专利名称：应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法
技术领域：
本发明涉及热加工食品安全领域；尤其是涉及以黄酮和酚酸类化合物为主要化学成分的天然竹叶提取物，在热加工食品中作为丙烯酰胺抑制剂的应用。
背景技术：
食品安全是关系生命健康和国计民生的重大问题，它的决定因素是食品危害，所以解决食品安全问题应从食品危害入手，也就是从物理危害、化学危害和微生物危害这三种食品危害入手。物理危害容易监测和防犯，微生物危害需在食品加工过程中加以控制，而化学危害(例如农药、兽药残留等)从一般意义上来讲，是在食品原料生长中由于人为因素而加入的，可从源头实施控制。最令人棘手的是，某些化学危害物并非来源于外部环境，而是在食品加工过程中自然形成的，如热加工食品中的丙烯酰胺(acrylamide)。
2002年4月，瑞典斯德哥尔摩大学的Margareta Trnqvist首次在油炸或焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物丙烯酰胺[Tareke，E.et al.Analysis of Acrylamide，a carcinogen Formed in Heated Foodstuffs.J.Agri.Food Chem.，2002，504998-5006]，她在报道中指出“淀粉类食品经过120℃以上的高温加工后，其中所含的丙烯酸胺会大大超出安全标准，长期食用者可导致癌症”的观点一度引起了人们的恐慌。这一发现促使瑞典国家食品管理局(Swedish National Food Administration，SNFA)对随机抽取的一百多种食品进行了检验和分析，并在其官方网站上公布了检验结果。2002年5月17日，英国食品标准局(Food Standards Agency，FSA)公布了类似的结果，随后，挪威、美国、澳大利亚、新西兰、加拿大等国的负责食品安全的政府机构对丙烯酰胺在食品中的含量也进行了测定并公布了结果，瑞典科学家的发现被广泛证实。与此同时，许多国际组织和研究机构对丙烯酰胺在食品中的形成机理、毒理学、风险评估等各方面展开了研究。2005年3月2日，世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)属下的食品添加剂联合专家委员会在日内瓦发表声明，含有致癌毒素——丙烯酰胺化合物(简称“丙毒”)的食品会严重危害人的健康，特别是“洋快餐”的多种食物中均含有大量丙毒。丙烯酰胺是一种公认的神经毒素和致癌物[JIFSAN/NCFST Workshop“Acrylamide in food，scientific issues，uncertainties，and research strategies，”28-30th October 2002.Rosemont，USA]，动物实验表明，长期暴露在丙烯酰胺的环境中，不仅会引发神经系统的病变，而且可能导致各种癌变。进一步研究表明这一化学危害物并不存在于食品原料中，而是在食品加工过程中形成的[Mottram，D.S.，et al.Acrylamide is formed in the Maillard reaction.Nature，2002，419448-449；Stadler，R.H.，et al.Acrylamide from Maillard reactionproducts.Nature，2002，419449-450]。
丙烯酰胺是一种白色晶体，溶于水、乙醇、甲醇、二甲醚、丙酮，而不溶于非极性溶剂如庚烷和苯，它的α，β-不饱和氨基系统非常容易和亲核物质(例如蛋白质中半胱氨酸的巯基)通过Michael Addition发生化学反应，从而影响蛋白质的正常功能而致病。
各国政府对丙烯酰胺都有一定的限量标准，如饮用水中规定不超过0.5μg/L。比照这个标准，每kg油炸薯片中应至多含有0.5μg的丙烯酸胺，而实际情况是，炸薯片中丙烯酰胺的含量高达1480μg/kg，是正常安全标准的2960倍。其它一些淀粉类食品，像烤面包片、饼干等经高温处理的食品中丙烯酸胺的含量也大大超出安全标准。在我国广泛消费的大众化食品中有着类似热加工方式(加工温度≥120℃)的有以油条、烧饼为代表的传统早餐食品，以油炸方便面、谷物早餐为代表的引进速食品，以咖啡、可可为代表的饮品，还有以烟草和香烟为代表的副食品。可令人遗憾的是，自2002年热加工食品中丙烯酰胺的发现距今两年多的时间里，我国在这方面的监测、监控和危害评估几近空白。
对丙烯酰胺产生机理的研究表明，丙烯酰胺是由游离的天门冬酰胺通过美拉德反应(Maillard Reaction)而形成的，如今这一机理基本得到确认。美拉德反应是由还原性糖和氨基酸或蛋白质中的自由氨基在高温条件下所发生的一系列复杂的化学反应，它是热加工食品风味产生的重要途径之一。美拉德反应主要有三个反应阶段，第一阶段是由还原糖的羰基和氨基酸的氨基形成的具有“C＝N”键的Schiff碱，经过重排而生成Amadori或Heyns产物；第二阶段是Amadori或Heyns产物通过不同途径降解而成多种风味化合物和中间体；最后阶段是美拉德反应棕黄色物质的形成。
由天门冬酰胺参与美拉德反应而形成丙烯酰胺的机理被称作天门冬酰胺途径。天门冬酰胺途径的开始是美拉德反应的初始阶段，当Schiff碱中间物(与N-糖基氨基酸处于动态平衡之中)形成以后，两条不同的反应路线都可导致丙烯酰胺的产生一条继续美拉德反应，Schiff碱经过Amadori重排生成Amadori产物，继而脱水、脱氨生成含有羰基的产物，天门冬酰胺在这些含有羰基的分子存在下可以通过Strecker降解机制在脱羧、脱氨后生成丙烯酰胺，这一反应机理可以称作Strecker途径；而另一条则是由Schiff碱经过分子内环化反应生成唑烷酮，进而形成脱羧Amadori产物，这一产物的“C-N”键在高温下被断裂而生成丙烯酰胺，这一反应机理可叫做N-糖苷(N-glycoside)途径[张根义。热加工食品中丙烯酰胺的形成机理和风险分析。无锡轻工大学学报，2003，22(4)91-99]。Yaylayan等和Becalski等的工作进一步证实了天门冬酰胺是形成丙烯酰胺的关键前体物质[Yaylayan，V.A.，et al.Why asparagine needscarbohydrates to generate acrylamide.J.Agric.Food Chem.，2003，511753-1757；Becalski，A.，et al.Acrylamide in foodsoccurrence，sources，andmodeling.J.Agric.Food Chem.，2003，51802-808]；Elmore等用土豆、小麦和黑麦的热加工模式系统也证实了食品中丙烯酰胺的形成机理和前体物质[Elmore，J.S.，et al.Measurement of acrylamide and its precursors in potato，wheatand rye model systems.J.Agric.Food Chem.，2003，514782-4787]。
根据丙烯酰胺形成的上述理论，如果去除食品原料中游离的天门冬酰胺或者抑制美拉德反应的进行，热加工时丙烯酰胺的形成就会受到抑制。目前的实验研究表明，在热加工过程中降低或抑制丙烯酰胺产生的途径主要有两种，一是通过改变热加工的条件(包括热加工方式、时间、温度)来实现；二是通过改变食品的加工属性来实现。首先，丙烯酰胺的产生因热加工的时间和温度而异，且受热加工方式的影响，通过控制这些热加工过程中的关键条件，从而达到降低或抑制丙烯酰胺产生之目的。例如，通过水煮的方法，控制加热温度在45～78℃以及加热时间在4min以上，可达到抑制丙烯酰胺生成的目的[Lindsay，R.C.and Jang，S.Method for suppressing acrylamide formation.US patent，US2004/0224066 A1]；通过控制油炸和加热过程以及先前的洗涤过程中的关键环节，如完全去皮、充分洗涤、及时翻炸和沥干油分等措施来降低丙烯酰胺的生成[Barryy，D.L.et al.Method for reducing acrylamide formationin thermally processed foods.PCT patent，WO2004/075656 A2]，其机理是通过降低油脂的热解度来抑制油脂-甘油-丙烯醛-丙烯酸-丙烯酰胺途径[Tricoit，J.etal.Method for preventing acrylamide formation during heat treatment of food.USpatent，US2004/0115321 A1；Tricoit，J.et al.Method for preventing acrylamideformation during heat-treatment of food.EU patent，03292813.7]。其次，可通过改变或合理控制食品的加工属性或添加其它组分来降低或抑制丙烯酰胺的产生，如富含盐类(包括钙、镁、铜、铝、铁盐)的食品，由于其二价或三价金属阳离子的存在而使得它们在热加工过程中产生的丙烯酰胺很少[Elder，V.A.et al.Method for reducing acrylamide formation in thermally processed foods.PCT patent，WO 2004/075657 A2；Elder，V.A.et al.Method for reducingacrylamide formation in thermally processed foods.US patent，US 2004/0085045A1]；通过酸处理降低食品原料的pH值，使亲核性强的氨基(-NH2)质子化为亲核性弱的胺类物质(-NH3+)，可以抑制丙烯酰胺的产生[Baardseth，P.et al.Reduction of acrylamide formation.PCT patent，WO 2004/028278 A2；Jung，M.Y.et al.Method for the reduction of acrylamide formation.PCT patent，WO2004/060078 A1；Jung，M.Y.et al.A novel technique fo limitation of acrylamideformation in fried and baked corn chips and in french fries.J.Food Sci.，2003，681287-1290]；通过降低丙烯酰胺前体物质在食品原料中的含量(包括以微生物糖代谢的方式消耗还原糖或添加天门冬酰胺酶使天门冬酰胺转化为天冬氨酸)来抑制丙烯酰胺的产生[Awad，A.C.Reduction of acrylamide formation incooked starchy foods.US patent，US 2004/0086597 A1；Elder，V.A.et al.Methodfor reducing acrylamide formation in thermally processed foods.PCT patent，WO2004/026042 A1]；另外，还可以利用竞争性抑制作用的原理，添加一些其它氨基酸，使其与还原糖反应，从而限制天门冬酰胺与还原糖的反应，这些氨基酸包括半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和精氨酸[Elder，V.A.et al.Method forreducing acrylamide formation in thermally processed foods.PCT patent，WO2004/075655 A2]。尽管这些方法从理论上可能对丙烯酰胺的产生具有不同程度的抑制作用，但从方法的实用性、食品对色香味的要求以及食用安全性的角度来讲，很难满足实际的需要，所以还有待探索新的方法来降低丙烯酰胺的形成，并保持食品原有的风味和质构。最近，国内学者采用钙离子和阿魏酸作用于由天门冬酰胺和葡萄糖组成的模拟反应体系，在钙离子和阿魏酸的最适添加范围以及最适反应温度和时间内发现其对丙烯酰胺的抑制率可达80％以上[欧仕益等。用于高温加工食品的丙烯酰胺抑制剂及其应用工艺方法。公开号CN 1561866A]，但实际体系与模拟体系往往存在显著的差异，其在实际体系中的应用效果还有待检验。同时，由天门冬酰胺途径产生的丙烯酰胺随热加工条件变化的规律也有待进一步研究。
芬兰赫尔辛基大学食品技术研究所2004年最近公告的PCT专利称，在制作炸薯条的过程中，使用黄酮类化合物可大大减少薯条中的丙烯酰胺含量。其在制作薯条过程中添加了0.05～0.15％的植物提取物，该提取物由绿茶提取物(45％)、苹果浓缩汁(45％)和洋葱浓缩汁(10％)组成，富含大量的黄酮类化合物。结果发现，在实际油炸过程中产生的丙烯酰胺减少了50％[Kurppa，L.A process and composition for prevention of reducing the formation ofacrylamide in foods.PCT patent，WO 2004/032647 A1]。
黄酮类化合物是一种重要的食物功能因子，广泛存在于药用植物和蔬菜、水果中，具有很强的生物抗氧化活性，对心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病等具有明显的防治效果。用植物黄酮来抑制食品体系中丙烯酰胺的形成可能是目前比较适用的方法，因为这一方法融合了食品安全和功能性食品这两个对于保障生命健康都十分重要的方面。
就其抗氧化性质而言，植物黄酮类提取物中的许多品种，如茶叶提取物、甘草提取物、迷迭香提取物等在世界范围内被广泛用作食品抗氧化剂。本发明者近期研发的一种竹叶提取物(竹叶抗氧化物)已于2004年4月被卫生部批准列入了《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》(GB-2760)。如专利申请号为200310107871.5所述的竹叶抗氧化物(AOB)，是一种从竹叶中提取的天然酚性部位，以黄酮和酚酸类化合物为主要化学成分，包括四种主要的竹叶碳苷黄酮和三种酚酸，分别是荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷和绿原酸、阿魏酸、咖啡酸。其分子结构式如下 (I)荭草苷 (II)异荭草苷
(III)牡荆苷(IV)异牡荆苷 (V)绿原酸 (VI)咖啡酸(VII)阿魏酸竹叶碳苷黄酮的结构特点是黄酮母核在6位或8位以C-C键与葡萄糖相连，由于C-C键合的强大键能，这类化合物具有极高的结构稳定性，遇酸完全不水解，并能抗热解和酶解，同时具有良好的亲水性，适用于多种食品体系，具有氧苷黄酮(O-glycosyl flavone)无法比拟的优越性，尤其是应用于高温处理的热加工食品。尽管人类对黄酮类化合物的研究已经有100多年的历史，但大量的研究工作主要集中在黄酮苷元(如槲皮素等)和氧苷黄酮(如芦丁等)上。自20世纪90年代起，国际上对碳苷黄酮的结构与功能性的研究开始起步，属国际前沿领域。迄今用碳苷黄酮抑制高温处理的食品中丙烯酰胺形成的研究未见公开报道。
鉴于竹叶“药食两用”的独特背景和竹叶提取物的优良禀赋，它在食品工业中的应用前景将十分广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一种竹叶提取物的新用途，即在热加工食品中作为丙烯酰胺抑制剂的应用。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，在竹叶提取物中添加银杏提取物、茶叶提取物、迷迭香提取物、苹果多酚提取物、山楂提取物、洋葱提取物、甘草提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物和牛蛭提取物中的至少一种制成复配物，竹叶提取物占复配物总重的34～95％。
作为本发明的一种改进在每千克食品原料中添加0.001～5克复配物。
作为本发明的进一步改进在每千克食品原料中添加0.1～1克复配物。
作为本发明的另一种改进在每千克包裹料中添加0.001～5克复配物制成混合包裹料，再用所述混合包裹料均匀包裹食品原料。
作为本发明的进一步改进在每千克包裹料中添加0.1～1克复配物制成混合包裹料。
作为本发明的又一种改进在每升水溶液或低醇溶液中添加0.001～5克复配物制成浸泡液，再用所述浸泡液浸泡食品原料。
作为本发明的进一步改进在每升水溶液或低醇溶液中添加0.1～5克复配物制成浸泡液。
作为本发明的又一种改进在每升水溶液或低醇溶液中添加0.001～10克复配物制成喷洒液，再用所述喷洒液均匀喷洒食品原料的表面。
作为本发明的进一步改进在每升水溶液或低醇溶液中添加0.1～10克复配物制成喷洒液。
作为本发明的进一步改进热加工是指热处理温度在120℃以上的食品加工。热加工食品是指以油炸、焙烤、烧烤、烘烤、微波加热、膨化、燃烧方式得到的炸薯条、炸薯片、薄脆饼、饼干、蛋糕、面包、谷物早餐、油条、大饼、方便面、汉堡包、炸鸡块、咖啡、可可、烟草、香烟。
本发明的竹叶提取物作为丙烯酰胺抑制剂在上述食品体系中使用时，其对丙烯酰胺的抑制率是通过比较添加和不添加竹叶提取物的复配物的食品原料，在热加工过程中产生的丙烯酰胺含量来确定的，其中丙烯酰胺的测定方法采用气相色谱法(GC)或液相色谱-两级质谱联用法(LC-MS/MS)进行。经测定表明，使用不同复配物后，对丙烯酰胺的抑制率范围为15～98％。
具体实施例方式
对本发明的具体实施方式
进行详细说明。
本发明所指的竹叶提取物是从禾本科(Graminae)、竹亚科(Bambusoideae)、刚竹属(Phyllostachys Sieb.Et Zucc)品种的叶子中得到的天然竹叶提取物，其生产工艺在申请者以前的两项发明专利(专利号分别为ZL 98104563.4和ZL 98104564.2)中已经涉及。需要声明的是，本专利所指的竹叶提取物既可以是采用上述专利工艺得到的产品，也可以是在此基础上进一步运用吸附～解吸和膜分离等高新技术及其组合方法精制得到的竹叶提取物制品。
竹叶提取物的外观为黄色或棕黄色粉末(也可以浸膏的形式存在)，其主要成分包括以荭草苷(Orientin)、异荭草苷(Homoorientin)、牡荆苷(Vitexin)和异牡荆苷(Isovitexin)为代表的黄酮类化合物和以绿原酸(Chlorogenic acid)、阿魏酸(Ferulic acid)和咖啡酸(Caffeic acid)为代表的酚酸类化合物。其总黄酮含量一般在4～50％(硝酸铝-亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品)，总酚含量一般在10～80％(福林试剂还原比色法测定，以对羟基苯甲酸为标准品)。
在由天门冬酰胺途径产生丙烯酰胺的模拟反应体系中，以天门冬酰胺和葡萄糖按等摩尔浓度比例进行反应，反应体系可以是水溶液或混合物润湿体，在≥120℃的温度条件下加热10～40min，从而产生丙烯酰胺，并测定丙烯酰胺的生成量。同时，以此反应体系为空白对照，并在此基础上添加本发明声明的添加范围内的含竹叶提取物的复配物，按同样条件加热并测定丙烯酰胺的生成量，与空白对照作比较，计算竹叶提取物的复配物对丙烯酰胺形成的抑制率。丙烯酰胺的测定采用GC或LC-MS/MS进行。
在食品原料经过热加工而产生丙烯酰胺的实际反应体系中，一是将含竹叶提取物的复配物按比例直接添加至食品原料或包裹料中，使其在热加工过程中阻断产生丙烯酰胺的反应链，从而降低或抑制丙烯酰胺的产生；二是将复配物按比例配成水溶液或加入少量乙醇或料酒制成低醇溶液，用来浸泡食品原料或均匀喷洒在食品原料的表面。同时，以不添加复配物的实际热加工体系为空白对照，在试验组添加本发明声明的添加范围内的复配物后，按同样条件加热并测定丙烯酰胺的生成量，与上述空白对照作比较，计算含竹叶提取物的复配物对丙烯酰胺生成的抑制率。丙烯酰胺的测定采用GC或LC-MS/MS进行。
其中，(1)气相色谱法(GC)分析的实验条件如下
仪器名称Fuli GC9790气相色谱仪；检测器ECD(电子捕获)；色谱柱HP-5(30m×0.32mm，25μm)；进样器SLIP(不分流毛细管)；流动相以及流速氮气(1mL/min)；进样量1μL；柱箱初温100℃；检测口温度250℃；进样口温度250℃；升温程序100℃ 1min→10℃/min 140℃ 15min→30℃/min 240℃7min。
与此同时，气相色谱法测定前须对样品进行衍生化处理提高其挥发程度，采用KBr和KBrO3通过氧化还原反应产生溴分子，使溴分子与丙烯酰胺反应生成一溴或二溴丙酰胺，最后加入Na2S2O3终止衍生化反应并将多余的溴还原为Br-。
(2)液相色谱-两级质谱联用(LC-MS/MS)分析的实验条件如下仪器名称Micromass公司液相色谱-两级质谱联用仪；LC条件色谱柱Atlantis C18(1.5×210mm，5μm)；流动相甲醇(0.1％甲酸)∶水(0.1％甲酸)＝2∶98；流速1mL/min；柱温20℃；进样量10μL。
MS条件毛细管电压3.50kV；锥孔电压50V；源温100℃；脱溶剂温度350℃；锥孔气流速45L/h；脱溶剂气流速400L/h；MRM参数丙烯酰胺标样72＞55，13C3-丙烯酰胺内标75＞58；碰撞能量6eV。
实施例1、含竹叶提取物的复配物对模拟反应体系产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物、迷迭香提取物和甘草提取物按3∶1∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的60％。
取0.1mol/L的L-天门冬酰胺和D-葡萄糖各10mL混合→置于100mL锥形瓶中→设空白对照组；还在上述空白对照组的基础上加入复配物，制成最终体系中复配物浓度分别为10mg/kg的试验组1和150mg/kg的试验组2→将空白对照组、试验组1、试验组2分别在120℃水浴中加热15min→直接取得到的反应溶液后进行衍生化→GC分析。
其中衍生化反应具体过程如下各取20μL的空白对照组、试验组1、试验组2→入20mL比色管中→加入0.6mL 10％(v/v)H2SO4→加水定容至10mL→4℃冰箱放置20min预冷→加入1.5g KBr粉末充分溶解→加入1mL 0.1mol/L KBrO3→充分混匀→冰箱中静置衍生30min→取出后加入0.1mL 1mol/LNa2S2O3→充分混匀→取出后加入5mL重蒸后或者HPLC纯的乙酸乙酯充分萃取→取乙酸乙酯相并用无水Na2SO4脱水→待用。
其中竹叶提取物为杭州浙大力夫生物科技有限公司生产的竹叶抗氧化物(产品代码为AOB)，外观为棕黄色粉末，总黄酮含量为32.5％，总酚含量为56.7％。其中四种竹叶碳苷黄酮——异荭草苷、荭草苷、异牡荆苷和牡荆苷的含量比例为2.75∶1.05∶1.15∶1[Yu Zhang et al.，Determination of flavone C-glucosides in antioxidant of bamboo leaves(AOB)fortified foods byreversed-phase high-performance liquid chromatography with ultraviolet diodearray detection，Joural of Chromatography A，2005，1065177-185]。迷迭香提取物和甘草提取物均为市售产品。
根据峰面积计算并折合后得空白对照组、试验组1和试验组2的丙烯酰胺生成量分别为5421.12μg/kg、421.44μg/kg和148.40μg/kg，含竹叶提取物的复配物对模拟反应体系产生的丙烯酰胺的抑制率分别为92.2％和97.3％(如表1所示)。
表1 含竹叶提取物的复配物对模拟反应体系产生丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表1可见，含竹叶提取物的复配物对模拟反应体系产生的丙烯酰胺具有极显著的抑制作用。
实施例2、含竹叶提取物的复配物对油炸土豆片产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物和茶叶提取物按19∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的95％。
(1)土豆片新鲜土豆经清洗后去皮并切成厚度大约为1mm的薄片，切好的土豆片经挑选后用流水漂洗两次，并用吸水纸吸干。
(2)植物提取物竹叶提取物为杭州浙大力夫生物科技有限公司生产的产品(产品代码为EOB-C01)，总黄酮含量为40.7％，总酚含量为79.8％；茶叶提取物为浙江大学茶学系提供的水溶性茶多酚制剂，含量为98％。
(3)实验分组本实验共设8个组空白对照组A(土豆片不用任何溶液处理)。
将复配物制成质量浓度为0.001g/L的水溶液，即在每升水中溶入0.001克复配物，然后将土豆片浸没在竹叶提取物水溶液中，浸渍时间为1min，所得的土豆片为试验组B。
同理，依照试验组B的浸渍方法，当将复配物制成质量浓度为0.01g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组C；当将复配物制成质量浓度为0.1g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组D；当将复配物制成质量浓度为0.5g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组E；当将复配物制成质量浓度为1g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组F；当将复配物制成质量浓度为2.5g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组G；当将复配物制成质量浓度为4.9g/L的水溶液时，所得的土豆片为试验组H。
将上述所有组中的土豆片分别放入功率为750W的家用微波炉中，在中火档加热干燥，干燥时间A组3.5min，其余组均为5.5min。
(4)油炸设定各组土豆片的量均为50～60g，将干燥后的上述所有组的土豆片分别在油锅中炸制，所用油为市售花生油，油温控制在140～160℃之间，油炸时间在3min左右，炸至土豆片表面呈金黄色或黄棕色，捞出，沥油，检测；每炸完一组后启用新油。
(5)取样及样品预处理取适量油炸土豆片样品并用研钵碾碎→称取1.5g样品→加入浓度为1μg/mL的内标500μL→静置10min→两次加入20mL重蒸石油醚脱脂、并充分振荡10min→两次加入8mL 2M NaCl超声振荡提取20min→15000rpm离心15min→三次加入15mL重蒸乙酸乙酯充分萃取→合并萃取液旋转蒸发→N2吹干→1.5mL蒸馏水重溶→6cc HLB柱固相萃取纯化→进样分析。
(6)结果检测土豆片经上述预处理后，用LC-MS/MS测定丙烯酰胺的含量。
根据峰面积计算得含竹叶提取物的复配物对油炸土豆片产生丙烯酰胺的抑制率(如表2所示)。
表2 含竹叶提取物的复配物对油炸土豆片产生丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表2可见，当含竹叶提取物(EOB-C01)复配物的浸泡液浓度在0.001～4.9g/L的范围内时，浸泡所得到的土豆片对其油炸产生丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用，其抑制率在复配物浸泡液浓度为0.001～1g/L时随着浸泡液浓度的增加而增加，而在复配物浸泡液浓度为1～4.9g/L时却随着浸泡液浓度的增加而减少，这说明存在一个最适添加量区间。因此，含竹叶提取物的复配物对油炸土豆片产生的丙烯酰胺在经不同浓度浸泡液浸泡后具有不同程度的抑制作用。
实施例3、含竹叶提取物的复配物对香烟燃烧过程中产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物、银杏提取物、山楂提取物按1∶1∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的34％。
(1)试样来源竹叶提取物为杭州浙大力夫生物科技有限公司生产的产品(产品代码为EOB-S03)，外观为深棕色浓缩液，总黄酮含量为4.5％，固形物含量为25.2％；银杏提取物和山楂提取物均为市售产品。本实施例中采用低醇溶液作为浸泡液溶剂，是指体积分数为20％的酒精溶液。
(2)试验分组本实验共设4个组空白对照组A为普通烟丝制成的卷烟。
将复配物配制成浓度为10g/L的低醇溶液，即在每升低醇溶液中含有以干基计10克的复配物，然后将此溶液以10mL/kg的比例均匀喷洒至烟丝表面，制成的卷烟为试验组D。
将复配物调整为浓度1g/L的低醇溶液，即在每升溶液含以干基计1克的复配物，然后将此溶液以10mL/kg的比例均匀喷洒至烟丝表面，制成的卷烟为试验组C。
将复配物调整为浓度0.1g/L的低醇溶液，即在每升溶液中含以干基计为0.1克的复配物，然后将此溶液以10mL/kg的比例均匀喷洒至烟丝表面，制成的卷烟为试验组B。
(3)卷烟燃烧采用吸烟机在标准条件下进行卷烟的燃烧试验，并分别收集焦油相和气相，测定焦油相中丙烯酰胺的含量。焦油相样品的预处理方法同实施例2，样品经预处理后用LC-MS/MS法测定其丙烯酰胺的含量。根据峰面积计算含竹叶提取物的复配物对烟草产生丙烯酰胺的相对抑制率(如表3所示)。
表3 含竹叶提取物的复配物对烟草燃烧过程中产生的丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表3可见，当含竹叶提取物(EOB-S03)复配物的低醇溶液浓度在0.1～10g/L的范围内时，以10mL/kg的比例均匀喷洒至烟丝表面，采用吸烟机在标准条件下进行卷烟的燃烧试验，对其燃烧过程焦油相中产生丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用，其抑制率在复配物的低醇溶液浓度为0.1～10g/L(即烟丝中复配物添加量为0.001～0.1g/L)时随着喷洒液浓度的增加而增加。
实施例4含竹叶提取物的复配物对炸鸡翅产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物、苹果多酚提取物和洋葱提取物按1.63∶1∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的45％。
竹叶提取物为杭州浙大力夫生物科技有限公司生产的产品，总黄酮含量为16.5％，总酚含量为33.7％。苹果多酚提取物和洋葱提取物均为浙江大学生物系统工程与食品科学学院天然产物实验室自制，均为30％的乙醇提取物干粉。
(1)实验分组本实验共设8个组空白对照组A，使用普通的炸鸡料用来均匀包裹鸡翅，其中炸鸡料为市售品。
在每千克炸鸡料中加入0.001克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组B；同理，在每千克炸鸡料中加入0.01克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组C；当每千克炸鸡料中加入0.1克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组D；当每千克炸鸡料中加入0.5克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组E；当每千克炸鸡料中加入1克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组F；当每千克炸鸡料中加入2.5克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组G；当每千克炸鸡料中加入4.9克的复配物制成混合包裹料，用此混合包裹料包裹的鸡翅为试验组H。
(2)油炸将面粉加水调成稀薄糊状，并打入鸡蛋一个，拌匀制成面糊。将上述各组鸡翅(已经裹有相应的炸鸡料)再分别挂上面糊，立即上油锅炸制，等到金黄色即出锅，每次炸完一组后将油弃去。样品预处理方法同实施例2，经样品预处理后用LC-MS/MS测定其丙烯酰胺的含量。
根据内标法计算得含竹叶提取物的复配物对炸鸡翅产生丙烯酰胺的抑制率(如表4所示)。
表4 含竹叶提取物的复配物对炸鸡翅产生的丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表4可见，在炸鸡翅过程中当含竹叶提取物的复配物添加量在0.001～4.9g/kg的范围内时，与原料混合后对炸鸡翅产生丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用，其抑制率在复配物添加量为0.001～1g/kg时随着添加量的增加而增加，而在添加量为1～4.9g/kg时却随着添加量的增加而减少，这说明存在一个最适添加量区间。因此，含竹叶提取物的复配物对炸鸡翅产生的丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用。
实施例5、含竹叶提取物的复配物对油条产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物和葡萄籽提取物按3∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的75％。
竹叶提取物(AOB)的来源同实施例1，葡萄籽提取物为市售产品。
试验分组本实验共设8个组空白对照组A，面粉不作任何处理。
在每千克面粉中加入0.001克的复配物制成试验组B；同理，在每千克面粉中加入0.01克的复配物制成试验组C；在每千克面粉中加入0.1克的复配物制成试验组D；在每千克面粉中加入0.5克的复配物制成试验组E；在每千克面粉中加入1克的复配物制成试验组F；在每千克面粉中加入2.5克的复配物制成参比对照组G；在每千克面粉中加入4.9克的复配物制成试验组H。
将上述8组用于制作油条的面粉，分别加入适量苏打和发酵粉，然后加水和成面团。静置12h后再和面一次，然后静置直至油炸。
(3)油炸将各组发酵好的面团搓成条状，切成小团，然后拉成长条状以后入油锅炸制，待金黄色且膨松后将油条捞出油锅并沥干油分即成。样品预处理方法同实施例2，经样品预处理后用LC-MS/MS测定其丙烯酰胺的含量。
根据内标法计算得含竹叶提取物的复配物对油条产生丙烯酰胺的抑制率(如表5所示)。
表5 含竹叶提取物的复配物对油条产生的丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表5可见，在制作油条过程中当含竹叶提取物的复配物添加量在0.001～4.9g/kg的范围内时，与原料混合后对炸油条产生丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用，其抑制率在含竹叶提取物的复配物添加量为0.001～1g/kg时随着添加量的增加而增加，而在添加量为1～4.9g/kg时却随着添加量的增加而减少，这说明存在一个最适添加量区间。因此，含竹叶提取物的复配物对炸油条产生的丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用。
实施例6、含竹叶提取物的复配物对油条产生丙烯酰胺的抑制作用将竹叶提取物和银杏提取物、茶叶提取物、迷迭香提取物、苹果多酚提取物、山楂提取物、洋葱提取物、甘草提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物、牛蛭提取物按30∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的质量比混合得到复配物，此时竹叶提取物占复配物总重的75％。
竹叶提取物(AOB)的来源同实施例1；茶叶提取物为浙江大学茶学系提供的水溶性茶多酚制剂，含量为98％；苹果多酚提取物和洋葱提取物均为浙江大学生物系统工程与食品科学学院天然产物实验室自制，均为30％的乙醇提取物干粉；银杏提取物、迷迭香提取物、山楂提取物、甘草提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物、牛蛭提取物为市售产品。
试验分组本实验共设8个组
空白对照组A，面粉不作任何处理。
在每千克面粉中加入0.001克的复配物制成试验组B；同理，在每千克面粉中加入0.01克的复配物制成试验组C；在每千克面粉中加入0.1克的复配物制成试验组D；在每千克面粉中加入0.5克的复配物制成试验组E；在每千克面粉中加入1克的复配物制成试验组F；在每千克面粉中加入2.5克的复配物制成试验组G；在每千克面粉中加入4.9克的复配物制成试验组H。
将上述8组用于制作油条的面粉，分别加入适量苏打和发酵粉，然后加水和成面团。静置12h后再和面一次，然后静置直至油炸。
(3)油炸将各组发酵好的面团搓成条状，切成小团，然后拉成长条状以后入油锅炸制，待金黄色且膨松后将油条捞出油锅并沥干油分即成。样品预处理方法同实施例2，经样品预处理后用LC-MS/MS测定其丙烯酰胺的含量。
根据内标法计算得含竹叶提取物的复配物(质量含量为75％)对油条产生丙烯酰胺的抑制率(如表6所示)。
表6 含竹叶提取物的复配物对油条产生的丙烯酰胺的抑制率(n＝6)
由表6可见，在制作油条过程中当含竹叶提取物的复配物添加量在0.001～4.9g/kg的范围内时，与原料混合后对炸油条产生丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用，其抑制率在含竹叶提取物的复配物添加量为0.001～1g/kg时随着添加量的增加而增加，而在添加量为1～4.9g/kg时却随着添加量的增加而减少，这说明存在一个最适添加量区间。因此，含竹叶提取物的复配物对炸油条产生的丙烯酰胺具有不同程度的抑制作用。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在竹叶提取物中添加银杏提取物、茶叶提取物、迷迭香提取物、苹果多酚提取物、山楂提取物、洋葱提取物、甘草提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物和牛蛭提取物中的至少一种制成复配物，所述竹叶提取物占复配物总重的34～95％。
2.根据权利要求1所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每千克食品原料中添加0.001～5克所述复配物。
3.根据权利要求2所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每千克食品原料中添加0.1～1克所述复配物。
4.根据权利要求1所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每千克包裹料中添加0.001～5克所述复配物制成混合包裹料，再用所述混合包裹料均匀包裹食品原料。
5.根据权利要求4所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每千克包裹料中添加0.1～1克所述复配物制成混合包裹料。
6.根据权利要求1所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每升水溶液或低醇溶液中添加0.001～5克复配物制成浸泡液，再用所述浸泡液浸泡食品原料。
7.根据权利要求6所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每升水溶液或低醇溶液中添加0.1～5克复配物制成浸泡液。
8.根据权利要求1所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每升水溶液或低醇溶液中添加0.001～10克复配物制成喷洒液，再用所述喷洒液均匀喷洒食品原料的表面。
9.根据权利要求8所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是在每升水溶液或低醇溶液中添加0.1～10克复配物制成喷洒液。
10.根据权利要求3、5、7或9所述的应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，其特征是所述热加工是指热处理温度在120℃以上的食品加工，所述热加工食品是指以油炸、焙烤、烧烤、烘烤、微波加热、膨化、燃烧方式得到的炸薯条、炸薯片、薄脆饼、饼干、蛋糕、面包、谷物早餐、油条、大饼、方便面、汉堡包、炸鸡块、咖啡、可可、烟草、香烟。
全文摘要
本发明公开了一种应用竹叶提取物作为热加工食品中丙烯酰胺抑制剂的方法，在竹叶提取物中添加银杏提取物、茶叶提取物、迷迭香提取物、苹果多酚提取物、山楂提取物、洋葱提取物、甘草提取物、葛根提取物、葡萄籽提取物和牛蛭提取物中的至少一种制成复配物，竹叶提取物占复配物总重的34～95％。本发明的竹叶提取物作为丙烯酰胺抑制剂在上述食品体系中使用时，其对丙烯酰胺的抑制率达15～98％。
文档编号C07C233/09GK1663477SQ20051004940
公开日2005年9月7日 申请日期2005年3月21日 优先权日2005年3月21日
发明者张英, 章宇, 吴晓琴, 尤新 申请人:浙江大学