专利名称：Sars感染的可显像动物模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及冠状病毒感染模型。更具体地，它涉及感染了荧光蛋白标记的冠状病毒的动物。
背景技术：
最近，严重急性呼吸综合征(SARS)在全世界的爆发导致了大量死亡和旅游计划的中断，也使数千人处于检疫状态。在很短的时间里，利用从六个国家的患者身上获得的临床样本，已经确定感染是由冠状病毒引起的。例如可参见Ksiazek，T.G.，et al.，New England J.Med.(2003)3481947-1958。
冠状病毒家族成员包含大约30kb的正义RNA基因组，在许多不同物种中能引起呼吸道或肠道感染。例如可参见de Haan，C.A.M.，et al.，Virology(2002)296177-189。可基于抗原和遗传标准将它们分成三组。冠状病毒的共同特征是具有编码复制酶和结构功能蛋白的必需基因。在这些基因中分散着组内相似，组间不同的组特异性开放读码框(ORFs)。
主要必需基因(ORF)占基因组的大约2/3，位于基因组的5′端。这个基因是复制酶基因，它编码两个大的前体，切割该前体物质可得到参与RNA复制和转录的产物。其他共同的必需基因编码四种基础结构蛋白N，M，E和S。核衣壳蛋白(N)包装病毒RNA，形成病毒粒子的核心。这种核衣壳核心结构被含有最丰富膜蛋白(M)的脂质被膜包围。小被膜蛋白(E)和棘突蛋白(S)与M蛋白相连。S蛋白形成参与病毒-细胞融合和细胞-细胞融合的病毒外包膜突起。这些基因位于病毒基因组的3′端。这些组特异性基因的性质(identity)和位置会变化，它们的所有功能还没有确定。小鼠肝炎病毒(MHV)所属的第2组病毒具有两个组特异性基因，基因2a以及位于ORF lb与S基因之间的血凝素-酯酶(HE)ORF。另外的两个组2-特异性基因，基因4和基因5a位于S和E基因之间。
MHV具有大约31kb的单链正义RNA基因组。参见Kim，K.H.，et aL，J.Virol.(1995)692313-2321。MHV基因组RNA的5′端包含长72-77个核苷酸的引导序列。引导序列的下游是各自被基因间序列的特殊短伸展序列分开的MHV特异性基因。MHV感染的细胞会产生七种主要的病毒特异性亚基因组mRNA。冠状病毒mRNA呈多顺反子结构，但产生单顺反子蛋白。在嵌套式结构中，冠状病毒的mRNAs共享3′端，其中每一个mRNA以逐渐增多的方式比它3′端的相邻基因长一个基因，而且只有每一个mRNA的5′端的大部分基因被翻译。依据这些亚基因组mRNAs的大小，按由大到小的次序将其命名为1到7。mRNA序列在其5′端与引导序列融合。
在DBT细胞中将MHV毒株JHM连续不稀释传代可产生缺陷的干扰(DI)RNAs的病毒，这代病毒被分成两种类型。一种需要辅助病毒感染才能复制。另一种DI型包含大小接近病毒基因组，没有辅助病毒感染时自身能复制并能被包装进MHV颗粒的DIssA。在DIssA复制细胞中，几乎所有MHV mRNA的合成都被强烈抑制，但mRNA7及其产物，以及N蛋白的合成却不被抑制。对DIssA的RNase TI寡核苷酸指纹分析显示DIssA的基因1和基因7基本完整，但基因2一基因6存在多个缺失。mRNA 7是从DIssA的模板RNA，而不是从辅助病毒的模板RNA合成的，基因1的产物和N蛋白对于MHV RNA的合成而言是足够的。
因此如果能标记DI型DIssA，监测复制就足够了。这就是本发明所描述的方法。
使用荧光蛋白作为荧光标记物已经有很多年。最初分离的蛋白发射绿色波长，因此被称为绿色荧光蛋白(GFP)。因此虽然已经制备出包括红色荧光蛋白(RFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)和黄色(YFP)荧光蛋白的其他各种颜色的蛋白，但总体上绿色荧光蛋白已经成为这种荧光蛋白的种类标记(genericlabel)。例如，美国专利6,232,523；6,235,967；6,235,968和6,251,384中讨论了这些蛋白的性能，在此引入所有文献作为参考。这些专利描述了利用各种颜色的荧光蛋白监测转基因啮齿类动物内的肿瘤生长和转移的情况，其中转基因啮齿类动物是方便的肿瘤模型。另外，在美国申请09/812,710中这些荧光蛋白被用来监测启动子介导的表达，在美国系列号10/192,740中被用来监测细菌感染，在美国临时申请60/425,776中被用来监测细胞分选。美国临时申请60/404,005和60/427,604公开了利用不同颜色的荧光蛋白标记细胞核和细胞浆的情况。美国临时申请60/445,583描述了所有组织都被标记，因此具有相同颜色的一致性荧光的小鼠。在此引入所有这些文献作为参考。
发明内容
本发明提供了动物模型，其中用荧光标记的冠状病毒来感染易感动物受试者，优选啮齿类动物或兔子，其中通过监测荧光来随诊感染即冠状病毒复制的进展。在一个优选实施方案中，动物是含有发第一颜色荧光的组织的转基因动物，在第一颜色荧光的映衬下，容易看见正在复制的冠状病毒的荧光。利用这一模型，通过直接观察治疗和未治疗的情况下或者接种疫苗和未接种疫苗的情况下感染的进展，可以确定疫苗和药物的效果。下面利用来自MHV的DIssA特异性序列作为模型来说明本发明。
因此，一方面，本发明涉及标记有荧光蛋白，例如GFP或RFP的冠状病毒。另一方面，本发明涉及感染了标记的病毒的动物。另一方面，本发明涉及利用本发明的动物模型来监测感染进程，评价抗病毒药物和疫苗效果的方法。
实施发明的方式上述引入作用参考的美国专利和专利申请中描述了本发明中有用的工具。这些文献中已经描述了全身显像(Whole body imaging)，本发明所用荧光蛋白的性质以及标记整个动物的方法。
已经公开的方法适用于冠状病毒家族中各组的冠状病毒。虽然在说明性实例中，病毒是用RFP标记的，并且在所有组织都表达GFP的裸小鼠的背景下观察所述病毒，但选择这些具体颜色和使用标记动物作为受试者都不是必需的。
重组冠状病毒公开的发明中使用了经改造表达标记物，诸如荧光蛋白的重组冠状病毒。通过用上述重组冠状病毒感染模型生物体，本领域普通技术人员可以利用重组病毒来研究宿主动物体内病毒复制的进展。而且，这种重组冠状病毒模型系统可以用作鉴定减慢或抑制冠状病毒复制的抗病毒物质的测定方法。
Cornelis，et al的工作证实能重组改造冠状病毒，使其表达外源基因，而不严重影响病毒复制。Cornelis，et al.，J.Virol.(2003)77(21)11312-11323，在此将全文引入作为参考。这项研究的结果表明外源基因在病毒基因组中的位置可能影响重组病毒载体的病毒复制。特别是Cornelis和他的同事观察到当外源基因被插入到靠近病毒基因组的3′端时，外源基因的表达水平增加。因此，在本发明的优选实施方案中也将荧光蛋白编码序列安置在朝(toward)病毒基因组3′端的位置。
Cornelis和他的同事在他们的研究中使用的是小鼠冠状病毒模型。本领域已经公知这种病毒的序列。至少一种人SARS病毒的突变体已经被测序。Marra，M.A.et al.，″The Genome sequence of the SARS-associatedcoronavirus″Science 300(5624)，1399-1404(2003)。以登陆号NC 004718公众可以获得该序列。在这里，表1中的SEQ ID NOXX提供了这种SARS突变体的基因组序列。
表1
(SEQ ID NOXX)1 atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt61 ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac121 gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct181 tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc241 gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca301 cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg361 gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt421 ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa481 cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg541 gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc601 gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt661 ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat721 cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa781 ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc841 ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg901 tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt961 gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag1021 acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag1081 tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag1141 actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt1201 aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag1261 acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa1321 ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc1381 tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac1441 attgaaactc gactccgcaa gggaggtagg actagatgtt ttggaggctg tgtgtttgcc1501 tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc1561 tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag1621 atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag1681 gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag1741 agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc1801 aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca1861 ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt1921 gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt1981 atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc2041 aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg2101 ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag2161 gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc2221 attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag2281 gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa2341 gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa2401 agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct2461 cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc2521 tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc2581 ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag2641 attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc2701 tttcgcttaa aagggggtgc accaattaaa ggtgtaacct ttggagaaga tactgtttgg2761 gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa2821 gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt2881 gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc2941 aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct3001 ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa3061 gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt3121 acagaggatg attatcaagg tctccctctg gaatttggtg cctcagctga aacagttcga3181 gttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag3241 ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt3301 actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct3361 atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca3421 ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat3481 ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt3541 ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtgaggaca tccagcttct taaggcagca3601 tatgaaaatt tcaattcaca ggacatctta cttgcaccat tgttgtcagc aggcatattt3661 ggtgctaaac cacttcagtc tttacaagtg tgcgtgcaga cggttcgtac acaggtttat3721 attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg3781 aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact
3841 gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt3901 gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt3961 gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg4021 tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc4081 acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct4141 ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt4201 tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta4261 ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga4321 gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga4381 gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt4441 gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg4501 aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt4561 tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca4621 gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca4681 tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat4741 tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac4801 cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa4861 ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac4921 aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt4981 ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt5041 aagactttct ttgtactacc tagtgatgac acactacgta gtgaagcttt cgagtactac5101 catactcttg atgagagttt tcttggtagg tacatgtctg ctttaaacca cacaaagaaa5161 tggaaatttc ctcaagttgg tggtttaact tcaattaaat gggctgataa caattgttat5221 ttgtctagtg ttttattagc acttcaacag cttgaagtca aattcaatgc accagcactt5281 caagaggctt attatagagc ccgtgctggt gatgctgcta acttttgtgc actcatactc5341 gcttacagta ataaaactgt tggcgagctt ggtgatgtca gagaaactat gacccatctt5401 ctacagcatg ctaatttgga atctgcaaag cgagttctta atgtggtgtg taaacattgt5461 ggtcagaaaa ctactacctt aacgggtgta gaagctgtga tgtatatggg tactctatct5521 tatgataatc ttaagacagg tgtttccatt ccatgtgtgt gtggtcgtga tgctacacaa5581 tatctagtac aacaagagtc ttcttttgtt atgatgtctg caccacctgc tgagtataaa5641 ttacagcaag gtacattctt atgtgcgaat gagtacactg gtaactatca gtgtggtcat5701 tacactcata taactgctaa ggagaccctc tatcgtattg acggagctca ccttacaaag5761 atgtcagagt acaaaggacc agtgactgat gttttctaca aggaaacatc ttacactaca5821 accatcaagc ctgtgtcgta taaactcgat ggagttactt acacagagat tgaaccaaaa5881 ttggatgggt attataaaaa ggataatgct tactatacag agcagcctat agaccttgta5941 ccaactcaac cattaccaaa tgcgagtttt gataatttca aactcacatg ttctaacaca6001 aaatttgctg atgatttaaa tcaaatgaca ggcttcacaa agccagcttc acgagagcta6061 tctgtcacat tcttcccaga cttgaatggc gatgtagtgg ctattgacta tagacactat6121 tcagcgagtt tcaagaaagg tgctaaatta ctgcataagc caattgtttg gcacattaac6181 caggctacaa ccaagacaac gttcaaacca aacacttggt gtttacgttg tctttggagt6241 acaaagccag tagatacttc aaattcattt gaagttctgg cagtagaaga cacacaagga6301 atggacaatc ttgcttgtga aagtcaacaa cccacctctg aagaagtagt ggaaaatcct6361 accatacaga aggaagtcat agagtgtgac gtgaaaacta ccgaagttgt aggcaatgtc6421 atacttaaac catcagatga aggtgttaaa gtaacacaag agttaggtca tgaggatctt6481 atggctgctt atgtggaaaa cacaagcatt accattaaga aacctaatga gctttcacta6541 gccttaggtt taaaaacaat tgccactcat ggtattgctg caattaatag tgttccttgg6601 agtaaaattt tggcttatgt caaaccattc ttaggacaag cagcaattac aacatcaaat6661 tgcgctaaga gattagcaca acgtgtgttt aacaattata tgccttatgt gtttacatta6721 ttgttccaat tgtgtacttt tactaaaagt accaattcta gaattagagc ttcactacct6781 acaactattg ctaaaaatag tgttaagagt gttgctaaat tatgtttgga tgccggcatt6841 aattatgtga agtcacccaa attttctaaa ttgttcacaa tcgctatgtg gctattgttg6901 ttaagtattt gcttaggttc tctaatctgt gtaactgctg cttttggtgt actcttatct6961 aattttggtg ctccttctta ttgtaatggc gttagagaat tgtatcttaa ttcgtctaac7021 gttactacta tggatttctg tgaaggttct tttccttgca gcatttgttt aagtggatta7081 gactcccttg attcttatcc agctcttgaa accattcagg tgacgatttc atcgtacaag7141 ctagacttga caattttagg tctggccgct gagtgggttt tggcatatat gttgttcaca7201 aaattctttt atttattagg tctttcagct ataatgcagg tgttctttgg ctattttgct7261 agtcatttca tcagcaattc ttggctcatg tggtttatca ttagtattgt acaaatggca
7321 cccgtttctg caatggttag gatgtacatc ttctttgctt ctttctacta catatggaag7381 agctatgttc atatcatgga tggttgcacc tcttcgactt gcatgatgtg ctataagcgc7441 aatcgtgcca cacgcgttga gtgtacaact attgttaatg gcatgaagag atctttctat7501 gtctatgcaa atggaggccg tggcttctgc aagactcaca attggaattg tctcaattgt7561 gacacatttt gcactggtag tacattcatt agtgatgaag ttgctcgtga tttgtcactc7621 cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct7681 gtgaaaaatg gcgcgcttca cctctacttt gacaaggctg gtcaaaagac ctatgagaga7741 catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca7801 ctgcctatta atgtcatagt ttttgatggc aagtccaaat gcgacgagtc tgcttctaag7861 tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct7921 cttgtatcag acgttggaga tagtactgaa gtttccgtta agatgtttga tgcttatgtc7981 gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca8041 gctcacagcg agttagcaaa gggtgtagct ttagatggtg tcctttctac attcgtgtca8101 gctgcccgac aaggtgttgt tgataccgat gttgacacaa aggatgttat tgaatgtctc8161 aaactttcac atcactctga cttagaagtg acaggtgaca gttgtaacaa tttcatgctc8221 acctataata aggttgaaaa catgacgccc agagatcttg gcgcatgtat tgactgtaat8281 gcaaggcata tcaatgccca agtagcaaaa agtcacaatg tttcactcat ctggaatgta8341 aaagactaca tgtctttatc tgaacagctg cgtaaacaaa ttcgtagtgc tgccaagaag8401 aacaacatac cttttagact aacttgtgct acaactagac aggttgtcaa tgtcataact8461 actaaaatct cactcaaggg tggtaagatt gttagtactt gttttaaact tatgcttaag8521 gccacattat tgtgcgttct tgctgcattg gtttgttata tcgttatgcc agtacataca8581 ttgtcaatcc atgatggtta cacaaatgaa atcattggtt acaaagccat tcaggatggt8641 gtcactcgtg acatcatttc tactgatgat tgttttgcaa ataaacatgc tggttttgac8701 gcatggttta gccagcgtgg tggttcatac aaaaatgaca aaagctgccc tgtagtagct8761 gctatcatta caagagagat tggtttcata gtgcctggct taccgggtac tgtgctgaga8821 gcaatcaatg gtgacttctt gcattttcta cctcgtgttt ttagtgctgt tggcaacatt8881 tgctacacac cttccaaact cattgagtat agtgattttg ctacctctgc ttgcgttctt8941 gctgctgagt gtacaatttt taaggatgct atgggcaaac ctgtgccata ttgttatgac9001 actaatttgc tagagggttc tatttcttat agtgagcttc gtccagacac tcgttatgtg9061 cttatggatg gttccatcat acagtttcct aacacttacc tggagggttc tgttagagta9121 gtaacaactt ttgatgctga gtactgtaga catggtacat gcgaaaggtc agaagtaggt9181 atttgcctat ctaccagtgg tagatgggtt cttaataatg agcattacag agctctatca9241 ggagttttct gtggtgttga tgcgatgaat ctcatagcta acatctttac tcctcttgtg9301 caacctgtgg gtgctttaga tgtgtctgct tcagtagtgg ctggtggtat tattgccata9361 ttggtgactt gtgctgccta ctactttatg aaattcagac gtgtttttgg tgagtacaac9421 catgttgttg ctgctaatgc acttttgttt ttgatgtctt tcactatact ctgtctggta9481 ccagcttaca gctttctgcc gggagtctac tcagtctttt acttgtactt gacattctat9541 ttcaccaatg atgtttcatt cttggctcac cttcaatggt ttgccatgtt ttctcctatt9601 gtgccttttt ggataacagc aatctatgta ttctgtattt ctctgaagca ctgccattgg9661 ttctttaaca actatcttag gaaaagagtc atgtttaatg gagttacatt tagtaccttc9721 gaggaggctg ctttgtgtac ctttttgctc aacaaggaaa tgtacctaaa attgcgtagc9781 gagacactgt tgccacttac acagtataac aggtatcttg ctctatataa caagtacaag9841 tatttcagtg gagccttaga tactaccagc tatcgtgaag cagcttgctg ccacttagca9901 aaggctctaa atgactttag caactcaggt gctgatgttc tctaccaacc accacagaca9961 tcaatcactt ctgctgttct gcagagtggt tttaggaaaa tggcattccc gtcaggcaaa10021 gttgaagggt gcatggtaca agtaacctgt ggaactacaa ctcttaatgg attgtggttg10081 gatgacacag tatactgtcc aagacatgtc atttgcacag cagaagacat gcttaatcct10141 aactatgaag atctgctcat tcgcaaatcc aaccatagct ttcttgttca ggctggcaat10201 gttcaacttc gtgttattgg ccattctatg caaaattgtc tgcttaggct taaagttgat10261 acttctaacc ctaagacacc caagtataaa tttgtccgta tccaacctgg tcaaacattt10321 tcagttctag catgctacaa tggttcacca tctggtgttt atcagtgtgc catgagacct10381 aatcatacca ttaaaggttc tttccttaat ggatcatgtg gtagtgttgg ttttaacatt10441 gattatgatt gcgtgtcttt ctgctatatg catcatatgg agcttccaac aggagtacac10501 gctggtactg acttagaagg taaattctat ggtccatttg ttgacagaca aactgcacag10561 gctgcaggta cagacacaac cataacatta aatgttttgg catggctgta tgctgctgtt10621 atcaatggtg ataggtggtt tcttaataga ttcaccacta ctttgaatga ctttaacctt10681 gtggcaatga agtacaacta tgaacctttg acacaagatc atgttgacat attgggacct10741 ctttctgctc aaacaggaat tgccgtctta gatatgtgtg ctgctttgaa agagctgctg
10801 cagaatggta tgaatggtcg tactatcctt ggtagcacta ttttagaaga tgagtttaca10861 ccatttgatg ttgttagaca atgctctggt gttaccttcc aaggtaagtt caagaaaatt10921 gttaagggca ctcatcattg gatgctttta actttcttga catcactatt gattcttgtt10981 caaagtacac agtggtcact gtttttcttt gtttacgaga atgctttctt gccatttact11041 cttggtatta tggcaattgc tgcatgtgct atgctgcttg ttaagcataa gcacgcattc11101 ttgtgcttgt ttctgttacc ttctcttgca acagttgctt actttaatat ggtctacatg11161 cctgctagct gggtgatgcg tatcatgaca tggcttgaat tggctgacac tagcttgtct11221 ggttataggc ttaaggattg tgttatgtat gcttcagctt tagttttgct tattctcatg11281 acagctcgca ctgtttatga tgatgctgct agacgtgttt ggacactgat gaatgtcatt11341 acacttgttt acaaagtcta ctatggtaat gctttagatc aagctatttc catgtgggcc11401 ttagttattt ctgtaacctc taactattct ggtgtcgtta cgactatcat gtttttagct11461 agagctatag tgtttgtgtg tgttgagtat tacccattgt tatttattac tggcaacacc11521 ttacagtgta tcatgcttgt ttattgtttc ttaggctatt gttgctgctg ctactttggc11581 cttttctgtt tactcaaccg ttacttcagg cttactcttg gtgtttatga ctacttggtc11641 tctacacaag aatttaggta tatgaactcc caggggcttt tgcctcctaa gagtagtatt11701 gatgctttca agcttaacat taagttgttg ggtattggag gtaaaccatg tatcaaggtt11761 gctactgtac agtctaaaat gtctgacgta aagtgcacat ctgtggtact gctctcggtt11821 cttcaacaac ttagagtaga gtcatcttct aaattgtggg cacaatgtgt acaactccac11881 aatgatattc ttcttgcaaa agacacaact gaagctttcg agaagatggt ttctcttttg11941 tctgttttgc tatccatgca gggtgctgta gacattaata ggttgtgcga ggaaatgctc12001 gataaccgtg ctactcttca ggctattgct tcagaattta gttctttacc atcatatgcc12061 gcttatgcca ctgcccagga ggcctatgag caggctgtag ctaatggtga ttctgaagtc12121 gttctcaaaa agttaaagaa atctttgaat gtggctaaat ctgagtttga ccgtgatgct12181 gccatgcaac gcaagttgga aaagatggca gatcaggcta tgacccaaat gtacaaacag12241 gcaagatctg aggacaagag ggcaaaagta actagtgcta tgcaaacaat gctcttcact12301 atgcttagga agcttgataa tgatgcactt aacaacatta tcaacaatgc gcgtgatggt12361 tgtgttccac tcaacatcat accattgact acagcagcca aactcatggt tgttgtccct12421 gattatggta cctacaagaa cacttgtgat ggtaacacct ttacatatgc atctgcactc12481 tgggaaatcc agcaagttgt tgatgcggat agcaagattg ttcaacttag tgaaattaac12541 atggacaatt caccaaattt ggcttggcct cttattgtta cagctctaag agccaactca12601 gctgttaaac tacagaataa tgaactgagt ccagtagcac tacgacagat gtcctgtgcg12661 gctggtacca cacaaacagc ttgtactgat gacaatgcac ttgcctacta taacaattcg12721 aagggaggta ggtttgtgct ggcattacta tcagaccacc aagatctcaa atgggctaga12781 ttccctaaga gtgatggtac aggtacaatt tacacagaac tggaaccacc ttgtaggttt12841 gttacagaca caccaaaagg gcctaaagtg aaatacttgt acttcatcaa aggcttaaac12901 aacctaaata gaggtatggt gctgggcagt ttagctgcta cagtacgtct tcaggctgga12961 aatgctacag aagtacctgc caattcaact gtgctttcct tctgtgcttt tgcagtagac13021 cctgctaaag catataagga ttacctagca agtggaggac aaccaatcac caactgtgtg13081 aagatgttgt gtacacacac tggtacagga caggcaatta ctgtaacacc agaagctaac13141 atggaccaag agtcctttgg tggtgcttca tgttgtctgt attgtagatg ccacattgac13201 catccaaatc ctaaaggatt ctgtgacttg aaaggtaagt acgtccaaat acctaccact13261 tgtgctaatg acccagtggg ttttacactt agaaacacag tctgtaccgt ctgcggaatg13321 tggaaaggtt atggctgtag ttgtgaccaa ctccgcgaac ccttgatgca gtctgcggat13381 gcatcaacgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca ccgtgcggca13441 caggcactag tactgatgtc gtctacaggg cttttgatat ttacaacgaa aaagttgctg13501 gttttgcaaa gttcctaaaa actaattgct gtcgcttcca ggagaaggat gaggaaggca13561 atttattaga ctcttacttt gtagttaaga ggcatactat gtctaactac caacatgaag13621 agactattta taacttggtt aaagattgtc cagcggttgc tgtccatgac tttttcaagt13681 ttagagtaga tggtgacatg gtaccacata tatcacgtca gcgtctaact aaatacacaa13741 tggctgattt agtctatgct ctacgtcatt ttgatgaggg taattgtgat acattaaaag13801 aaatactcgt cacatacaat tgctgtgatg atgattattt caataagaag gattggtatg13861 acttcgtaga gaatcctgac atcttacgcg tatatgctaa cttaggtgag cgtgtacgcc13921 aatcattatt aaagactgta caattctgcg atgctatgcg tgatgcaggc attgtaggcg13981 tactgacatt agataatcag gatcttaatg ggaactggta cgatttcggt gatttcgtac14041 aagtagcacc aggctgcgga gttcctattg tggattcata ttactcattg ctgatgccca14101 tcctcacttt gactagggca ttggctgctg agtcccatat ggatgctgat ctcgcaaaac14161 cacttattaa gtgggatttg ctgaaatatg attttacgga agagagactt tgtctcttcg14221 accgttattt taaatattgg gaccagacat accatcccaa ttgtattaac tgtttggatg
14281 ataggtgtat ccttcattgt gcaaacttta atgtgttatt ttctactgtg tttccaccta14341 caagttttgg accactagta agaaaaatat ttgtagatgg tgttcctttt gttgtttcaa14401 ctggatacca ttttcgtgag ttaggagtcg tacataatca ggatgtaaac ttacatagct14461 cgcgtctcag tttcaaggaa cttttagtgt atgctgctga tccagctatg catgcagctt14521 ctggcaattt attgctagat aaacgcacta catgcttttc agtagctgca ctaacaaaca14581 atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaataa agacttttat gactttgctg14641 tgtctaaagg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaact aaaacacttc ttctttgctc14701 aggatggcaa cgctgctatc agtgattatg actattatcg ttataatctg ccaacaatgt14761 gtgatatcag acaactccta ttcgtagttg aagttgttga taaatacttt gattgttacg14821 atggtggctg tattaatgcc aaccaagtaa tcgttaacaa tctggataaa tcagctggtt14881 tcccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ctcaatgagt tatgaggatc14941 aagatgcact tttcgcgtat actaagcgta atgtcatccc tactataact caaatgaatc15001 ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc tctatctgta15061 gtactatgac aaatagacag tttcatcaga aattattgaa gtcaatagcc gccactagag15121 gagctactgt ggtaattgga acaagcaagt tttacggtgg ctggcataat atgttaaaaa15181 ctgtttacag tgatgtagaa actccacacc ttatgggttg ggattatcca aaatgtgaca15241 gagccatgcc taacatgctt aggataatgg cctctcttgt tcttgctcgc aaacataaca15301 cttgctgtaa cttatcacac cgtttctaca ggttagctaa cgagtgtgcg caagtattaa15361 gtgagatggt catgtgtggc ggctcactat atgttaaacc aggtggaaca tcatccggtg15421 atgctacaac tgcttatgct aatagtgtct ttaacatttg tcaagctgtt acagccaatg15481 taaatgcact tctttcaact gatggtaata agatagctga caagtatgtc cgcaatctac15541 aacacaggct ctatgagtgt ctctatagaa atagggatgt tgatcatgaa ttcgtggatg15601 agttttacgc ttacctgcgt aaacatttct ccatgatgat tctttctgat gatgccgttg15661 tgtgctataa cagtaactat gcggctcaag gtttagtagc tagcattaag aactttaagg15721 cagttcttta ttatcaaaat aatgtgttca tgtctgaggc aaaatgttgg actgagactg15781 accttactaa aggacctcac gaattttgct cacagcatac aatgctagtt aaacaaggag15841 atgattacgt gtacctgcct tacccagatc catcaagaat attaggcgca ggctgttttg15901 tcgatgatat tgtcaaaaca gatggtacac ttatgattga aaggttcgtg tcactggcta15961 ttgatgctta cccacttaca aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc tttcacttgt16021 atttacaata cattagaaag ttacatgatg agcttactgg ccacatgttg gacatgtatt16081 ccgtaatgct aactaatgat aacacctcac ggtactggga acctgagttt tatgaggcta16141 tgtacacacc acatacagtc ttgcaggctg taggtgcttg tgtattgtgc aattcacaga16201 cttcacttcg ttgcggtgcc tgtattagga gaccattcct atgttgcaag tgctgctatg16261 accatgtcat ttcaacatca cacaaattag tgttgtctgt taatccctat gtttgcaatg16321 ccccaggttg tgatgtcact gatgtgacac aactgtatct aggaggtatg agctattatt16381 gcaagtcaca taagcctccc attagttttc cattatgtgc taatggtcag gtttttggtt16441 tatacaaaaa cacatgtgta ggcagtgaca atgtcactga cttcaatgcg atagcaacat16501 gtgattggac taatgctggc gattacatac ttgccaacac ttgtactgag agactcaagc16561 ttttcgcagc agaaacgctc aaagccactg aggaaacatt taagctgtca tatggtattg16621 ccactgtacg cgaagtactc tctgacagag aattgcatct ttcatgggag gttggaaaac16681 ctagaccacc attgaacaga aactatgtct ttactggtta ccgtgtaact aaaaatagta16741 aagtacagat tggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct gttgtgtaca16801 gaggtactac gacatacaag ttgaatgttg gtgattactt tgtgttgaca tctcacactg16861 taatgccact tagtgcacct actctagtgc cacaagagca ctatgtgaga attactggct16921 tgtacccaac actcaacatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat tatcaaaagg16981 tcggcatgca aaagtactct acactccaag gaccacctgg tactggtaag agtcattttg17041 ccatcggact tgctctctat tacccatctg ctcgcatagt gtatacggca tgctctcatg17101 cagctgttga tgccctatgt gaaaaggcat taaaatattt gcccatagat aaatgtagta17161 gaatcatacc tgcgcgtgcg cgcgtagagt gttttgataa attcaaagtg aattcaacac17221 tagaacagta tgttttctgc actgtaaatg cattgccaga aacaactgct gacattgtag17281 tctttgatga aatctctatg gctactaatt atgacttgag tgttgtcaat gctagacttc17341 gtgcaaaaca ctacgtctat attggcgatc ctgctcaatt accagccccc cgcacattgc17401 tgactaaagg cacactagaa ccagaatatt ttaattcagt gtgcagactt atgaaaacaa17461 taggtccaga catgttcctt ggaacttgtc gccgttgtcc tgctgaaatt gttgacactg17521 tgagtgcttt agtttatgac aataagctaa aagcacacaa ggataagtca gctcaatgct17581 tcaaaatgtt ctacaaaggt gttattacac atgatgtttc atctgcaatc aacagacctc17641 aaataggcgt tgtaagagaa tttcttacac gcaatcctgc ttggagaaaa gctgttttta17701 tctcacctta taattcacag aacgctgtag cttcaaaaat cttaggattg cctacgcaga
17761 ctgttgattc atcacagggt tctgaatatg actatgtcat attcacacaa actactgaaa17821 cagcacactc ttgtaatgtc aaccgcttca atgtggctat cacaagggca aaaattggca17881 ttttgtgcat aatgtctgat agagatcttt atgacaaact gcaatttaca agtctagaaa17941 taccacgtcg caatgtggct acattacaag cagaaaatgt aactggactt tttaaggact18001 gtagtaagat cattactggt cttcatccta cacaggcacc tacacacctc agcgttgata18061 taaagttcaa gactgaagga ttatgtgttg acataccagg cataccaaag gacatgacct18121 accgtagact catctctatg atgggtttca aaatgaatta ccaagtcaat ggttacccta18181 atatgtttat cacccgcgaa gaagctattc gtcacgttcg tgcgtggatt ggctttgatg18241 tagagggctg tcatgcaact agagatgctg tgggtactaa cctacctctc cagctaggat18301 tttctacagg tgttaactta gtagctgtac cgactggtta tgttgacact gaaaataaca18361 cagaattcac cagagttaat gcaaaacctc caccaggtga ccagtttaaa catcttatac18421 cactcatgta taaaggcttg ccctggaatg tagtgcgtat taagatagta caaatgctca18481 gtgatacact gaaaggattg tcagacagag tcgtgttcgt cctttgggcg catggctttg18541 agcttacatc aatgaagtac tttgtcaaga ttggacctga aagaacgtgt tgtctgtgtg18601 acaaacgtgc aacttgcttt tctacttcat cagatactta tgcctgctgg aatcattctg18661 tgggttttga ctatgtctat aacccattta tgattgatgt tcagcagtgg ggctttacgg18721 gtaaccttca gagtaaccat gaccaacatt gccaggtaca tggaaatgca catgtggcta18781 gttgtgatgc tatcatgact agatgtttag cagtccatga gtgctttgtt aagcgcgttg18841 attggtctgt tgaataccct attataggag atgaactgag ggttaattct gcttgcagaa18901 aagtacaaca catggttgtg aagtctgcat tgcttgctga taagtttcca gttcttcatg18961 acattggaaa tccaaaggct atcaagtgtg tgcctcaggc tgaagtagaa tggaagttct19021 acgatgctca gccatgtagt gacaaagctt acaaaataga ggaactcttc tattcttatg19081 ctacacatca cgataaattc actgatggtg tttgtttgtt ttggaattgt aacgttgatc19141 gttacccagc caatgcaatt gtgtgtaggt ttgacacaag agtcttgtca aacttgaact19201 taccaggctg tgatggtggt agtttgtatg tgaataagca tgcattccac actccagctt19261 tcgataaaag tgcatttact aatttaaagc aattgccttt cttttactat tctgatagtc19321 cttgtgagtc tcatggcaaa caagtagtgt cggatattga ttatgttcca ctcaaatctg19381 ctacgtgtat tacacgatgc aatttaggtg gtgctgtttg cagacaccat gcaaatgagt19441 accgacagta cttggatgca tataatatga tgatttctgc tggatttagc ctatggattt19501 acaaacaatt tgatacttat aacctgtgga atacatttac caggttacag agtttagaaa19561 atgtggctta taatgttgtt aataaaggac actttgatgg acacgccggc gaagcacctg19621 tttccatcat taataatgct gtttacacaa aggtagatgg tattgatgtg gagatctttg19681 aaaataagac aacacttcct gttaatgttg catttgagct ttgggctaag cgtaacatta19741 aaccagtgcc agagattaag atactcaata atttgggtgt tgatatcgct gctaatactg19801 taatctggga ctacaaaaga gaagccccag cacatgtatc tacaataggt gtctgcacaa19861 tgactgacat tgccaagaaa cctactgaga gtgcttgttc ttcacttact gtcttgtttg19921 atggtagagt ggaaggacag gtagaccttt ttagaaacgc ccgtaatggt gttttaataa19981 cagaaggttc agtcaaaggt ctaacacctt caaagggacc agcacaagct agcgtcaatg20041 gagtcacatt aattggagaa tcagtaaaaa cacagtttaa ctactttaag aaagtagacg20101 gcattattca acagttgcct gaaacctact ttactcagag cagagactta gaggatttta20161 agcccagatc acaaatggaa actgactttc tcgagctcgc tatggatgaa ttcatacagc20221 gatataagct cgagggctat gccttcgaac acatcgttta tggagatttc agtcatggac20281 aacttggcgg tcttcattta atgataggct tagccaagcg ctcacaagat tcaccactta20341 aattagagga ttttatccct atggacagca cagtgaaaaa ttacttcata acagatgcgc20401 aaacaggttc atcaaaatgt gtgtgttctg tgattgatct tttacttgat gactttgtcg20461 agataataaa gtcacaagat ttgtcagtga tttcaaaagt ggtcaaggtt acaattgact20521 atgctgaaat ttcattcatg ctttggtgta aggatggaca tgttgaaacc ttctacccaa20581 aactacaagc aagtcaagcg tggcaaccag gtgttgcgat gcctaacttg tacaagatgc20641 aaagaatgct tcttgaaaag tgtgaccttc agaattatgg tgaaaatgct gttataccaa20701 aaggaataat gatgaatgtc gcaaagtata ctcaactgtg tcaatactta aatacactta20761 ctttagctgt accctacaac atgagagtta ttcactttgg tgctggctct gataaaggag20821 ttgcaccagg tacagctgtg ctcagacaat ggttgccaac tggcacacta cttgtcgatt20881 cagatcttaa tgacttcgtc tccgacgcag attctacttt aattggagac tgtgcaacag20941 tacatacggc taataaatgg gaccttatta ttagcgatat gtatgaccct aggaccaaac21001 atgtgacaaa agagaatgac tctaaagaag ggtttttcac ttatctgtgt ggatttataa21061 agcaaaaact agccctgggt ggttctatag ctgtaaagat aacagagcat tcttggaatg21121 ctgaccttta caagcttatg ggccatttct catggtggac agcttttgtt acaaatgtaa21181 atgcatcatc atcggaagca tttttaattg gggctaacta tcttggcaag ccgaaggaac
21241 aaattgatgg ctataccatg catgctaact acattttctg gaggaacaca aatcctatcc21301 agttgtcttc ctattcactc tttgacatga gcaaatttcc tcttaaatta agaggaactg21361 ctgtaatgtc tcttaaggag aatcaaatca atgatatgat ttattctctt ctggaaaaag21421 gtaggcttat cattagagaa aacaacagag ttgtggtttc aagtgatatt cttgttaaca21481 actaaacgaa catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg21541 accggtgcac cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta21601 tgaggggggt ttactatcct gatgaaattt ttagatcaga cactctttat ttaactcagg21661 atttatttct tccattttat tctaatgtta cagggtttca tactattaat catacgtttg21721 gcaaccctgt catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg21781 ttgtccgtgg ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagtcg gtgattatta21841 ttaacaattc tactaatgtt gttatacgag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt21901 tctttgctgt ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgcat21961 ttaattgcac tttcgagtac atatctgatg ccttttcgct tgatgtttca gaaaagtcag22021 gtaattttaa acacttacga gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt22081 ataagggcta tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga22141 aacctatttt taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagcc attcttacag22201 ccttttcacc tgctcaagac atttggggca cgtcagctgc agcctatttt gttggctatt22261 taaagccaac tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg22321 attgttctca aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagcttt gagattgaca22381 aaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgagattcc22441 ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg22501 tctatgcatg ggagagaaaa aaaatttcta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca22561 actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtttc tgccactaag ttgaatgatc22621 tttgcttctc caatgtctat gcagattctt ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa22681 tagcgccagg acaaactggt gttattgctg attataatta taaattgcca gatgatttca22741 tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaattata22801 attataaata taggtatctt agacatggca agcttaggcc ctttgagaga gacatatcta22861 atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc22921 cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg22981 tagtactttc ttttgaactt ttaaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaattatcca23041 ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg23101 tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg23161 atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgcg23221 cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc ttcatctgaa gttgctgttc23281 tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac23341 cagcttggcg catatattct actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtctta23401 taggagctga gcatgtcgac acttcttatg agtgcgacat tcctattgga gctggcattt23461 gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt23521 atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgcttactc taataacacc attgctatac23581 ctactaactt ttcaattagc attactacag aagtaatgcc tgtttctatg gctaaaacct23641 ccgtagattg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat ttgcttctcc23701 aatatggtag cttttgcaca caactaaatc gtgcactctc aggtattgct gctgaacagg23761 atcgcaacac acgtgaagtg ttcgctcaag tcaaacaaat gtacaaaacc ccaactttga23821 aatattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattacctga ccctctaaag ccaactaaga23881 ggtcttttat tgaggacttg ctctttaata aggtgacact cgctgatgct ggcttcatga23941 agcaatatgg cgaatgccta ggtgatatta atgctagaga tctcatttgt gcgcagaagt24001 tcaatggact tacagtgttg ccacctctgc tcactgatga tatgattgct gcctacactg24061 ctgctctagt tagtggtact gccactgctg gatggacatt tggtgctggc gctgctcttc24121 aaataccttt tgctatgcaa atggcatata ggttcaatgg cattggagtt acccaaaatg24181 ttctctatga gaaccaaaaa caaatcgcca accaatttaa caaggcgatt agtcaaattc24241 aagaatcact tacaacaaca tcaactgcat tgggcaagct gcaagacgtt gttaaccaga24301 atgctcaagc attaaacaca cttgttaaac aacttagctc taattttggt gcaatttcaa24361 gtgtgctaaa tgatatcctt tcgcgacttg ataaagtcga ggcggaggta caaattgaca24421 ggttaattac aggcagactt caaagccttc aaacctatgt aacacaacaa ctaatcaggg24481 ctgctgaaat cagggcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtctgag tgtgttcttg24541 gacaatcaaa aagagttgac ttttgtggaa agggctacca ccttatgtcc ttcccacaag24601 cagccccgca tggtgttgtc ttcctacatg tcacgtatgt gccatcccag gagaggaact24661 tcaccacagc gccagcaatt tgtcatgaag gcaaagcata cttccctcgt gaaggtgttt
24721 ttgtgtttaa tggcacttct tggtttatta cacagaggaa cttcttttct ccacaaataa24781 ttactacaga caatacattt gtctcaggaa attgtgatgt cgttattggc atcattaaca24841 acacagttta tgatcctctg caacctgagc ttgactcatt caaagaagag ctggacaagt24901 acttcaaaaa tcatacatca ccagatgttg atcttggcga catttcaggc attaacgctt24961 ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg25021 aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt25081 atgtttggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt25141 gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca25201 agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat tacacataaa25261 cgaacttatg gatttgttta tgagattttt tactcttaga tcaattactg cacagccagt25321 aaaaattgac aatgcttctc ctgcaagtac tgttcatgct acagcaacga taccgctaca25381 agcctcactc cctttcggat ggcttgttat tggcgttgca tttcttgctg tttttcagag25441 cgctaccaaa ataattgcgc tcaataaaag atggcagcta gccctttata agggcttcca25501 gttcatttgc aatttactgc tgctatttgt taccatctat tcacatcttt tgcttgtcgc25561 tgcaggtatg gaggcgcaat ttttgtacct ctatgccttg atatattttc tacaatgcat25621 caacgcatgt agaattatta tgagatgttg gctttgttgg aagtgcaaat ccaagaaccc25681 attactttat gatgccaact actttgtttg ctggcacaca cataactatg actactgtat25741 accatataac agtgtcacag atacaattgt cgttactgaa ggtgacggca tttcaacacc25801 aaaactcaaa gaagactacc aaattggtgg ttattctgag gataggcact caggtgttaa25861 agactatgtc gttgtacatg gctatttcac cgaagtttac taccagcttg agtctacaca25921 aattactaca gacactggta ttgaaaatgc tacattcttc atctttaaca agcttgttaa25981 agacccaccg aatgtgcaaa tacacacaat cgacggctct tcaggagttg ctaatccagc26041 aatggatcca atttatgatg agccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaaga26101 aagtgagtac gaacttatgt actcattcgt ttcggaagaa acaggtacgt taatagttaa26161 tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gtcacactag ccatccttac26221 tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtttag taaaaccaac26281 ggtttacgtc tactcgcgtg ttaaaaatct gaactcttct gaaggagttc ctgatcttct26341 ggtctaaacg aactaactat tattattatt ctgtttggaa ctttaacatt gcttatcatg26401 gcagacaacg gtactattac cgttgaggag cttaaacaac tcctggaaca atggaaccta26461 gtaataggtt tcctattcct agcctggatt atgttactac aatttgccta ttctaatcgg26521 aacaggtttt tgtacataat aaagcttgtt ttcctctggc tcttgtggcc agtaacactt26581 gcttgttttg tgcttgctgc tgtctacaga attaattggg tgactggcgg gattgcgatt26641 gcaatggctt gtattgtagg cttgatgtgg cttagctact tcgttgcttc cttcaggctg26701 tttgctcgta cccgctcaat gtggtcattc aacccagaaa caaacattct tctcaatgtg26761 cctctccggg ggacaattgt gaccagaccg ctcatggaaa gtgaacttgt cattggtgct26821 gtgatcattc gtggtcactt gcgaatggcc ggacactccc tagggcgctg tgacattaag26881 gacctgccaa aagagatcac tgtggctaca tcacgaacgc tttcttatta caaattagga26941 gcgtcgcagc gtgtaggcac tgattcaggt tttgctgcat acaaccgcta ccgtattgga27001 aactataaat taaatacaga ccacgccggt agcaacgaca atattgcttt gctagtacag27061 taagtgacaa cagatgtttc atcttgttga cttccaggtt acaatagcag agatattgat27121 tatcattatg aggactttca ggattgctat ttggaatctt gacgttataa taagttcaat27181 agtgagacaa ttatttaagc ctctaactaa gaagaattat tcggagttag atgatgaaga27241 acctatggag ttagattatc cataaaacga acatgaaaat tattctcttc ctgacattga27301 ttgtatttac atcttgcgag ctatatcact atcaggagtg tgttagaggt acgactgtac27361 tactaaaaga accttgccca tcaggaacat acgagggcaa ttcaccattt caccctcttg27421 ctgacaataa atttgcacta acttgcacta gcacacactt tgcttttgct tgtgctgacg27481 gtactcgaca tacctatcag ctgcgtgcaa gatcagtttc accaaaactt ttcatcagac27541 aagaggaggt tcaacaagag ctctactcgc cactttttct cattgttgct gctctagtat27601 ttttaatact ttgcttcacc attaagagaa agacagaatg aatgagctca ctttaattga27661 cttctatttg tgctttttag cctttctgct attccttgtt ttaataatgc ttattatatt27721 ttggttttca ctcgaaatcc aggatctaga agaaccttgt accaaagtct aaacgaacat27781 gaaacttctc attgttttga cttgtatttc tctatgcagt tgcatatgca ctgtagtaca27841 gcgctgtgca tctaataaac ctcatgtgct tgaagatcct tgtaaggtac aacactaggg27901 gtaatactta tagcactgct tggctttgtg ctctaggaaa ggttttacct tttcatagat27961 ggcacactat ggttcaaaca tgcacaccta atgttactat caactgtcaa gatccagctg28021 gtggtgcgct tatagctagg tgttggtacc ttcatgaagg tcaccaaact gctgcattta28081 gagacgtact tgttgtttta aataaacgaa caaattaaaa tgtctgataa tggaccccaa28141 tcaaaccaac gtagtgcccc ccgcattaca tttggtggac ccacagattc aactgacaat
28201 aaccagaatg gaggacgcaa tggggcaagg ccaaaacagc gccgacccca aggtttaccc28261 aataatactg cgtcttggtt cacagctctc actcagcatg gcaaggagga acttagattc28321 cctcgaggcc agggcgttcc aatcaacacc aatagtggtc cagatgacca aattggctac28381 taccgaagag ctacccgacg agttcgtggt ggtgacggca aaatgaaaga gctcagcccc28441 agatggtact tctattacct aggaactggc ccagaagctt cacttcccta cggcgctaac28501 aaagaaggca tcgtatgggt tgcaactgag ggagccttga atacacccaa agaccacatt28561 ggcacccgca atcctaataa caatgctgcc accgtgctac aacttcctca aggaacaaca28621 ttgccaaaag gcttctacgc agagggaagc agaggcggca gtcaagcctc ttctcgctcc28681 tcatcacgta gtcgcggtaa ttcaagaaat tcaactcctg gcagcagtag gggaaattct28741 cctgctcgaa tggctagcgg aggtggtgaa actgccctcg cgctattgct gctagacaga28801 ttgaaccagc ttgagagcaa agtttctggt aaaggccaac aacaacaagg ccaaactgtc28861 actaagaaat ctgctgctga ggcatctaaa aagcctcgcc aaaaacgtac tgccacaaaa28921 cagtacaacg tcactcaagc atttgggaga cgtggtccag aacaaaccca aggaaatttc28981 ggggaccaag acctaatcag acaaggaact gattacaaac attggccgca aattgcacaa29041 tttgctccaa gtgcctctgc attctttgga atgtcacgca ttggcatgga agtcacacct29101 tcgggaacat ggctgactta tcatggagcc attaaattgg atgacaaaga tccacaattc29161 aaagacaacg tcatactgct gaacaagcac attgacgcat acaaaacatt cccaccaaca29221 gagcctaaaa aggacaaaaa gaaaaagact gatgaagctc agcctttgcc gcagagacaa29281 aagaagcagc ccactgtgac tcttcttcct gcggctgaca tggatgattt ctccagacaa29341 cttcaaaatt ccatgagtgg agcttctgct gattcaactc aggcataaac actcatgatg29401 accacacaag gcagatgggc tatgtaaacg ttttcgcaat tccgtttacg atacatagtc29461 tactcttgtg cagaatgaat tctcgtaact aaacagcaca agtaggttta gttaacttta29521 atctcacata gcaatcttta atcaatgtgt aacattaggg aggacttgaa agagccacca29581 cattttcatc gaggccacgc ggagtacgat cgagggtaca gtgaataatg ctagggagag29641 ctgcctatat ggaagagccc taatgtgtaa aattaatttt agtagtgcta tccccatgtg29701 attttaatag cttcttagga gaatgacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a虽然优选将荧光蛋白置于冠状病毒基因组中，但本发明的其他优选实施方案也提供了病毒荧光融合蛋白的构建，这种构建物允许本领域普通技术人员对动物模型中的病毒复制进行追踪观察。病毒结构蛋白或非结构蛋白都可以作为融合蛋白配偶体。可以作为融合蛋白配偶体的优选结构蛋白包括但不限于核衣壳磷蛋白(nucleocapsid phosphoprotein)，棘突糖蛋白(spikeglycoprotein)，膜糖蛋白(membrane glycoprotein)，小被膜蛋白(small envelopeprotein)或血凝素-酯酶糖蛋白(hemagglutinin-esterase glycoprotein)。这些蛋白的序列都已经公开在关于多种冠状病毒，包括小鼠和SARS毒株的文献中。
模型公开的发明中使用了经改造表达标记物，例如荧光蛋白的重组冠状病毒。通过用上述重组冠状病毒感染模型生物体，本领域普通技术人员能利用重组病毒来研究宿主动物体内病毒复制的进展。而且这种重组冠状病毒模型系统可以作为鉴定减慢或抑制冠状病毒复制的抗病毒物质的测定方法。
本发明的各方面使用的标记物都是荧光蛋白。这一类中编码种子(seminal)蛋白的天然基因一绿色荧光蛋白(GFP)是从生物发光水母Aequoreavictoria中克隆得到的(Morin，J.，etal.，J.CellPhysiol(1972)77313-318)。这个基因的可得性使利用GFP作为基因表达标志物成为可能。原始GFP本身是分子量为27kD的、283个氨基酸的蛋白质。它不需要来自其天然来源的其他蛋白质，也不需要仅可得自天然来源中的底物或辅助因子就能发出荧光(Prasher，D.C.，et al.，Gene(1992)111229-233；Yang，F.，et al.，NatureBiotechnol(1996)141252-1256；Cody，C.W.，et al.，Biochemistry(1993)321212-1218.)。已经发现原始GFP的突变体在增强表达，改进激发和荧光方面有用，因此已经获得各种颜色，包括红色和蓝色的“GFP”。GFP-S65T(其中65位的丝氨酸被苏氨酸替代)在本发明的方法中特别有用，它具有490nm处的单一激发蜂。(Heim，R.，et al，Nature(1995)373663-664)；美国专利5,625,048。Delagrade，S.，et al，Biotechnology(1995)13151-154；Cormack，B.，et al.，Gene(1996)17333-38和Cramer，A.，et al，NatureBiotechnol(1996)14315-319中也公开了其他的突变体。美国专利5,625,048中也公开了另外的突变体。通过适当的修饰可以改变GFP发射光的光谱。因此虽然在本申请中经常使用术语“GFP”，但该定义中所包含的蛋白质的外观表现不一定是绿色的。多种形式也包括在“GFP”这一定义中的GFP显示出绿色以外的颜色，这些GFP在本发明的方法和材料中是有用的。另外，已经公知可从其他生物体，例如sea pansy，Renilla reniformis中分离出属于“GFP”这一定义的绿色荧光蛋白。可以用任何方便合适形式的天然和突变GFP来修饰本发明中有用的感染性病原体。
为了避免引起混淆，我们将使用“荧光蛋白”这一简单的术语；一般而言，它指各种生物体，例如Renilla和Aequorea产生的荧光蛋白，以及这些天然荧光蛋白的修的饰形式，其能发出各种可见颜色荧光如红色，黄色，钴荧光，分别称为红色荧光蛋白(RFP)，黄色荧光蛋白(YFP)和钴荧光蛋白(CFP)。一般情况下术语“荧光蛋白”，“GFP”或“RFp”可以互换使用。
因为荧光蛋白有多种颜色，因此可同时进行一种以上单一颜色的显像。例如可以给生物体施用分别表达特征性荧光的两种不同的感染性病原体或三种不同的感染性病原体，评价所建议治疗的差异性效果。另外，单个感染性病原体可以用一种颜色以及另一种不同颜色组成型标记，以产生与细胞内或分泌的基因产物的融合物。因此可以将编码荧光蛋白的核苷酸序列插入待研究的基因座中，或作为与待研究蛋白的融合蛋白插入载体中，其中所述荧光蛋白的颜色与用于标记生物体本身的荧光蛋白的颜色不同。将利用双色显像来显现模型中病毒对具体位置诸如肺的靶向作用。而且可以用单一的颜色分别标记一种或多种感染性病原体，用另一种颜色标记目的基因，用第三种颜色标记宿主模型组织。例如，将通过全身显像来显现表达荧光的冠状病毒模型中的病毒复制。
本发明公开的方法可用于监测上述重组冠状病毒的复制以及各种抗病毒物质诸如化学治疗药物和抗病毒疫苗对冠状病毒复制的影响。
本发明的方法中使用了经修饰以表达编码荧光蛋白的核苷酸序列的感染性病原体，其中优选所述荧光蛋白的荧光强度足够强，这样不需要任何侵入性技术就能够看见受试者体内的荧光。因为能实现实时观察，所以优选全身显像。例如也可以使用内镜技术，如果需要也可以切除组织或器官直接观察或进行组织化学观察。
可以通过直接修饰的方式将编码荧光蛋白的核苷酸序列引入到感染性病原体中，例如可修饰病毒基因组使荧光蛋白编码序列位于病毒内源控制序列控制之下的合适位置，或者利用合适的表达载体将其导入微生物系统中。
接下来给受试者施用合适的经修饰的感染性病原体，如果需要，可模拟病原体的感染路径来施用该病原体，或者采用任意路径来施用该病原体。可以通过注射，管饲法，口服，气溶胶吸入到呼吸系统，栓剂，与黏膜表面接触或本领域公知的任何合适的导入感染性病原体的方式来施用。
虽然可以使用内窥镜，也可以切除个体组织，但通过荧光显像来观察完整动物体内感染性病原体的迁移和被感染的细胞特别方便。这种方法允许实时观察，特别是在模型系统中评价潜在的抗感染药物和实验设计时，能够在连续的基础上监测感染的进展。因此，与未接受药物或实验设计的对照组相比，在接受了待测药物或实验设计的受试动物体内直接观察到对感染的抑制表明了候选药物的有效性和用于治疗的潜能。在接受感染治疗的受试者中，实施荧光显像允许以连续方式将修改或不修改实验设计的合理性告知那些治疗计划的设计者。在一个实施例中，为了筛选有效抗病毒药剂，将表达荧光标记的病毒蛋白的重组冠状病毒注射到小鼠模型中来追踪病毒复制。病毒感染位点发出强荧光，用带有CCD相机和GFP滤光片的灯箱(light box)中的蓝光激发后很容易看见。
可以作为模型使用的合适的脊椎动物受试者优选哺乳动物受试者，最优选方便的实验室动物，如兔子，大鼠，小鼠等等。为了与人类受试者更相似，也可以使用灵长类动物。可以使用任何合适的脊椎受试动物，选择哪种脊椎动物主要依据便利性和与最终目的系统的相似性。最终，脊椎动物受试者可以是人。
下面的实施例用来例证说明本发明，而不限制本发明。
实施例1A.背景描述了肿瘤-宿主相互作用的双色荧光显像模型，该模型基于生长在GFP转基因小鼠体内并表达RFP的肿瘤，使得肿瘤-间质相互作用的双色显现称为可能，所述肿瘤-间质相互作用包括肿瘤血管生成和肿瘤中淋巴细胞的浸润。利用在鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子控制下表达GFP的转基因小鼠作为宿主(Okabe，M.，et al.，FEBS Lett(1997)407315-319)。在蓝色激发光下，这种转基因系的所有组织都发出绿色荧光。可用pLNCX2-DsRed-2-RFP质粒转导表达RFP的小鼠黑色素细胞B16F0(B16F0-RFP)。B16F0-RFP肿瘤和表达GFP的宿主细胞可同时清晰显像。高分辨率的双色显像能分辨肿瘤细胞，宿主组织至单细胞水平。包括成纤维细胞，肿瘤浸润型淋巴细胞，树突状细胞，表达GFP的血管和毛细血管的宿主细胞与表达RFP的肿瘤细胞很容易相区别。这种双色荧光显像系统应该能促进为了理解肿瘤生长和肿瘤血管发生中，肿瘤和宿主的相互作用而进行的研究。双色嵌和系统也提供了一种为了治疗和诊断/分析目的，分析和分离肿瘤浸润型淋巴细胞和其他与肿瘤作用的宿主基质细胞的强有力的工具。在本发明的双色可显像RFP-MHV-GFP宿主感染模型中利用了这种模型原理。
B.方法病毒和细胞接下来是de Haan，et al.，Virol.(2002)296177-189中的方法。使用了MHV-A59温度敏感(ts)突变株LA16，噬斑克隆的(plaque-cloned)MHV-JHM和不稀释传代培养原始噬斑克隆的(plaque-cloned)MHV-JHM(JHM19th)19代获得的病毒样品。用小鼠DBT细胞来进行RNA转染和病毒繁殖。
接下来的部分是Kim，K.H.，J.ViroL(1995)692313-2321中的方法。
病毒特异性细胞内RNA的制备和Northern(RNA)印迹从被病毒感染的细胞中提取病毒特异性的RNAs。将1.5mg细胞内RNA变性，用含有甲醛的1％的琼脂糖凝胶进行电泳。分离的RNA被吸附转移到尼龙滤膜上。将滤膜上的RNA与对MHV RNA多个区域特异的32P标记的探针杂交。
RNA转录和转染用XbaI消化使质粒线性化，在体外用T7RNA聚合酶转录。用脂质转染法进行RNA转染。
分离含有DIssA特异性序列的克隆为了扩增DIssA相关的亚基因组RNA，首先利用寡核苷酸1116(5′-CTGAAACTCTTTTCCCT-3′)(SEQ IDNOXX)作为引物，从细胞内RNA合成cDNA，所述寡核苷酸1116在mRNA7的5′端的250-267位核苷酸处与正链MHV mRNA 7相结合。接着将MHV特异性cDNA与能结合MHV RNA反前导序列的寡核苷酸78(5′-AGCTTTACGTACCCTCTCTACTATAAAACTCTTGTAGTTT-3′)(SEQID NOXX)，在PCR缓冲液(0.05M KCI，0.01M Tris盐酸[pH 8.3]，0.0025MMgCI2，0.01％明胶，三磷酸脱氧核糖核苷各0.17mM，5U Taq聚合酶[Promega])中，在93.8℃、30s，37.8℃、45s，72.8℃、100s的条件下保温25个循环。利用琼脂糖凝胶电泳分离出DIssA亚基因组RNA，并将其与探针杂交，其中探针来自MHV基因组RNA 3′端的1.5-1.7kb一致。这种探针能够与所有MHV mRNAs杂交。从凝胶中洗脱DIssA亚基因组RNA特异性RT-PCR产物，并将其克隆到TA克隆载体(Invitrogen)中。利用用于Southern印迹分析的探针，通过菌落杂交分离出含有DIssA特异性序列的克隆。为了扩增DIssA RNA，首先利用寡核苷酸1116作为引物，从凝胶纯化的DIssA RNA合成cDNA。接着在上述的PCR条件下，将DIssA特异性cDNA与寡核苷酸10121(5′-GAAGGGTTGTATGTGTTG-3′)(SEQ ID NOXX)在PCR缓冲液中一起保温，所述寡核苷酸10121能在基因2的5′端的核苷酸798-815处与负链MHV RNA结合。从制备型凝胶中洗脱DIssA特异性RT-PCR产物，并将其克隆到TA克隆载体中。利用在MHV基因2-1处杂交的探针，通过菌落杂交分离出含有DIssA特异性序列的克隆。
构建与RFP相连的小鼠肝炎全长cDNADIssA是天然存在的自我复制型DI RNA，具有接近上述完整MHV基因1和基因7。我们将在细菌人工染色体(BAC)pBeloBACII中侧接MHV cDNA的基因1和基因7，以及RFP基因，在其5′端是CMV早期立即启动子，3′端连接poly(A)尾，并依次紧跟着肝炎δ病毒核酶，牛GH终点和多腺苷酸化序列pBAC-MHV-RFP(参见Almazan，F.，et al.，PNAS(2000)975516-5521)。
转染和从cDNA克隆中收集感染性病毒在这个过程中使用了Almazan，F.，et al.，PNAS(2000)975516-5521中的方法。小鼠DBT细胞用pBAC-MHV-RFP转染。保温两天后，收集细胞上清液并在新鲜DBT细胞上传代六次。通过噬斑效价(plaque tritation)和RT-PCR来分析细胞上清液中存在的病毒。
RFP表达载体(参见，Yang，M.，Proc.NatL Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。从CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)购买pLNCX2载体。pLNCX2载体含有新霉素抗性基因，在真核细胞中可进行抗生素选择。在Egl II和Not I位点将红色荧光蛋白(RFP)(DsRed2，CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)插入到pLNCX2载体中。
RFP载体制备(参见，Yang，M.，Proc.Nail.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。为了进行逆转录病毒转导，从CLONTECH Laboratories购买了NIH3T3衍生的包装细胞系PT67，其表达10 Al病毒被膜。在补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-products，Calabasas，CA)的DME(IrvineScientific，Santa Ana，CA)中培养PT67细胞。为了制备载体，将70％满底的包装细胞(PT67)与DOTAPTM试剂(Boehringer Mannheim)的沉淀混合物，饱和量的pLEIN-GFP或pLNCX2-DsRed-2-RFP质粒一起保温18小时。此时补充新鲜培养基。在转染后48小时用荧光显微镜观察细胞。为进行选择，在500μg/ml-2000μg/ml的浓度渐增的G418存在的条件下培养细胞7天。
病毒-宿主相互作用的双色显像用重组冠状病毒感染GFP转基因小鼠后，将新鲜组织切成～1mm3的片。观察前，用胰蛋白酶/EDTA 37℃消化组织10分钟。用胰蛋白酶消化后，将组织放在预先洗干净的载玻片(FisherScientific，Pittsburgh，PA)上，盖上盖玻片(Fisher Scientific)。通过推盖玻片来挤压组织，使其变得足够薄，从而能在载玻片上显示完整的脉管系统。在荧光显微镜下很容易观察到被冠状病毒感染的发出GFP荧光的宿主细胞。可以用基于激光的系统对嵌和系统进行全身双色显像(whole-bodydual-color imaging)(见下文)。采用标准的免疫组织化学技术鉴定被RFP-MHV感染的所有宿主细胞类型可以证实所有的荧光结果。
荧光显像(参见，Yang，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)。利用配备50W汞灯能量供应的Leica荧光立体显微镜LZ12型来进行开始的低分辨率显像。为了使GFP和RFP荧光同时显像，用D425/60A带通滤波器和470DCXR分色镜来产生激发光。用长通滤波器(long pass filter)GG475(Chroma Technology，Brattleboro，VT)收集发射的荧光。在灯箱(light box)(Lightools Research，Encinitas，CA)中进行宏观显像。通过使用狭缝纤维光学的干涉滤光片(440+/-20nm)，在灯箱中激发GFP和RFP肿瘤发荧光。用520nm长通滤波器(long pass filter)观察荧光。来自显微镜和灯箱的图像用Hamamatsu C58103-芯片冷色(cool color)CCR相机(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)捕获。可以用SpectralPhysics模型3941-M1BB双重光子激光，Photon Technology Intl.模型GL-3300氮激光和Photon Technology Intl.模型GL-302染料激光来进行基于激光的显像。处理图像的对比度和亮度，用Image Pro Plus 4.0软件(MediaCybernetics，Silver Springs，Maryland)分析图像。直接将1024×724像素的高分辨率图像捕获在IBM PC上，或连续通过图像输出捕获在高分辨率SonyVCR模型SLV-R1000(Sony Corp.，Tokyo Japan)上。
多光子共聚焦显微镜(Wang，W.，etal.，Cancer Research(2002)6278-6288)。也可以在GFP荧光的最佳波长960nm，和Radiance 2000多光子系统(Bio-Rad，Hercules，CA)一起使用双重光子激光(Spectra-Physics model3941-M1BB)。用Bio-Rad′s Lasersharp 2000软件收集图像。激发仅限于被观察的光学切面。荧光基团的激发不出现在非焦点平面的960nm波长处。Spectral Physics模型3941-M1BB双重光子激光仪的辅助装置——Millenia，Tsunami TiSapphire激光仪具有长波长光学(超过1,000nm)用于RFP多光子显像。用Image Pro Plus 4.0软件处理图像。
光谱分辨率光谱显像是指产生每一个像素中都含有高分辨率光谱的图像，它“不混杂”病毒的RFP信号与GFP标记的宿主的信号。用冷单色(cooled monochrome)相机(Roper Scientific CCD thermo-cooled数字照相机)和位于常规低倍镜头前的液晶可调滤波器(CRI，Inc.，Woburn，MA)替代通常的彩色照相机可改良标准的GFP小鼠显像系统(长通发射滤波器)。通常，在500-650mm的范围内每10nm获取一系列图像，并将图像在内存中自动组合成光谱“堆”。利用预先确定的GFP或RFP以及自体荧光光谱，通过基于线性组合化学计量学的算法，可以将图像分解成不同的图像，得到只包含自体荧光信号或只包含GFP或RFP信号、在基本呈黑色的背景下可见的图像。应用光谱自体荧光消减，灵敏度由于信噪比的改进而增强。GFP或RFP标记的肿瘤模型所提供的优点，可通过使用波长选择性显像技术和对深部器官诸如肺的肿瘤的图像的分析(个人交流，Richard Levenson，CRI，Inc.，Woburn，MA)能进一步增强，其中所述肿瘤模型允许非侵入性、高选择性显像。
显像的深度本申请的一个目标就是在外部显现单个细胞或内部器官的病毒感染的细胞的显微集落。这种功率(power)的显像需要减少激发光和发射光的散射。用多光子或单光子激光在活体动物内可穿透更深。也可以和多光子激光一起联合使用共聚焦显微镜。大约为470nm的相对较长的激发光波长(GFP双光子为960nm和RFP双光子为大约1,220nm)不会损伤组织。多光子共聚焦系统将大大限制辐照区域，进一步保护宿主组织。皮瓣也能大大减少散射，而我们已经显示其能够进行外部单细胞显像。用长波长Ds-Red-2-RFP也能减少散射。
C.结果利用多种药物方案对感染小鼠进行治疗，在存在和不存在药物时，对病毒复制进行评价。能够成功减少病毒复制的药物被鉴定为可作为成功的候选治疗物质。
类似地，接受待测试免疫程序的小鼠在免疫后用感染水平的MHV冠状病毒攻击。然后评价暴露于病毒后受试者抵抗感染的能力。
权利要求
1.标记的冠状病毒蛋白或其片段，其与荧光蛋白偶联。
2.权利要求1所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述蛋白是结构蛋白或非结构蛋白。
3.权利要求2所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述结构蛋白选自核衣壳磷蛋白，棘突糖蛋白，膜糖蛋白，小被膜蛋白或血凝素-酯酶糖蛋白组成的组。
4.权利要求2所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述结构蛋白是SARS棘突糖蛋白(SEQ ID NO)。
5.权利要求2所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述结构蛋白是SARS小被膜蛋白(SEQ ID NO)。
6.权利要求2所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述结构蛋白是SARS基质蛋白(SEQ ID NO)。
7.权利要求1所述的标记的冠状病毒蛋白，其中所述荧光蛋白是绿色或红色蛋白。
8.感染的可显像动物模型，包含编码权利要求1-7任一项所述标记的冠状病毒蛋白的冠状病毒。
9.权利要求8所述的可显像动物模型，其是荧光蛋白表达型宿主。
10.权利要求9所述的可显像动物模型，其中所述动物模型包括表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠。
11.一种筛选抗病毒药物的方法，包括提供实验组动物和对照组动物，其中每一组的动物包含权利要求8-10任一项所述的动物模型；对实验组施用候选抗病毒药物；监测实验组和对照组产生的荧光发射；将实验组产生的荧光发射与对照组进行比较；以及选择能减少实验组中的荧光的候选抗病毒药物，所述减少是相对于对照组的减少。
12.一种筛选有效的抗病毒疫苗的方法，包括提供实验组和对照组动物，其中每一组的动物包含权利要求8-10任一项所述的动物模型；对实验组施用候选抗病毒疫苗；监测实验组和对照组产生的荧光发射；将实验组产生的荧光发射与对照组进行比较；以及，选择能减少实验组中的荧光的候选抗病毒疫苗，所述减少是相对于对照组的减少。
全文摘要
本发明描述了冠状病毒感染的可显像动物模型。
文档编号C07H21/04GK1829732SQ200480021811
公开日2006年9月6日 申请日期2004年5月27日 优先权日2003年5月27日
发明者杨萌, 徐明旭 申请人:抗癌公司