专利名称：一种编码人类白细胞抗原a*11的新等位基因a*110104全长多核苷酸序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全长多核苷酸序列及其用途。
背景技术：
毋容置疑，器官移植与造血干细胞移植已经成为迄今为止医治各种器官功能衰竭、脏器恶性肿瘤和多种恶性血液病等顽症的行之有效的重要措施之一。由于供-受者间组织相容性抗原(MHC，在人类则称人白细胞抗原(HLA))差异的主要作用，当然还有其它诸多已知与未知因素如次要组织相容性抗原(mH)、组织特异性抗原等等影响，不可避免的要发生宿主抗移植物(HVGD)和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，这是导致同种异体组织器官移植失败的最根本、最重要的原因之一！因此，HVGD和GVHD已成为临床上同种异体组织器官移植领域面临的最大障碍！业已证实，组织器官移植后，移植物能否存活很大程度上取决于供-受体之间HLA型别是否相符。在肾脏移植中，各HLA座位的重要性依次为HLA-DRB1、HLA-B、HLA-A。在造血干细胞移植中，HLA的匹配程度与GVHR发生的密切程度更大，一般状况下必须选择HLA完全相同的个体作为供者。然而在进行异基因脏器移植时，首先遇到的最大障碍就是难以寻找到一个白细胞抗原(HLA)完全相匹配的适宜供体，这已成为迄今为止似乎难以逾越和远未得以圆满解决的一个关键性问题！究其根本原因，则是由于人类主要组织相容性抗原(在人类称为HLA)的高度复杂性、多态性(polymorphism)、多样性(diversity)等遗传特点所决定的。
我们知道，人类白细胞抗原是一个复合体，是人体内最为复杂和最具多态性的基因遗传系统。迄今为止，已发现了1972个等位基因，其编码的抗原参与机体的免疫应答、免疫反应和免疫调节，并决定组织相容性，是人体启动一系列免疫应答与免疫反应的门户与枢纽。在正常情况下，HLA抗原与外来抗原(如病原微生物，细菌、病毒等)结合所形成的复合物可被自身T淋巴细胞识别，引发免疫应答反应，并将病原微生物杀灭或排出体外，从而保证人体的健康。当机体出现肿瘤等疾病时，HLA可与肿瘤抗原相结合而被自身T淋巴细胞识别，从而杀伤或杀死肿瘤细胞，起到自身免疫监视的作用。当机体免疫系统出现异常时，HLA与自身正常组织的抗原结合，导致自身T细胞攻击自身的器官或组织，从而引发自身免疫病，如糖尿病、类风湿性关节炎等。在进行器官及造血干细胞移植时，若供受体的HLA型别不匹配，移植后将会引发移植排斥反应，从而导致移植失败和病人死亡等严重后果。因此，移植前进行精细的HLA分型对于防止移植排斥反应、延长患者生命和提高移植成功率具有重要意义。另外，由于HLA抗原就如同人的指纹一样具有个体特异性，并以单倍体紧密连锁的方式遗传给下一代，因此HLA在法医学鉴定以及人类学和遗传学研究等方面同样具有重要意义。
应着重指出的是，为提高HLA分型的准确性、避免漏检尚未被发现的HLA等位基因，发现和鉴定特定人群中新的HLA等位基因已成为当前国际上HLA研究领域中的重要课题和研究热点。
自1958年法国科学家Dausset首次发现并报道了人类存在HLA现象后，直至十年后的1968年国际上才开始对HLA这一系统进行统一命名。最初仅是发现并鉴定出10个HLA-I类抗原。此后有关HLA结构与功能研究的发展是十分惊人的。现已证明，HLA复合体位于人第6号染色体短臂6p21.31，基因片段长度约4分摩或3600kb，占人体整个基因组的1/3000。HLA复合体的结构十分复杂且具有多基因性、多态性和连锁不平衡性。迄今为止，HLA复合体内共鉴定出224个基因座位，其中有产物表达的功能性基因为128个。39.8％的基因是与免疫系统有关，特别是II类区域中几乎所有基因均显示免疫相关功能。在已完成基因克隆并被命名的HLA基因座位数就已达100个之多，其中至少有18个基因座位显示复等位性，也就是说这些基因座位还各自有数量不等的等位基因，每种等位基因编码相应的HLA抗原产物，由此构成了人体内多态性最为丰富的基因系统。
在早期，对HLA基因产物的研究是以检测抗原特异性的血清学为基础的，并辅以细胞学分型的技术。而对HLA基因座位的等位基因进行系统的研究则是从1987年开始的，当时仅发现十几个等位基因；到1989年仅两年的时间有关HLA-I、II类等位基因的数量猛增到100个和50个；而到了1990年HLA-I、II等位基因的数量分别已达100个。随后，有关HLA-I、II等位基因数量的揭示呈指数方式攀升。2000年HLA-I、II等位基因的数量已达1028个，2002年4月其总数达1528个。截止到2005年1月其总数高达1972个，其中A位点349个、B位点626个、C位点182个、E位点5个、F位点2个、G位点15个、DRA位点3个、DRB位点470个、DQA1位点28个、DQB1位点60个、DPA1位点22个、DPB1位点116个、DMA位点4个、DMB位点6个、DOA位点8个、DOB位点8个，此外TAP1和TAP2位点还各有7个和4个、MICA位点还有57个。由此可见，即使仅以HLA-I、II类12个主要的功能基因来计算的话，如果各个座位基因的组合是随机的话，那么，人群中可能出现的HLA基因型就高达108-1010个之多。因此从理论上讲，在无血缘关系的随机人群中要寻找到一个HLA基因型(等位基因型水平)完全一致的供体是十分不易的！不过，由于HLA复合体是一个紧密连锁的基因群，这些连锁在一条染色体上的基因很少发生同源染色体间的交换。并且在遗传过程中，HLA单倍体是作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。而且，在随机婚配的群体中，在无新的突变和自然选择的情况下，HLA各等位基因的频率可代代维持不变。更况，事实上各基因并非随机地组成单倍体。所以也就会出现在不同的地域、不同的种族、不同的民族人群中保持各自的HLA等位基因频率。因此，也就不难理解不同的学者、不同的骨髓库会报道出不同的无关供体间HLA相匹配的概率，诸如1/400、1/10000、1/1000000乃至于几十万分之一。如此看来，只要在各国、各地、各民族所建立的骨髓库/脐血库中储有一定数量的供体，在无血缘关系的随机人群中寻找到一个HLA基因型(非等位基因水平)完全一致的供体则又不是不可能的。这已被国际骨髓库十余年的经验所证实。
随着我国无血缘关系供受体移植病例的迅猛增加，发现中国人群中特有的HLA等位基因，以提高HLA配型的精确度就显得格外重要。尤为重要的是，努力发掘中国人群中特有的HLA基因多态性，使得器官及造血干细胞移植患者能够更加准确地进行HLA精确配型以寻找最佳匹配供体，防止移植排斥反应发生和延长患者生命。同时，还将阐明人体中存在不同HLA抗原形式的具体意义，并且可广泛应用于法医学鉴定、人类种族迁移等相关研究中。
在这里应强调指出的是，HLA-A*11抗原是最早被检测出来的HLA抗原之一，在蒙古人种(中国人归属蒙古人种)、高加索人种以及黑人中的基因频率分别为10％-30％，4％-8％和＜1％，故可被看作是中国人种的优势特有抗原。因此，HLA-A*11新等位基因的发现对于人体免疫应答与调控、移植免疫、种族迁移研究以及法医学鉴定等都有十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全长多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
本发明的又一方面，还涉及所述编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于移植前进行精细的HLA分型的用途。
本发明的再一方面，涉及一种用于移植前进行精细的HLA分型的的试剂盒，其含有所述编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
本发明的另一方面，涉及所述编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于法医学鉴定以及人类学和遗传学研究的用途。
本发明的又一方面，还涉及一种用于法医学鉴定以及人类学和遗传学研究的试剂盒，其含有所述编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
本发明的再一方面，涉及所述编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于制备诊断或治疗肿瘤和/或自身免疫疾病的药物的用途。
图1显示HLA-A*110104扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果。其中泳道M为DNA分子量大小Marker，泳道1为阴性对照，泳道2和3为HLA-A*110104阳性扩增结果，泳道4为HLA-A*110101的扩增结果。HLA-A*110104特异性扩增片段大小为366bp，而内对照为HLA-DRB1内含子的序列，扩增片段为796bp。从电泳结果可以看出，本发明已成功建立了HLA-A*110104的PCR-SSP分型方法。
图2A、B、C和D显示血清学反应格局表，其是新等位基因编码的抗原表达于细胞膜表面，表现出与HLA-A11抗原相似的血清学反应特性的血清学检测结果。
图3A和图3B为根据2个家系HLA-A，B，C，DRB1，DQB1基因分型的结果，分别绘制的家系遗传图谱。从家系一的遗传图谱来看，HLA-A新等位基因来源于父亲，而且为HLA-A*11特异性，有二代遗传，在遗传选择上具有一定优势；从家系二来看，HLA-A新等位基因来源于祖母，而且为HLA-A*11特异性，有三代遗传，在遗传选择上具有一定优势。
图4显示为鉴定HLA-A位点新等位基因，采用位于5′及3′端非翻译区的序列位引物进行该位点全长cDNA序列的扩增的扩增产物电泳图。图中M代表DNA分子量大小，HLA-A位点全长cDNA序列为1098bp，加上两端的5′及3′端非翻译区的序列，长度增至1323bp。从电泳图来看，扩增片断的大小位于2000bp与1000bp之间，与理论值相符。
图5显示为验证所构建的载体中有无目标片段插入，以及插入片段的大小是否正确而对扩增质粒进行了酶切鉴定的电泳结果。从图中可以看到，1、4、5、6、7电泳道的标本均出现酶切结果，片段大小均为1323bp。
图6显示为证实本发明所建细胞株均未污染可作为永久性的标本来源，对所建细胞株进行支原体检测的结果。
实施例以下结合具体实施例进一步阐明但不意在限制本发明的保护范围。
本发明实施例中涉及的反应试剂按如下所述配制1)RPMT1640培养液的配制1小包装RPMT1640(GIBCOTMInvitrogen，10.4g含L-glutamine)溶于置于三角瓶内的1000ml三蒸水至充分溶解，通入CO2使PH值达到6.0左右，此时溶液呈桔黄色，待瓶底无未溶解的颗粒，加入NaHCO32g左右，使PH值回升到7.1-7.2左右，溶液由桔黄色转为桔红色。在超净工作台内用0.45μm膜过滤灭菌、分装，并记录抽滤日期。抽滤后的1640培养液，在4℃放置不要时间太长，一般抽滤一次1-2月内尽可能用完，如需保存时间较长，可放在-20℃下保存。抽滤时留3-5ml检菌(37℃，三天)2)抗菌素条件好的实验室可以不用抗菌素。一般浓度均为10000单位/ml。青霉素1000000单位，链霉素1g＝1000000单位，加生理盐水100ml溶解，过滤灭菌，分装小瓶，-20℃保存。用时每100ml全培养液基加1ml。
3)抗凝剂采血时所用抗凝剂是肝素，一般采用每毫升血加25单位肝素。每毫升全血加肝素也可少于25单位。市售肝素钠每2ml含12500单位，取肝素钠0.8ml(5000单位)加生理盐水99.2ml配成0.8％的肝素溶液。取0。8％肝素溶液0.5ml作抗凝剂，采5ml外周血后，置室温(25℃-30℃)2-3天后转化效果都很好。
4)谷氨酰胺称谷氨酰胺5.846g加三蒸水200ml(浓度为200mM)，分装成小瓶，-20℃保存。每100ml培养基加0.5ml-1.0ml。终浓度为1mM-2Mm。
5)胎牛血清美国HyClone公司生产的特级或优级FBS。购买血清时要注意是否对血清进行过内毒素、支原体、细菌和霉菌检测，使用前还需要进行血清灭活处理(+56℃，30分钟)。
6)1M Hepes液称Hepes23.85g，溶解在100ml三蒸水中，用1N NaoH调到PH到7.0，抽滤灭菌，分装小瓶，4℃保存。
7)淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque，Plus)Pharmacia(17-1440-02)产品，分装在10ml的试管内，每管4ml，避光保存。使用前在37C水浴中加温用前要充分摇匀，注意一定要选择无菌、低内毒素产品。
8)环孢霉素A(Cyclosporine A)商品名Sandimem，瑞士生产。每支5ml含250mg。将5ml环孢霉素分装成小瓶，4C保存。使用时取，浓度为50mg/ml的原液20μl加入50ml已经0.45μ膜抽滤灭菌的1640内，配制成20μg/ml的贮存液，分装成0.4-0.8ml小管内，-20C保存。如转化时样品量大，也可分装在10ml的大管中。使用时终浓度为2μg/ml。
9)Epsteim-Barr Virus(EBV)制备复苏B-958细胞株；所用培养液同细胞株的培养液相同，逐步增加培养液到所需要的毫升数时，饥饿细胞4-7天后，收集上清液，-70℃及37℃冻融3次，离心每分钟1800转/15分，过滤(0.2μm)，除去细胞碎片，分装后放置-70℃冰箱内保存待用。
10)PHA国产试剂，10mg，加生理盐水5ml，+4℃保存。
11)二甲基亚砜注意避光保存，室温下二甲基亚砜对细胞有毒。
12)全培养基全培养基内含RFMI 1640+15％胎牛血清1％双抗+1.6％ 1M Hepes液，需要说明的是如果培养箱不通CO2则Hepes应少加一些。通常是500ml 1640、90ml胎牛血清、6ml双抗，6ml谷氨酰胺，9ml Hepes液。在第一次转化每100ml全培养液中0.5ml PHA。
13)冻存液95％的胎牛血清，5％的二甲基亚砜，经0.2μm抽滤，避光保存(在4℃或-20℃)。冻存细胞时，一般1ml为一保存管为好(可控制复苏时的时间)。
实施例1 带有HLA-A位点新等位基因的家系标本获得及分析一、实验标本在5000例来我室拟进行造血干细胞移植前HLA配型的供受体中发现了2例HLA-A位点新等位基因的家系标本。为全面研究这2个新等位基因的家族遗传史及其相关免疫遗传特性尤其是为今后器官移植HLA配型试剂设计所需要，本研究抽取了这两个家系祖孙三代共13人的外周血标本，分别采用肝素抗凝和EDTA抗凝。
二、DNA提取采用QIAGEN公司提供的QIAamp Blood试剂盒进行提取。取0.5％EDTA抗凝全血200μl Buffer AL，200μl PK混匀，56℃温育10min，加入200μl无水乙醇混匀，转移至树脂柱，8000r/min离心1min，加入500μl Buffer AW1，1,8000r/min离心1min，加入500μl BufferAW2，8000r/min离心3min，将树脂柱转移至1.5ml离心管中，加入200μl Buffer AE，室温放置1min，8000r/min离心1min，-20℃保存。
三、PCR-SSP基因分型1 HLA-A、B、C位点PCR-SSP基因分型方法采用美国PEL-FREEZ公司提供的微量SSPTMHLA-A、B、C位点SSP-PCR基因分型试剂盒。先在微量管(D-MIX管)中加入去离子水270μl，再加入7.5μl(5U/μl)的Taq DNA聚合酶，混合后取8μl加入分型板的阴性对照孔中，取80μl DNA(75-125ng/μl)加入微量管中混匀，在分型板每个反应孔中加入8μl上述混合液，阴性孔不加，用封口膜密封。将反应板置于PE-9700 PCR仪上进行PCR反应，反应参数为(96℃ 60秒)×1个循环→(96℃ 25秒 70℃ 50秒 72℃ 45秒)×5个循环→(96℃ 25秒 65℃ 50秒 72℃ 45秒)×21个循环→(96℃ 25秒 55℃ 60秒 72℃ 120秒)×4个循环。取10μl PCR反应产物加入2.0％琼脂糖凝胶电泳孔内，电压140V，10min，在紫外检测仪下观察结果，分析电泳带格局，指定等位基因(参见图1)。
2 HLA-DR、DQ位点PCR-SSP基因分型方法采用美国PEL-FREEZ公司提供的微量SSPTMHLA-DR、DQ位点PCR-SSP基因分型试剂盒。先在微量管(D-MIX管)中加入去离子水90μl，再加入2.5μl(5U/μl)的Taq DNA聚合酶，混合后取8μl加入分型板的阴性对照孔中，取27μl DNA(75-125ng/μl)加入微量管中混匀，在分型板每个反应孔中加入8μl上述混合液，阴性孔不加，用封口膜密封。将反应板置于PE-9700 PCR仪上进行PCR反应，反应参数为(96℃ 60秒)×1个循环→(96℃ 25秒 70℃ 50秒 72℃ 45秒)×5个循环→(96℃ 25秒 65℃ 50秒 72℃ 45秒)×21个循环→(96℃ 25秒 55℃ 60秒 72℃ 120秒)×4个循环。取10μl PCR反应产物加入2.0％琼脂糖凝胶电泳孔内，电压140V，10min，在紫外检测仪下观察结果，分析电泳带格局，指定等位基因(参见图1)。
四、血清学实验为检验新等位基因所编码抗原是否为功能抗原，对家系标本进行了血清学实验。本实验采用美国One-lambda公司生产的荧光免疫磁珠法，即取2.5ml肝素抗凝外周血与已标记好的B细胞磁珠60-100μl以及2.5ml PBS(PH7.0)混匀，放入特制磁力架上，静置2min，吸弃所有混合液；之后加入PBS(PH7.0)4ml，混匀后静置2min，吸弃所有混合液；重复洗涤一次；加PBS(PH7.0)调细胞浓度为2000-2500个/μl，取1μl细胞液加入已含有HLA-A，B，C抗体和兔补体的72孔反应板中，37℃作用1h；加入反应终止液，2h后荧光倒置显微镜下观察结果。
血清学实验表明，该新等位基因编码的抗原表达于细胞膜表面，表现出与HLA-A11抗原相似的血清学反应特性，血清学结果详见反应格局表(图2A，B，C和D)。
实施例2.EBV转化建立永生化细胞株为获得永久性的标本来源，同时方便与国际间的交流与合作，本文建立了HLA新等位基因的永生化细胞株。具体过程如下.
1.采集标本如实施例1所述静脉采血5ml，肝素抗凝，1ml血提取DNA，4ml血转化用。
2.分离淋巴细胞4m1肝素抗凝血加2ml RPMI1640(Sigma，PH7.0)混匀，然后缓缓加入到已加有4ml淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque，Plus，Pharmacia(17-1440-02))的10ml离心管中，2500r/min 30min；吸淋巴细胞层于另一离心管中，加入5ml RPMI1640(Sigma，PH7.0)混匀，1500-1800r/min，10min，洗3次。
3.EBV转化向分离的淋巴细胞中加入2ml完全培养基，1.2ml EBV上清(中科院遗传所徐久瑾教授惠赠)，0.4ml环孢酶素A(PHA 0.5％)，5％ CO2，37℃孵育。
转化成功的标志在EBV感染24小时，首先为淋巴细胞增大，明显母细胞化；其次是增生的淋巴母细胞凝集现象迅速发生。在转化3-4天后，培养液PH值发生变化，呈橙黄色。
4.培养(1)悬浮培养培养液的体积不超过培养瓶的2/3。
(2)注意培养液的PH值的变化，一般从橙红色变化为橙黄色，如果2-3天内，PH值没有变化，说明细胞状态不太好；如果变化得太快，可能是加液量不够。
(3)半量换液培养瓶内的培养液达到了瓶体积的2/3时，就需要半量换液。从培养瓶中吸取液体体积的一半量或更多一点培养液弃去，加入等量的培养液或多一点。细胞量逐渐增多，可分瓶培养，一般情况一周两次加液或半量换液。
5.冻存细胞株冻存必要条件是细胞要达到一定的数目。当本细胞株细胞数达到300-600万/cm3就可以冻存(用计数板计数，健康活细胞应达到90以上)。冻存前一天需加新鲜的培养液。冻存细胞离心速度不超过1000转/分，冻存液保持4℃，细胞进入冻存液后，放置-70℃的冰箱1小时后或隔夜进入液氮柜中保存。冻存管上应标记细胞株的名称字母代码、顺序号数、冻存日期。
6复苏将细胞从液氮柜中取出，放入保温瓶或其他保温的容器中转移到实验室。在37℃水浴中解冻注意只浸没冻存管的下半部分，轻轻晃动，不要让水平面靠近冻存管盖，当冻存管中尚存有少量冰块(黄豆粒大小)时，用1％的新洁尔灭擦拭冻存管进入超净台中，整个时间约1分钟左右，解冻后的细胞直接进入全培养液中，无须离心洗涤。核对培养瓶上标记的细胞代码、号数及冻存日期后，进入37℃培养箱内。复苏成功标记(1)复苏3小时后，活细胞在50％以上；(2)24小时后pH值明显发生变化，细胞集合成团状。
支原体检测支原体污染会严重抑制细胞的生长。文献报道，世界各国有不少实验室的细胞株支原体污染率在17％-63％之间。检测支原体污染的方法有很多，如细胞培养法、免疫检测法、间接DNA染色(Hoechst33258染色)法及PCR法，各有千秋。本发明中采用的是细胞培养方法。
具体方法选美国GIBCOTMInvitrogen公司支原体检测试剂盒。其原理基于支原体和宿主哺乳动物细胞的生化差异，支原体含有大量的腺苷三磷酸酶，而哺乳动物细胞中含量甚微。腺苷三磷酸酶可以将6-MPDR(一种非毒性的腺苷同类)转化为两种物质6-甲基嘌呤和6-甲基嘌呤核苷，这两种物质对哺乳动物细胞均有害。
若检测细胞株中有无支原体污染，可通过其培养物与6-MPDR共同孵育后，检测哺乳动物的细胞毒性来判断。指示细胞选用的是VERO(非洲绿猴肾细胞，中国医学科学院基础医学研究所细胞库)，其对支原体的感染十分敏感。具体步骤如下a)用无抗生素DMEM培养基(GIBCOTMInvitrogen)培养指示细胞(VERO)，当其密度为2.0×104个细胞/ml时，可将细胞移至24孔板中，使每孔密度为3.0×104个细胞/1.5ml；b)将24孔板防于37℃，5％ CO2孵箱中培养，2h，使VERO细胞吸附于孔底；c)24孔板的第一行第一列作为阴性对照孔(用NC表示)，每孔均加入0.2ml的DMEM培养基；d)各行任选一孔为阳性对照孔(用Pc表示)，每孔各加入0.2ml的阳性对照稀释液(1mM腺苷三磷酸)；e)其余每纵行的三个孔可加入同一样品，做平行对比实验。取无抗生素培养的待检细胞株悬液加入同一纵列的三个孔中，每孔0.2ml。
f)37℃ 5％ CO2孵箱中培养24h；g)24h后，向第2、3行每孔中分别加入50μl的6-MPDR稀释液h)37℃ 5％ CO2孵箱中培养72-96h，直至阴性对照孔中细胞融合成片；i)吸出培养基，不要破坏单细胞层，j)加入10％ PBS(PH7.2)配制的0.2％龙胆紫于各孔中，室温孵育20mink)吸出染料，生理盐水冲洗至干净为止，空气中干燥。
l)光镜下观察结果(参见图6)实施例3、提取人外周血总RNA并RT-PCR(reverse transcriptpolymerase chain reaction)合成cDNA第一链肝素抗凝外周血5ml，淋巴细胞分层液分离单个核细胞，使用TRIZOL(GIBCOTMInvitrogen)一步法试剂盒提取人外周血总RNA，溶于30μl无核酶水。
采用RT-PCR试剂盒(GIBCOTMInvitrogen)反转录合成cDNA第一链，反应体系如下总RNA 100ng，OligodT16-18(500μg/ml)1μl，10mMdNTPMIX1μl，加灭菌水至10μl，65℃ 5min；冰浴大于1min，加入10×Buffer 2μl，25mM MgCl24μl，0.1M DTT 2μl，Rinaseout(40U/μl)1μl，混匀后离心，42℃ 2min，加SuperscriptII(200U/μl)，42℃ 50min，冰浴，加1μl RNAH(2U/μl)，37℃ 20min.
实施例4、位点特异性引物扩增HLA-A位点全长cDNA序列以cDNA为模板，PCR扩增HLA-A位点基因全序，反应体系如下1×pyrobest buffer(含2.5mM MgCl2)，0.2mM dNTPs，cDNA第一链3μl，HLA-A位点全长cDNA序列的上下游引物(A-upper5′-GGACTCAGATTCTCCCCAGACGCCGAGG-3′，A-lower5′-AGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGA AG-3′)各10pM，pyrobest DNA高保真聚合酶(5U/μl)0.25μl，加去离子水至50μl。(94℃ 30sec，66℃ 30sec，72℃ 120sec)×10循环→(94℃ 30sec，61℃ 30sec，72℃ 120sec)×20循环→72℃ 7min→4℃∝。所用试剂均为Takara公司生产。
cDNA扩增结果为鉴定HLA-A位点新等位基因，本研究采用位于5′及3′端非翻译区的序列位引物进行该位点全长cDNA序列的扩增，扩增结果见图4实施例5 连接、转化、克隆鉴定并DNA序列测定采用promega公司生产的pGEM-T easy载体连接试剂盒。由于pyrobest DNA高保真聚合酶合成的PCR产物为平末端，故需加“A”尾才能与T载体连接。加“A”尾步骤如下PCR产物3μl，25mM MgCl21μl，10×buffer 1μl，TaqDNA polymerase(5U/μl)1μl，去离子水3μl，70℃ 30min。连接pGEM-Teasy载体过程如下2×ligasebuffer 5μl，T4 vector 1μl，加“A”尾产物3μl，T4 ligase(5U/μl)1μl，4℃，连接过夜。转化、克隆与酶切鉴定见分子克隆。
将扩增片断纯化回收后，连接T-easy载体，为验证载体中有无片断插入，以及片断大小是否正确，本研究对扩增质粒进行了酶切鉴定，由于该载体在插入片断的两端是先加入EcoRI酶切位点，故采用该核酸内切酶就可以将插入片断切下。酶切片断的鉴定结果参见图5。
最后将鉴定克隆送Invitrogen公司测序鉴定。
HLA-A*11新等位基因的核苷酸序列如下1 ATGGCCGTCA TGGCGCCCCG AACCCTCCTC CTGCTACTCT CGGGGGCCCT GGCCCTGACC61CAGACCTGGG CGGGCTCCCA CTCCATGAGG TATTTCTACA CCTCCGTGTC CCGGCCCGGC121 CGCGGGGAGC CCCGCTTCAT CGCCGTGGGC TACGTGGACG ACACGCAGTT CGTGCGGTTC181 GACAGCGACG CCGCGAGCCA GAGGATGGAG CCGCGGGCGC CGTGGATAGA GCAGGAGGGG241 CCGGAGTATT GGGACCAGGA GACACGGAAT GTGAAGGCCC AGTCACAGAC TGACCGAGTG301 GACCTGGGGA CCCTGCGCGG CTACTACAAC CAGAGCGAGG ACGGTTCTCA TACCATCCAG361 ATAATGTATG GCTGCGACGT GGGGCCGGAC GGGCGCTTCC TCCGCGGGTA CCGGCAGGAC421 GCCTACGACG GCAAGGATTA CATCGCCCTG AACGAGGACC TGCGCTCTTG GACCGCGGCG481 GACATGGCAG CTCAGATCAC CAAGCGCAAG TGGGAGGCGG CCCATGCGGC GGAGCAGCAG541 AGAGCCTACC TGGAGGGCCG GTGCGTGGAG TGGCTCCGCA GATACCTGGA GAACGGGAAG601 GAGACGCTGC AGCGCACGGA CCCCCCCAAG ACACATATGA CCCACCACCC CATCTCTGAC661 CATGAGGCCA CCCTGAGGTG CTGGGCCCTG GGCTTCTACC CTGCGGAGAT CACACTGACC721 TGGCAGCGGG ATGGGGAGGA CCAGACCCAG GACACGGAGC TCGTGGAGAC CAGGCCTGCA781 GGGGATGGAA CCTTCCAGAA GTGGGCGGCT GTGGTGGTGC CTTCTGGAGA GGAGCAGAGA841 TACACCTGCC ATGTGCAGCA TGAGGGTCTG CCCAAGCCCC TCACCCTGAG ATGGGAGCTG901 TCTTCCCAGC CCACCATCCC CATCGTGGGC ATCATTGCTG GCCTGGTTCT CCTTGGAGCT961 GTGATCACTG GAGCTGTGGT CGCTGCCGTG ATGTGGAGGA GGAAGAGCTC AGATAGAAAA1021 GGAGGGAGTT ACACTCAGGC TGCAAGCAGT GACAGTGCCC AGGGCTCTGA TGTGTCTCTC1081 ACAGCTTGTA AAGTGTGAHLA-A*11新等位基因编码的推定氨基酸序列如下MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHT
IQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGRCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV从测序结果来看，出现HLA-A*11新等位基因的2个家系的测序结果完全一致，是同一个HLA-A*11新等位基因，而且出现在安徽与山西两个省份的2个不同家系中，可见该等位基因在中国人群中具有一定的频率和普遍性，而非罕见的HLA等位基因。
实施例6、1.同源序列比较并注册Genbank本发明在克隆HLA-A*11新等位基因全长cDNA并测序分析后，先登陆Genbank进行同源序列比较，然后登陆GenBank国际网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html，获得登录号AY786585。
2.注册IMGT，最终获得WHO正式命名注册IMGT(EMBL:http://www.ebi.ac.uk/Submissions/index.html)生物信息学网站，WHO HLA命名委员会正式命名AY786585为HLA-a*110104，并将公布于Human Immunology、European J Immunogenetics、Tissue Antige杂志上。
实施例7、建立HLA-A*110104新等位基因的PCR-SSP基因分型方法根据突变的碱基位于第三外显子的第8位(C-T)，故将下游引物的3′端设计为A，又依据上下游引物的Tm值大小设计了如下引物对上游引物5′-GGGACCAGGAGACACGGAATG-3′，下游引物5′-GCAGCCATACATTATCTGGATGGTA-3′，扩增片断长度为366bp。实验中设立内对照，其PCR产物为HLA-DRBl内含子片段，长度为796bp，上下游引物分别为5′-ACGGAATGTGAAGGCCCAG-3′和5′-GCATCTTGCTCTGTGCAGATT-3′。反应体系如下基因组DNA 1μl(200ng/μl)，25mM MgCl24μl，10×buffer 5μl，2mM dNTPMIX5μl，HLA-A*110104特异性引物对1μl(20pmol/μl)，内对照引物对1μl(10pmol/μl)，TaqDNA polymerase(5U/μl)1μl，去离子水加至50μl，将反应板置于PE-9700 PCR仪上进行PCR反应，反应参数为(96℃ 25秒 66℃ 50秒 72℃ 60秒)×10个循环→(96℃ 25秒 61℃ 50秒 72℃ 60秒)×20个循环。取10μl PCR反应产物加入2.0％琼脂糖凝胶电泳孔内，电压100V，10min，在紫外检测仪下观察结果，分析电泳带格局，指定等位基因。电泳结果如图1所示。
实施例8 HLA-I，II类基因分型结果本研究为探讨HLA新等位基因的来源，分别对2个家系三代标本进行了HLA-I，II类低分辨率基因分型，结果详见表1及表2。从表1中可以看到，SBW(先证者)的HLA-A新基因来自其父亲，而其祖父与祖母的HLA-A位点并未出现新的HLA等位基因，也就是说该新等位基因在家系一中表现为2代遗传。从表2中可以看到，NWW(先证者)的HLA-A新基因来自其父亲，而其父亲是由其祖母遗传而来，也就是说该新等位基因在家系二中表现为3代遗传。
本研究为证实HLA新等位基因低分辨率的分型结果，对SBW、SRS、NHL、NWW及RXZ标本的HLA-A位点进行了高分辨基因分型。从结果来看，高分辨分析结果中无论指定A11或其它基因，均有缺孔出现，这进一步证明了HLA-A位点新等位基因的确存在。
表1.家系一的HLA-I、II类低分辨率基因分型结果
表2.家系二的HLA-I、II类低分辨率基因分型结果
实施例9 绘制家系遗传图谱为进一步研究新等位基因的来源及其遗传选择的优势，本研究根据2个家系HLA-A，B，C，DRB1，DQB1基因分型的结果，分别绘制了其家系遗传图谱。从家系一的遗传图谱来看，HLA-A新等位基因来源于父亲，而且为HLA-A*11特异性，有二代遗传，在遗传选择上具有一定优势；从家系二来看，HLA-A新等位基因来源于祖母，而且为HLA-A*11特异性，有三代遗传，在遗传选择上具有一定优势(参见图3A和B)。
讨论八十年代未随着分子生物学的飞速发展和在免疫遗传学研究领域中的广泛渗透，对HLA结构与功能以及配型应用领域的研究也带来巨大变化，PCR技术及DNA序列测序方法的建立，已极大地改善了人们发现并鉴定HLA基因座位和等位基因的数量。同时也使配型的准确性和分辨率得到了极大地改观。回顾性对比研究已确证，既往被确定为完全相合的许多供-受体实质上其HLA等位基因并不相同。因为对于等位基因的检测而言，血清学方法根本无法实现。配型分辨率的极大提高和不断发现的大量新等位基因是空前的，从而极大地动摇了人们所讲的“临床”HLA相合的概念。由于HLA基因分型方法比传统的HLA血清学分型方法准确，故已取代后者并被广泛用于骨髓移植中的HLA分型。根据HLA基因分型的精细程度，一般被分为低分辨分型和高分辨分型两种。低分辨分型是指被鉴定的等位基因相当于HLA抗原分解物(split)水平，即通常所说的HLA亚型(即组基因)。在WHO基因命名中，HLA亚型相当于星号后2位数的水平。高分辨分型是指精确到核苷酸顺序水平，即WHO命名的星号后4位数。临床资料表明，骨髓移植供者和受者的HLA-A、B、DR抗原相合程度越高，发生移植物抗宿主反应(GVHD)的机会越低，移植存活率也高。因此，为提高HLA分型的准确性、避免漏检尚未被发现的HLA等位基因，发现和鉴定特定人群中新的HLA等位基因已成为当前国际上HLA研究领域中的重要课题和研究热点。
近些年无关供者骨髓库和脐血库的迅猛成功发展给许多病人提供了挽救其生命的可能机遇。目前仅美国骨髓库(NMDP)就注册登记3.5万之多，国际骨髓库(BMDW)的库容已超过7百多万份。这些库容登记资料包括HLA配型结果，绝大多数库的资料可通过www.marrow.org及www.bmdw.org在网站上进行查询。从NMDP所查获的遴选供体HLA的配型资料＞80％均为HLA-A、B、DR中分辨水平。随后移植中心可获取候选供体及病人的新鲜标本再进行高分辨及更多信息的配型。美国西雅图华盛顿大学和Fred Hutchinson癌症研究中心的经验表明，从所筛选到的候选供体中一般约50-60％的病人能从中找到在等位基因水平相匹配的供体。然而，从国际上更多移植中心的查询结果来看，更多的病人则只能找到HLA基因位点部分匹配的供体。应强调指出的是，这些确证的统计资料只适用于欧洲大陆和北美高加索人，因为无论是NMDP也好还是BMDW也罢，其绝大部分供体的来源组成就是由这些人种所构成的。言外之意也就是说，从上述库中找到与其它种族或少数民族相匹配供者的极率是很小很小。因此，应必须加快在世界各国进行无关供体捐赠的筹建。随着我国无血缘关系供受体移植病例的迅猛增加，发现中国人群中特有的HLA等位基因，以提高HLA配型的精确度就显得格外重要。尤为重要的是，努力发掘中国人群中特有的HLA基因多态性，使得器官及造血干细胞移植患者能够更加准确地进行HLA精确配型以寻找最佳匹配供体，防止移植排斥反应发生和延长患者生命。
的确在无关供体骨髓库或脐血库中能够寻找到HLA相匹配的供体对等待接受造血干细胞移植的病人来讲是一个非常重要的治疗选择。但对于如何有效确定无关供-受体间HLA匹配程度的可接受范围以及这种移植的利和弊目前仍是亟待解决的难点之一。迄今为止对于HLA最小匹配度的可纳性尚无令人信服和意见统一的指导原则，当然这也是极其难做的大问题，需要大规模大宗的移植病例进行双盲随机的临床移植实验研究方能得出科学公正的结论。因为这种移植的结果会在不同年龄的病人、不同的病种、不同的病期、不同的预处理方案有明显的区别。1998年在国际《血液》杂志上刊发了由美国Fred Hutchinson癌症研究中心及西雅图华盛顿大学联合对300例接受无关供体造血干细胞移植的CML病人进行了HLA等位基因错配对移植排斥反应影响的研究结果，总的排斥率为5.6％，而HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点等位基因完全匹配者的排斥率仅为2％；当II类的一个DR或DQ等位基因的不匹配时并未出现排斥反应；相反，当供-受体间I类基因如有2个或更多等位基因不合时则移植排斥率明显增加可高达20％。此结果与该研究所1997年所发表的结果相一致，即I类A、B或C等位基因的不合比II类DR或DQ等位基因不合所引起的移植排斥会更高。
值得注意的是，同年日本学者在《新英格兰医学杂志》上首次报告了HLA等位基因匹配度与GVHD及生存率关联的报告，这组473例病人是日本无关供体库(JMDP)的受体。由美国Fred Hutchinson癌症研究中心及西雅图华盛顿大学在国际《血液》杂志上报道的300例无关供受体主是高加索人。两组报告的结论均认为，移植后GVHD的发生率及死亡率可因供-受体HLA-A、B、C、DRB1和DQB1等位基因的完全匹配而明显减少，多位点等位基因的不匹配与移植后显著高发的并发症、低生存率相关。日本人的结果明显提示，aGVHD和死亡率的高危险指数与A位点相关。而美国西雅图的结果却表明，DRB1或DQB1位等位基因的不合是发生GVHD较大的因素，而与I类单一等位基因的匹配与否无关，aGVHD最危险的因素在美国西雅图是与I、II类等基因不匹配相关。同样，生存率更明显地受至少一个I类等位基因和一个II类等位基因的影响，而单个I类或一个II类等位基因的不合并不明显减少生存率，两个或更多的I类等位基因的不合则会使生存率减少。为什么GVHD在日本人的研究中与HLA-A位点的等位基因不合相关，而在美国西雅图却与DRB1或DQB1位点的等位基因密切相关。使人信服的理由是，这两组病人在种族遗传上有明显的不同可以解释临床结果的不同。显然，在日本移植病人错匹的A位点等位基因和在美国高加索病人配错的A位点的等位基因是不一样的。这一发现提示，不同错配的等位基因可能导致不同的同种免疫反应，也就更加加支持某些等到位基因是可允许错配“permissive mismatches”的这一观点。
根据国际骨髓供者协会(WBDA)以及欧洲免疫遗传学联盟(EFI)的标准[5，6]，在大规模的骨髓库供者分型中，一般只要求鉴定到WHO命名星号后2位数，即HLA抗原特异性亚型水平。但是对于患者及其HLA配合的供者，应该做高分辨分型。此外，在HLA-I类基因中还应该包括C座位。在选择供者是，HLA-I类基因主要看抗原特异性是否配合；HLA-DRB1基因要求尽量达到WHO命名星后4位数全相同。如果无其他选择，取DR抗原相同者为佳。
HLA-A*11抗原是中国人群常见的抗原，其在中国人群中的发生频率为10％-30％，而在高加索人种以及黑人中的频率仅分别为4％-8％和＜1％。HLA-A*11抗原属于HLA-I类抗原，表达于所有有核细胞表面，是人体重要的移植抗原，在器官与造血干细胞移植排斥反应中发挥重要作用。所以，在中国人群中发现HLA-A*11新等位基因就具有特别重要的意义。本研究所发现的HLA-A*110104新等位基因出现在安徽与山西两个省份的2个不同家系中，而且均有两到三代遗传史，可见该等位基因在中国人群中具有一定的频率和普遍性，而非罕见的HLA等位基因，所以更具有重要的医学与人类学研究价值。尤为重要的是，本研究所发现的HLA-A*110104新等位基因具有几种不同遗传编码形式，这可能会造成其编码抗原的不表达、低表达或引发细胞内信号传导的改变，从而造成不同的免疫应答现象，对于这一方面的深入研究正在进行之中。
总之，HLA-A*110104新等位基因的发现不仅为人类遗传基因库增添了新的成员，而且，使得器官及造血干细胞移植患者能够更加准确地进行HLA精确配型以寻找最佳匹配供体，防止移植排斥反应发生和延长患者生命。同时，这项新发现还将阐明人体中存在不同HLA抗原形式的具体意义，并且可广泛应用于法医学鉴定、人类种族迁移等相关研究中。
权利要求
1.一种编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全长多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于移植前进行精细的HLA分型的用途。
3.一种用于移植前进行精细的HLA分型的的试剂盒，其含有权利要求1所述的编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
4.权利要求1所述的编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于法医学鉴定以及人类学和遗传学研究的用途。
5.一种用于法医学鉴定以及人类学和遗传学研究的试剂盒，其含有权利要求1所述的编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
6权利要求1所述的编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104用于制备诊断或治疗肿瘤和/或自身免疫疾病的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种编码人类白细胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全长多核苷酸序列及其用途。
文档编号C07K16/28GK1834244SQ20051005560
公开日2006年9月20日 申请日期2005年3月18日 优先权日2005年3月18日
发明者奚永志, 孙玉英, 梁飞, 金荔 申请人:中国人民解放军军事医学科学院附属医院