Cd20－结合多肽组合物的制作方法

专利名称：Cd20－结合多肽组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与CD20抗原结合的多肽组合物。更具体地，本发明涉及与人CD20抗原结合的多肽组合物和该组合物的使用方法。这些多肽组合物包括嵌合抗体、抗体片段以及抗体或抗体片段与细胞因子的融合蛋白。
背景技术：
在很多情况下，治疗蛋白质的功效受限于对治疗蛋白质的不需要的免疫反应。一些鼠单克隆抗体有望用于许多人类疾病的治疗，但在某些情况下由于诱导了显著程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而失败(Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535)。对于单克隆抗体，已经发展了大量试图减弱HAMA应答的技术(WOA8909622、EPA0239400、EPA0438310、WOA9106667、EPA0699755)。这些重组DNA方法一般在减少最终的抗体构建体中的鼠遗传信息的同时增加最终构建体中的人遗传信息，以产生通常称为“人源化”抗体的抗体分子。
多数情况下人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受者的高变区残基被非人物种(如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物)来源的高变区残基(供体抗体)取代，该方法有时称为“CDR嫁接”。通常用相应的非人残基取代人免疫球蛋白额外的Fv构架区(FR)，一些情况下还进行其他替换以进一步恢复抗体功能。一般将人源化抗体重建到含有两个可变区的完整抗体分子中，其中全部或基本全部的高变环对应于非人免疫球蛋白，而全部或基本全部的FR区为人免疫球蛋白序列。人源化抗体通常还含有人源免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分(Jones等(1986)，Nature 321522-525；Reichmam等(1988)，Nature 332323-329)。尽管如此，在一些情况下人源化抗体仍然会在患者中引发免疫应答(Issacs J.D.(1990)Sen.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420)。
诱导免疫应答的关键是蛋白质内存在能够通过呈递于第二类MHC分子而刺激T细胞活性的多肽，即所谓“T细胞表位”。这类T细胞表位通常定义为具有结合第二类MHC分子能力的任一氨基酸残基序列。无疑地，“T细胞表位”指当与MHC分子结合时能被T细胞受体(TCR)识别的表位，并且其(至少原则上)能够通过与TCR衔接引起这些T细胞的活化，以促进T细胞应答。
第二类MHC分子是在辅助T细胞的选择和活化中起中心作用的一组高多态性蛋白质。人白细胞抗原组DR(HLA-DR)是该组蛋白质的主要同种型，同种型HLA-DQ和HLA-DP表现相似的功能。在人种群中，个体携带二到四个DR等位基因、两个DQ和两个DP等位基因。已经解出了大量DR分子的结构，表现为具有大量疏水口袋的开口的肽结合沟(Brown等Nature(1993)36433；Stern等(1994)Nature 368215)，所述疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)衔接。标明不同同种异型第2类分子的多态性造成了肽结合沟内肽的不同结合表面的广泛多样性，并在种群水平保证了识别异种蛋白质和引起对病原生物的免疫应答的最大灵活性。
对治疗蛋白质的免疫应答通过第二类MHC肽呈递途径发生。这时外源蛋白质被吞入并加工以进行与DR、DQ或DP型第二类MHC分子相关的呈递。第二类MHC分子由专职抗原呈递细胞(APC)表达，所述细胞如巨噬细胞和树突细胞等。第二类MHC肽复合物与T细胞表面的相关T细胞受体的接合以及与某些其他共同受体(如CD4分子)等交叉结合可以在T细胞中诱导活化态。活化引起细胞因子的释放，这些因子进一步活化其他淋巴细胞(如B细胞)产生抗体或作为完全细胞免疫应答而活化T杀伤细胞。
T细胞表位鉴定是表位消除的第一步。可以通过恰当的氨基酸替换或其他修饰策略消除鉴定出的表位。这样的方法在WO98/52976和WO00/34317中得到了认可，其中后者描述了以计算穿引技术(computational threading technique)作为鉴定可能与人第二类MHC DR同种型亚组结合的多肽序列的方法，并通过目的蛋白质内的氨基酸替换去除预测的T细胞表位。
在一个给定的(原则上为有治疗价值的)但本来为免疫原性的肽、多肽或蛋白质中鉴定和去除或至少减少T细胞表位可能是需要的。这些有治疗价值的分子之一是对人B细胞抗原CD20具有结合特异性的单克隆抗体。本发明优选地单克隆抗体为抗体2B8和Leu16的修饰形式。抗体2B8描述于U.S专利NO.5,736,137，其公开内容在本文中引入作为参考。抗体Leu16描述于Wu等Protein Engineering(2001)141025-1033，其公开内容在本文中引入作为参考。
CD20是35000道尔顿的非糖基化磷蛋白，一般命名为人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35B。该蛋白质是表达于前B和成熟B细胞(包括90％以上的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)B细胞)的高度细胞特异性表面分子。靶向CD20的单克隆抗体和放射性免疫缀合物已经作为NHL的新疗法出现。最重要的实例包括本发明的亲本抗体，即单克隆抗体2B8(Reff，M.E.等(1994)Blood 83435-445)。已经克隆了2B8的可变区结构域并与人恒定区结构域组合以产生命名为C2B8的嵌合抗体，所述嵌合抗体在美国称为RITUXANTM上市，在欧洲称为MABTHERA(利妥希玛)上市。C2B8已经公认为是对于NHL和其他B细胞疾病的治疗有价值的治疗剂(Maloney，D.G.等(1997)J.Clin.Oncol.153266-3274；Maloney，D.G.等(1997)Blood 902188-2195)。
抗CD20治疗的其他实例由抗体B1提供，述于US专利NO.6,090,365。类似地，该抗体已经获准用于NHL治疗，尽管在这种情况下分子(BEXXARTM)是131I放射性免疫缀合物。天然B1(非缀合的)抗体可用于淋巴瘤和耐受性白血病的自体骨髓移植治疗的离体清除疗法(Puryingregimen)中(Freedman，A.S.等(1990)，J.Clin.Oncol.8784)。
尽管有成功的抗体如C2B8(利妥希玛)和BEXXARTM，仍然需要具有增强特性的抗CD20类似物。尤其需要在施用于人受试者时增强体内特征。为此非常需要提供在人受试者中减弱或缺乏诱导免疫应答潜能的抗CD20抗体。这些蛋白质将在人受试者中表现出增加的循环时间，并在长期使用(如抗CD20分子的治疗用途)中特别有益。本发明提供在体内显示增强特性的修饰的抗CD20抗体。
发明概述本发明提供与CD20抗原(优选人CD20抗原)结合的多肽组合物。CD20组合物含有一个或多个抗CD20重链和/或轻链可变区多肽片段，所述片段可以是选自抗CD20抗体2B8重链可变区(Vh)的修饰形式、抗CD20抗体2B8轻链可变区(Vk)的修饰形式、抗CD20抗体Leu16重链可变区(Vh)的修饰形式和抗CD20抗体Leu16轻链可变区(Vk)的修饰形式的多肽。修饰的Vh和Vk多肽通过2B8和Leu16Vh和/或Vk区天然序列中一个或多个氨基酸残基的替换区别于抗体的天然Vh或Vk区。相对于天然2B8和Leu16抗体Vh或Vk区的免疫原性，Vh或Vk多肽的氨基酸残基替换赋予本发明的Cd-20结合组合物较低水平的免疫原性。
本发明结合CD20的多肽组合物含有至少一个选自以下的多肽片段具有SEQ ID NO1(2B8抗体的Vh)的氨基酸残基序列，但在SEQ IDNO1中含有选自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一个氨基酸残基替换的多肽；具有SEQ ID NO4(2B8抗体的Vk)的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO4中含有选自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的的多肽；具有SEQ ID NO9(Leu16抗体的Vh)的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO9中含有选自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一个氨基酸残基替换的多肽；具有SEQ ID NO11(Leu16抗体的Vk)的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO11中含有选自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的多肽。
本文和附加的权利要求书中使用的氨基酸残基替换的命名通过列出序列中的天然氨基酸残基的单字母代码，然后是该残基的位置编号(下标)，然后是取代该天然氨基酸的氨基酸残基的单字母代码。因此SEQ ID NO4中的替换L11I指SEQ ID NO4(从N端编号)中位置11的亮氨酸(L)被异亮氨酸(I)取代(即替换)。
优选本发明结合CD20的多肽组合物对人CD20抗原的结合亲和力与单克隆抗体2B8或Leu16对人CD20的结合亲和力相当或更强。
本发明优选地实施方案包括多肽片段例如含有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的本文称为VhC的重链，SEQ ID NO2QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWTGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA；含有SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的本文称为VhD的单克隆抗体V区重链，SEQ ID NO3QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA；含有SEQ ID NO10的氨基酸残基序列本文称为VhY的单克隆抗体V区重链，SEQ ID NO10EVQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGTGTTVTVSS。
本发明其他优选地实施方案包括多肽片段例如含有SEQ ID NO5的氨基酸残基序列本文称为VkA的单克隆抗体V区轻链，SEQ ID NO5QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSASYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；
含有SEQ ID NO6的氨基酸残基序列的本文称为VkB的单克隆抗体V区轻链，SEQ ID NO6QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO7的氨基酸残基序列的本文称为VkC的单克隆抗体V区轻链，SEQ ID NO7QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO8的氨基酸残基序列的本文称为VkD的单克隆抗体V区轻链，SEQ ID NO8QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO12的氨基酸残基序列的本文称为VkZ的单克隆抗体V区轻链，SEQ ID NO12DIVLTQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK。
本发明提供了对人CD20阳性B细胞疾病的治疗具有治疗潜力的多肽组合物。本发明结合CD20的多肽组合物可以是以下形式完整抗体、Fab片段或含有完整抗体和细胞因子的融合蛋白、抗体片段和细胞因子的融合蛋白，或结合CD20抗原的任何其他形式。
本发明结合CD20的多肽组合物优选包含共同结合CD20抗原的重链(Vh)抗CD20抗体可变区和轻链(Vk)抗CD20抗体可变区的组合。Vh/Vk组合可以装配为完整抗体、Fab片段或含有完整抗体和细胞因子的融合蛋白、抗体片段或细胞因子的融合蛋白或与CD20抗原结合的任何其他构型。在另一个优选的实施方案中，V区通过多肽主链彼此连接。
优选地，本发明结合CD20的多肽组合物包含装配为完整抗体的Vh和Vk多肽，所述抗体包含轻链恒定区和重链CH1、CH2和CH3结构域。另外，Vh和/或Vk多肽可以装配成Fab片段或具有CH3结构域但缺少CH2结构域的“微型抗体”(参阅例如Wu等，US 5,837,821)。另外，Vh和Vk多肽可以通过接头彼此连接以形成“单链Fv”抗体分子。在一组优选地实施方案中，将人恒定区与结合CD20的Vh和Vk多肽组合。这些恒定区包括来自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型免疫球蛋白。当结合CD20的多肽组合物中包含CH2结构域时，优选包括人IgG结构域，如IgG1 CH2结构域。其他优选地实施方案缺少见于IgGCH2结构域的N-连接的寡糖糖基化位点。优选通过突变相关的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸或毗邻的氨基酸或用酶如(PNGase F)处理含有CH2的蛋白质以除去寡糖来设计缺失N-连接糖基化位点。
优选地Vh和Vk区组合包括含有重链V区VhC(SEQ ID NO2)和轻链VkA(SEQ ID NO5)的多肽组合物；含有重链V区VhC(SEQ IDNO2)和轻链V区VkB(SEQ ID NO6)的多肽组合物；含有重链V区VhC(SEQ ID NO2)和轻链V区VkC(SEQ ID NO7)的多肽组合物；含有重链V区VhC(SEQ ID NO2)和轻链V区VkD(SEQ ID NO8)的多肽组合物；含有重链V区VhD(SEQ ID NO3)和轻链V区VkB(SEQID NO6)的多肽组合物；含有重链V区VhD(SEQ ID NO3)和轻链V区VkD(SEQ ID NO8)的多肽组合物和含有重链V区VhY(SEQ ID NO10)和轻链V区VkZ(SEQ ID NO12)的多肽组合物。
本发明的一个优选地多肽组合物包括抗体2B8的V区重链(SEQ IDNO1)，其中包括在SEQ ID NO1中一个或多个选自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的氨基酸残基替换。
另一个优选地多肽组合物含有抗体2B8的V区轻链(SEQ ID NO4)，所述轻链经修饰以在SEQ ID NO4中包含选自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的一个或多个氨基酸残基替换。

图16以下划线标出了优选地氨基酸残基替换的位置。
另一个优选地本发明结合CD20的多肽组合物包括抗体Leu16的V区重链(Vh)(SEQ ID NO9)，所述轻链经修饰以在SEQ ID NO9中包含选自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的一个或多个替换。
另一个优选地本发明多肽组合物包括抗体Leu16的V区轻链(Vk)(SEQ ID NO11)，所述轻链经修饰以包含L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L中的一个或多个氨基酸残基替换。图16以下划线标出了优选地氨基酸残基替换的位置。
本发明结合CD20的多肽组合物还包括具有一个或多个抗CD20抗体重链V区的组合物，所述重链V区含有选自SGAELKKPGAS(SEQ ID NO15)、VSCKASGYT(SEQ ID NO16)、LEWTGAIY(SEQ ID NO17)、YNQKFKGKT(SEQ ID NO18)、FKGKTTLTA(SEQ ID NO19)、YMELSSLRS(SEQ ID NO20)、SSLRSEDTAV(SEQ ID NO21)、和DWGTGTTVT(SEQ ID NO22)的多肽片段。
类似地，本发明结合CD20的多肽组合物还包括具有一个或多个抗CD20抗体轻链V区的组合物，所述轻链V区含有选自IITASPGEKV(SEQ ID NO23)、CRASTSASY(SEQ ID NO24)、QQKPTSSP(SEQ ID NO25)、LASGVPSRF(SEQ ID NO26)、FSGSGSGTT(SEQ ID NO27)、和YSMTISSLE(SEQ ID NO28)的多肽片段。
例如，V区重链和轻链可以装配为完整抗体、抗体片段、抗体与细胞因子的融合蛋白、抗体片段-细胞因子融合蛋白、Fab分子、单链Fv分子和微型抗体。优选地，CD20结合组合物装配为完整抗体，更优选含有具IgG重链恒定区同种型的人恒定区的抗体、最优选包含IgG1重链恒定区并具有完整的效应子功能、如抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。
在另一优选地实施方案中，CD20结合组合物装配为抗体-细胞因子融合蛋白，优选包含具IgG1同种型的人恒定区并具有完整效应子功能，如抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性。在这些优选地抗体-细胞因子融合蛋白中，可以有用地包含白细胞介素(如白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18)、血细胞生成因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、红细胞生成素)、肿瘤坏死因子(TNF)(如TNFα)、淋巴因子(如淋巴细胞毒素)、代谢过程调节剂(如瘦素)、干扰素(如干扰素α、干扰素β和干扰素γ)或趋化因子。优选地，本发明的抗体-细胞因子融合蛋白表现细胞因子的生物学活性(例如刺激免疫细胞，如T细胞或B细胞)。
本发明的多肽组合物具有多种有用的生物学特性，包括结合人B细胞的能力；结合CD20抗原的能力；相对于抗体Leu16、2B8或1H4降低的免疫应答能力；针对B细胞增殖紊乱(如非白血病、淋巴瘤、类风湿性关节炎)和其他自身免疫疾病的活性。本发明结合CD20的多肽组合物的诊断用途也在考虑中，所述用途中组合物可以是全长抗体、抗体片段(例如F(ab’)2)、放射性标记的抗体、固定抗体或与缀合异源化合物的抗体。这些诊断方法可以用于检测呈递CD20的细胞的存在，纯化或分离呈递CD20的细胞等等。
本发明还提供含有的如上文定义的CD20结合组合物连同可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物，以及产生该多肽组合物的方法。
附图简述图1以单字母代码显示2B8抗体V区重链蛋白质天然氨基酸残基序列和基于天然序列的修饰的氨基酸残基序列VhC和VhD。
图2以单字母代码显示2B8抗体V区轻链蛋白质天然氨基酸残基序列和基于天然序列的修饰的序列VkA、VkB、VkC和VkD。
图3以单字母代码显示Leu16Vh重链可变区和命名为VhY的修饰的Leu16Vh区的氨基酸残基序列。
图4以单字母代码显示Leu16Vk轻链可变区和命名为VhZ的修饰的Leu16Vk的氨基酸残基序列。
图5为实施例3中描述的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)裂解测定的图示表示。测试的蛋白质为嵌合Leu16抗体(chLeu16；实心三角)、chLeu16和IL2的融合蛋白(chLeu16-IL2；实心方块)、LeuVhY/VkZ-IL2融合蛋白(实心方块)、嵌合2B8抗体(C2B8，实心圆)、C2B8-IL2融合蛋白(空心方块)和非靶向CD20的KS-IL2免疫细胞因子融合蛋白(空心圆)。X轴浓度(ng/ml)；Y轴裂解百分比。
图6展示结合CD20的多肽组合物和免疫细胞因子(IC)的抗CD20结合能力。将人Daudi淋巴瘤细胞与不同浓度的多肽组合物和IC孵育并如实施例2所述通过流式细胞术评估细胞的相对结合。图6A显示平均荧光强度(MFI，Y轴)，其作为多肽浓度(X轴)的函数增长。图6B显示以下测量的荧光强度不呈递初级抗原的Daudi细胞样品(最左边的峰)、针对Daudi细胞中不表达的EGF受体的抗体-IL2融合物(左边中间的峰)和Leu16VhY/VkZ-IL2(最右边的峰)。X轴10μg/ml的荧光强度；Y轴事件数目。
图7展示抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。图7A和7B显示与图5相比独立的ADCC测试。在使用51Cr标记的Daudi靶细胞和人PBMC作为效应器(E∶T＝100)的4小时测定法中测定ADCC。图7A测试的抗体为2B8(实心圆)、chLeu16(实心菱形)和Leu16VhY、VkZ(空心三角)。图7B测试的免疫细胞因子为chLeu16-IL2(实心方块)和Leu16VhY/VkZ-IL2(实心三角)、去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(X)和作为非结合对照的huKS-IL2(空心圆)。Y轴裂解百分比，X轴浓度(ng/ml)。
图7C显示如实施例4所述使用51Cr标记的Daudi细胞和人血浆作为补体来源的CDC活性。使用相同的抗体和免疫细胞因子孵育1小时。测试的抗体为2B8(实心圆)、chLeu16(实心菱形)、chLeu16-IL2(实心方块)和Leu16VhY/VkZ-IL2(实心三角)和作为非结合对照的huKS-IL2(空心圆)。
图8展示如实施例5所述的消除表位的Leu16免疫细胞因子在小鼠中的药代动力学。每种免疫细胞因子的静脉(i.v.)给药后进行时间-浓度分析。通过检测完整形式的天然(实心方块)和去糖基化的蛋白质(空心圆)的ELISA测定血清浓度。对小鼠注射25mg标明的免疫细胞因子，通过后眼眶采血取样并通过用抗人IgG H&L抗血清捕获和抗人IL2抗体检测进行测定。以每个小鼠注射后立刻采集的血清中的起始浓度将结果标准化。X轴小时。Y轴残留ID的百分比。
图9显示SCID小鼠中的抗肿瘤模型评估。对SCID小鼠静脉注射2×106个CD20+Daudi淋巴细胞，接着从第3天(图9A)或第7天(图9B)开始连续5天每天注射免疫细胞因子。使用高剂量的EGFR特异性非靶向对照免疫细胞因子425-IL2展示由于改变的IL-2半衰期导致的不完全活性。图9A的处理在第3、4、5、6和7天进行，包括只有PBS(实心菱形)、425-IL2(暗的X)和5微克(mcg)(亮的X)、10mcg(实心三角)和20mcg(实心方块)每日剂量的Leu16VhY/VkZ-IL2。在图9A中，后三个剂量都显示出对小鼠的完全保护，且数据点是重叠的。图9B的处理在第7、8、9、10和11天进行，包括只有PBS(实心菱形)和5mcg(浅色X)和20mcg(实心方块)每日剂量的Leu16VhY/VlcZ-IL2。X轴天数，Y轴存活百分比。
图10显示SCID小鼠中抗肿瘤模型评估的结果(2B8与chLeu16-IL2)；对SCID小鼠注射Daudi淋巴瘤细胞并如图9所述在7天后开始用标明的抗体或免疫细胞因子进行处理。处理包括只有PBS(X，第7-11天)、利妥希玛(C2B8，实心圆，第7、9和11天25mg/kg)、高剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(大方块、第7-11天1mg/kg)、低剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(小方块，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠(B)存活小鼠，X轴天数，Y轴健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
图11显示SCID小鼠中抗肿瘤模型评估的结果(chLeu16-112对去免疫的(DI)-Leu16-IL2)。对SCID小鼠注射Daudi淋巴瘤细胞并如图9所述在7天后开始用标明的抗体或免疫细胞因子处理。处理包括只有PBS(交叉X，第7-11天)、利妥希玛(实心圆，第7、9和11天25mg/kg)、高剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(大方块、第7-11天1mg/kg)、低剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(小方块，第7-11天0.25mg/kg)、高剂量chLeu16-IL2(大三角，第7-11天1mg/kg)和低剂量chLeu16-IL2(小三角，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠，(B)存活小鼠。X轴天数，Y轴健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
图12展示ADCC活性的丧失只对Leu16VhY/VKZ-IL2介导的抗肿瘤活性具有部分影响(DI-Leu16-IL2对去糖基化DI-Leu16-IL2)。如图9所述在注射Daudi淋巴瘤细胞后7天用两种不同剂量的天然的和酶去糖基化的Leu16VhY/VKZ-IL2处理SCID小鼠。处理包括只有PBS(交叉X，第7-11天)、利妥希玛(实心圆，第7、9和11天25mg/kg)、高剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(大三角、第7-11天1mg/kg)、低剂量Leu16VhY/VkZ-IL2(小三角，第7-11天0.25mg/kg)、高剂量去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(粗线的大X，第7-11天1mg/kg)和低剂量去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(细线的小X，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠，(B)存活小鼠。X轴天数，Y轴健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
图13说明抗原特异性对最佳抗肿瘤活性非常重要。通过比较DI-Leu16-IL2和对在Daudi淋巴瘤细胞中只有低水平表达的分子——EGFR具有结合特异性的另一个免疫细胞因子的活性来测试肿瘤细胞靶向的作用。处理包括只有PBS(X，第7-11天)、利妥希玛(实心菱形，第7、9和11天25mg/kg)、DI-Leu16抗体(空心菱形，第7、9和11天，25mg/kg)、中等剂量DI-Leu16-IL2(实心方块，第7-11天，1mg/kg)、降低剂量的DI-Leu16-IL2(空心圆，第7和10天，1mg/kg)、低剂量DI-Leu16-IL2(空心方块，第7-11天，0.25mg/kg)和中等剂量抗EGFR-IL2(实心三角，第7-11天，1mg/kg)。结果以无疾病存活率进行评分。X轴天数，Y轴无疾病百分比。
图14说明Leu16VhY/VkZ-IL2比组合游离IL-2的高剂量抗CD20抗体更有效。将中等剂量的Leu16VhY/VkZ-IL2(实心方块，第7-11天，20mg/小鼠)和相应剂量的单体抗体及IL-2组分(空心方块，第7-11天静脉给药16.7mg Leu16VhY、VkZ和3.3mg IL-2)的抗肿瘤活性与高剂量利妥希玛和皮下(s.c.)给药IL-2(空心菱形，第7天500mg利妥希玛和第7、9和11天，10mg IL-2)、仅利妥希玛(实心菱形，第7天，500mg)或PBS对照进行比较。X轴天数，Y轴无疾病百分比。
图15说明正常抗CD20+B细胞的存在没有消除Leu16VhY/VkZ-IL2的抗肿瘤活性。如在方法中所述，在同一SCID/Daudi淋巴瘤模型中测试了先前植入的正常CD20+B细胞的效果。用单独的高剂量利妥希玛(菱形，第7天，25mg/kg)、Leu16VhY/VkZ-IL2(方块、第11-15天，1mg/kg)、两种给药方案的组合(三角、第7天为利妥希玛，接着第11-15天为Leu16VhY/VkZ-IL2)或者在全部给药日中仅使用PBS。处理小鼠组。半数组在第5天被静脉注射4.5×106个PBMC(空心符号)或仅接受PBS(实心符号)通过测量所有小鼠血清中的人抗体水平确认B细胞的植入。X轴天数，Y轴无疾病百分比。
图16显示抗CD20抗体2B8、Leu16和1H4的重链和轻链V区以及2B8表位消除的衍生物V区(VhC、VhD、VkA、VkB、VkC和VkD和表位消除Leu16V区VhY和VkZ的比对。
图17显示本申请中使用的所有序列标识号(SEQ ID NO1-43)的概述。
优选实施方案详述本文及附带权利要求书中使用的术语“多肽组合物”指单链多肽以及多链多肽，所述多链多肽中多肽链彼此化学结合，如通过一条链中的半胱氨酸残基和另一条链中的半胱氨酸残基间的一个或多个二硫键、通过酯键、酰胺键或任何其他适当的连接。
结合CD20的多肽组合物含有至少一个选自以下的多肽片段具有SEQ ID NO1的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO1中含有选自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一个氨基酸残基替换的修饰的重链可变区多肽(Vh)；具有SEQ ID NO4的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO4中含有选自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的修饰的轻链可变区多肽(Vk)；具有SEQ ID NO9的氨基酸残基序列，但在SEQID NO9中含有选自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一个氨基酸残基替换的修饰的Vh；和具有SEQ ID NO11的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO11中含有选自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的修饰的Vk。
优选地，结合CD20的多肽组合物包括至少一个具有选自SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO15和SEQ ID NO28的氨基酸残基序列的多肽片段。
在优选地实施方案中，结合CD20的多肽组合物含有修饰的重链可变区多肽和修饰的轻链可变区多肽。更优选地，结合CD20的多肽组合物为嵌合抗体的形式并且还包括人重链恒定区和人轻链恒定区。优选地人重链恒定区为IgG恒定区，更优选IgG1恒定区。人轻链恒定区优选为人κ轻链恒定区。本发明结合CD20的多肽组合物的另一优选实施方案为含有多肽组合物的融合蛋白，所述多肽组合物包含如前述与细胞因子融合的修饰的重链或轻链可变区片段。优选地细胞因子为IL2。
本发明结合CD20的多肽组合物的另一优选实施方案为如前述包含至少一个修饰的Vh或修饰的Vk片段的抗体分子，如Fab抗体片段、单链Fv抗体片段或微型抗体。
特别优选地结合CD20的多肽组合物含有至少一个具有选自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的Vh多肽片段。
另一特别优选地结合CD20的多肽组合物含有至少一个具有选自SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸残基序列的Vk多肽片段。
更优选地，结合CD20的多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2、SEQID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的Vh多肽片段和具有选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ IDNO12的氨基酸残基序列的Vk多肽片段。
其他优选地本发明结合CD20的多肽组合物含有选自以下的修饰的Vh和修饰的Vk片段的组合(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO5的氨基酸残基序列的Vk片段；(b)具有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO6的氨基酸残基序列的Vk片段；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO7的氨基酸残基序列的Vk片段；(d)具有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO8的氨基酸残基序列的Vk片段；(e)具有SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO6的氨基酸残基序列的Vk片段；(f)具有SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO8的氨基酸残基序列的Vk片段；和(g)具有SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO12的氨基酸残基序列的Vk片段。
本发明的另一方面为含有与可药用载体、赋形剂、稀释剂共存的本发明结合CD20的多肽组合物的药物组合物。药物组合物也可以包含额外的药理学效应药物。
公开的序列来自对在本文中称为“亲本”抗体的小鼠单克隆抗体2B8和Leu16V区序列的分析，关于所述抗体体外和体内的效用在US专利NO.5,736,137、US专利NO.5,776,456、US专利NO.6,399,061、US专利NO.6,455,043和外国等价物，以及Wu等(Protein Enginering(2001)141025-1033)及其参考文献中完全公开。
以鉴定在人类中能作为第二类MHC配体并因而发挥T细胞表位功能的序列中所含有的多肽为导向进行序列分析。本发明目的是提供亲本抗体的改进形式。因此对可能的第二类MHC表位位置的认识是改造过程中重要的第一步。按照本文中整体引为参考的WO 02/069232中详细描述的方案，用计算机进行表位鉴定。第一步之后，本发明人惊奇的发现了满足所有在亲本抗体中引入所需修饰的若干不同标准的氨基酸替换组。
亲本抗体V区内的替换组产生具有降低第二类MHC配体数的多肽，因而降低了多肽作为T细胞表位的可能。同样地，所述替换组使多肽序列保持了亲本抗体的结构和功能特性，对于在宿主细胞中保持并稳定表达所特别需要的两种特性而言确是如此，多肽序列还保留了特别重要的结合人CD20抗原、特别是体外结合人B细胞的能力。
值得注意的是，尽管为独立来源，2B8和Leu16以及抗CD20抗体B1的Vh和Vk氨基酸残基序列非常相似。不限于任何理论的，本发明的见解如下。CD20胞外小肽的一部分，侧翼为可能形成二硫键的半胱氨酸的人CD20中的序列CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO29)相应于小鼠CD20中的序列CEPSNSSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO38)。小鼠NSS序列可能是N连接的糖基化位点，而人中相应的NPS序列可能不是N连接的糖基化位点。小鼠和人CD20序列中的该差异将从鼠免疫系统的有利位置中揭示人序列中的表位。因此可以对所有针对人CD20产生的小鼠抗体进行选择以识别非常精细限定的表位，对此可能存在一个小鼠V区的最优组。
因此本发明提供一组对识别人CD20重要的免疫原性减弱的共同V区序列。例如在重链中，本发明的修饰重链中的序列片段VSCKASGYT(SEQID NO16)在与CD20结合的抗体中是有用的；具体而言，该片段比来自2B8和Leu16抗体的相应片段MSCKASGYT(SEQ ID NO30)具有更低的免疫原性。类似地，序列YNQKFKGKT(SEQ ID NO18)、FKGKTTLTA(SEQ ID NO19)和YMELSSLRS(SEQ ID NO20)在CD20抗体中是有用的，并比见于亲本2B8和Leu16抗体的相应序列YNQKFKGKA(SEQ ID NO31)、FKGKATLTA(SEQ ID NO32)和YMQLSSLRS(SEQ ID NO33)具有更低的免疫原性。
对轻链而言，本发明的修饰轻链中的序列片段IITASPGEKV(SEQ IDNO23)在与CD20结合的抗体中是有用的，具体而言，该片段比来自亲本2B8和Leu16抗体的相应片段ILSASPGEKV(SEQ ID NO34)具有更低的免疫原性。类似地，序列LASGVPSRF(SEQ ID NO26)、FSGSGSGTT(SEQ ID NO27)和YSMTISSLE(SEQ ID NO28)在CD20抗体中是有用的，并比见于亲本2B8和Leu16抗体的序列LASGVPVARF(SEQ ID NO35)、FSGSGSGTS(SEQ ID NO36)和YSLTISRVE(SEQ ID NO37)具有更低的免疫原性。
本文及附带的权利要求书中使用的“基本非免疫原性”或“减弱的免疫原性潜能”包括与副本或“亲本”抗体(即非修饰的鼠或嵌合单克隆抗体，如2B8或Leu16)相比较减弱的免疫原性。术语“免疫原性”包括引发、诱导或促进宿主动物(特别是人)中体液和/或T细胞介导的应答的能力。
术语“抗体分子”指能够与抗原组合、相互作用或结合的免疫球蛋白家族的多肽，包括完整抗体。
本文中使用的术语“抗原”指能够与抗体分子相互作用的物质，在本发明上下文中指CD20。本发明的CD20是人CD20或呈现抗体2B8的抗原的任何CD20。CD20可以是可溶的CD20衍生物或膜结合的CD20。
本文中使用的术语“免疫球蛋白”指由一个或多个基本由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定区基因和天然的多种免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白的一种天然形式是含有两个相同的配对的四聚体，其中每个配对有一条轻链和一条重链。每个配对中重链和轻链可变区共同提供能与抗原相互作用的结合表面。本文中使用的术语Vh指重链可变区，本文中使用的术语Vk指轻链可变区且在该情况下众多单克隆抗体共同轻链普遍为“κ”型链。
V区包括来自“互补性决定区”或“CDR”(即如Kabat等(Kabat等，《Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版。Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))所定义的轻链可变结构域的约24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)氨基酸残基和重链可变结构域的约31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基)的氨基酸残基。CDR的其他定义也为本领域所公认，例如按照Chothia(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196901-917)的方案，CDR见于轻链中的约26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)氨基酸残基和重链中的约26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基。“构架”或“FR”残基为如本文中定义的CDR残基之外的V区残基。
本文中使用的Vh指序列与本文中任一指定的Vh链相应的、长度约为110到125个氨基酸残基的多肽，所述多肽与Vk的组合后能够结合人CD20。类似地，Vk指序列与本文中任一特定的Vk链相应的长度约为95-130个氨基酸残基的多肽，所述多肽与Vh组合后能够结合人CD20。全长免疫球蛋白重链分子量约为50kDa，N端由Vh基因编码，C端由恒定区基因之一编码。类似地，全长轻链分子量约为25kDa，N端由V区基因编码，C端由恒定区基因编码。
除了完整抗体(四聚体)以外，免疫球蛋白还以从应用重组DNA技术或蛋白质化学得来的大量其他形式存在。这些形式包括例如Fv、Fab、Fab’和(Fab)2分子并且都可以含有本发明的任一Vh或Vk序列。其他实例可以包括“双特异”抗体，即含有与具有不同抗原特异性的另一Vh/Vk组合相组合的本发明Vh/Vk组合。
本文及附带的权利要求书中使用的术语“T细胞表位”指能够结合第二类MHC、能够刺激T细胞和/或与第二类MHC形成复合物后还能结合(不一定显著激活)T细胞的氨基酸序列。
本文及附带的权利要求书中使用的术语“肽”为包括两个或及更多氨基酸残基的化合物。氨基酸残基通过(下文定义的)肽键彼此连接。有20种通用的天然存在氨基酸与肽的生物产生相关，任何数量的所述氨基酸可以以任何顺序连接形成肽链或环。肽的生物产生中使用的天然存在氨基酸都是L-构型。也可以使用常规合成方法利用L-氨基酸以及D-氨基酸或两种构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。有些肽只含有少量氨基酸残基。例如具有小于十个氨基酸残基的短肽有时称为“寡肽”。其他肽含有大量氨基酸残基例如多至100或更多，称为“多肽”。
约定俗成地，“多肽”可以认为是含有三个或更多氨基酸残基的肽链，而“寡肽”通常认为是“短”多肽的特殊类型。因此，本文中提到的任何“多肽”应该理解为也包括寡肽。另外，任何时候提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸残基的每种不同排列形成不同的多肽或蛋白质。可以形成的多肽的数量(以及由此产生的不同蛋白质的数量)实际上是无限的。
术语“肽组合物”指至少含有一个来自抗CD20抗体(优选为2B8和Leu16)的多肽的组合物。多肽可以以单链(例如重链或其部分，轻链或其部分或单链Fv)或二聚体形式存在。二聚体形式可以是完整抗体、Fab片段、微型抗体或任何双链分子，其中单链仅通过一条化学键连接。组合物可以只含有若干不通过化学或半胱氨酸键连接的单链多肽。
本发明还涉及抗CD20单克隆抗体，其中在分子V区内的位置引入了至少一个氨基酸残基的替换，以使蛋白质中一个或多个可能的T细胞表位的活性显著降低或消失。最优选提供这样的修饰抗体分子，其中在亲本分子免疫原性最强的区域内进行氨基酸修饰(例如替换)。本发明主要优选地实施方案含有修饰的抗体分子，其中改变了任何第二类MHC配体以消除结合或减少肽可以结合的MHC同种异数目。为了消除T细胞表位，在预测能够实现显著降低或消除T细胞表位活性的肽序列中的适当位点进行氨基酸替换。实际上适当的位点优选等同于在第二类MHC分子结合沟内提供的口袋之一中结合的氨基酸残基。
最优选在豁口的第一个口袋内肽的所谓P1或P1锚位置改变结合。肽的P1锚残基和第二类MHC结合沟的第一个口袋的结合相互作用的质量公认是整个肽的总体结合亲合力的主要决定因素。在肽的该位置的适当的替换是用不容易适应口袋的残基进行的，例如替换为更亲水的残基。肽中等同于结合MHC结合豁口中其他口袋区域内的氨基酸残基也在考虑中，并属于本发明的范围。
应该理解在给定的潜在T细胞表位中的单个氨基酸替换是消除表位的最优途径。可以考虑单个表位内替换的组合，例如当单独定义的表位彼此重叠时特别适用。另外，可以不在等同于关于二类MHC结合沟的“口袋残基”的位置，而在肽序列中的任何位点进行给定表位中的单个氨基酸替换或与单个表位内组合的氨基酸替换。所有这样的替换都属于本发明的范围。
本发明的修饰抗体分子的重要的和有意义的特征是它们保留了非修饰亲本抗体的功能性活性。因此特别需要产生表现亲本非修饰抗体中与治疗效力相关的全部有益技术特征的修饰抗体或修饰抗体分子。这与本发明设想的用途相关，即提供在大量人类重要疾病中具有治疗效果的组合物，所述疾病尤其是包括B细胞淋巴瘤和其他B细胞介导的病症。这样的治疗用途是本发明优选地实施方案。
因此，本发明的修饰抗体分子对其靶抗原表现的亲合力与亲本抗体表现的亲合力相似。因此该抗体分子识别CD20阳性人B细胞。亲本分子的治疗效力认为是通过抗体诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力来介导。抗体恒定区(即Fc结构域)结合人血清补体组分C1q的能力对该活性是至关重要的。ADCC和C1q结合通过完整抗体分子的恒定区结构域介导，本发明设想产生含有与ADCC诱导相容的人Fc的完整抗体分子。这些恒定区最优选与人κ轻(如Km3)链组合的IgG1重链。
本发明涉及修饰的抗CD20抗体分子、含有修饰的抗体或修饰抗体的片段的组合物并且相关的组合物也在本发明范围内。本发明因此设想产生和使用包括例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段的抗体片段。这些片段可以通过标准方法(例如Coligan等(《Current Protocols in Immunology》，JohnWiley & Sons 1991-1997))制备。本发明还设想来自本领域熟知的分子种类的抗体分子的多种重组形式。这些种类包括稳定化的Fv片段，其包括含有连接Vh和Vk结构域的肽接头的单链Fv形式(例如scFv)，或通过链间二硫键稳定并含有设计用来促进Vh和Vk结构域连接的额外的半胱氨酸残基的Fv(dsFv)。同样地，其他组合物为本领域所熟悉并包括称为“微型抗体”的种类和单独的可变区“dAb”。还可以通过例如整合入其他种类以提高修饰的抗体V区结构域的效价，即通过改造二聚化结构域(例如“亮氨酸拉链”)或化学修饰策略而具有多抗原结合位点的种类。
另一方面，本发明涉及在其中偶联了本发明的抗CD20V区和非免疫球蛋白融合配偶伴蛋白质(如抗癌蛋白质)的融合蛋白。这些蛋白的实例包括毒素(如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素)、酶(如抗体依赖性的前体药物疗法(“ADEPT”)的细菌蛋白酶)或细胞因子。特别有用的细胞因子是IL-2、IL-12的野生型和突变形式、IL-2和IL-12的融合形式和其他白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子。Gillies和其同事(US5,150,650、WO98/25978、WO01/10912、WO02/72605、WO03/48334)、Epstein(WO03/15697)和Halin等(Cancer Res.(2003)633202-10)已经描述了抗癌抗体V区和细胞因子的大量构型。这些方法和构型在本文中引入作为参考。含有本发明V区的融合蛋白的免疫球蛋白恒定区可以通过突变进行其他修饰，如影响补体固定的突变、影响Fc受体结合的突变、影响FcRn结合的突变和影响融合蛋白血清半衰期的突变。这些突变的实例描述于引入作为参考的WO09943713和WO01/58957。
另一方面，本发明涉及编码结合CD20的多肽组合物的分离核酸，例如编码修饰的抗CD20抗体分子、修饰的重链可变区多肽、修饰的轻链可变区多肽、抗CD20抗体融合蛋白等等的核酸。图17显示了编码Leu16轻链的多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO39)。编码Leu16轻链优选地表位消除形式的DNA序列在图17中以SEQ ID NO40显示。图17显示了编码Leu16重链的多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO41)。编码Leu16重链优选地表位消除形式(即包括VhY和人恒定区)的DNA序列在图17中以SEQ ID NO42显示。编码融合了IL-2的Leu16重链优选地表位消除形式(即包括VhY、人恒定区和结合于恒定区C末端的IL-2)的DNA序列在图17中显示为SEQ ID NO43。
本发明的另一方面涉及使用本发明结合CD20的多肽组合物治疗人的方法。实施例说明了如何将本发明的多肽组合物用于治疗鼠模型中的人癌细胞，以下得到的结果是可能用于治疗人类癌症(如B细胞淋巴癌和其他表达CD20的癌症)的策略的一般性描述。
本发明结合CD20的多肽组合物(如抗CD20-IL2融合蛋白)按如下使用对患表达CD20的癌症(如B细胞淋巴癌)的患者施用本发明的多肽组合物。优选地给药途径为静脉注射或皮下注射，但也可以采用肌内、腹膜内、皮内或其他注射途径。还可以采用吸入、口服或栓剂作为给药途径。优选在四周的循环中每周三次给药，接着三个星期不进行处理。取决于给定的个体中融合蛋白的药代动力学行为，治疗频率可以更高或更低。约70千克的成人优选地剂量在每剂约1到约100毫克的范围内，优选范围为每剂约4到约20毫克。对每月治疗一次的70kg的成人最优选地剂量约为10毫克。根据标准程序监控病人的反应。
实施例实施例描述了产生本发明的蛋白质的某些具体方法，但蛋白质表达领域的技术人员会认识到可以使用多种熟知的技术产生本发明的蛋白质。例如，优选在真核细胞(如哺乳动物细胞，如NS/0细胞、BHK细胞、CHO细胞、293细胞或PERC6细胞)中产生本发明的蛋白质。本发明的蛋白质可以例如依次使用以下步骤中的一些或全部进行纯化Abx Mixed Resin柱层析、重组A蛋白层析和Q Sepharose柱层析，接着进行Pellicon 2切向流动透析以将缓冲液更换为配方缓冲液。病毒失活和去除步骤在这些步骤中交叉进行。病毒失活和去除对于纯化本身不是必要的，而是用于满足调节因素。本发明的另一方面涉及使用修饰的抗CD20抗体分子治疗人的方法。实施例说明了如何将本发明的蛋白质用于处理鼠模型中的人类癌细胞，以下得到的结果是可能用于治疗人类癌症(如B细胞淋巴瘤和其他表达CD20的癌症)的策略的一般性描述。
本发明的融合蛋白按如下使用。治疗患表达CD20的癌症如B细胞淋巴瘤的病人。优选地给药途径为静脉注射或皮下注射，但也可以采用肌内、腹膜内、皮内或其他注射途径。还可以采用吸入、口服或栓剂作为给药途径。优选在四周的循环中每周三次给药，接着三个星期不进行处理，但取决于给定个体中抗CD20-IL2融合蛋白的药代动力学行为，治疗频率也可更高或更低。约70千克的成人优选地剂量在每剂约1到约100毫克的范围内，优选范围为每剂约4到约20毫克。对每月治疗一次的70kg的成人最优选地剂量约为10毫克。根据标准程序监控病人的反应。
实施例1.表达去免疫的Leu16抗体的方法和试剂1A细胞培养和转染为得到稳定转染的克隆，通过电穿孔法将质粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0细胞中。一次洗涤约5×106个细胞并用磷酸缓冲溶液(PBS)重悬浮。然后将10μg线性化的质粒DNA在Gene Pulser杯(0.4cm电极间距，BioRad)中与细胞在冰上孵育10分钟。使用GenePulser(BioRad)并设定为0.25V和500RF实施电穿孔。使细胞在冰上复原10分钟，然后在生长培养基中重悬浮并置于96孔板上。通过在转染后两天引入的100nM氨甲喋呤(MTX)存在下进行培养来选择稳定转染的克隆。以每3天一次的频率再给细胞添加2到3次营养，MTX抗性克隆在2到3周内出现。通过抗人FC的ELISA和分析型高压液相色谱(HPLC)测定来自克隆的上清液以鉴定高生产者(Gillies等(1989)J.Immunol.Methods 125191)。分离高生产的克隆(在培养基规模的细胞培养物中每毫升细胞培养物上清液产生约100μg纯化蛋白质)并在含有100mM MTX的生长培养基中增殖。
1BELISA使用ELISA测定MTX抗性克隆上清液中蛋白质产物的浓度。使用抗huFc ELISA测量含有人Fc的蛋白质的量。抗hu-Fc ELISA在下文有详细描述。
A.包被平板使用PBS中5μg/ml的AFFINIPURETM山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immuno Research)以96孔平板(Nunc ImmunoPlate Maxisorp)中100μl/孔包被ELISA平板。盖上包被过的平板并在4℃孵育过夜。然后用OBS中0.05％的Tween(Tween 20)洗涤平板4次并用PBS中1％的牛血清白蛋白(BSA)/1％的山羊血清以200μl/孔封闭平板。在37℃用封闭缓冲液/孵育两小时后，用0.05％的Tween洗涤4次并在纸巾上敲干。
B.与测试样品和第二抗体孵育在样品缓冲液中将测试样品稀释到适当的浓度，所述样品缓冲液在PBS中含有1％ BSA/1％山羊血清/0.05％Tween。用已知浓度的(携带人Fc的)嵌合抗体制备标准曲线。为了制备标准曲线，在样品缓冲液中进行连续稀释以得到从125ng/ml到3.9ng/ml范围那的标准曲线。稀释的样品和标准样以100μl/孔加入平板中，并在37℃孵育平板2小时。
C.孵育后，用PBS中的0.05％ Tween洗涤平板8次。然后在每孔中加入100μl第二抗体在样品缓冲液中约1∶120,000稀释的辣根过氧化酶(HRP)缀合抗人IgG(Jackson Immune Research)。第二抗体的准确稀释倍数必须对每一批HRP缀合抗人IgG进行分别测定。在37℃孵育2小时后，用PBS中的0.05％ Tween洗涤平板8次。
D.显色将制就的底物溶液(TMB Substrate，BioFX Laboratories，MD)以100μl/孔加入平板，并在室温显色10分钟。加入1N HCl(100μl/孔)终止反应。使用设置为450nm波长的平板读数器阅读平板。
1C基于分析型HPLC的测定蛋白质浓度的方法蛋白质浓度也使用分析HPLC测定。以KS-IL2免疫缀合物作为标准，在Agilent 1100 HPLC系统上用POROS柱(Perceptive Biosystems)使用基于pH的洗脱程序确定范围0.78到50.0μg/ml蛋白质浓度的标准曲线。
实施例2.表位消除的Leu-16抗体-IL2融合蛋白对表达CD20抗原的Daudi肿瘤细胞相对结合亲合力的测定使用流式细胞术分析将表位消除的Leu16-IL2融合蛋白与表达CD20抗原的Daudi肿瘤细胞的结合同其他已知抗CD20抗体的结合进行比较。每个测试的样品在100μl体积中使用约106个Daudi细胞与不同浓度的抗体。此分析显示带有VHY和VKZ可变区的修饰的抗体-IL2融合蛋白与表达CD20的细胞的结合至少与相应的嵌合Leu16-IL2融合蛋白一样好。这显示引入Leu16V区以产生VHY和VKZ可变区的突变不干扰抗体结合。还有利的将带有VHY和VKZ可变区的抗体-IL2融合蛋白与RITUXAN(C2B8)以及含有鼠2B8 V区的2B8-IL2融合蛋白进行了比较。以下表1显示流式细胞仪测定的暴露于不同浓度的抗体或抗体-IL2融合蛋白的Daudi细胞的平均荧光强度，该数据代表了一组典型的实验结果。
表1
实施例3.由携带减弱免疫原性突变的抗CD20-IL2融合蛋白驱动的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)将表达CD20的NS/0细胞暴露于各种浓度的抗体或抗体-IL2融合蛋白并按照标准程序测试ADCC裂解。典型数据集在图5中显示。测试的蛋白质如下chLeu16为由Leu16小鼠V区和人IgG1恒定区组成的嵌合抗体、chLeu16-IL2为由Leu16小鼠V区和人IgG1恒定区组成的嵌合抗体，并且抗体重链C端融合了人IL-2部分；除了图3和4中列出的VhHY和VkZ可变区代替鼠Leu16V区存在外，Ab(VhY/VkZ)-IL2与chLeu16-IL2相同；该图中的2B8是由小鼠288 V区和人IgG1恒定区组成的嵌合抗体；该图中的2B-IL2是由小鼠2B8 V区和人IgG1恒定区组成的嵌合抗体并且抗体重链的C端融合有人IL-2部分；以及KS-IL2是抗体重链C端融合了人IL-2部分的抗EpCAM抗体。KS-IL2蛋白质作为阴性对照。某些抗体-IL2融合蛋白具有如Gillies(WO02/66514)等所述的C端重链氨基酸突变。这些突变对ADCC数据没有影响。
数据表明携带VhY和VkZ可变区的融合蛋白与携带结合CD20的鼠V区的类似分子对刺激ADCC具有同等活性。通过若干不同细胞试验测定IL2活性。结果示于下文表2。
表2
另外已经发现，至少在不存在表达相同表面抗原的正常人B细胞时，靶向CD20的基于IL-2的免疫细胞因子在良好建立淋巴瘤的SCID小鼠模型中非常有效，还发现尽管缺乏功能性T细胞(已在众多临床前试验中鉴定为免疫细胞因子抗肿瘤活性的首要效应器的细胞)，使用免疫细胞因子对于延长患弥散性疾病(disseminated disease)的小鼠的存活的疗效远高于裸抗体。
实施例4.由携带减弱免疫原性的突变的抗CD20-IL2融合蛋白驱动的补体依赖性细胞毒性(CDC)为测定本发明的抗体和融合蛋白的CDC活性，将51Cr标记的Daudi细胞与作为补体来源的人血浆(稀释8倍)孵育1小时。通过从实验值中减去背景放射性并除以用去垢剂裂解得到的总释放的放射性，再乘以100来计算特异性裂解的百分比。
嵌合Leu-16抗体CDC活性与相应具有表位消除V区的Leu16抗体的比较表明这两种抗体的活性基本相同。嵌合Leu-16抗体-IL2融合物和具有表位消除V区的相应Leu16抗体-IL2融合物之间类似地比较表明这两中融合蛋白的活性也基本相同。
与ADCC相反，H链C端融合了IL-2后CDC有所减弱(图2B)。先前报道了使用抗GD2免疫细胞因子的类似效果(Gillies SD，等CancerRes.(1999)；592159-2166)。典型结果在图7C中显示。
实施例5.表位去除的Leu16-IL2融合蛋白的药代动力学图谱在特别有用的Leu16VhY/YkZ-IL2构建体中，通过使用Cg1重链同种型保留了FcR结合和ADCC活性，但在H链和IL-2之间整合了修饰的连接区以减弱细胞内蛋白水解(WO01/58957)。具体而言，使用了相应于抗体重链C端氨基酸的赖氨酸到丙氨酸的改变。得到的蛋白质良好的遵循静脉注射给药的药代动力学谱，特别是在分配相(图8)。通过在同一实验中测试酶去糖基化的Leu16VhY/VkZ(Lys-Ala)-IL2来考查FcR结合对药代动力学谱的影响。结果表明FcR结合的丧失在一定程度上改善了药代动力学行为。取决于应用和需要的给药频率，可以优选使用CH2结构域中带有N-连接糖基化位点的Leu16VhY/VkZ-IL2分子，其具有ADCC活性但血清半衰期相对较短，或是使用CH2结构域中缺乏N-连接糖基化位点的Leu16VhY/VkZ-IL2分子，其不具ADCC活性但具有相对较长的血清半衰期。
实施例6.表位消除的Leu16-IL2融合蛋白的疗效谱对SCID小鼠静脉注射5×106个CD20+Daudi淋巴瘤细胞(第0天)，接着在第7天开始静脉注射免疫细胞因子(5次5或20mg日剂量)或对照抗体(每隔一天500mg，共3次)。以高剂量使用对EGFR(对照)特异的低靶向对照免疫细胞因子425-IL2以说明活性主要由改变的IL-2半衰期决定。结果记录为一般健康(例如死亡10-14天前出现的瘫痪)和小鼠存活。图9-12显示了典型结果。图10-12的数据来自单个大规模试验，但数据在不同的图中显示以便于阅读。在第一个抗肿瘤实验中，将Daudi细胞静脉注射进SCID小鼠，引起广泛的弥散性疾病并在第30天内引起全部小鼠的瘫痪。将处理延缓到第7天以保证肿瘤细胞完全植入。我们使用5种日剂量的免疫细胞因子和3种隔日剂量的抗体将低和中等剂量的嵌合和Leu16VhY/VkZ-IL2免疫细胞因子与高剂量的利妥希玛进行了比较。选择这一安排是由于利妥希玛的循环半衰期(数天)与免疫细胞因子(约8小时)相比长很多。在这些条件下，利妥希玛(25mg/kg×3)与PBS对照相比将协带肿瘤小鼠的50％存活率从39天延长到56天(图4)。低剂量嵌合和Leu16VhY/VkZ-IL2组(0.25mg/kg×5)具有与高剂量利妥希玛相似的存活曲线(50％存活率为64天)。用更高剂量免疫细胞因子(1mg/kg×5)处理的组显示出存活率的明显提高，在试验终止时(第110天)Leu16VhY/VkZ-IL2组的小鼠没有出现死亡，且在chLeu16-IL2组中只有八分之一的小鼠死亡。因此，在基于IL-2的免疫细胞因子中，Leu16抗体表位消除的V区与鼠Leu16抗体对于SCID小鼠中弥散性淋巴瘤的治疗同样有效。同一实验中还使用上文已显示丧失ADCC活性的酶去糖基化Leu16VhY/VkZ-IL2测试了抗体效应子功能对抗肿瘤活性的贡献(图7B)。如图12所示，尽管丧失ADCC活性，抗肿瘤活性的绝大部分得到了保留。在后面的时间点中，在高剂量组中观察到了完整的和去糖基化的形式之间明显的差异。因此，尽管ADCC看来在该模型中发挥作用，该模型中抗肿瘤活性的一大部分可以单独归因于IL-2对肿瘤的靶向递送。为了说明表位消除的免疫细胞因子与靶细胞实际结合的重要性，而不是简单的延长IL-2血清半衰期的效果，测试了靶向在该细胞系中表达水平很低(图6B)的EGFR的对照IL-2免疫细胞因子(Cruz等J Biotechnol.(2002)26；96169-183)。发现即使连续5天给予较高剂量(1mg/kg)，该模型中的抗肿瘤活性也远低于同剂量的靶向CD20的免疫细胞因子(图13)。EGFR靶向的免疫细胞因子的活性也显著低于间隔3天只给药两次(第7天和第10天)或以低四倍的剂量给药5天的同剂量的Leu16VhY/VKkIL2。这些结果说明了特异性肿瘤细胞靶向作用对抗肿瘤活性的重要性。
分离的抗体和IL-2组分的抗肿瘤活性。组合利妥希玛和IL-2的临床试验已显示出提高的应答率(Friedberg等Br.J.Haematol.(2002)；117828-834)。使用两种不同方法在同一Daudi淋巴瘤模型中测试了该组合，并与Leu16VhY/VkZ-IL2处理进行比较。在第一种情况下，给动物连续5天静脉注射与20mg Leu16VhY/VkZ-IL2中所含有的摩尔量相等的Leu16VhY/VkZ抗体和IL-2。在第二种情况下，每隔一天经皮下给药25mg/kg利妥希玛和10mcg IL2，共3次。后一种给药方案由于皮下给药的驻留作用可保证高抗体水平和持续的IL-2活化。结果表明两种组合方案得到大致相同程度的抗肿瘤活性，具有63天的50％存活率(图14)。低剂量组合组中使用的等量Leu16VhY/VkZ-IL2免疫细胞因子处理引起所有小鼠的长期存活。这一点尤其值得注意，因为用分离的抗体和IL-2处理的组由于其长得多的半衰期可以比Leu16VhY/VkZ-IL2接触抗体的时间长的多。另外，比较使用的IL-2的量是基于质量而不是IL-2活性单位。如上文表2所示，当用表达高亲合力IL-2R的小鼠细胞系进行衡量时，自由的rIL-2比Leu16VhY/VkZ-IL2中含有的等摩尔量的等价物活性高约3倍。对于只表达中等IL-2R的小鼠免疫细胞，对这一差异超过10倍有利于自由rIL-2。
实施例7.用人免疫细胞重建的小鼠中Leu16VhY、VKZ的抗肿瘤活性在用人B细胞重建的SCID模型中，在第0天对小鼠静脉注射5×106个CD20+Daudi淋巴瘤细胞，在第5天静脉注射4.5×107个人PBMC。一组小鼠(n＝8)只接受PBS、一组只接受抗体(第7、9和11天，500mg)、一组只接受免疫细胞因子(第11-15天，20mg)、一组接受抗体(第7、9和11天500mg)和免疫细胞因子(第11-15天20mg)的组合。在第21和34天通过抗人IgG ELISA检查所有小鼠血清中人抗体的存在。由于CD20在正常B细胞表面表达，靶向B淋巴瘤细胞表面的该抗原是复杂的。因此，治疗涉及大量正常B细胞背景中的肿瘤细胞的靶向消除。由于IL-2免疫细胞因子剂量可能受限于IL-2组分的毒性，裸抗体引起正常B细胞消除所需的高剂量不太可能用于Leu16VhY、VKZ-IL2。组合治疗是可能的临床方案，其中Leu16VhY、VKZ-IL2治疗可以随利妥希玛治疗首先去除大量(de-bulk)的CD20+肿瘤细胞和正常B细胞后进行。在建立更真实的肿瘤模型的尝试中，对小鼠注射含有人B细胞的PBMC，然后比较利妥希玛或Leu16VhY/VkZ-IL2的单一疗法及其组合，所述组合中抗体在第7天以单剂给药，接着在第11天开始用Leu16VhY/VkZ-IL2进行治疗疗程。第二组小鼠未植入PBMC但接受同样的治疗方案。通过在所有小鼠组中测定人IgG水平确定B细胞的植入。表3中的数据显示接受人PBMC的小鼠都存在高于500μg/ml水平的人IgG，说明植入有效。
表3.植入人PBMC的SCID小鼠的人抗体产生
通过抗IgG ELISA对人抗体定量并表示为mcg/ml。
-B细胞组中检测的抗体显示了rituimab和DI-Leu16-IL2(均为人IgG)对总循环抗体的贡献。所有治疗组(包括Leu16VhY/VkZ-IL2单治疗组)在第21天的抗体水平显示出显著下降，而IgG水平到第34天略为上升，表明B细胞的继续产生。另一方面，利妥希玛或组合治疗到第34天引起人抗体产生的消除。由于在未植入PBMC的相应组中观察到同样的水平，在利妥希玛和组合治疗组的小鼠血中检测到的残留水平显然是利妥希玛本身。结果还显示所有治疗组的抗肿瘤活性没有受到存在CD20+人B细胞的显著影响(图15)。不限于任何理论，这可能部分因为Leu16VhY/VkZ-IL2单独清除大部分植入的B细胞以及肿瘤细胞的能力。由于治疗开始的推迟(第11天和第7天)，该模型中Leu16VhY/VkZ-IL2的活性水平与先前的实验相比显著降低，然而，应该注意只在单疗程中比较了不同分子，而临床上可能使用额外的治疗周期。我们还发现利妥希玛单次给药与接着的Leu16VhY/VkZ-IL2单疗程的组合至少具有加和的抗肿瘤活性，在实验结束时(第120天)大部分小鼠仍未患病。
实施例8.从抗CD20抗体中去除T细胞表位的一般方法Haisma等(Blood 92184(1998))已经描述了称为1H4的另一抗CD20抗体，其V区与Leu16的V区约95％是相同的。图16显示了2B8、Leu16、它们的本发明表位消除衍生物和1H4的重和轻(κ)V区的比对。由于抗体2B8、Leu16和1H4的序列非常相似，本发明的推论为所有这些抗体识别CD20中同样的表位。不限于任何理论，本发明发现CD20是在小鼠和人中高度保守的蛋白质，CD20的胞外结构域中存在一段与小鼠CD20的序列CEPSNSSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO29)相应的序列CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO38)。在人CD20中，序列NPS未被N-糖基化，而小鼠CD20中相应的序列NSS是N-糖基化的。根据本发明的这一理论，人CD20缺乏N-糖基化揭示了鼠CD20中不存在的抗体表位，因此当用人CD20免疫小鼠时，该表位不会被小鼠免疫系统识别为自身。因此，根据本发明，针对CD20的单克隆抗体的起始V区与Leu16或2B8的V区至少80％序列一致，更经常为至少90％序列一致。抗体1H4就是这样的一个实例。根据本发明抗CD20抗体(例如1H4)的T细胞表位的去除是通过首先与Leu16、2B8和图16所示的相应表位消除变体的重链和轻链V区进行比对，然后在CD20抗体(如1H4)的V区引入与表位消除的Leu16和/或2B8中所引入的突变相应的突变。可以通过手工比对或使用熟知的比对程序如BLAST进行比对。例如使用图16的比对，显然分别产生了具有一个或多个以下氨基酸片段的抗CD20Vh结构域SGAELKKPGAS、VSCKASGYT、LEWTGAIY、YNQKFKGKT、FKGKTTLTA、YMELSSLRS、SSLRSEDTAV和DWGTGTTVT，即SEQID NO15-22。类似地，使用图16的比对，显然分别产生了具有一个或多个以下氨基酸片段的抗CD20 VL结构域IITASPGEKV、CRASTSASY、QQKPTSSP、LASGVPSRF、FSGSGSGTT和YSMTISSLE，即SEQ IDNO23-28。具体地说，产生了具有一个或多个本段前述氨基酸片段的抗体1H4的变体。可以使用鉴定T细胞表位活性的标准技术检查T细胞表位确实被去除，以确证新引入的突变的有效性。例如，可以使用Carr等(US专利申请20030153043和WO02/069232)的方法。另外，可以向免疫细胞(优选人免疫细胞)中加入与可能的T细胞表位相应的肽，并根据标准技术测试刺激细胞增殖的能力。相应的含有V区的蛋白质可以装配为完整抗体、抗体融合蛋白、Fabs、Fab融合蛋白、单链Fv蛋白或抗体V区的其他标准构型。然后如前面的实施便所述，根据标准蛋白质表达方法产生相应的含有V区的蛋白质。
权利要求
1.具有结合CD20抗原的能力的多肽组合物，其含有至少一个选自以下的多肽片段(i)具有SEQ ID NO1的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO1中含有选自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一个氨基酸残基替换的修饰的重链可变区多肽；(ii)具有SEQ ID NO4的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO4中含有选自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的修饰的轻链可变区多肽；(iii)具有SEQ ID NO9的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO9中含有选自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一个氨基酸残基替换的修饰的重链可变区多肽；和(iv)具有SEQ ID NO11的氨基酸残基序列，但在SEQ ID NO11中含有选自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一个氨基酸残基替换的修饰的轻链可变区多肽；
2.权利要求1的结合CD20的多肽组合物，其含有修饰的重链可变区多肽和修饰的轻链可变区多肽。
3.权利要求2的结合CD20的多肽组合物，其以嵌合抗体并另外包含人重链恒定区和人轻链恒定区的形式。
4.权利要求3的结合CD20的多肽组合物，其中人重链恒定区为IgG恒定区。
5.权利要求4的结合CD20的多肽组合物，其中IgG恒定区为IgG1恒定区。
6.权利要求3的结合CD20的多肽组合物，其中人轻链恒定区为人κ轻链恒定区。
7.具有结合CD20抗原能力的多肽组合物，所述多肽组合物含有至少一条具有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的多肽片段。
8.具有结合CD20抗原能力的多肽组合物，所述多肽组合物含有至少一条具有选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸残基序列的多肽片段。
9.具有结合CD20抗原能力的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的多肽片段，和具有选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸残基序列的多肽片段。
10.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO5的氨基酸残基序列的多肽片段。
11.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO6的氨基酸残基序列的多肽片段。
12.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO7的氨基酸残基序列的多肽片段。
13.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO2的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO8的氨基酸残基序列的多肽片段。
14.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO6的氨基酸残基序列的多肽片段。
15.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO8的氨基酸残基序列的多肽片段。
16.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，所述多肽组合物含有具有选自SEQ ID NO10的氨基酸残基序列的多肽片段和具有选自SEQ IDNO12的氨基酸残基序列的多肽片段。
17.根据权利要求1-16中任一项的结合CD20的多肽组合物，其中多肽与细胞因子融合。
18.权利要求17的结合CD20的多肽组合物，其中细胞因子为IL2。
19.权利要求17或18的结合CD20的多肽组合物，其中多肽的C端与细胞因子的N端融合。
20.权利要求9的结合CD20的多肽组合物，其中细胞因子为IL2。
21.根据权利要求1-20中任一项的结合CD20的多肽组合物，其中多肽为完整抗体、Fab抗体片段、单链Fv抗体片段或微型抗体的形式。
22.根据权利要求1-21中任一项的结合CD20的多肽组合物，其中组合物包括具有选自SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO15和SEQ ID NO28的氨基酸残基序列的多肽片段。
23.药物组合物，其含有根据权利要求1-22中任一项的结合CD20的多肽组合物和可药用载体、赋形剂、稀释剂。
24.权利要求23的药物组合物，其还含有额外的药理学效应药物。
25.DNA分子，其编码根据权利要求1-22中任一项的组合物中的多肽。
26.权利要求25的DNA分子，其选自SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43。
27.权利要求1-22中任一项的多肽组合物或权利要求23或24的药物组合物在制造治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及与CD20抗原(特别是人CD20抗原)结合的多肽组合物。多肽组合物具有已知的抗CD20抗体(如2B8和Leu16)的生物活性，但与非修饰分子相比表现出降低的免疫原性。多肽组合物包括嵌合抗体、抗体片段和抗体或抗体片段与细胞因子的融合蛋白。
文档编号C07K16/30GK1835977SQ200480023372
公开日2006年9月20日 申请日期2004年8月16日 优先权日2003年8月14日
发明者F·J·卡尔, S·威廉斯, S·D·吉利斯 申请人:默克专利有限公司