专利名称：可诱导的粘着斑激酶细胞试验的制作方法
背景技术：
本发明涉及用于诱导粘着斑激酶(FAK)基因表达的方法和组合物，该粘着斑激酶(FAK)基因编码参与生长因子应答和细胞迁移的信号蛋白，并且还与疾病相关。本发明还涉及FAK抑制剂的鉴定。
FAK是一种胞质非受体酪氨酸激酶。FAK转导来自不同种类的刺激(如整合蛋白、细胞因子、趋化因子和生长因子)的信号，来控制包括细胞增殖、迁移、形态和细胞存活在内的多种细胞通路和过程。除了在多数组织类型表达外，已发现FAK在大多数人类癌症，尤其在高度侵染性转移中水平升高。已证明人肿瘤细胞中显性失活的(dominant-negative)FAK相关非激酶(FRNK)的表达导致细胞成圆形，粘着斑不可逆丧失以及随后的细胞死亡。此外，FRNK的可控表达使FAK的酪氨酸磷酸化减少，说明FAK磷酸化的抑制能产生治疗人类癌症的治疗指数。
虽然导致FAK活化的确切机制并不十分清楚，但认为导致Y397(位于397位点的酪氨酸残基)磷酸化的FAK酶活性在整合蛋白信号转导中是关键步骤(Guan，JL，Int.J.Biochem.Cell.Biol.291085-96，1997)。对于将胞外基质(ECM)蛋白与细胞肌动蛋白细胞骨架和细胞核连接，从而调节细胞形态、组织结构和粘附介导的基因表达来说，跨膜整合蛋白受体是很重要的。整合蛋白受体和FAK同位于粘着斑位点将会导致FAK在Y397残基磷酸化，产生一个Src家族酪氨酸激酶的SH2停靠位点。Src与磷酸酪氨酸FAKY397的结合导致FAK在不同下游酪氨酸残基处，包括Y576、Y577、Y861和Y925优先被磷酸化。FAK酪氨酸残基(Y576/Y577)的磷酸化使得FAK激酶活性增强，并转导信号来调节细胞骨架重组、细胞繁殖、细胞存活和细胞迁移。
由于参与整合蛋白信号级联的激酶和底物的多样性，需要设计对特定激酶特异的试验。本发明的目的是设计并开发一种FAK药物发现途径，该途径追踪FAK的生物化学机理。若干外源性刺激都能导致FAK磷酸化，如1)整合蛋白与ECM配体结合(例如，整合蛋白β1与纤连蛋白结合)；2)细胞因子或趋化因子刺激(例如，内皮素1/2、铃蟾肽或PMA)；3)酪氨酸激酶受体的生长因子刺激(例如，PDGFBB)；和4)整合蛋白抗体交联(例如，抗-β1)。相反，使FAK失活的最可行的外源性控制就是阻断细胞-细胞和细胞-ECM的接触(例如，细胞悬浮)。
发明概述本发明涉及鉴定粘着斑激酶(FAK)的细胞-活性(cell-active)抑制剂的方法，包括(a)在哺乳动物细胞中加入诱导剂诱导编码FAK的基因表达，其中所述哺乳动物细胞被所述基因稳定转染，且所述基因在所述诱导剂存在时表达；(b)加入被测化合物；(c)利用FAK捕捉剂(capture agent)捕捉表达的FAK；并(d)检测所述FAK的磷酸化。
本发明的实施方式提供了一种测定被测化合物的细胞毒性的方法，包括用编码FAK的基因稳定转染哺乳动物细胞，其中所述基因在诱导剂存在时表达；加入诱导剂诱导所述编码FAK的基因表达；加入被测化合物；将细胞毒性指示剂加至所述细胞；并，检测所述被测化合物的细胞毒性。在某些实施方式中，通过细胞毒性指示剂的比色转化来确定被测化合物的细胞毒性，其中细胞毒性指示剂的转化量与活细胞数成正比。
本发明的实施方式提供了一种用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，其中所述重组的核酸分子选自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQID NO7和SEQ ID NO8，其中所述序列的表达需要诱导剂的存在。
本发明的实施方式提供了一种用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，该重组的核酸分子编码含有选自SEQ ID NO1、2、3和4的序列的蛋白，其中所述蛋白的表达需要诱导剂的存在。
图1显示了利用辣根过氧化物酶-偶联的磷酸酪氨酸抗体(pY54HRP)检测磷酸化的FAK的示意图。
图2显示了利用未偶联的磷酸酪氨酸抗体(pY54)，之后使用鼠的辣根过氧化物酶的第二抗体来检测磷酸化的FAK的示意图。
图3显示了本发明的FAK可诱导性以细胞为基础的试验的示意图。
发明详述本发明涉及FAK可诱导性以细胞为基础的试验。所述以细胞为基础的试验利用了FAK的生物学和可诱导的基因表达系统，从而外源地控制FAK表达和在397位点处酪氨酸残基(Y397)的FAK磷酸化。通过利用FAKY397磷酸化-特异性的以细胞为基础的试验，而不是通常的磷酸酪氨酸系统，可以避免鉴定出假阳性抑制剂。本发明以细胞为基础的试验是灵活的，它能测定Y397位的FAK磷酸化、全部FAK磷酸化，鉴定突变的FAK蛋白并测定蛋白与磷酸酪氨酸的组合。
本发明FAK可诱导性以细胞为基础的试验具有优势，因为它严格控制了FAK的异位基础水平的表达，并通过外源性刺激使FAK基因表达快速地去抑制(de-repression)。以细胞为基础的试验是灵活的，这样如磷酸酪氨酸FAKY397、全部FAK磷酸酪氨酸分布图、FAK或突变蛋白、或蛋白和磷酸酪氨酸的一些组合的测定，最终读数与FAK的生物学机械相关。此外，已将本发明成功地用于鉴定若干FAK抑制剂。如本文中所用，“严格控制”是指在外源性刺激存在时出现的FAK基因的可控表达。换句话说，本发明提供了一种可诱导FAK性基因表达系统，在该系统中，在合适的诱导剂存在条件下可诱导FAK表达。本发明提供了一种可诱导FAK表达的方法，其中调节表达FAK基因并不对细胞的生存力产生不利影响。
本发明的实施方式涉及一种筛选FAK抑制剂的以细胞为基础的试验。以细胞为基础的试验利用了FAK的生物学和可诱导的基因表达系统，从而外源性控制FAK表达以及在位点397处酪氨酸残基(Y397)的FAK磷酸化。所述以细胞为基础的试验与FAK的生物学机械地相关，并测定FAK磷酸化中的变化。通过使用FAKY397磷酸化-特异性的以细胞为基础的试验，而不是通常的磷酸酪氨酸系统，可避免鉴定出假阳性抑制剂。本发明的以细胞为基础的试验是灵活的，它能测定FAK磷酸化、全部FAK磷酸化，鉴定突变的FAK蛋白并测定蛋白与磷酸酪氨酸的组合。
本发明的实施方式提供了一种鉴定FAK的细胞-活性抑制剂的方法，包括用编码FAK的基因稳定转染哺乳动物细胞，其中所述基因在诱导剂存在时表达；加入诱导剂来诱导所述编码FAK的基因表达；加入被测化合物；利用FAK捕捉剂捕捉表达的FAK；使捕捉的FAK暴露于抗-磷酸酪氨酸的抗体；并检测所述FAK的磷酸化。在一些实施方式中，所述FAK磷酸化的程度通过抗-磷酸-酪氨酸抗体与所捕捉FAK的结合来确定，其中结合所捕捉的FAK的抗-磷酸-酪氨酸抗体量与所述FAK的磷酸化量成比例。
在本发明的某些实施方式中，鉴定FAK的细胞-活性抑制剂的方法包括将哺乳动物细胞包被在第一固相上的可选步骤。所述第一固相优选是第一微量滴定板的孔。在本发明的另一个实施方式中，在捕捉表达的FAK之前，用裂解缓冲液将包被在第一固相上的细胞裂解。所述裂解缓冲液可选包含可溶性去污剂。在某些实施方式中，FAK捕捉剂被包被在第二固相上，该第二固相优选是第二微量滴定板的孔。
在某些实施方式中，被测化合物含抑制Y397处的FAK磷酸化。
本发明的实施方式提供了一种测定被测化合物细胞毒性的方法，包括用编码FAK的基因稳定转染哺乳动物细胞，其中所述基因在诱导剂存在时表达；加入诱导剂来诱导所述编码FAK的基因的表达；加入被测化合物；将细胞毒性指示剂加至所述细胞；并，检测被测化合物的细胞毒性。在某些实施方式中，通过细胞毒性指示剂的比色转化来确定被测化合物的细胞毒性，其中细胞毒性指示剂的转化量与活细胞数成比例。
在本发明的某些实施方式中，测定被测化合物细胞毒性的方法包括将哺乳动物细胞包被在固相上的可选步骤。该固相优选是第一微量滴定板的孔。
本发明的实施方式提供了一种鉴定粘着斑激酶(FAK)的细胞-活性抑制剂的方法，包括在第一固相上包被一群均一的哺乳动物细胞，使细胞与第一固相粘附，其中所述细胞被编码FAK的基因稳定转染，且其中所述基因在诱导剂存在时表达；加入诱导剂来诱导所述编码FAK的基因表达；加入被测化合物；使粘附细胞溶解来释放细胞裂解物；用FAK捕捉剂包被第二固相，使所述FAK捕捉剂与第二固相附着；使细胞裂解物暴露于附着的FAK捕捉剂来使FAK捕捉剂捕捉FAK；使捕捉的FAK暴露于抗-磷酸-酪氨酸的抗体；并，测定抗-磷酸-酪氨酸抗体与所捕捉的FAK的结合，其中与所捕捉的FAK结合的抗-磷酸-酪氨酸抗体量与所述FAK磷酸化的量成比例。
本发明的另一个实施方式提供了用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，其中所述重组的核酸分子选自SEQ ID No5，SEQ ID No6，SEQ IDNo7和SEQ ID No8，且其中所述序列的表达需要诱导剂的存在。
本发明的实施方式提供了用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，该重组的核酸分子编码包含选自SEQ ID No1，2，3和4的序列的蛋白，其中所述蛋白的表达需要诱导剂的存在。
FAK还已知是蛋白-酪氨酸激酶2，PTK2。任何活性FAK变体都能在上述测定中使用。还可在测定中使用无活性突变体作各种对照。可在上述测定中使用其他FAK变体，包括具有1052个氨基酸(SEQ ID NO1)的在153012的野生型(WT)人FAK；FAK接合变体，如Andre，E.&Becker-Andre，M.脑中N末端截短形人粘着斑激酶的表达，Biochem.Biophys.Res.Commun.190140-147，1993(描述了AAA35819的879个氨基酸的变体，PC1226的431个氨基酸的变体和PC1227的554个氨基酸的变体)所描述；XP_050337的FAK的570催化域；NP_032008.1的小鼠FAK，它与人FAK有1023/1053个氨基酸的同一性(97％)；AAH30180.1的小鼠FAK羧基截短的变体，它与人FAK的1-903氨基酸有878/904个氨基酸的同一性(97％)；NP_037213.1的大鼠FAK，它与人FAK有1020/1055个氨基酸的同一性(96％)；JC5494的FAK变体，它与人FAK有1017/1055个氨基酸的同一性(96％)；Q00944的鸡FAK变体，它与人FAK有988/1054个氨基酸的同一性(93％)；A45388的鸡FAK变体，它与人FAK有965/1029个氨基酸的同一性(93％)；合成的FAK突变体，包括FAK Y397F(SEQ ID NO2)，K454R(SEQ ID NO3)，FRNK(含有之前有启动子MET的FAK残基694-1052的氨基末端截短体)(SEQ ID NO4)，和各种磷酸化模拟物包括FAK Y397D，Y397E，Y577D，Y577E，Y861D，Y861E，Y925D，Y925E及其组合；CD2-FAK融合体(构建的有活性的FAK和CD2的融合体)，如Chan P等J Biol.Chem.(1994)；269(32)20567-74所述。
在本文中，术语“诱导剂”是一种产生至少6倍信噪比的介质(agent)、化合物或化学品。诱导剂的例子包括但不限于美服培酮(Mifepristone)(Ru486)和其他抗黄体酮，如Org31806和Org31376。参见O′Malley等，Cell，69，703-713.(1992)。在本文中，术语捕捉剂是一种能捕捉任何形式粘着斑激酶的介质、化合物或化学品，包括用组氨酸残基、链霉抗生物素蛋白或其他有类似亲和性的标记来标记的FAK。所述捕捉剂包括但不限于磷酸酪氨酸FAKY397特异性抗体、通常的磷酸酪氨酸抗体、抗FAK抗体、抗组氨酸标记抗体和能利于捕捉到抗生物素蛋白修饰的FAK的含有生物素的分子。在本发明的某些实施方式中，捕捉剂包括一种或多种抗体的组合，包括但不限于山羊抗兔抗体和磷酸酪氨酸FAKY397特异性抗体的组合。
在本文中，术语“抗磷酸-酪氨酸抗体”包括但不限于磷酸酪氨酸FAKY397特异性抗体以及通常的磷酸酪氨酸抗体，其中后者能识别任何磷酸化的酪氨酸残基，包括但不限于在FAK位点397的酪氨酸残基。
在本文中，细胞毒性指示剂是用于评价细胞生存力的试剂、化学品或化合物。细胞毒性指示剂的例子包括但不限于尤其适合此种分析的四氮唑盐(例如MTT、XTT、WST-1)。
MTT是一种黄色四氮唑盐，它被代谢活性细胞切割为紫色甲臜(fornazan)晶体。利用ELISA读数器或其他分光光度计设备可以用分光光度法定量溶解的甲臜产品。如吸光度所测，活体量与形成的紫色甲臜晶体量直接相关。
利用可诱导性FAK基因表达系统实施本发明的实施方式，该系统具有一致和紧密调节基因表达的能力。在本发明的实施方式中，提供了一种可诱导性FAK基因表达系统，其包括调节转基因即FAK表达的系统。当诱导剂不存在时，FAK表达“关闭”，而当诱导剂存在时，FAK表达“开启”。该系统由两个基因组成其中一个编码调节蛋白，另一个编码感兴趣的可诱导转基因。表达所述调节蛋白由构建的启动子操纵。可诱导的FAK转基因含有启动子，该启动子由与能结合所述调节蛋白的结合位点的多拷贝连接的最小启动子组成。
在本发明的实施方式中，所述调节蛋白是转录因子，它由酵母GAL4DNA结合区、截短的人黄体酮受体配体结合区和来自NF-κB的人p65活化区组成，利于在基础表达中紧密调节所述转基因。编码调节蛋白的质粒包含GAL4启动子，该启动子形成了正反馈环路(100p)来利于对配体处理产生迅速反应。利用小分子配体外源性控制调节蛋白的表达。通过所述调节蛋白与所述转基因的启动子的物种选择性结合，并通过所述调节蛋白的配体依赖性构象活化来实现紧密调节。
因此，在某些实施方式中，发明具有以下优点■利用可诱导系统在细胞中诱导FAK，该系统在不被诱导时能紧密抑制基因表达，产生活细胞克隆。
■可用磷酸化FAK的检测来鉴定FAK激酶活性的抑制剂。一些检测磷酸化FAK的方法包括鉴定FAK抑制剂的基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析和基于ELISA的分析。还可使用其他适合的检测系统。
■试验可用于检测全部FAK蛋白，全部被磷酸化的FAK蛋白，或在给定酪氨酸处(例如，酪氨酸397)被磷酸化的FAK蛋白。
■可用以细胞为基础的系统体内筛选FAK抑制剂，由于被转染的细胞是致瘤性的，而且能通过给动物喂食美服培酮而在体内诱导FAK。已经显示了此系统体内的效用。
比较例比较例1为希望改善试验信号和噪音，在不同的细胞背景中，尝试产生稳定异位表达的FAK或FAK突变蛋白。但是，由于这些细胞大部分对FAK蛋白水平的变化显示了敏感性，而且从来不能形成开发以细胞为基础的试验的存活克隆，这些努力被证明是不成功的。表达从低到中等水平的内源FAK的细胞，如NIH3T3小鼠成纤维细胞或A2058人转移性黑色素瘤细胞耐受不多于两倍内源水平的FAK表达。这样，由于与前面描述的相似原因刺激和再现性不良，高背景噪音和不益于药物发现，证明这些克隆并不适合试验开发。因此发现在含天然FAK的细胞中，FAK的非诱导表达并不适合诱导FAK表达的研究。
比较例2为了开发一种既有助于中通量和高通量筛选(ELISA系统)，又能追踪FAK生物化学机理的以细胞为基础的FAK试验，已采取了大量措施来开发FAK生物。例如，通过在胞外基质蛋白(ECM)蛋白如纤连蛋白、或胶原蛋白，或其他ECM如matrigel上接种细胞，尝试模拟FAK的粘附细胞刺激，但该措施被证明并不有效，使FAK刺激不良而且完全由细胞类型决定。此外，通过pY54HRP(辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的磷酸酪氨酸抗体)检测测定ECM-matrigel-诱导的细胞附着不会产生FAK磷酸化刺激，并且单独使用二级抗鼠HRP(20MHRP)的对照检测使孔中的试验信号的非特异性增长，该孔中孵育了来自在matrigel上刺激的细胞的裂解物。当使用pY54HRP和20MHRP组合时，信噪比(S/N)从1.0到1.7，而pY54(未偶联磷酸酪氨酸抗体)和20MHRP联合产生的信噪比为1.0-2.4。这说明而且可以肯定，试验信号的非特异性增长是由细胞裂解物中某些matrigel污染物的交叉反应性引起的。因此，上述开发以细胞为基础的FAK试验的措施是不可行的。
结果还显示细胞附着ECM matrigel或纤连蛋白时，微弱(modest)并且不太合适(suboptimal)的两倍至三倍的FAK磷酸化信噪比刺激。通过改变细胞数量、细胞-ECM附着时间、检测和捕捉抗体的类型，并利用内皮细胞素-1和佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙脂酸(PMA)的联合刺激对这些试验条件进行进一步优化，显示这些FAK刺激的非可诱导法不可行，不能再现而且不适合试验开发。
比较例3由于整合蛋白簇集使FAK磷酸化，利用β1整合蛋白特异性抗体对整合蛋白受体的抗体交联可行性进行了研究。但是，因为FAK刺激的间接法导致高可变性和不可再现性，这些努力也证明是不成功的。例如，由于最佳刺激需要温度敏感性(temperature-sensitive)步骤，该步骤消耗时间且难于管理，整合蛋白β1交联甚至对于中通量筛选来说都是非常繁琐的。另外，由于ECM接触不良，将细胞固定在聚苯乙烯平板上来降低背景噪音会使细胞生存力下降，所以使得这些非诱导的表达系统不适合试验开发。
比较例4为了加快FAK的以细胞为基础的试验开发，进行了产生稳定克隆的尝试，这些克隆能在各种细胞背景中表达野生型或突变的FAK蛋白。产生的克隆含有FAK cDNA转录物，该转录物编码组成型活性蛋白(CD2·FAK)，膜结合的酪氨酸-失效(dead)蛋白(CD2·FAKY397F)，或失去关键下游酪氨酸残基的胞质FAK突变体(例如FAKY861F，FAKY925F和FAKY861F/Y922F)。在FAK生物学认识的基础上对这些生物工具进行有策略的设计，以解决前面所描述的问题并开发有益于药物开发的强烈(robust)并可再现的以细胞为基础的试验。
即使获得了能表达载体构型或者LacZ蛋白的活的对照克隆，尝试产生过表达FAKWT的稳定克隆也是不成功的。设计FAK突变体构型来切断下游FAK磷酸化而保留Y397位FAK磷酸化和激酶活性(FAKY861F，FAKY925F和FAKY861F/Y925F)，或不再需要整合蛋白受体(CD2·FAKWT和CD2·FAKY397F)，证明这些FAK突变体构型的转染都是不成功的。在表达低到中等水平的内源FAK如人转移性黑色素瘤A2058的细胞中鉴定活的克隆。但A2058·FAKWT克隆显示FAK水平只增加了约2倍，这说明它不适合以细胞为基础的FAK试验开发。
除了进行外源性刺激，控制基础FAK磷酸化，并尝试异位表达FAK克隆之外，使用Tet-On/Tet-Off可诱导系统用四环素控制FAKWT和酪氨酸-失效FAKY397FcDNA。但未检测到FAKWT或FAKY397F转染子。由于未能鉴定到活克隆，就不能确定在FAKWT或FAKY397FTet-转染子中的“遗漏(leakiness)”，即对基础表达调节不够的水平。Tet-OnTM/Tet-OffTM系统显示对靶蛋白表达的可变调控，因此它不适合致死基因如FAK的调节。
实施例将野生型FAKWT(SEQ ID NO5)，酪氨酸-失效FAKY397F(SEQ ID NO6)，激酶-失效FAKK454R(SEQ ID NO7)和显性失活的FAK相关非激酶(FRNK)(SEQ ID NO8)作为BarnHI-Apal或Kpnl-Apal插入片段，克隆到GeneSwitchTMpGeneV5/His A-载体骨架中去。如本文所用，术语“基因编码的FAK”包括但不限制到SEQ ID NO1-4。这些构型以人FAK序列的公开(GenBank登录号L13616)为基础，参见Whitney，G.S.等，DNA Cell Biol.12(9)，823-830(1993)，而且每种构型都经测序确定，并与公开序列比对。改造DNA结构来包括唯一且区别于现有技术的特异性5′和3′限制性位点。此外，还改造某些构型的3’末端来包括标记的表位如V5和组氨酸标记。
选择许多细胞系用于转染，其包括NIH Swiss Mouse成纤维细胞NIH3T3(ATCC登录号CCL-92)，人表皮样癌A431(ATCC登录号CRL1555)和人恶性胶质瘤星形细胞瘤U87MG(ATCC登录号HTB-14)。每种细胞系都显示了其适用于过表达FAK的独特特性。例如，NIH3T3细胞使FAK种特异性过表达并且易于被转染，A431细胞表达中等水平的内源FAK并提供更能代表FAK天然环境的肿瘤背景，U87MG细胞缺少假定的FAK失活调节剂PTEN(一种肿瘤抑制性磷酸酶(tumorsuppressor phosphatase))。利用Stratagene的Gene JammerTM转染剂，将pSwitch调节载体与pGeneVectorV5His，或pGeneFAKWTV5His，或pGeneFAK突变体(pGeneFAKK454RV5His，和pGeneFAKY397FV5His)共转染入A431细胞。相似地，转化NIH3T3和U87MG细胞来共表达pSwitch调节蛋白和感兴趣的特异性pGene构型。选出潮霉素和Zeocin抗性克隆，在培养基中增殖(expand)以通过western和RT-PCR分析进行筛选。将许多可诱导的克隆包括A431FAKWTV5His，A431FAKY397FV5His，A431FAKK454RV5His，A431载体，NIH3T3FAKWTV5His，NIH3T3FAKY397FV5His，NIH3T3载体，U87MGFAKWTV5His和U87MGFAKY397FV5His成功分离，选出，确定和证实。
本发明实施方式的FAK可诱导性试验测定了Y397位的FAK磷酸化。将A431FAKWTV5His细胞(约1.0×104-1.0×107个细胞)接种在U型底96孔板上，在用0.1nM美服培酮过夜温育之前，在37℃，5％CO2附着4-6小时。然后，将A431FAKWTV5His诱导的细胞不经处理放置或者在37℃，5％CO2用抑制化合物处理30分钟，并在RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCI，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF和每50ml溶液一粒(pellet)CompleteTM无EDTA蛋白酶抑制剂颗粒)中裂解。将约45μg的总蛋白(100μl)转移至用0.35μg/孔抗FAK磷酸特异性Y397抗体包被的山羊抗兔平板，以捕捉和随后检测磷酸化的FAK蛋白(见图3)。
在T25烧瓶中，接种NIH3T3FAKWTV5His克隆和NIH3T3FAKY397FV5His克隆至汇合度约为80％，不经处理放置或者在37℃，5％CO2用0.1nM美服培酮刺激约16小时。制备细胞裂解物，并用抗-FAK(UBITM，Lake Placid，N.Y.)单克隆抗体免疫耗尽全部FAK蛋白。然后，对FAK免疫复合体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用抗-FAK(A17)多克隆抗体进行免疫印迹。表1显示在放射自显影胶片以随机“band light”单位测定的光密度定量，和与未刺激细胞相比FAK蛋白水平的倍数变化。
表1以光密度量测定的美服培酮诱导的FAK蛋白水平
观察到FAKWT可诱导细胞对美服培酮刺激反应强烈。
上述条件可以很容易地解释为96孔ELISA形式。表2显示了被诱导来表达FAKWT或FAKY397F蛋白的NIH3T3克隆。捕捉FAKWT和FAKY397F蛋白来测定由美服培酮诱导的全部FAK蛋白或磷酸酪氨酸FAKY397F。
表2以光密度450测定得到的美服培酮诱导的FAK蛋白水平
观察到NIH3T3克隆产生强烈的磷酸酪氨酸FAKY397F，并且FAK蛋白信噪比分别为～7和～6。NIH3T3酪氨酸失效克隆和载体NIH3T3转染子均证明试验对磷酸FAKY397的特异性。
表3显示在最优化条件下分析的A431FAK克隆。
表3以光密度450测定得到的美服培酮诱导的FAK蛋白水平
在最优化条件下，所述A431FAK克隆产生强烈的磷酸酪氨酸FAKY397F，并且FAK蛋白信噪比分别为～17和～11。A431酪氨酸失效克隆和载体A431转染子均证明试验对磷酸FAKY397的特异性。磷酸酪氨酸<p>表4.测试车辆的一般特征
利用FTIR设备获得的绝对排放量可以明显不同于利用传统测量技术所获得的排放量。然而，FTIR技术能够用来比较不同燃料的结果。由于柴油发动机非常低的烃排放量，因此，能够利用FTIR设备测量的绝大多数化合物均低于检测极限。当考虑柴油发动机时，FTIR最适合于监测甲醛排放。在测量期间记录的化合物的例子如下所示·甲醛(CH2O)·二氧化氮(NO2)·一氧化二氮(N2O)·铵(NH3)·甲烷(CH4)·乙炔(C2H2)·乙烯(C2H4)·丙烯(C3H6)·苯(BNZ)·正辛烷(NC8)·1，3-丁二烯(C4H6)测试设备和步骤用于废气稀释和收集，以及气态规定排放物浓度分析的所有设备均与Directive 70/220/EEC的91/441/EEC修正的规格相一致。
使用Froude Consine制造的DC型底盘测力器和Pierburg<p>表4
1)氢化精制的矿物油，总芳烃含量1.2质量％，含硫量0.001质量％，100℃下的运动粘度5.6mm2/s，粘度指数125，NOACK蒸发损失8质量％2)水杨酸的组分比3-烷基水杨酸63mol％；5-烷基水杨酸28mol％；4-烷基水杨酸4mol％；3，5-二烷基水杨酸3mol％；5-烷基-4-羟基间苯二甲酸2mol％；烷基仲C14，C16，C18，金属比1，Ca含量2.0质量％，硫酸化灰分6.8质量％3)水杨酸的组分比3-烷基水杨酸51mol％；5-烷基水杨酸35mol％；4-烷基水杨酸6mol％；3，5-二烷基水杨酸7mol％；5-烷基-4-羟基间苯二甲酸1mol％；烷基仲C14，C16，C18，金属比1，Ca含量2.0质量％，硫酸化灰分6.8质量％4)二(正丁基)磷酸锌，磷含量13.2质量％，硫含量0质量％，锌含量13.0质量％，硫酸化灰分含量19.5质量％5)聚丁烯基琥珀酰亚胺，聚丁烯基的数均分子量1,3006)辛基-3-(3，5-二叔丁基-4-羟苯基)丙酸酯和烷基二苯基胺(1∶1)7)OCP，重均分子量150,0008)聚二醇基在实验B中，观察到比未处理细胞高4倍的微弱诱导。但是，在新鲜生长培养基中将刺激细胞悬浮15分钟之后与塑料附着4小时使得磷酸FAKY397减少。另外，让悬浮的美服培酮-诱导的细胞再附着24小时，会使磷酸酪氨酸FAKY397再次活化，这说明FAK活化机制是完整的。与FAK蛋白水平的时间依赖性降低相一致，截止72小时，磷酸酪氨酸FAKY397降低至未经刺激的对照水平。
细胞悬浮导致FAK磷酸化失活。通过重新接种悬浮细胞来允许细胞附着可使FAK重新活化。表4说明在上述讨论的调节系统之下，FAK活化机制是完整的。也就是说，美服培酮的外源性刺激导致机械相关的FAK活化。
本发明FAK可诱导性以细胞为基础的试验被成功地用于鉴定若干FAK抑制剂，包括PP1和星形孢菌素。此外，该试验被用于测定特定化合物对FAK表达细胞的细胞毒性。在这些实验中，使被测化合物与FAK诱导的细胞或未诱导的对照细胞接触。表5显示当用增加浓度的FAK抑制剂处理时，OD450单位下的FAK磷酸化的变化。表6显示以放射自显影胶片的随机“band light”单位测定的光密度定量，和FAK抑制剂浓度增加时FAK磷酸化的倍数变化。因此，本发明的试验可被方便用于FAK药物开发计划。
如图3所描述的，FAK可诱导性以细胞为基础的试验可用于筛选FAK抑制剂。FAK抑制剂的10μm曲线以如表5所示的1/2对数稀释进行。测定抑制百分比，并计算50％(IC50)时的抑制浓度。在T25烧瓶中接种A431FAKWT细胞至密度为～80％，不经处理放置或者用0.1nm美服培酮刺激过夜。然后，用与表5相同的FAK抑制剂，以与10μm曲线相同的1/2对数浓度在37℃，5％CO2处理被刺激的细胞30分钟。然后制备细胞裂解产物并通过蛋白分析测定总蛋白浓度。使用磷酸酪氨酸FAKY397特异性抗体，通常的磷酸酪氨酸pY20抗体和抗FAK(A17)抗体，对等量的完全蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和western分析，表5以光密度450量度得到的FAK磷酸化
Y397和FAK蛋白的诱导通过改变试验条件来进行控制，如美服培酮温育时间，美服培酮浓度，细胞密度和抗体浓度。
在A431和其他细胞背景中，对FAK活化的机理进行了研究。将A431FAKWT细胞不经处理放置或者用美服培酮刺激它。首先，洗脱实验(即，将用美服培酮刺激过夜(16小时)的细胞随后在无美服培酮的新鲜生长培养基中培养一段时间)显示FAK蛋白和磷酸酪氨酸Y397水平呈时间依赖性降低。接着，分离美服培酮刺激的A431FAKWT细胞，并使其悬浮在新鲜生长培养基中15分钟，然后，重新接种到用组织培养基处理的培养皿(Petri dish)中4、24、48和72小时。表4，实验A，显示以放射自显影胶片的随机“bandlight”单位测定的光密度定量，和与未刺激对照相比FAK磷酸化的倍数变化。
表4以光密度定量测定的FAK磷酸化实验A
实验B
在96孔板或T25/T75烧瓶上，将细胞(如A2058人转移性黑素瘤)接种至生长培养基(DMEM 10％FBS，Pen/Strep/Glu)内，并使其在37℃，5％CO2粘附到组织培养基处理的塑料上约5小时。随后，在37℃，5％CO2使细胞在0.1％FBS DMEM饥饿培养基中饥饿过夜，然后，用(最多100μM的)内皮细胞素I，(最多100nM的)铃蟾肽，或(最多800nM的)PMA处理来刺激细胞。在37℃，5％CO2，使细胞暴露于细胞因子从10分钟到长达60分钟不等。利用抗FAK特异性抗体，以ELISA形式捕捉或免疫沉淀全部FAK蛋白。然后，以ELISA或Western形式用通常的抗FAK磷酸酪氨酸抗体检测磷酸酪氨酸FAK蛋白。
在用不同浓度(200μg/ml原液浓度的1∶100，1∶330，1∶1000，1∶3,300或1∶10,000)的β1整合蛋白抗体(4℃，30分钟)培养饥饿细胞前，将饥饿细胞(如A2058)预冷藏在4℃30分钟。在4℃，用1∶500稀释度的山羊抗鼠二抗诱导β1整合蛋白簇集30分钟。然后，在裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，5mMNaCl，10mM EDTA，2mM钒酸钠，1％NP40，蛋白酶抑制剂)中制备全细胞裂解物，并利用抗FAK抗体使全部FAK蛋白免疫沉淀。利用抗磷酸酪氨酸抗体Py54测定磷酸酪氨酸FAK蛋白。
FAKWT和FAK突变体(不可诱导性和Tet-OnTM/Tet-OffTM系统)的克隆在RT-PCR中，利用引物FAK5′BamGGATCCATGGCAGCTGCTTACCTTGAC(SEQ ID NO9)和FAK3′BamGGATCCTCACTCACTCAGTGTGGTCTCGTCTGCCCA(SEQ ID NO10)从T细胞cDNA文库中克隆全长FAKWTcDNA，并与登录号L13616对比确定序列。利用StratageneQuikChangeTM定点诱变试剂盒对FAKWT模板进行定点诱变。为了产生用于电穿孔入Clontech预先制备的HeLa或HEK293tet-On/tet-Off细胞系的质粒，将全长FAKWT，酪氨酸失效突变体(FAKY397F)和激酶失效突变体(FAKK454R)cDNA亚克隆入pTREFLAG载体的BamH1位点。制备下述构型，并将其电穿孔入HeLa Tet-Off，HeLa Tet-On，或293Tet-OnpTREFLAG载体，pTREFAKWTFLAG和pTREFAKY397FFLAG。选出G418抗性克隆，并在DMEM+100ug/ml G418生长培养基中增殖。
FAKWT和FAK突变体(GeneSwitchTM系统)的克隆在RT-PCR中，利用上述引物从T细胞cDNA文库中克隆全长粘着斑激酶(FAKWT)cDNA，并与登录号L13616对比确认序列。利用StratageneQuikChangeTM定点诱变试剂盒对FAKWT模板进行定点诱变。将全长FAKWT，酪氨酸失效突变体(FAKY397F)和激酶失效突变体(FAKK454R)cDNA亚克隆入pGeneV5/His-A质粒的BamHI-Apal位点。将显性失活的FAK相关性非激酶(FRNK)cDNA作为Kpnl-Apal插入片段亚克隆入pGeneV5/His A-载体盒内。通过DNA测序和限制性酶切分析确定这些质粒。接着，利用Stratagene的GeneJammerTM转染试剂将这些构型与编码GeneSwitchTM蛋白的pSwitch构型共转染入NIH3T3、A431或U87MG细胞。转染子在掺有750μg/ml Zeocin和50μg/ml潮霉素抗生素的DMEM生长培养基(10％FBS，Pen/Strep/Glu)中生长并被选出。选出潮霉素和Zeocin抗性克隆，并在培养基中增殖以用于在Western和RT-PCR中进行筛选。
A431·FAK克隆的筛选在T25烧瓶中，接种A431·FAkWT和A431·FAKY397F克隆至汇合度接近80％，未经处理放置或者用0.1nM美服培酮配体处理过夜(～16小时)。然后，在RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCI，1mM EDTA，1mM Na3VO4，1mM NaF和每50ml溶液中一粒CompleteTM无EDTA蛋白酶抑制剂)中裂解A431转染子，并分析所述细胞裂解物的总蛋白浓度。利用标准western印迹技术，用等量的总蛋白浓度对FAK或FAK突变体，蛋白和磷酸酪氨酸FAKY397进行western免疫印迹分析。选出检测为阳性并表现出诱导比内源性FAK水平高至少3倍的克隆，来最优化并开发FAK以细胞为基础的试验。
还通过RT-PCR对克隆进行筛选和确认。利用随机六聚物，从A431·FAK野生型和突变克隆中分离并纯化胞质mRNA转录物用于cDNA合成。随后，利用对N末端、内部FAK序列和FAK C末端特异的引物，在衍生自A431·FAK转录物的cDNA文库进行聚合酶链式反应。也用对抗生素转录物Zeocin或潮霉素特异的引物和GAPDH扩增这些基因，作为转染以及cDNA文库质量的内部对照。
FAK可诱导性以细胞为基础的系统优化在T25烧瓶中接种A431·pGeneVector，A431·FAKWT，A431·FAKK454R和A431·FAKY397F克隆至汇合度接近80％，不经处理放置或者用0.1，10或100nM美服培酮配体处理过夜(～16小时)。然后，在RIPA裂解缓冲液(如上所述)中裂解A431转染子，并分析所述细胞裂解物的总蛋白浓度。利用标准的western印迹技术，用等量的总蛋白浓度进行FAK或FAK突变体，蛋白和磷酸酪氨酸FAKY397的western免疫印迹分析。为了确定最优化的美服培酮浓度从western格式被翻译为ELISA系统，也在ELISA格式中最优化美服培酮浓度和培养时间。
在96孔U型底平板中，以1.2×106细胞/ml的细胞密度接种A431·pGeneVector，A431·FAKWT和A431·FAKY397F克隆。在用美服培酮配体诱导前，将细胞置于37℃，5％CO26-8小时。接着，A431克隆不经处理放置或者在37℃，5％CO2用0.1，10，100或1000nM美服培酮处理～0.5，1.0，2.0，4.0或24.0小时。然后，在RIPA裂解缓冲液中裂解细胞，并将100μl细胞裂解物(45μg总蛋白)转移至96孔板内。在分别用FAK特异性抗体或磷酸酪氨酸FAKY397抗体包被的山羊抗鼠或山羊抗兔平板上捕捉FAK或FAK突变蛋白和磷酸酪氨酸FAKY397。为了捕捉FAK或FAK突变蛋白，例如，在用100μl细胞裂解物(45μg总蛋白)孵育山羊抗鼠平板前，将山羊抗鼠平板用0.5μg/ml抗FAK(UBI)单克隆抗体包被。通过抗FAK(A17)多克隆抗体测定捕获的FAK或FAK突变蛋白检测。相似地，通过用3.5μg/ml抗FAKp[Y397]多克隆抗体包被的山羊抗兔平板进行磷酸酪氨酸FAKY397蛋白的捕捉，随后用抗FAK(UBI)单克隆抗体进行检测。
可以最优化使用的特定高通量筛选系统的参数，包括评价96孔板的类型(例如，抗兔，蛋白A或蛋白G)，捕捉抗体浓度，检测抗体浓度，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗浓度，细胞密度，封闭缓冲液(例如，SuperBlockBlocking TBS，3％BSA封闭)和化合物处理时间。
利用纯化的在Y397残基磷酸化的GST·FAK蛋白，首先用浓度增加的抗FAKp[Y397]磷酸特异性抗体包被的96孔抗兔平板来确定最优化的捕获抗体浓度。制出捕获的磷酸特异性GST·FAKY397对抗FAKp[Y397]抗体浓度图表以确定最优化的捕捉抗体浓度。利用此初步抗FAKp[Y397]捕捉浓度，将其他参数(检测和二抗浓度，细胞密度，封闭缓冲液)最优化，并格式化(formatted)用于高通量筛选(HTS)。这些参数大多数被优化，或通过建立96孔矩阵或交叉比较大量变换(permutation)的信噪比变化进行同时评价。例如，在用3.5μg/ml抗FAKp[Y397]捕捉抗体包被的96孔抗兔平板上，在96孔基质中建立浓度增加的检测和二抗HRP以检测捕捉的磷酸酪氨酸FAKY397蛋白，从而最优化这些抗体的浓度。可以在蛋白A平板上重复此实验和/或通过改变封闭缓冲液或其他参数来交叉比较大量变换的信噪比值，从而使系统最优化。
确认FAK以细胞为基础的试验在T25烧瓶中接种A431·FAKWT细胞至汇合度接近80％，不经处理放置或者用0.1nM美服培酮配体处理过夜(～16小时)。在37℃，5％CO2，用10ml PBS洗涤A431·FAKWT未诱导的和诱导的细胞并悬浮在15ml生长培养基(DMEM 10％FBS，Pen/Strep/Glu，750μg/ml Zeocin，50μg/ml潮霉素)中30，60，90或120分钟。接着，在RIPA裂解缓冲液(如上所述)中裂解细胞并分析所述细胞裂解物的总蛋白浓度。利用标准western印迹技术，用等量的总蛋白浓度进行FAK或磷酸酪氨酸FAKY397的western免疫印迹分析。
在T25烧瓶中接种A431·FAKWT和A431·FAKY397F克隆至汇合度接近80％，不经处理放置或者用0.1nM美服培酮配体处理过夜(～16小时)。接着，用浓度增加的FAK抑制剂(10μM起始溶液的半对数稀释)处理A431·FAKWT细胞，所述FAK抑制剂是用FAK可诱导性细胞为基础的试验鉴定的。然后，在RIPA裂解缓冲液中制备细胞裂解物，并分析总蛋白浓度。利用标准western印迹技术，用等量的总蛋白浓度进行FAK，通常的磷酸酪氨酸FAK或磷酸酪氨酸FAKY397蛋白的western免疫印迹分析。
序列表<110>辉瑞产品公司(Pfizer Products Inc.)Roberts，Walter GregoryUng，Ethan James TeklyWhalen，Pamela Mathews<120>可诱导的粘着斑激酶细胞测试<130>PC11699A<160>10<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1052<212>PRT<213>人野生型FAK(未包括V5表位和His标记)<400>1Met Ala Ala Ala Tyr Leu Asp Pro Asn Leu Asn His Thr Pro Asn Ser1 5 10 15Ser Thr Lys Thr His Leu Gly Thr Gly Met Glu Arg Ser Pro Gly Ala20 25 30Met Glu Arg Val Leu Lys Val Phe His Tyr Phe Glu Ser Asn Ser Glu35 40 45Pro Thr Thr Trp Ala Ser Ile Ile Arg His Gly Asp Ala Thr Asp Val50 55 60Arg Gly Ile Ile Gln Lys Ile Val Asp Ser His Lys Val Lys His Val65 70 75 80Ala Cys Tyr Gly Phe Arg Leu Ser His Leu Arg Ser Glu Glu Val His85 90 95Trp Leu His Val Asp Met Gly Val Ser Ser Val Arg Glu Lys Tyr Glu100 105 110Leu Ala His Pro Pro Glu Glu Trp Lys Tyr Glu Leu Arg Ile Arg Tyr115 120 125Leu Pro Lys Gly Phe Leu Asn Gln Phe Thr Glu Asp Lys Pro Thr Leu130 135 140Asn Phe Phe Tyr Gln Gln Val Lys Ser Asp Tyr Met Leu Glu Ile Ala145 150 155 160
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权利要求
1.鉴定粘着斑激酶(FAK)的细胞-活性抑制剂的方法，包括(a)在哺乳动物细胞中加入诱导剂以诱导编码FAK的基因的表达，其中所述哺乳动物细胞被所述基因稳定转染，且所述基因在所述诱导剂存在时表达；(b)加入被测化合物；(c)利用FAK捕捉剂捕捉所表达的FAK；并(d)检测所述FAK的磷酸化。
2.权利要求1所述的方法，其中将所述哺乳动物细胞包被在第一固相上，且其中通过将磷酸化的FAK与抗-磷酸-酪氨酸抗体接触并检测所述抗体的存在，来检测FAK的磷酸化。
3.权利要求1所述的方法，其中所述FAK捕捉剂包括一种或多种类型的抗体。
4.权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种类型的抗体包括抗磷酸-酪氨酸抗体。
5.权利要求1所述的方法，其中所述磷酸化与抗磷酸-酪氨酸抗体对所捕获的FAK的结合成比例。
6.权利要求2所述的方法，其中所述细胞与第一固相天然附着，且其中所述的细胞在捕捉表达的FAK之前用裂解缓冲液裂解。
7.权利要求1所述的方法，其中所述诱导剂是编码FAK的基因的表达的激动剂。
8.权利要求1所述的方法，其中所述被测化合物抑制FAK的激酶依赖性磷酸化。
9.测定被测化合物细胞毒性的方法，包括(a)用编码FAK的基因稳定转染哺乳动物细胞，其中所述基因在诱导剂存在时表达；(b)加入诱导剂来诱导所述编码FAK的基因表达；(c)加入被测化合物；(d)将细胞毒性指示剂加至所述细胞；并，(e)检测所述被测化合物的细胞毒性。
10.用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，该重组的核酸分子编码包含选自SEQ ID NO1，2，3和4的序列的蛋白，其中所述蛋白的表达需要诱导剂的存在。
11.用重组的核酸稳定转染的哺乳动物细胞，其可诱导性表达FAK蛋白。
12.权利要求11所述的哺乳动物细胞，其中所述核酸编码选自下述的蛋白人FAK剪接变体，人FAK催化域，大鼠FAK，小鼠FAK和鸡FAK。
13.用重组的核酸分子稳定转染的哺乳动物细胞，其包含选自SEQ IDNO5，6，7和8的多核苷酸，且其中所述多核苷酸的表达需要诱导剂的存在。
14.鉴定粘着斑激酶(FAK)的细胞-活性抑制剂的方法，包括下列步骤(a)用一群均一的哺乳动物细胞包被第一固相，使细胞粘附到第一固相上，其中所述细胞被编码FAK的基因稳定转染，且其中所述基因在诱导剂存在时表达；(b)加入诱导剂来诱导所述编码FAK的基因表达；(c)加入被测化合物；(d)溶解所述粘附的细胞来释放细胞裂解物；(e)用FAK捕捉剂包被第二固相，使FAK捕捉剂附着到该第二固相上；(f)使所述细胞裂解物与附着的FAK捕捉剂接触，从而让FAK捕捉剂捕捉FAK；(g)使捕捉的FAK暴露于抗磷酸-酪氨酸抗体，并，(h)检测抗磷酸-酪氨酸抗体与捕捉的FAK的结合，其中结合捕捉的FAK的抗磷酸-酪氨酸抗体量与所述FAK的磷酸化量成比例。
全文摘要
本发明以细胞为基础的试验利用可诱导的基因表达系统和FAK生物学，外源地控制FAK表达和在位点397的酪氨酸残基(Y
文档编号C12N1/21GK1681939SQ03822151
公开日2005年10月12日 申请日期2003年9月8日 优先权日2002年9月19日
发明者沃尔特·G·罗伯茨, 帕梅拉·M·惠伦, 伊桑·J·T·昂 申请人:辉瑞产品公司