显性失活的跨膜受体在转基因动物乳汁中的表达的制作方法

专利名称：：显性失活的跨膜受体在转基因动物乳汁中的表达的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于能在转基因哺乳动物的乳汁中表达所需跨膜受体构建体的转基因动物产生的改进的方法。更具体地说，本发明提供一种方法以改进用于表达可用作治疗分子的跨膜受体蛋白质和/或显性失活的跨膜受体蛋白质的转基因动物的产生。
背景技术：
：本发明大体涉及核移植和所需的转基因动物产生的领域。更具体地，其涉及用于在转基因动物中产生跨膜受体蛋白质的方法。能产生转基因动物的技术的发展提供了特别精确地用于动物产生的方法，该动物经改造以携带特定的性状或设计成能表达某些蛋白质或者其他的分子化合物。也就是说，转基因动物为携带在发育早期已经人为引入体细胞和/或胚系细胞的基因的动物。随着动物的发育和生长，改造成动物的蛋白质产物或特定的发育转变变得明显。发现用于新的治疗靶位的重要化学物质的能力是大多数制药公司药物发现方案中首要的关键一步。细胞生物学、基因组测序和转基因学的最新进展已经允许解析信号转导途径以及新的生化调控位点，以工业上空前的速度促进小分子药物介入的潜在的新机遇的确定。如上所述G蛋白-偶联受体(GPCR)是用于制药工业靶向的主要类型。GPCR是7-跨膜受体蛋白质的超家族，其在许多自分泌、旁分泌和内分泌信号系统中有极重要的功能。这些蛋白质通过鸟嘌呤核苷酸结合调控蛋白质(G-蛋白质)的调节转导胞外配体和激素的结合成为胞内的信号事件。以GPCR为目标的传统的药物发现方案依赖于天然来源的整个动物或组织制备物的使用，其作为起点用生物学或药理学测定法进行合成的/医药的或天然产物文库的筛选。由于和跨膜蛋白质的真正性质相关的表达问题，跨膜受体蛋白质特别难以有效量表达或纯化。(Loisel等，1997)。本领域的那些工作在产生任何有效量作为独立治疗分子的可溶性跨膜受体或其显性失活类型上是不成功的。例如，大量工作耗在发现166-残基的造血生长激素促红细胞生成素(EPO)和其细胞因子受体的替代小分子配体上。已经鉴定和广泛研究了一种与天然EPO配体序列上无关的20-残基环肽(Livnah等，1996)，但是该降低大小的多肽未能转化为药物本身，也没有帮助制备对治疗分子开发有效的受体蛋白。本发明之前，可用于能产生跨膜受体蛋白质的转基因家畜生成的技术是低效的和/或不能以近于商业可用的等级产生所需的重组蛋白质。在携带目的受体跨膜DNA序列的转基因建立者系的开发过程中存在各种问题。一般，转基因根本不可能掺入或掺入但不能表达。进一步的问题是由于位置效应的错误调控的可能性。此指在用相同的转基因构建体产生的不同建立者动物之间基因表达水平和基因调控精度的可变性。因此，一般是生成大量的建立者动物并且常常证实小于5％的以确保转基因系维持的方式表达该转基因。另外，产生转基因家畜的效率低，常见生成的100个子代中1个为转基因的(Wall等，1997)。因此转基因动物生成的相关成本可多至每只表达的动物250,000-500,000美元(Wall等，1997)。现有技术的方法在克隆过程中一般使用胚胎细胞类型。此包括Campbell等(NATURE1996)和Stice等(BIOL.REPROD.1996)的工作。在那些研究中，胚胎细胞系源自妊娠少于10天的胚胎。该研究中，细胞在滋养层上培养以防止在克隆过程中将使用的供体细胞的明显分化。本发明使用已分化的细胞。可以理解和以分化的供体细胞核起始克隆的胚胎一起，胚胎细胞类型也可用于本发明的方法中。因此虽然已经通过各种方法产生了一些不同种类的转基因动物，但还是缺乏以合理的成本方便地和可再现地产生能大量表达所需跨膜蛋白质或证实遗传变化是由转基因的插入所引起的转基因动物的方法。上述表达的尝试包括改造跨膜结构域缺失的膜相关蛋白质，由此留下可结合配体的胞外部分(St.Croix等，美国专利申请20030017157)。所述跨膜受体蛋白质的这种可溶形式可用于与天然形式竞争结合配体。有可能所述可溶片段能用作抑制剂，但是其是否能真正提供与保留跨膜序列的天然跨膜受体确切竞争的能力是不清楚的。有关哮喘和相关呼吸疾病流行病学的研究明确证实变态反应性疾病的发病率已经提高，且较高的诊断率不仅仅是因为诊断方式的改变或者检测的改进。此外，对过敏性鼻炎和变应性哮喘常常共同存在的提高的认识已促成这样的共识，即这些貌似独立的病症是在上或下呼吸道表现出的相同疾病的体现。现今对哮喘的许多治疗并没有针对疾病本身发展基础下的机制，并且有时候，在延长使用后带来明显的副作用和降低的功效。尽管在过去的25年内治疗有进展，哮喘的发病率和严重程度基本上还在增长因而有开发针对新治疗靶位新药的明确需求。以现有哮喘药物的市场规模，新的和有效的哮喘药物的商业潜力估计将超过50亿美元。虽然以哮喘病状各个方面为目标的一系列新疗法目前处于临床发展阶段，资料的重要部分显示作为关键作用的IL-13和其受体的相互作用，其出现在其他细胞因子和非-细胞因子基础靶目标的上游。然而，作为哮喘治疗潜在治疗途径的IL-13功能异常跨膜受体的产生还没有探究或提出。因此，对用于跨膜受体蛋白质重组表达的改进方法存在的需求将允许转基因动物开发中生产效率的提高，尤其涉及可提供哮喘或相关变态反应病症治疗的另外治疗选择的分子的产生。
发明内容简言之，本发明提供用于在转基因重组系统中表达跨膜蛋白质的方法。本发明的方法包括通过核移植方法克隆用跨膜受体蛋白所需受体转基因的非人哺乳动物，包括获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得至少一个卵细胞；将该至少一个卵细胞去核；将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；同时融合和活化细胞偶联体以形成转基因胚胎；培养该活化的转基因胚胎直至大于2-细胞发育阶段；以及最后将该转基因胚胎移植入合适的宿主哺乳动物中使得胚胎发育成胎儿。一般，上述方法通过使用供体细胞核而完成，其中在所述分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核的卵细胞之前，已经插入、除去或修饰编码目的跨膜受体蛋白的所需基因。还需注意的事实是所用的卵细胞优选去核前是体外成熟的。此外，本发明提供跨膜受体的转基因生产，包括IL-13受体、成纤维细胞生长因子受体1至4、CFTR受体、阿立新(Orexin)受体、黑色素浓集激素受体、CD-4受体，以及上述所有的显性失活的类型。本发明证实许多不同的跨膜蛋白质可在转基因乳汁中产生。该能力是重组哺乳动物转基因表达系统独有的。本发明还提供能抑制受体功能的显性失活跨膜蛋白质的表达和制造。该表达允许利用表达的分子通过干预依赖跨膜受体的信号转导途径而形成疾病病状的新治疗方法靶向的基础。按照一个优选实施方案，该显性失活的跨膜受体蛋白通过目的蛋白质中一个或多个酪氨酸激酶位点功能的消除而制备。其他可改变以消除生理功能的位点包括对目的跨膜受体蛋白的功能很重要的活性丝氨酸激酶位点。此外，本发明的方法还提供通过在中期-II时期获得的山羊卵细胞的使用而优化转基因动物的生成，其是去核的并且与供体体细胞融合而同时活化。一种转基因克隆动物的乳汁的分析显示了人的所需目的转基因蛋白质产物的高水平的产生。另外要重点指出的是也可从克隆的子代分离细胞、组织和器官。该方法可以提供用于许多医疗和兽医治疗包括细胞和基因治疗的″材料″来源。如果将细胞移植回细胞来源的动物中，则免疫排斥得到避免。并且，由于可从这些克隆分离许多细胞类型，其他的方法如造血嵌合状态(chimericism)可用于避免同种类动物中以及种之间的免疫排斥。图1显示了通过核移植产生克隆动物的过程的概括图。图2显示了IL-13受体转基因的构建。图3显示了IL13受体在转基因小鼠乳汁中的表达。泳道1-8，分别来自八只建立者小鼠BC894-4、BC894-79、BC894-81、BC894-96、BC894-104、BC894-114A、BC894-114B和BC894-116的全部乳汁。泳道9和10，分别为小鼠1和2的脂类组分。M，分子量标记。N，阴性乳汁。具体实施例方式以下缩写已在说明书中指明含义主要的缩写体细胞核移植(SCNT)培养的内细胞团细胞(CICM)核移植(NT)合成的输卵管液体(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶链式反应(PCR)牛血清白蛋白(BSA)术语的注解山羊-各种种类的或相关的山羊。重建的胚胎-重建的胚胎为其遗传物质通过去核过程而除去的卵细胞。其已经通过在融合事件之后将成体或胎儿体细胞遗传物质置于卵细胞而″重建″。融合载玻片-用于并联以固定间隔距离放置的电极的载玻片。细胞偶联体放置于电极之间以接受电流而融合和活化。细胞偶联体-融合和/或活化前的去核卵细胞和体或胎儿核体。细胞分裂抑素-B-有选择地和可逆地阻断胞质分裂而不影响核分裂的某些真菌的代谢产物。胞质体-真核细胞的细胞质物质。显性失活效应-突变体受体或改变的氨基酸序列可与野生型受体/配体形成二聚物，但是胞内信号由于其中关键结构域区的缺少或改变(例如来自突变体受体的酪氨酸激酶结构域缺失)而不能被活化。因此，具有该突变的细胞将不能响应配体的存在。核体-通过去核而获自细胞的细胞核，由胞质和质膜的窄环环绕。体细胞-生物体机体除生殖细胞外的任何细胞。单性生殖(Parthenogenic)-来自无精子透入卵细胞的胚胎的发育。转基因生物-实验性地移植来自另一个生物体的遗传物质进入生物体以使宿主在其染色体组成中获得所移植基因的遗传特性。体细胞核移植-也称作治疗性克隆，是体细胞与去核的卵细胞融合的过程。体细胞的细胞核提供遗传信息，而卵细胞提供养分及其他产生能量的物质，其对于胚胎的发育是必需的。一旦融合发生，细胞为全能性的，且最终发育成胚囊，此时内细胞团是分离的。自从最初报道在绵羊中利用体细胞的成功后(Wilmut等，1997)，核移植取得了显著的进步。此后许多其他物种从体细胞克隆，获得不同程度的成功(Baguisi等，1999和Cibelli等，1998)。许多其他的胎儿和成体体细胞组织类型(Zou等，2001和Wells等，1999)，以及胚胎(Yang等，1992；Bondioli等，1990；和Meng等，1997)也有报道。重建时核体所处的细胞周期时期也用不同的实验室方法(Kasinathan等，Biol.Reprod.2001；Lai等，2001；Yong等，1998；和Kasinathan等，NatureBiotech.2001)证实是关键性的。然而，用于融合和活化次序、时机和方法存在相当大程度的可变性。现有技术依赖用于核移植方法的早期胚胎分裂球的使用。该方法受可用的胚胎分裂球的很少数量以及不能将外源遗传物质引入上述细胞的限制。相反，分化的胚胎、胎儿或成体体细胞可用作核移植核体供体的发现提供了胚系改变的各种可能性。根据本发明，用于核移植的重组体细胞系的使用以及通过利用″重建″胚胎增加可用细胞数目而提高该方法的效率，不仅允许通过传统的转染方法将转基因引入更多的转基因动物而且基本上提高了转基因动物产生的效率同时克服了建立者镶嵌现象的问题。之前已经显示同时的电融合和活化可以成功地产生山羊物种及其他动物的活的子代。供体核体获自最初的胎儿体细胞系，其源自通过负性成体雌性用来自转基因雄性的精子人工受精而产生的40-天的转基因雌性胎儿。用两种核移植方法产生活的子代。在一种方案中，将处于停滞于分裂中期-II期的山羊卵细胞去核，与供体体细胞电融合并且同时活化。在第二种方案中，将体内活化的山羊卵细胞在分裂末期-II期去核，与供体核体电融合并且同时再次活化以诱导基因组的再活化。产生了三个健康的、同一的雌性子代。基因型分析证实所有克隆的子代都源自供体细胞系。一种转基因克隆动物的乳汁的分析显示了人跨膜受体蛋白质的高水平的产生。因此，通过本发明中所用的方法和系统，转基因动物山羊通过体细胞核移植产生并且证实能在所克隆动物的乳汁中产生目的治疗受体蛋白。虽然上述发明已经通过用于理解目的的例证和实例较详细地描述，但是对本领域技术人员而言很显然可进行某些变化和改变。因此，描述和实例不应认为是限制本发明的范围，本发明的范围通过附加的权利要求描述。GPCR一般，GPCR已被分类并且受体亚类已通过在放射性同位素示踪结合测定法中对激动剂和拮抗剂亲合力的药理学差异的观察而鉴定。随着现代基因组的到来，在特定的细胞系中表达的已知亚类的重组人受体的筛选已成为用于重要发现方案的准则。本领域典型的发现方案可包括放射性配体膜置换测定法，随之细胞报道分子二级测定法的使用。不管应用怎样的测定法，表达高水平目的受体的一系列单细胞克隆必须经过鉴定并且进行有效的分子筛选，而其常常利用报道基因的读数很容易地完成(Stables等，1999)。替代的方法包括通过整个细胞的放射-配体结合测定法挑选克隆。后者的方法不受专利限制，但为更多劳动强度的。该方法通常以目的受体的cDNA转染进入在通过受体-依赖的信号转导途径调节的启动子的调控下共表达报道基因的稳定细胞系而起始。通过其配体或激动剂的目的受体的活化最终导致很容易测定活性的报道基因的转录。该活性用于鉴定受体表达的、稳定的、无性细胞系，因为通常报道分子信号的变幅与受体表达水平相关。一旦鉴定了阳性克隆，将其扩大并且选择测定法形式。置换测定法有两种常见类型基于过滤的放射-配体结合和SPA。通过置换的活性化合物的检测呈现简单的、明确的体系，因此允许进行详细的亲合力和构效关系(SAR)的研究(Rosati等，1998)。然而，根据现有技术，还没能制备和表达跨膜受体本身，或者其显性失活的类型用作潜在的治疗分子。由于过去较低的成功率，靶蛋白-受体相互作用是生物技术工业主要避免的一个领域。蛋白质/蛋白质相互作用的一个实例为细胞因子或生长因子接合其靶受体。生物学上，这些在控制信号转导、细胞交流和粘着中的关键事件方面起着重要作用，且因此很可能作为自身免疫疾病、癌症、哮喘、过敏症等等中介入的点而引起注意。跨膜受体蛋白质的表达泌乳乳腺上皮细胞的一种特有的生理学特征为其分泌脂类进入乳汁。该脂类以磷脂膜和蛋白质包裹的乳脂小球、脂肪滴大量分泌。许多细胞膜蛋白质在乳脂小球的膜组分中被发现。在本发明中我们提供了一种利用该分泌途径作为一种手段而从转基因动物乳汁产生重组跨膜蛋白质的方法。当具有一个或多个跨膜结构域的蛋白质由乳腺中的转基因表达时，乳腺上皮细胞可能能以乳脂小球″分泌″之，因此可从乳汁收获该重组蛋白质。此将使得该转基因乳汁生产成为能分泌跨膜蛋白质的唯一体系并且提供给本发明的实施者机会以可能产生其他蛋白质表达系统不能提供的许多种类的跨膜蛋白质如通道蛋白、细胞表面受体、抗药性调节剂。本发明提供在转基因动物乳汁中跨膜蛋白质如IL-13受体和其显性失活类型的表达。用于哮喘和过敏症治疗的转基因的显性失活IL-13受体目前哮喘的处理方针强调作为首要抗炎疗法的吸入的皮质甾类早期干预的重要性。一些研究证实某些抗组胺剂的二级制品具有抗炎活性。还进行了研究，研究在过敏性鼻炎和哮喘中与鼻内的和/或吸入的皮质甾类相比，其与白细胞三烯受体拮抗体联合的效果。在新的抗-细胞因子疗法中，目前正在哮喘中研究用抗-IL-5、抗-IL-13、抗-TNF-α以及可溶的IL-4受体拮抗体的治疗。小鼠中最新公开的研究已突出了IL-13在变应性哮喘发展过程中的作用。当用截短形式的IL-13治疗时，最初发展为哮喘-样症状的小鼠呈现上述症状的减轻和消除。重组IL-13向原初小鼠的气道的重复给药诱导类似的症状而证实这些病状中IL-13的作用。这些报道和各种其他研究确定IL-13在小鼠过敏性气道疾病并且推广到人哮喘发展过程中的重要作用。人中最新的合作研究证实IL-13受体在多种细胞中的表达在人哮喘肺的活体检查中发现。数据表明IL-13在气道疾病关键特征的发展过程中起着重要作用。基于此，显性失活的IL-13受体可与天然IL-13受体配体竞争或另外干扰IL-13信号途径的组分的有效性代表了用于哮喘或过敏性鼻炎治疗的一种新的治疗途径。IL-13受体转基因的构建IL-13为最近被发现是介导动物模型中过敏性哮喘必需的和充分的2型细胞因子。显示了IL-13配体用IL-13受体的中和完全阻断哮喘的表型，包括气道过敏现象、IgE的产生和粘液分泌过多(SCIENCE，Dec1998)。本发明提供能通过本发明的转基因表达系统制备并且其后能递送至气道细胞的IL-13受体的显性失活突变体。递送后IL-13的正常信号转导途径被阻断，导致受体的抑制。治疗结果为哮喘表型得到治疗。因此选择表达IL-13受体作为在乳汁中产生膜蛋白质以及以使其能有效用于作为治疗分子而产生的方式表达显性失活的膜受体的一个实例。为了构建转基因，IL-13受体的cDNA(获自Invitrogen)被亚克隆进入克隆载体puc19-2X以引入两个XhoI位点，一个为起始密码子的5′而另一个为终止密码子的3′。IL-13受体cDNA的XhoI片段随后被克隆进入BC350生成BC948。该BC948转基因包含在其C末端跟随V5标记和HisC标记的完整IL-13受体编码区。纯化BC948的SalI/NotI片段用于显微注射。转基因建立者小鼠利用IL-13受体转基因特异性寡核苷酸对通过PCR鉴定。IL-13受体在乳汁中的表达利用HRP缀合的抗-V5标记抗体通过蛋白质印迹法测定。对7只雌性转基因建立者小鼠分析，5只在其乳汁中表达IL-3。IL-13受体表达的水平在0.1至0.25mg/ml范围内(图3)。人IL-13受体的序列是已知的并且由本领域一些不同的作者呈现。以下为人IL-13受体的氨基序列SEQ.ID.No.1.Genbank/EMBL/DDBJ登记号NP_000631，来自生物技术信息国家中心-人IL-13受体(380个氨基酸残基)；(Wu等，(2003)；和David等，(2002))1mafvclaigclytflisttfgctsssdteikvnppqdfeivdpgylgylylqwqpplsld61hfkectveyelkyrnigsetwktiitknlhykdgfdlnkgieakihtllpwqctngsevq121sswaettywispqgipetkvqdmdcvyynwqyllcswkpgigvlldtnynlfywyegldh181alqcvdyikadgqnigcrfpyleasdykdfyicvngssenkpirssyftfqlqnivkplp241pvyltftressceiklkwsiplgpiparcfdyeieireddttlvtatvenetytlkttne301trqlcfvvrskvniycsddgiwsewsdkqcwegedlskktllrfwlpfgfililvifvtg361lllrkpntypkmipeffcdt钙粘蛋白钙粘蛋白组成细胞表面跨膜受体蛋白质的家族，其由八组组成。最为人所知的钙粘蛋白组称为“标准钙粘蛋白”，在建立和维持细胞-细胞粘附复合物如粘着连接中起作用。标准钙粘蛋白以二聚物簇起作用，而粘附强度通过改变细胞表面表达的二聚物数目和成簇的程度来调节。标准钙粘蛋白结合胞质连接蛋白质，称为连环蛋白，其连接钙粘蛋白至肌动蛋白细胞骨架。钙粘蛋白簇通过形成细胞骨架构架，其组织信号蛋白质及其基质形成三维复合物而调节胞内信号。标准钙粘蛋白主要通过调控细胞-细胞粘附的特异性以及细胞形状和运动的变化而是组织形态发生必不可少的。钙粘蛋白超家族由超过70种结构相关的蛋白质组成，所有的蛋白质都具有两种性质这些蛋白质的胞外区结合钙离子而正确折叠(由此钙为Ca)并且这些蛋白质粘附其他蛋白质(由此，″粘附″)。钙粘蛋白参与细胞-细胞粘附、细胞迁移和信号转导。所发现的钙粘蛋白的第一个组包括在上皮细胞之间形成的粘着带连接中发现的那些。这些目前称为″标准钙粘蛋白″以与其更多较远相关的家族成员区分开。所有标准钙粘蛋白为具有单个膜-跨越结构域、蛋白质的氨基端的五个胞外域以及保守的胞质C末端尾部的跨膜受体。脊椎动物中，根据其首次发现的位点上皮、胎盘、神经、视网膜和血管内皮，五个标准钙粘蛋白分别称为E-、P-、N-、R-和VE-钙粘蛋白。标准钙粘蛋白以在细胞表面上的二聚物簇起作用。这些二聚物结合相邻细胞上相同的二聚物。N-和R-钙粘蛋白对还彼此相互结合(异嗜性结合)。细胞可以通过活动性调节而调控其粘附强度，其包括改变细胞表面上受体的总数和质膜内受体的横向扩散。不成簇的钙粘蛋白不会与相邻细胞形成强的粘附。这是钙粘蛋白簇在细胞-细胞粘附中重要性的直接证据。提供该证据的实验是基于钙粘蛋白胞质尾区对二聚体形成很重要的事实(Yap等，1997)。标准钙粘蛋白在发育过程中通过调控细胞-细胞粘附的强度和通过提供特异性细胞-细胞识别机制而起主导作用。例如，在发育过程中，E-钙粘蛋白在胚囊形成时表达，且被认为在紧密连接形成时提高细胞-细胞粘附而随后上皮细胞在发育的胚胎中极化。不出意外，在发育过程早期E-钙粘蛋白基因的遗传敲除是致死的(Larue等，1994)。其他钙粘蛋白家属的功能性突变或敲除影响各式各样器官的发育包括脑、脊索、肺和肾。所有这些发育事件共有的一个重要主题是称为内陷的细胞运动的过程。例如，脊椎动物中当包括外胚层的细胞沿着胚胎外表面形成脊，其变深而成裂隙且随后压紧而形成神经管时产生第一个神经组织。为了形成该管，上皮细胞必须收缩其顶端结构域和向内弯曲，形成沟，随后分离并且移至新的部位以闭合该管。类似的运动在许多外胚层来源的组织的形成中发生，并且所有的都需要细胞-细胞接触类型的变化。钙粘蛋白基因的缺失导致各式各样的发育异常，如由于错误靶向神经元导致的运动技能缺乏，其还因上皮内陷的错误引起(Fesenko，2001)。其他目的分子阿立新受体SEQ.ID.No.2.Genbank/EMBL/DDBJ登记号NP_001516，来自生物技术信息国家中心-人阿立新受体1(Sakurai，T.，等，(1998))(425个氨基酸)。1mepsatpgaqmgvppgsrepspvppdyedeflrylwrdylypkqyewvliaayvavfvva61lvgntlvclavwrnhhmrtvtnyfivnlsladvlvtaiclpasllvditeswlfghalck121vipylqavsvsvavltlsfialdrwyaichpllfkstarrargsilgiwavslaimvpqa181avmecssvlpelanrtrlfsvcderwaddlypkiyhscffivtylaplqlmamayfqifr241klwgrqipgttsalvrnwkrpsdqlgdleqglsgepqprgraflaevkqmrarrktakml301mvvllvfalcylpisvlnvlkrvfgmfrqasdreavyacftfshwlvyansaanpiiynf361lsgkfreqfkaafscclpglgpcgslkapsprssashkslslqsrcsiskisehvvltsv421ttvlpSEQ.ID.No.3.Genbank/EMBL/DDBJ登记号NP_001517，来自生物技术信息国家中心-人阿立新受体2(deLecea，L.等，(1998))(444个氨基酸)。1msgtkledsppcrnwssaselnetqepflnptdyddeeflrylwreylhpkeyewvliag61yiivfvvalignvlvcvavwknhhmrtvtnyfivnlsladvlvtltclpatlvvditetw121ffgqslckvipylqtvsvsvsvltlscialdrwyaichplmfkstakrarnsiviiwivs181ciimipqaivmecstvfpglankttlftvcderwggeiypkmyhicfflvtymaplclmv241laylqifrklwcrqipgtssvvqrkwkplqpvsqprgpgqptksrmsavaaeikqirarr301ktarmlmvvllvfaicylpisilnvlkrvfgmfahtedretvyawftfshwlvyansaan361piiynflsgkfreefkaafsccclgvhhrqedrltrgrtstesrkslttqisnfdniskl421seqvvltsistlpaangagplqnw黑色素浓集激素受体SEQ.ID.No.4.Genbank/EMBL/DDBJ登记号NP_005288，来自生物技术信息国家中心-黑色素浓集激素受体1(Pissios，P.，等，(2003))(422个氨基酸)。1msvgamkkgvgravglgggsgcqateedplpdcgacapgqggrrwrlpqpawvegssarl61weqatgtgwmdleasllptgpnasntsdgpdnltsagspprtgsisyiniimpsvfgtic121llgiignstvifavvkksklhwcnnvpdifiinlsvvdllfllgmpfmihqlmgngvwhf181getmctlitamdansqftstyiltamaidrylatvhpisstkfrkpsvatlvicllwals241fisitpvwlyarlipfpggavgcgirlpnpdtdlywftlyqfflafalpfvvitaayvri301lqrmtssvapasqrsirlrtkrvtrtaiaiclvffvcwapyyvlqltqlsisrptltfvy361lynaaislgyansclnpfvyivlcetfrkrlvlsvkpaaqgqlravsnaqtadeertesk421gtSEQ.ID.No.5.Genbank/EMBL/DDBJ登记号NP115892，来自生物技术信息国家中心-黑色素浓集激素受体2(HillJ.，等，(2001))(340个氨基酸)。1mnpfhascwntsaellnkswnkefayqtasvvdtvilpsmigiicstglvgnilivftii61rsrkktvpdiyicnlavadlvhivgmpflihqwarggewvfggplctiitsldtcnqfac121saimtvmsvdryfalvqpfrltrwrtryktirinlglwaasfilalpvwvyskvikfkdg181vescafdltspddvlwytlyltittfffplplilvcyililcytwemyqqnkdarccnps241vpkqxvmkltkmvlvlvvvfilsaapyhviqlvnlqmeqptlafyvgyylsiclsyasss301inpflyillsgnfqkrlpqiqrratekeinnmgntlkshf成纤维细胞生长因子受体-家族SEQ.ID.No.6.Genbank/EMBL/DDBJ登记号P22455，来自生物技术信息国家中心-成纤维细胞生长因子受体-4(PartanenJ.，等，(1991))(802个氨基酸)。1mrlllallgvllsvpgppvlsleaseevelepclapsleqqeqeltvalgqpvrlccgra61ergghwykegsrlapagrvrgwrgrleiasflpedagrylclargsmivlqnltlitgds121ltssnddedpkshrdpsnrhsypqqapywthpqrmekklhavpagntvkfrcpaagnptp181tirwlkdgqafhgenriggirlrhqhwslvmesvvpsdrgtytclvenavgsirynylld241vlersphrpilqaglpanttavvgsdvellckvysdaqphiqwlkhivingssfgadgfp301yvqvlktadinssevevlylrnvsaedageytclagnsiglsyqsawltvlpeedptwta361aapearytdiilyasgslalavllllaglyrgqalhgrhprppatvqklsrfplarqfsl421esgssgksssslvrgvrlsssgpallaglvsldlpldplwefprdrlvlgkplgegcfgg481vvraeafgmdparpdqastvavkmlkdnasdkdladlvsemevmkligrhkniinllgvc541tqegplyvivecaakgnlreflrarrppgpdlspdgprssegplsfpvlvscayqvargm601qylesrkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglargvhhidyykktsngrlpvkwmapea661ltdrvythqsdvwsfgillweiftlggspypgipveelfsllreghrmdrpphcppelyg721lmrecwhaapsqrptfkqlvealdkvllavseeyldlrltfgpyspsggdasstcsssds781vfshdplplgsssfpfgsgvqtSEQ.ID.No.7.Genbank/EMBL/DDBJ登记号P22607，来自生物技术信息国家中心-成纤维细胞生长因子受体-3(Murgue，B.，等，(1991))(806个氨基酸)。1mgapacalalcvavaivagasseslgteqrvvgraaevpgpepgqqeqlvfgsgdavels61cpppgggpmgptvwvkdgtglvpservlvgpqrlqvlnashedsgayscrqrltqrvlch121fsvrvtdapssgddedgedeaedtgvdtgapywtrpermdkkllavpaantvrfrcpaag181nptpsiswlkngrefrgehriggiklrhqqwslvmesvvpsdrgnytcvvenkfgsirqt241ytldv1ersphrpilqaglpanqtavlgsdvefhckvysdaqphiqwlkhvevngskvgp301dgtpyvtvlktaganttdkelevlslhnvtfedageytclagnsigfshhsawlvvlpae361eelveadeagsvyagilsygvgfflfilvvaavtlcrlrsppkkglgsptvhkisrfplk421rqvslesnasmssntplvriarlssgegptlanvselelpadpkwelsrarltlgkplge481gcfgqvvmaeaigidkdraakpvtvavkmlkddatdkdlsdlvsememmkmigkhkniin541llgactqggplyvlveyaakgnlreflrarrppgldysfdtckppeeqltfkdlvscayq601vargmeylasqkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglardvhnldyykkttngrlpvkw661mapealfdrvythqsdvwsfgvllweiftlggspypgipveelfkllkeghrmdkpanct721hdlymimrecwhaapsqrptfkqlvedldrvltvtstdeyldlsapfeqyspggqdtpss781sssgddsvfahdllppappssggsrtSEQ.ID.No.8.Genbank/EMBL/DDBJ登记号P21802，来自生物技术信息国家中心-成纤维细胞生长因子受体-2(DionneC.A.，等，(1990))(821个氨基酸)。1mvswgrficlvvvtmatlslarpsfslvedttlepeepptkyqisqpevyvaapgeslev61rcllkdaaviswtkdgvhlgpnnrtvligeylqikgatprdsglyactasrtvdsetwyf121mvnvtdaissgddeddtdgaedfvsensnnkrapywtntekmekrlhavpaantvkfrcp181aggnpmptmrwlkngkefkqehriggykvrnqhwslimesvvpsdkgnytcvveneygsi241nhtyhldvversphrpilqaglpanastvvggdvefvckvysdaqphiqwikhvekngsk301ygpdglpylkvlkaagvnttdkeievlyirnvtfedageytclagnsigisfhsawltvl361papgrekeitaspdyleiaiycigvfliacmvvtvilcrmknttkkpdfssqpavhkltk421riplrrqvtvsaessssmnsntplvrittrlsstadtpmlagvseyelpedpkwefprdk481ltlgkplgegcfgqvvmaeavgidkdkpkeavtvavkmlkddatekdlsdlvsememmkm541igkhkniinllgactqdgplyviveyaskgnlreylrarrppgmeysydinrvpeeqmtf601kdlvsctyqlargmeylasqkcihrdlaarnvlvtennvmkiadfglardinnidyykkt661tngrlpvkwmapealfdrvythqsdvwsfgvlmweiftlggspypgipveelfkllkegh721rmdkpanctnelymmmrdcwhavpsqrptfkqlvedldriltlttneeyldlsqpleqys781psypdtrsscssgddsvfspdpmpyepclpqyphingsvktSEQ.ID.No.9.Genbank/EMBL/DDBJ登记号P11362，来自生物技术信息国家中心-成纤维细胞生长因子受体-1(IssacchiA.，等，(1990))(822个氨基酸)。1mswkcllfwavlvtatlctarpsptlpeqaqpwgapvevesflvhpgdllqlrcrlrdd61vqsinwlrdgvqlaesnrtritgeevevqdsvpadsglyacvtsspsgsdttyfsvnvsd121alpssedddddddssseeketdntkpnrmpvapywtspekmekklhavpaaktvkfkcps181sgtpnptlrwlkngkefkpdhriggykvryatwsiimdsvvpsdkgnytclveneygsln241htyqldvversphrpilqaglpanktvalgsnvefmckvysdpqphiqwlkhievngski301gpdnlpyvqilktagvnttdkemevlhlrnvsfedageytclagnsiglshhsawltvle361aleerpavmtsplyleiiiyctgafliscmvgsvivykmksgtkksdfhsgmavhklaks421iplrrqvtvsadssasmnsgvllvrpsrlsssgtpmlagvseyelpedprwelprdrlvl481gkplgegcfgqvvlaeaigldkdkpnrvtkvavkmlksdatekdlsdlisememmkmigk541hkniinllgactqdgplyviveyaskgnlreylqarrppgleycynpshnpeeqlsskdl601vscayqvargmeylaskkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglardihhidyykkttng661rlpvkwmapealfdriythqsdvwsfgvllweiftlggspypgvpveelfkllkeghrmd721kpsnctnelymmmrdcwhavpsqrptfkqlvedldrival材料和方法如GavinW.G.1996中所述，此处特别引入作为参考，进行用作卵细胞供体的供体的同步发情和超数排卵，以及显微操作。如之前上文所述，还进行初级体细胞的分离和建立以及用作核体供体的体细胞的转染和制备。初级体细胞为分化的非生殖细胞，其获自利用标准的基于脂类的转染方案目的基因转染的动物组织。转染的细胞经检验并且是如Baguisi等，1999中所述培养和制备的转基因-阳性细胞，它们用作核移植的供体细胞。还应当记住的是去核和重建过程可以在有或没有用DNA染料Hoechst33342或其他用于显现核酸的荧光光敏性组合物将细胞染色下进行。然而优选，以大约0.1-5.0μg/ml使用Hoechst33342用于遗传物质在赤道板处发光。山羊用于该研究的无羊搔痒症的阿尔卑斯式、萨能和多根堡奶山羊的纯的和混合配种的畜群按照优质农业规范(GoodAgroculturePractice)(GAP)指南饲养。山羊胎儿体细胞系的分离用作核体供体的原始山羊胎儿成纤维细胞系源自通过用从转基因的雄性动物新收集的精子向2只非转基因母畜人工受精而产生的35-和40-天的胎儿。胎儿经外科手术取出并且置于平衡磷酸盐缓冲盐水(PBS，无Ca++/Mg++)中。通过剪碎在38℃暴露于0.025％胰蛋白酶、0.5mMEDTA10分钟的胎儿组织而制备单细胞悬液。用胎儿细胞培养基[用核苷、0.1mM2-巯基乙醇、2mML-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)补充的含有10％胎牛血清(FBS)的平衡的199培养基(M199，Gibco)]洗涤细胞，并且在25cm2细颈瓶中培养。原始胎儿细胞汇合的单层在孵育4天后通过胰蛋白酶消化而采集并且随后在培养物中维持或冷藏。供体细胞系的性别鉴定和基因分型从胎儿组织分离基因组DNA，并且通过聚合酶链式反应(PCR)分析靶信号序列以及用于性别鉴定的序列的存在。目标转基因序列通过367-bp序列的扩增而检测。利用zfX/zfY引物对和扩增片段的SacI限制性内切酶消化进行性别鉴定。用于胚胎重建的供体细胞的制备转基因母系(CFF6)用于所有的核移植过程。胎儿体细胞接种在有胎儿细胞培养基的4-孔平皿中并且在培养物中维持(5％CO2，39℃)。48小时后，培养基用新鲜的低血清(0.5％FBS)胎儿细胞培养基替换。在过了接下来的7天后每48至72小时用低血清的胎儿细胞培养基替换培养基。在低血清培养基第一次添加后的第7天，体细胞(用作核体供体)通过胰蛋白酶消化采集。在融合至去核卵细胞之前细胞重悬于用2mML-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)补充的含有10％FBS的平衡M199中1至3小时。卵细胞采集如之前所述(GavinW.G.，1996)进行卵细胞供体同步化和超排卵，并且与切除输精管的雄性以超过48-小时的间隔交配。采集后，卵细胞在用2mML-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)补充的含有10％FBS的平衡M199中培养。胞质体制备和去核弃去附着卵丘细胞的卵细胞。将无卵丘的卵细胞分成两组停滞在分裂中期-II(一个极体)和分裂末期-II的方案(没有清楚可见的极体或部分排出的第二极体的存在)。停滞在分裂中期-II方案的卵细胞首先去核。分配至活化的分裂末期-II方案的卵细胞通过在M199/10％FBS中培养2至4小时而制备。该时期后，所有活化的卵细胞(部分排出的第二极体存在)分为培养-诱导的、钙-活化的分裂末期-II卵细胞(分裂末期-II-Ca)和去核组。在培养期未活化的卵细胞随后在包含7％乙醇的M199，10％FBS中孵育5分钟以诱导活化并且随后在含有10％FBS的M199中培养另外的3小时以达到分裂末期-II(分裂末期-II-EtOH方案)。所有卵细胞用细胞分裂抑素-B(Sigma，含有10％FBS的M199中5μg/ml)在去核前处理15至30分钟。分裂中期-II时期卵细胞用25至30μm的玻璃吸管通过吸出第一个极体和邻近的胞质环绕的极体(胞质的约30％)以除去赤道板而去核。分裂末期-II-Ca和分裂末期-II-EtOH卵细胞通过除去第一个极体和包含部分排出的第二极体的环绕胞质(胞质的10至30％)而去核。去核后，所有卵细胞立即重建。核移植和重建在用于卵细胞去核的相同的培养基中进行供体细胞注射。利用玻璃吸管将一个供体细胞置于透明带和卵质膜之间。电融合和活化过程之前该细胞-卵细胞偶联体在M199中孵育30至60分钟。重建的卵细胞在融合缓冲液(300mM甘露糖醇、0.05mMCaCl2、0.1mMMgSO4、1mMK2HPO4、0.1mM谷胱甘肽、0.1mg/mlBSA)中平衡2分钟。室温下在装满融合培养基的、做成″融合载玻片″(500μm间隙；BTX-Genetronics，SanDiego，CA)的带有2个不锈钢电极的融合室中进行电融合和活化。利用融合载玻片进行融合。融合载玻片置于融合平皿内部，并且该平皿充满足够量的融合缓冲液以覆盖融合载玻片的电极。从培养温箱移出偶联体并且用融合缓冲液洗涤。利用解剖显微镜，偶联体等距离地置于电极之间，核体/胞质体结合处平行于电极。值得注意的是为了促进活化和融合而施于该偶联体的电压范围可在1.0kV/cm至10.0kV/cm。然而优选，最初单独的同时融合和活化的电脉冲电压范围为2.0至3.0kV/cm，最优选2.5kV/cm，优选至少20μs持续时间。此利用BTXECM2001ElectrocellManipulator施加至细胞偶联体。微脉冲的持续时间可为10至80μs。该过程后处理的偶联体一般转至新鲜的融合缓冲液滴。融合处理的偶联体用平衡的SOF/FBS洗涤，随后转入有或没有细胞分裂抑素-B的平衡的SOF/FBS。如果使用细胞分裂抑素-B，其浓度可为1至15μg/ml，最优选5μg/ml。偶联体在空气中包含大约5％CO2的湿润气室中37-39℃孵育。应当注意的是本发明提供的任何方案中均可用甘露糖醇替代细胞分裂抑素-B(含有Ca+2和BSA的HEPES-缓冲的甘露糖醇(0.3mm)基础培养基)。融合后10至90分钟之间开始，最优选在融合后30分钟，测定真正核体/胞质体融合的存在。根据本发明的目的融合的偶联体可接受另外的活化处理(双脉冲)。另外的脉冲电压强度方面可为0.1至5.0kV/cm，时间为10至80μs。然而优选，融合的偶联体接受0.4或2.0kV/cm的另外的单个电脉冲(双脉冲)20μs。可在第一个脉冲至少15分钟后开始另一个脉冲的传递，然而最优选，另一个脉冲开始于最初的融合和活化处理后30分钟至2小时的时候以促进另外的活化。在其他的实验中，非融合的偶联体用单个电脉冲重-融合。最初的融合脉冲后至少15分钟时产生的另一个脉冲的电压和时间范围可为1.0kV/cm至5.0kV/cm，至少10μs。然而更优选，在最初的融合和活化后30分钟至1小时的时候开始的该另一个电脉冲为2.2至3.2kV/cm，20μs以促进融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回至添加5μg/ml细胞分裂抑素-B的SOF/FBS。偶联体在空气中包含大约5％CO2的湿润气室中37-39℃孵育至少20分钟，优选30分钟。本发明当前方法的另外的方案提供在最初的融合和活化处理后至少15分钟，优选30分钟至1小时开始的、用于细胞偶联体的另外的单个电脉冲(双脉冲)，优选2.0kV/cm，至少20μs以促进另外的活化。用于该另外活化的脉冲的电压范围可为1.0至6.0kV/cm。或者，在随后的工作中剩余的融合的偶联体接受在最初的融合和活化处理后至少30分钟开始的、最优选2.0kV/cm，20μs，15至30分钟间隔的至少三个另外的单个电脉冲(四脉冲)以促进另外的活化。然而，应当注意的是在该另外的方案中该另外活化脉冲的电压范围可为1.0至6.0kV/cm，持续时间可为10μs至60μs，其起始可在短至最初的融合处理后15分钟或长至4小时后。在随后的实验中，非融合的偶联体用起始于最初的融合和活化处理后1小时的2.6至3.2kV/cm的单个电脉冲20μs以促进融合而重-融合。所有融合的和融合处理的偶联体返回至有或没有细胞分裂抑素-B的SOF/FBS。如果使用细胞分裂抑素-B，其浓度可为1至15μg/ml，最优选5μg/ml。偶联体在空气中包含大约5％CO2的湿润气室中37-39℃孵育至少30分钟。可用甘露糖醇替代细胞分裂抑素-B。重-融合后30分钟开始，测定到核体/胞质体重-融合的成功。融合处理的偶联体用平衡的SOF/FBS洗涤，随后转入添加5μg/ml放线菌酮的平衡的SOF/FBS。偶联体在空气中包含大约5％CO2的湿润气室中37-39℃孵育至多4小时。放线菌酮处理后，偶联体用至少0.1％牛血清白蛋白，优选至少0.7％，优选0.8％，加上100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的平衡的SOF培养基(SOF/BSA)多次洗涤。偶联体转入平衡的SOF/BSA，并且在包含大约6％O2，5％CO2，其余为氮气的湿润的模块孵育室中37-39℃静止培养24-48小时。具有适当发育时期(24至48小时时1-细胞至8-细胞)的核移植胚胎转入替代同步化受体。核移植胚胎的培养和转入受体所有核移植胚胎在用矿物油覆盖的50μl含有10％FBS的M199的液滴中，在原始山羊输卵管上皮细胞单细胞层上共-培养。胚胎移植至受体之前，胚胎培养物在具有5％CO2的湿润的39℃温箱中维持48小时。受体胚胎移植如之前所述进行22。妊娠和围产期照管对于山羊，在发情期第一天后的第25天开始通过超声波检查确定妊娠。每周评估直至妊娠的第75天，并且其后一月一次评估胎儿的存活力。对于持续超过152天的妊娠，用5mgPGF2α(Lutalyse，Upjohn)诱导分娩。处理后24小时内发生分娩。出生后羊羔立即从母畜移出，并且产后1小时内接受经加热处理的初乳。所克隆动物的基因分型出生后不久，从所克隆的雌性动物(例如，山羊)和替代母畜获得血样和耳朵皮肤的活体检查用于基因组DNA的分离。每个样品首先利用特异性转基因靶蛋白的引物通过PCR分析，并且随后利用特异靶蛋白的cDNA经Southern印迹分析。对于每个样品，用EcoRI(NewBnglandBiolabs，Beverly，MA)消化5μg基因组DNA，在0.7％琼脂糖凝胶(SeaKem，ME)中电泳并且通过本领域已知的标准方法后的毛细管转移固定至尼龙膜(MagnaGraph，MSI，Westboro，MA)上。利用Prime-It试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)经α-32PdCTP标记的1.5kbXhoI至SalIhATcDNA片段探测膜。杂交在65℃过夜进行。斑点用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤并且暴露于X-OMATTMAR感光胶片48小时。乳汁的蛋白质分析对幼年的雌性转基因动物进行两个月-时期泌乳的激素诱导。该动物每天一次用手挤奶以收集用于hAT表达分析的乳汁样品。蛋白质印迹和rhAT活性分析如上述进行(Edmunds，T.等，1998)。在本发明开发过程中进行的实验中，去核和重建后，核体/胞质体偶联体在用1％至15％胎牛血清，优选10％FBS，加入100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的平衡的合成输卵管液体培养基(SOF/FBS)中孵育。融合前偶联体在空气中包含大约5％CO2的湿润气室中37-39℃孵育至少30分钟。本发明允许通过提供活化和融合的转基因胚胎另外的生成而提高转基因方法的效率。这些胚胎可移植入替代动物中或可无性繁殖以及储存或使用。此外通过核移植与体外修饰和选择这些细胞的能力的结合，该方法比先前的转基因胚胎技术更有效。根据本发明，这些转基因克隆的胚胎可用于产生CICM细胞系或其他的胚细胞系。因此，本发明消除了这种必要-获得和体外维持有益于遗传工程技术的未分化细胞系。因此，在一个方面，本发明提供用于克隆哺乳动物的方法。通常，哺乳动物可通过包括以下步骤的核移植方法产生(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得卵细胞；(iii)将所述的卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成转基因胚胎；(vi)培养所述的转基因胚胎直至大于2-细胞发育阶段；和(vii)将所述转基因胚胎移植入宿主哺乳动物中使得胚胎发育成胎儿；其中所述的转基因胚胎包含目的跨膜受体蛋白的DNA序列。本发明还包括克隆遗传改造的或转基因的哺乳动物的方法，通过该方法，在该分化的哺乳动物细胞或细胞核插入去核的卵细胞之前，在该分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰所需的基因。本发明还提供根据上述方法获得的哺乳动物，以及那些哺乳动物的子代。本发明优选用于克隆山羊。本发明进一步提供在细胞、组织和器官移植的领域中核移植胎儿和核移植以及嵌合子代的用途。在另一个方面，本发明提供用于产生CICM细胞的方法。该方法包括(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得卵细胞；(iii)将所述的卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成转基因胚胎；(vii)培养所述的转基因胚胎直至大于2-细胞发育阶段；和(viii)培养获自所述培养活化的胚胎的细胞以获得CICM细胞；其中所述的转基因胚胎包含目的跨膜受体蛋白的DNA序列。此外，源自此处所述方法的CICM细胞可方便地用于细胞、组织和器官移植的领域，或用于胎儿或子代，包括转基因的胎儿或子代的产生中。分化的哺乳动物细胞为已经过早期胚胎时期的那些细胞。已分化的细胞可源自外胚层、中胚层或内胚层组织或细胞层。还可使用一种替代方法，其中细胞偶联体暴露于多次电击以增强融合和活化。通常，哺乳动物可通过包括以下步骤的核移植方法产生(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得卵细胞；(iii)将所述的卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；施加至少两次电击给细胞-偶联体以引发所述细胞偶联体的融合和活化而成为活化的和融合的胚胎，(vii)培养所述的活化和融合的胚胎直至大于2-细胞发育阶段；和(viii)将所述第一个和/或第二个转基因胚胎移植入宿主哺乳动物中使得胚胎发育成胎儿；其中所述的至少两次电击的第二次在最初电击的至少15分钟后给予。哺乳动物细胞，包括人细胞，可通过众所周知的方法获得。对本发明有用的哺乳动物细胞包括，举例来说，上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、心肌细胞及其他肌细胞等等。此外，用于核移植的哺乳动物细胞可从不同器官获得，例如，皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾、尿道及其他泌尿器官等等。这些仅仅为合适的供体细胞的实例。合适的供体细胞，即对本发明有用的细胞可从身体的任何细胞或器官获得。此包括所有的体或生殖细胞。成纤维细胞为一种理想的细胞类型，因为其可大量地从正发育的胎儿和成年动物获得。成纤维细胞为有点分化的以及因此，先前被认为是用于克隆方法的不良细胞类型。重要的是，这些细胞可在体外以快速的倍增时间很容易地繁殖并且可经无性繁殖用于基因寻靶方法中。此外由于使用已分化的细胞类型，本发明是新的。因为细胞可在体外很容易地繁殖、遗传修饰和选择，所以本发明是方便的。卵细胞的合适的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长类等等。优选，卵细胞获自山羊和有蹄类，并且最优选山羊。用于卵细胞分离的方法在本领域为大家所熟知。主要地，此将包括从哺乳动物，例如山羊的卵巢或生殖道分离卵细胞。山羊卵细胞的易于获得的来源来自激素诱导的母畜。为了如遗传工程、核移植和克隆技术的成功应用，在这些细胞可被用作核移植的受体细胞之前，以及在其可通过精子受精而发育成为胚胎之前，卵细胞可优选在体内成熟。分裂中期II时期的卵细胞，其已在体内成熟，已经成功地用于核移植技术中。基本上，成熟的分裂中期II卵细胞从发情期开始后或人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似的激素注射后的几个小时非超排卵或超排卵动物通过手术收集。此外，应当注意的是通过转基因技术修饰动物基因组的能力提供了用于重组蛋白质制造的新的替代方案。转基因农畜乳汁中人重组药物的产生解决了涉及微生物生物反应器(例如，缺乏翻译后修饰、错误的蛋白质折叠、高纯化成本)或动物细胞生物反应器(例如，高投资费用、昂贵的培养基、低产量)的许多问题。已报道在去核和核移植时卵细胞的成熟阶段对于核移植方法的成功是很重要的。(First和Prather1991)。通常，成功的哺乳动物胚胎克隆操作使用分裂中期II时期的卵细胞作为受体卵细胞，因为认为在该时期，卵细胞可以被“活化”或被充分″活化″以象处理受精精子一样处理引入的细胞核。家畜中，尤其是山羊，卵细胞的活化期通常发生在精子接触和穿透进入卵细胞质膜的时候。定时的成熟期后，其约10至40小时，优选约16-18小时，卵细胞被去核。去核之前，卵细胞在卵丘细胞除去之前优选被移出且置于每毫升包含1毫克透明质酸酶的EMCARE培养基中。此可通过用很细内径的吸管反复吹吸或通过简短地涡旋而完成。剥离的卵细胞随后用于筛选极体，并且所选的通过极体的存在而测定的分裂中期II卵细胞随后用于核移植。随后去核。去核可通过如美国专利4,994,384中所述的已知方法完成，此处引入作为参考。例如，分裂中期II卵细胞可置于EMCARE培养基中，优选包含每毫升7.5微克的细胞分裂抑素B，用于立即去核，或者可置于合适的培养基中，例如诸如添加10％FBS的CRlaa的胚胎培养基中，并且随后去核，优选不超过24小时之后，更优选16-18小时后。去核可利用微量移液管显微操作完成以除去极体和邻近的胞质。卵细胞可随后经筛选以鉴定其中已经成功去核的那些。该筛选可通过用每毫升EMCARE或SOF中1微克33342Hoechst染料染色卵细胞，并且随后在紫外线照射下观察卵细胞少于10秒钟而完成。已经成功去核的卵细胞随后可置于合适的培养基中。在本发明中，受体卵细胞优选是在体外或体内成熟起始后约10小时至约40小时范围内去核的，更优选在体外或体内成熟起始后从约16小时至约24小时的，而最优选在体外或体内成熟起始后约16-18小时的。与去核卵细胞相同种类的单个哺乳动物细胞随后将移植入所用去核卵细胞的卵黄膜周隙中以产生活化的胚胎。哺乳动物细胞和去核的卵细胞将根据本领域已知的方法用于产生活化的胚胎。例如，细胞可通过电融合而融合。电融合通过提供足以引起质膜瞬间击穿的电脉冲而完成。由于膜快速重组，这种质膜的击穿是很短暂的。因此，如果两个邻近的膜被诱导击穿并且在重组时脂双分子层混合，则两个细胞之间将打开小的通道。由于这种小孔隙的热力学不稳定性，其扩大直至两个细胞成为一体。对于该方法的进一步讨论，参见Prather等的美国专利4,997,384(此处整体引入作为参考)。可使用各种电融合培养基包括例如，蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇和磷酸盐缓冲溶液。还可以利用仙台病毒作为融合剂完成融合(Ponimaskin等，2000)。此外，有时候(例如使用小的供体细胞核)相比利用电穿孔融合，将细胞核直接注射入卵细胞可能是优选的。这样的技术在Collas和Barnes，MOL.REPROD.DEV.，38264-267(1994)中公开，此处整体引入作为参考。活化的胚胎可通过已知的方法活化。这样的方法包括，例如，在亚-生理学温度培养活化的胚胎，基本上通过将冷的，或实际上凉的温度冲击应用至该活化的胚胎。通过在室温下培养该活化的胚胎可能是最方便完成的，其相对于胚胎通常暴露的生理学温度条件是冷的。或者，可通过已知的活化剂的应用完成活化。例如，已表明核移植后在受精期间卵细胞经精子的穿透可活化灌注的卵细胞而产生更多数量的活的妊娠胎以及多个遗传相同的幼仔。此外，如电和化学冲击的处理可用于在融合后活化NT胚胎。合适的卵细胞活化法为Susko-Parrish等的美国专利5,496,720的主题，此处整体引入作为参考。另外，活化最好同时完成，虽然确实存在按序活化的方案。通过活化发生以下细胞事件(i)提高卵细胞中二价阳离子的水平，和(ii)降低卵细胞中细胞蛋白质的磷酸化作用。上述事件可通过将二价阳离子例如镁、锶、钡或钙，例如以离子载体的形式引入卵细胞胞质中，经外源刺激而发生。提高二阶阳离子水平的其他方法包括电击的使用，乙醇的处理和笼状(caged)螯合剂的处理。用已知方法可以降低磷酸化作用，例如，通过激酶抑制剂的加入，如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如6-二甲基氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。或者，胞内蛋白质磷酸化可以通过向卵细胞中导入磷酸酶，例如磷酸酶2A和磷酸酶2B而抑制。治疗组合物本发明的蛋白质可根据已知的方法配制以制备药学有用的组合物，在此本发明的分子或其功能衍生物与药学可接受载体赋形剂混合而组合。例如，为了形成适于有效给药的药学可接受组合物，描述了合适的赋形剂和包括其他的人蛋白质，例如人血清白蛋白的制剂，所述组合物包含有效量的本发明的一种或多种蛋白质以及合适量的载体赋形剂。用于本发明的药物组合物可利用一种或多种生理可接受的载体或赋形剂以常规方法配制。因此，重组跨膜受体蛋白质和其生理学可接受盐和溶剂化物可经配制而用于通过吸入法或吹入法(通过口或鼻子)或口服、口腔含化的、肠胃外的或直肠的给药。对于口服给药，药物组合物可采取例如片剂或胶囊的形式，其通过常规方法与药学可接受赋形剂如粘合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)而制备。片剂可用本领域熟知的方法包衣。用于口服的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形成，或者其在与水或其他合适的赋形剂组合使用前可以干燥的产品存在。上述液体制剂可通过常规方法与药学可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤锥素衍生物或氢化的食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性赋形剂(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)制备。视情况，该制剂还可包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服的制剂可适当配制以使活性化合物受控释放。对于口腔含化给药组合物可采取用常规方法配制的片剂或糖锭形式。对于通过吸入法的给药，用于本发明的重组跨膜受体以用密闭包装或喷雾器呈递的气雾喷剂的形式，借助合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体而方便地递送。在密闭气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供一个用于递送计量量的阀而确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可配制成包含化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。本发明的重组跨膜受体可配制用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注的肠胃外给药。用于注射的制剂可以和添加的防腐剂一起以单位剂型存在，例如，在安瓿中或在多-剂量容器中。该组合物可采取如油或水性赋形剂中的悬浮液、溶液或乳液形式并且可包含配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉剂形式而在使用前用于和合适的赋形剂，例如无菌的无热原水组合。该化合物还可配制为直肠组合物如栓剂或滞留灌肠剂，例如包含常规的栓剂成分如可可脂或其他的甘油酯。除了之前描述的制剂，本发明的重组跨膜受体蛋白质还可配制为长效制剂。上述长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌肉注射而给药。因此，例如，该化合物可与合适的聚合或疏水材料(例如可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂或如微溶的衍生物，例如微溶盐一起配制。如果需要，该组合物可存在于包装或分配器装置中，其包含一种或多种包含活性成分的单位剂型。该包装可例如包括金属或塑料薄膜，如泡罩包装。该包装或分配器装置可附有给药的说明书。本发明的一些重组跨膜受体蛋白质在癌症治疗中是治疗有效的(FGFR1至4)。因此其可以与常规化疗剂或有用于目的化合物靶向递送的其他试剂联合配制。常规化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、各种天然产品(例如，长春花碱、表鬼臼毒素、抗生素和氨基酸-减少的酶)、激素和激素拮抗药。试剂的特定种类包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂复合物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药和雄激素。一些典型的化合物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、长春花碱、长春新碱、阿霉素、红比霉素、丝裂霉素、顺氯氨铂、羟基脲、脱氢可的松、己酸羟孕酮、甲羟基孕酮、甲地孕酮、乙芪酚、乙炔雌二醇、三苯氧胺、丙酸睾酮和氟羟甲睾酮。在治疗乳腺癌中，例如优选三苯氧胺。因此，可以理解的是此处提供的用于跨膜受体蛋白质转基因生产的本发明的实施方案仅仅用于解释本发明原理的应用。根据上面的描述很显然的是用于要求保护的转基因生物药物的治疗用途所公开方法的形式的变化、所用的方法和要素的应用是新的，并且可以在不背离本发明的精神或所附的权利要求的范围下进行改进和/或借用。引用的和引入作为参考的文献1.AlberioR，等，MammalianOocyteActivationLessonsfromtheSpermandImplicationsforNuclearTransfer，INTJDEVBIOL2001；45797-809。2.AlberioR，等，RemodelingofDonorNuclei，DNASynthesis，andPloidyofBovineCumulusCellNuclearTransferEmbryosEffectofActivationProtocol，MOLREPRODDEV2001；59371-379。3.BaguisiA，等，ProductionofGoatsbySomaticCellNuclearTransfer，NATBIOTECH1999；17456-461。4.BertoglioD.M.，TNF-αPotentiatesIL-4/IL-13-inducedIL-13R-alpha2expression，ANN.N.Y.ACAD.Sci.973207-09(2002)。5.BondioliKR，WesthusinMEAndCRLoony，ProductionofIdenticalBovineOffspringbyNuclearTransfer，THERIOGENOLOGY1990；33165-174。6.Brennan，M.B.，DrugDiscovery.FilteringOutFailuresEarlyInThePipeline，CHEMICAL&ENGINEERINGNEWS，(2000)563-73。7.Bronstein，I.，等，ChemiluminescentAndBioluminescentReporterGeneAssays，ANALYTICALBIOCHEMISTRY，(1994)219，169-81。8.Campbell，KHS，McwhireJ，RitchieWAAndI.Wilmut.SheepClonedbyNuclearTransferFromaCulturedCellLine，NATURE1996；38064-66。9.CibelliJB，等，ClonedTransgenicCalvesProducedFromNonquiescentFetalFibroblasts.SCIENCE1998；2801256-1258。10.Civelli，O.，Nothacker，H.-P.，&Reinscheid，R.，ReversePhysiologyDiscoveryOfTheNoyelNeuropeptide，OyphaninFQ/Nociceptin.CRITICALREVIEWSINNEUROBIOLOGY，(1998)12，163-76。11.CollasP.，ElectricallyInducedCalciumElevation，Activation，andParthenogenicDevelopmentofBovineOocytes.MOLREPROD1993；34212-223。12.CorryD.，等，InductionandRegulationoftheIgEResponse，NATURE(1999)，Supplementto402(6760)，PagesB18-B23。13.deLecea，L.等，TheHypocretinsHypothalamus-SpecificPeptidesWithNeuroexcitatoryActivity，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.95(1)，322-327(1998)。14.Dionne，C.A.，等.，CloningAndExpressionOfTwoDistinctHigh-AffinityReceptorsCross-ReactingWithAcidicAndBasicFibroblastGrowthFactors，EMBOJ.9(9)，2685-2692(1990)。15.Drews，J.，DrugDiscoveryAHistoricalPerspective，SCIENCE(2000)，287，1960-64。16.Gavin，W.G.，GeneTransferIntoGoatEmbryos，TRANSGENICANIMALS-GENERATIONANDUSE，L.M.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uGluGlnTyrSerProSerTyrPro770775780AspThrArgSerSerCysSerSerGlyAspAspSerValPheSerPro785790795800AspProMetProTyrGluProCysLeuProGlnTyrProHisIleAsn805810815GlySerValLysThr820<210>9<211>759<212>PRT<213>人<220><221>misc_特征<223>成纤维细胞生长因子受体-l<300><308>Genbank/EMBL/DDBJ登记号P11362<309>1991-05-01<313>(1)..(759)<400>9MetSerTrpLysCysLeuLeuPheTrpAlaValLeuValThrAlaThr151015LeuCysThrAlaArgProSerProThrLeuProGluGlnAlaGlnPro202530TrpGlyAlaProValGluValGluSerPheLeuValHisProGlyAsp354045LeuLeuGlnLeuArgCysArgLeuArgAspAspValGlnSerIleAsn505560TrpLeuArgAspGlyValGlnLeuAlaGluSerAsnArgThrArgIle65707580ThrGlyGluGluValGluValGlnAspSerValProAlaAspSerGly859095LeuTyrAlaCysValThrSerSerProSerGlySerAspThrThrTyr100105110PheSerValAsnValSerAspAlaLeuProSerSerGluAspAspAsp115120125AspAspAspAspSerSerSerGluGluLysGluThrAspAsnThrLys130135140ProAsnArgMetProValAlaProTyrTrpThrSerProGluLysMet145150155160GluLysLysLeuHisAlaValProAlaAlaLysThrValLysPheLys165170175CysProSerSerGlyThrProAsnProThrLeuArgTrpLeuLysAsn180185190GlyLysGluPheLysProAspHisArgIleGlyGlyTyrLysValArg195200205TyrAlaThrTrpSerIleIleMetAspSerValValProSerAspLys210215220GlyAsnTyrThrCysIleValGluAsnGluTyrGlySerIleAsnHis225230235240ThrTyrGlnLeuAspValValGluArgSerProHisArgProIleLeu245250255GlnAlaGlyLeuProAlaAsnLysThrValAlaLeuGlySerAsnVal260265270GluPheMetCysLysValTyrSerAspProGlnProHisIleGlnTrp275280285LeuLysHisIleGluValAsnGlySerLysIleGlyProAspAsnLeu290295300ProTyrValGlnIleLeuLysThrAlaGlyValAsnThrThrAspLys305310315320GluMetGluValLeuHisLeuArgAsnValSerPheGluAspAlaGly325330335GluTyrThrCysLeuAlaGlyAsnSerIleGlyLeuSerHisHisSer340345350AlaTrpLeuThrValLeuGluAlaLeuGluGluArgProAlaValMet355360365ThrSerProLeuTyrLeuGluIleIleIleTyrCysThrGlyAlaPhe370375380LeuIleSerCysMetValGlySerValIleValTyrLysMetLysSer385390395400GlyThrLysLysSerAspPheHisSerGlnMetAlaValHisLysLeu405410415AlaLysSerIleProLeuArgArgGlnValThrValSerAlaAspSer420425430SerAlaSerMetAsnSerGlyValLeuLeuValArgProSerArgLeu435440445SerSerSerGlyThrProMetLeuAlaGlyValSerGluTyrGluLeu450455460ProGluAspProArgTrpGluLeuProArgAspArgLeuValLeuGly465470475480LysProLeuGlyGluGlyCysPheGlyGlnValValLeuAlaGluAla485490495IleGlyLeuAspLysAspLysProAsnArgValThrLysValAlaVal500505510LysMetLeuLysSerAspAlaThrGluLysAspLeuSerAspLeuIle515520525SerGluMetGluMetMetLysMetIleGlyLysHisLysAsnIleIle530535540AsnLeuLeuGlyAlaCysThrGlnAspGlyProLeuTyrValIleVal545550555560GluTyrAlaSerLysGlyAsnLeuArgGluTyrLeuGlnAlaArgArg565570575ProProGlyLeuGluTyrCysTyrAsnProSerHisAsnProGluGlu580585590GlnLeuSerSerLysAspLeuValSerCysAlaTyrGlnValAlaArg595600605GlyMetGluTyrLeuAlaSerLysLysCysIleHisArgAspLeuAla610615620AlaArgAsnValLeuValThrGluAspAsnValMetLysIleAlaAsp625630635640PheGlyLeuAlaArgAspIleHisHisIleAspTyrTyrLysLysThr645650655ThrAsnGlyArgLeuProValLysTrpMetAlaProGluAlaLeuPhe660665670AspArgIleTyrThrHisGlnSerAspValTrpSerPheGlyValLeu675680685LeuTrpGluIlePheThrLeuGlyGlySerProTyrProGlyValPro690695700ValGluGluLeuPheLysLeuLeuLysGluGlyHisArgMetAspLys705710715720ProSerAsnCysThrAsnGluLeuTyrMetMetMetArgAspCysTrp725730735HisAlaValProSerGlnArgProThrPheLysGlnLeuValGluAsp740745750LeuAspArgIleValAlaLeu75权利要求1.通过核移植方法克隆非-人哺乳动物的方法，包括(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得至少一个卵细胞；(iii)将所述的至少一个卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成转基因胚胎；(vii)培养所述的转基因胚胎直至大于2-细胞发育阶段；和(viii)(viii)将所述转基因胚胎移植入宿主哺乳动物中使得胚胎发育成胎儿；其中所需的已分化的细胞或细胞核包含重组转基因；并且，其中所述的重组转基因编码目的重组跨膜受体蛋白。2.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自中胚层。3.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自内胚层。4.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自外胚层。5.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。6.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。7.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自成纤维细胞。8.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自有蹄类。9.权利要求1或8的方法，其中所述供体细胞或者供体细胞核来自选自牛、羊、猪、马、山羊和水牛的有蹄类。10.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自成体非人哺乳动物体细胞。11.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。12.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾和尿道的器官。13.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵细胞在去核前是体内成熟的。14.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵细胞在去核前是体外成熟的。15.权利要求1的方法，其中所述的非人哺乳动物为啮齿类。16.权利要求1的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞为非-休眠体细胞或分离自所述非-休眠体细胞的核。17.权利要求1或8的方法，其中胎儿发育为子代。18.权利要求1的方法，其中将所述的至少一个卵细胞在体外成熟起始后约10至60小时去核。19.权利要求1的方法，其中在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核的卵细胞之前，在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰所需的基因。20.权利要求1或19的方法生成的子代。21.权利要求19的生成的子代，进一步包括其中所述核移植方法产生的子代为嵌合的。22.权利要求1的方法，其中细胞分裂抑素-B用于该克隆方案。23.权利要求1的方法，其中细胞分裂抑素-B不用于该克隆方案。24.用于产生培养的内细胞团细胞的方法，包括(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得至少一个卵细胞；(iii)将所述的至少一个卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入该去核的卵细胞；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成最初的转基因胚胎；(vi)活化细胞偶联体，其不融合以产生最初的转基因胚胎，而是在首次电击后通过提供包括另一电击的至少一个另外的活化方案被活化，以形成第二个转基因胚胎；和(vi)培养获自所述培养的活化胚胎的细胞以获得培养的内细胞团细胞；其中所述的转基因胚胎编码目的重组跨膜受体蛋白。25.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自中胚层。26.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自内胚层。27.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自外胚层。28.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自胎儿体细胞组织。29.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。30.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自成纤维细胞。31.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自有蹄类。32.权利要求24或31的方法，其中所述供体细胞或者供体细胞核来自选自牛、羊、猪、马、山羊和水牛的有蹄类。33.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自成体哺乳动物体细胞。34.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。35.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核来源的所述供体的已分化的哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾和尿道的器官。36.权利要求24的方法，其中所述的至少一个卵细胞在去核前是体内成熟的。37.权利要求24的方法，其中所述的至少一个卵细胞在去核前是体外成熟的。38.权利要求24的方法，其中所述的哺乳动物细胞源自啮齿类。39.权利要求24的方法，其中用作供体核或供体细胞核的所述供体的已分化的哺乳动物细胞为非-休眠体细胞或分离自所述非-休眠体细胞的核。40.权利要求24或31的方法，其中任何所述培养的内细胞团细胞胎儿发育成非人子代。41.权利要求24的方法，其中将所述的至少一个卵细胞在体外成熟起始后约10至60小时去核。42.权利要求24的方法，其中在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核的卵细胞之前，在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰所需的基因。43.权利要求24或42的方法生成的子代。44.权利要求42的生成的子代，进一步包括其中所述核移植方法产生的任何非人子代为嵌合的。45.权利要求24的方法，其中细胞分裂抑素-B用于该方案。46.权利要求24的方法，其中细胞分裂抑素-B不用于该方案。47.权利要求24的方法，其中细胞分裂抑素-B用于该方案。48.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质为连续的DNA编码序列的产物。49.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质在宿主转基因哺乳动物的乳汁中以至少每升1克的水平表达。50.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质在乳腺上皮细胞中泌乳诱导时表达。51.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质表达时保留其生物学活性。52.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质改造成作为天然跨膜蛋白质的显性失活类型起作用。53.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质缺乏任何生物学功能。54.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质选自以下物质，包括IL-13受体、阿立新受体、黑色素浓集激素受体、成纤维细胞生长因子受体、CFTR受体、CD4受体和钙粘蛋白。55.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述重组跨膜受体蛋白为选自以下物质，包括IL-13受体、阿立新受体、黑色素浓集激素受体、成纤维细胞生长因子受体、CFTR受体、CD4受体和钙粘蛋白的生物蛋白质的显性失活类型。56.权利要求1的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质选自以下物质，包括通道蛋白、抗药性调节剂蛋白和离子孔蛋白。57权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质为连续的DNA编码序列的产物。58.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质在宿主转基因哺乳动物的乳汁中以至少每升1克的水平表达。59.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质在乳腺上皮细胞中泌乳诱导时表达。60.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质表达时保留其生物学活性。61.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质被改造成作为天然跨膜蛋白质的显性失活类型起作用。62.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质缺乏任何生物学功能。63.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质选自以下物质，包括IL-13受体、阿立新受体、黑色素浓集激素受体、成纤维细胞生长因子受体、CFTR受体、CD4受体和钙粘蛋白。64.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述重组跨膜受体蛋白为选自以下物质，包括IL-13受体、阿立新受体、黑色素浓集激素受体、成纤维细胞生长因子受体、CFTR受体、CD4受体和钙粘蛋白的生物蛋白质的显性失活类型。65.权利要求24的重组跨膜受体蛋白，其中所述跨膜蛋白质选自以下物质，包括通道蛋白、抗药性调节剂蛋白和离子孔蛋白。66.通过核移植方法克隆非人哺乳动物的方法，包括(i)获得所需的已分化的哺乳动物细胞用作供体细胞核的来源；(ii)从与供体细胞核来源的细胞相同种类的哺乳动物获得至少一个卵细胞；(iii)将所述的卵细胞去核；(iv)将所需的已分化的细胞或细胞核移植入去核卵细胞内；施加至少两次电击给细胞偶联体以引发所述细胞偶联体的融合和活化而成为活化的和融合的胚胎；(vii)培养所述活化的和融合的胚胎直至大于2-细胞发育阶段；(viii)将所述融合的胚胎移植入宿主哺乳动物中使得胚胎发育成胎儿；其中所述的至少两次电击的第二次在最初电击的至少15分钟后给予；其中在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核的卵细胞之前，在所述已分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、除去或修饰所需的基因；和其中所述所需的基因编码能在乳腺上皮细胞中泌乳诱导时表达的目的重组跨膜受体蛋白。67.治疗疾病的方法，包括将有效量的转基因产生的跨膜受体蛋白或其显性失活类型给药使得所述化合物与已经或将要暴露于疾病情形的细胞或细胞组接触，其中所述化合物用于干扰该疾病的继续发展。68.权利要求67的方法，其中所述疾病为哮喘。69.权利要求67的方法，其中所述疾病为过敏症。70.权利要求67的方法，其中所述疾病为牛皮癣。71.权利要求67的方法，其中所述疾病为FGRF过量产生引起的癌症。72.权利要求67的方法，其中所述疾病为炎症。73.治疗肥胖的方法，包括将有效量的转基因产生的跨膜受体蛋白或其显性失活类型给药。74.权利要求67的方法，其中所述跨膜受体蛋白选自阿立新受体、黑色素浓集激素受体和ghrelin受体。75.权利要求67的方法，其中所述化合物的给药通过药物制剂如片剂的口服完成。全文摘要本发明提供数据表明转基因动物乳汁中跨膜受体蛋白的转基因哺乳动物的产生，提供用作治疗分子的这些蛋白和其显性失活类型的产生方法。文档编号C07K14/715GK1852977SQ200480026566公开日2006年10月25日申请日期2004年9月15日优先权日2003年9月15日发明者陈理浩申请人:Gtc生物治疗学公司