抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
27.一种检测患者中肿瘤细胞粘着的方法，其包括对患者施用变性胶原IV型选择性拮抗物，并检测患者中已经被结合的变性胶原IV型选择性拮抗物。
28.一种治疗患者的肿瘤的方法，其包括对患者施用肿瘤细胞粘着抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
29.一种治疗患者的转移的方法，其包括对患者施用肿瘤细胞粘着抑制有效量的变性胶原IV型选择性拮抗物。
30.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物以下述方式施用静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮、局部、眼内、口服、鼻内或通过蠕动方式。
31.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物的剂量范围为每天每公斤0.1毫克到每天每公斤300毫克。
32.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物的剂量范围为10毫克到3000毫克。
33.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与化疗剂组合施用。
34.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与放射性物质组合施用。
35.权利要求26的方法，其中变性胶原IV型选择性拮抗物与细胞生长抑制剂一起施用。
36.权利要求26的方法，其中所述患者是哺乳动物。
37.权利要求26的方法，其中所述患者是人类。
全文摘要
本发明描述了通过施用一种拮抗物来抑制组织中的血管发生的方法，该拮抗物特异性结合蛋白水解的或变性的胶原IV型，其结合亲和力大大高于与天然三股螺旋形式的胶原IV型的结合亲和力。还描述了利用这种拮抗物治疗肿瘤生长、肿瘤转移或再狭窄的方法，以及在体内和体外利用这种拮抗物作为正常或疾病组织中血管发生的诊断标记的方法。
文档编号C07K7/08GK1750841SQ200480004812
公开日2006年3月22日 申请日期2004年2月19日 优先权日2003年2月20日
发明者彼得·C·布鲁克斯, 珍妮弗·M·罗思 申请人:纽约大学