核酸复合体的制作方法

专利名称：核酸复合体的制作方法
相关申请本申请要求提交于2004年2月28日的美国临时申请系列号60/548,963的优先权，将其全部内容并入作为参考。
背景探针杂交已被用于检测小量的特异性核酸序列。该检测方法不是非常灵敏的，因为其经常不能区别真实的信号与来自非特异结合的干扰。最近研制的方法通过扩增靶序列解决了该问题。
靶扩增通过重复从头合成特异性靶序列来提高检测的灵敏性。见，例如美国专利4,683,195，4,683,202，4,800,159，5,455,166，5,288,611，5,639,604，5,658,737，和5,854,033；EP No.320,308A2；国际申请PCT/US87/00880；和Zehbe等，20 Cell Vision，vol.1，No.1，1994。然而，这些方法是费力的并且需要使用昂贵的仪器或酶。此外，它们的成功取决于靶序列的完整性。损伤的靶序列不能通过这些方法进行检测。
检测灵敏性还可以通过扩增信号，循环靶，循环探针，或使用支链DNA分子作为信号发生物(generator)来增加。见，例如，美国专利4,699,876，6,114,117，和5,118,605；和Bekkaoui，等，BioTechniques，20240-248，1996。此外，这些方法由于对核酸杂交固有的背景干扰不加选择的扩增而具有被限制的诊断应用。
已经将基于重组酶recA的同源DNA链交换和D-环形成用于富集和检测核酸。见，例如美国专利5,670,316和6,335,164。虽然如此，这些方法易被异源DNA的干扰所影响。
存在开发一种核酸检测方法的需要，所述核酸检测方法与现有的方法相比，更灵敏、特异和廉价。
发明概述本发明基于交联的核酸复合体的发现，所述核酸复合体仅在如果其组成核酸的三个包含彼此同源的序列时才可以形成。重要的是，非常小量的目标核酸序列的拷贝足以促使该复合体的形成。此外，所述复合体在其用荧光染料染色后，具有高度增加的荧光发射。结果，目标序列在非常低的量时即可容易地进行检测。此外，该复合体的形成可以被目标序列的片段化的碎片所激发，并因此，检测灵敏性不依赖于序列的完整性。
因此，本发明涉及制备交联核酸复合体的方法，其通过在存在痕量第三核酸的情况下，使用多个第一和第二核酸来进行。用于本文时，术语“多个(a plurality of)”指至少102的数目(例如，106)。术语“痕量”指至少1的数目。第一核酸的每一种与第二核酸的每一种互补，并且包含与第三核酸的每一种的位点，即片段，互补的序列。所述第一核酸和第二核酸可以被方便地提供为双链DNA并且它们的数目各自是第三核酸的数目的1到1016倍(优选地，103到1013倍)。它们各自具有100到20,000个核苷酸的长度(例如，200-8,000个核苷酸)。在第一核酸和第三核酸之间的互补序列可以具有10-20,000个核苷酸(例如，20-8,000个核苷酸)的长度。为了促进交联的核酸复合体的形成，可以将第一，第二和第三核酸进行变性，并将它们定位于平面。作为实例，可以使用离液序列高(chaotropic)的水性溶剂来使核酸变性，并且接着加入疏水有机溶剂到离液序列高的水性溶剂中来将核酸定位在两种溶剂之间的界表面。如果必要，由此形成的交联的核酸复合体还可以从这两种溶剂的混合物中提取。
在由此获得的在本发明范围内的交联的核酸复合体中，第一或第二核酸的数目是第三核酸的数目的1-1012倍(优选地，103到108倍)。所述复合体具有独特的荧光性质。当用溴化乙锭染色后，在518nm处激发时，其发射605nm的荧光，其强度为溴化乙锭染色的非交联的第一，第二和第三核酸的至少10倍。
所述交联的核酸复合体可以充当在鉴定例如获自样品的核酸序列中的靶位点的方法中的可检测手段。更具体地，当所述第三核酸(上面提及)是被怀疑包含与所述第一核酸(也在上面提及)的每个的序列互补的靶位点的DNA或RNA分子时，靶位点的鉴定可以通过进行上述方法来完成。由于交联的核酸复合体在缺乏靶位点的情况下不形成，检测到该复合体则表明靶位点是存在的。交联的核酸复合体的形成可以通过其表观分子量的增加得到证实，并且其量可以通过其在用双链DNA嵌入荧光染料染色后的荧光发射强度来确定。
重要的是，第三核酸的序列完整性没有影响检测，因为对于复合体形成，不需要从头DNA合成。这种优势使得检测即使损伤的DNA，即少于一个完整靶位点的DNA成为可能，并且不能通过基于PCR的扩增方法来完成。
也在本发明的范围内的是多相系统，其中可以进行上述方法来形成交联的核酸复合体。这种多相系统包括在混合时彼此分离成两相的疏水有机溶剂和离液序列高的水性溶剂，和在两种溶剂之间的平面界表面表面的多个核酸。在平面界表面表面的核酸可以是第一，第二和第三核酸(上面提及)的混合物，第一和第二核酸的混合物，或第三核酸的混合物，这要取决于将所述三个核酸被引入疏水有机溶剂和离液序列高的水性溶剂的混合物中的顺序。
本发明的其它的特点、目标和优势将通过说明书和权利要求变得显而易见。
发明详述为了说明本发明的核酸复合体可以怎样制备，在下面详细描述了这样的复合体在用于检测靶核酸位点的方法中的形成。
所述靶位点可以是单链核酸(例如，单链病毒DNA或人mRNA)，双链DNA(例如，双链病毒DNA或人基因组DNA)，DNA-RNA杂化物，和上述一种或多种的组合的部分。例如，可以如下检测分离自人血的双链病毒DNA。首先通过鉴定病毒基因组的共有序列来选择待检测的靶位点，所述共有序列对于病毒是独特的，并且在人和其它病毒DNAs中是不存在的。接着，可以通过标准分子克隆技术来构建包含互补于选定的靶位点的序列的双链DNA探针。接着在离液序列高的水性溶剂中对所述双链病毒DNA和双链探针(优选地，103到1010倍于病毒DNA的拷贝数)进行变性，其中所述病毒DNA和探针是不稳定的，并且它们各自的互补链解离以采取解旋构象。接着，将疏水有机溶剂加入水性溶剂中来产生双相系统，其中在所述两种溶剂中形成平表面。适合的疏水有机溶剂的实例包括苯胺，正丁醇，叔戊醇，环己醇，苯酚，对甲氧基苯酚，苯甲醇，吡啶，嘌呤，3-氨基三唑，丁酰胺，己酰胺，硫代乙酰胺，δ-valarolactam(戊内酰胺)，叔丁脲，亚乙基硫脲，烯丙基硫脲，硫脲，氨基甲酸乙酯，N-丙基氨基甲酸乙酯，N-甲基氨基甲酸乙酯，氰基胍，和上述两个或更多的组合。适合的离液序列高的水性溶剂的实例包括包含SCN-，Mg2+，Ca2+，Na+，K+，NH4+，Cs+，Li+，和(CH3)4N+的一个或多个的那些，以及包含甲苯磺酸盐-，Cl3CCOO-，ClO4-，I-，Br-，Cl-，BrO3-，CH3COO-，HSO3-，F-，SO42-，(CH3)3CCOO-，和HPO4-的一个或多个的那些。
下面描述的是假设的机制，通过所述机制形成了交联的核酸复合体。在离液序列高的水性溶剂-疏水有机溶剂系统(即，两亲性环境)中的双链探针和双链病毒DNA将被吸引到有机相和水相之间的界表面并且将它们的亲水磷酸核糖部分暴露于水相，将它们的疏水环部分暴露于有机相。换言之，不能维持沃森-克里克配对。此外，因此稳定的两个互补探针链(以及病毒DNA的两个互补链)在相同的平面上彼此紧密接近地并行配对，即呈平行配对的状态。在一对平行探针链之间的区域性配对被包含靶位点的病毒DNA链所干扰，所述病毒DNA链与包含互补于所述靶位点的序列的探针链配对。除了被干扰的区域，所述探针链保持平行配对的状态。换言之，所述互补探针链仅仅被部分解开(displace)。然而，在被干扰区域的任一末端产生扭结(kink)。所述纽结扭曲平行探针链的拓扑结构并且迫使它们的部分从平表面进入水相。在平表面上，包含与靶位点相同的序列的部分解开的探针链还与另一对平行探针链的其中一条并行配对，使该对的另外一条被部分解开并且准备与该平行探针链的另一对的其中一条配对。在受控的条件下，该方法继续进行直到复合体形成过程在能量方面不再是有利的，因为所述探针链减少并且不再进行平行配对。结果，小量拷贝的病毒DNA足以在探针链中引发一系列的交联事件，产生交联的核酸复合体。因此形成的复合体可以容易地通过乙醇或异丙醇沉淀在存在离液序列高的水溶液情况下进行分离。
当用溴化乙锭染色后在518nm处激发时，由此获得的交联的复合体发射605nm的荧光，其强度是溴化乙锭染色的非交联的探针核酸和病毒DNA的至少10倍。其实，这种增加很多的荧光强度可以如下确定。用0.25μg/ml的溴化乙锭对100ng的交联复合体进行染色达5分钟。接着测量荧光强度并且与获自100ng的未处理核酸，即病毒DNA和双链探针的荧光强度进行比较。还可以通过其它方法来检测所述复合体。例如，其可以在通过凝胶电泳分析后肉眼观察。交联的复合体的存在通过在凝胶上的带来指示，所述带的分子量大于未处理的核酸的组合分子量。或者，可以通过在沉降平衡过程中，是否有物质距离旋转轴的距离比较未处理的核酸更远的原理来检测所述复合体。还可以通过显微镜来检测所述复合体。例如，可以在显微镜载玻片上经过湿室蒸发后在荧光显微镜下观察荧光染料染色的复合体。形成的复合体的量还可以在将以单链形式存在的未反应的探针用单链DNA特异性核酸酶(例如绿豆核酸酶)消化去除后，通过定量PCR(QPCR)来进行定量。可以将靶特异性的引物用于在信号产生引物(例如AmpliSensor)或探针(例如TaqMan探针)存在的情况下扩增所述靶序列来指示在复合体中存在的探针核酸的总量。
来自生物或其它样品的核酸优选地在检测测定之前进行纯化。例如，样品(例如，血液，淋巴液，尿，食物或污水)可以首先在裂解缓冲液中温育。接着，加入乙醇或异丙醇以促进核酸沉淀。如上所述，核酸，以及双链探针，可以用以前提到的离液序列高的水性溶剂来进行变性。可以根据经验对离液剂的浓度进行确定从而使探针核酸的互补链在变性后，仍旧在平表面上彼此并行配对。
通常，检测灵敏性可以通过增加探针链的量或增加探针链的长度来提高。通过在探针中包含防止分枝迁移的如夹子的高能量屏障(即，更高的GC含量)区域，其还将在所述复合体形成后稳定所述复合体。还可以通过在每次重复前使所述复合体片段化后，重复所述复合体的形成过程来增加检测的灵敏性。复合体可以用T7内切核酸酶I来形成片段，所述T7内切核酸酶I消化错配的DNA和霍利迪结构。片段化的复合体将继续进行典型的(canonical)B型螺旋的沃森-克里克碱基配对，并且可以因此引发其与新增加的双链探针的交联反应。
可以将特异于单一靶位点的多个探针或特异于多个靶位点的单一探针用于在单一测定中检测不同的靶位点。由于信号，甚至是无区别的信号，将与在反应中存在的各自靶位点的量直接相关，该方法对于在一个样品中同时检测多个病原体是特别有用的。
上述方法还可以用于制备涂布材料，其通过，如果必要用任何适合的核酸序列来取代病毒DNA进行。所述交联的复合体由于核酸的聚阴离子基团而具有高电荷密度，并且可以用于涂布表面以固定阳离子分子。其可以通过标准喷雾技术来涂布于表面形成薄膜。
也在本发明范围内的是，用于通过上述方法检测特异性核酸序列的试剂盒。所述试剂盒可以包含下列试剂的两个或更多特异于靶序列的探针核酸，离液序列高的试剂或离液序列高的水性溶剂，疏水有机溶剂，用于检测的荧光染料。
不需另外的解释，认为本领域技术人员可以，基于上述描述(包括假定的机制，其不局限所要求的本发明的范围)，将本发明用到其最广泛的范围。本文引用的所有的出版物和以前的美国临时申请系列号60/548,963特此以其全部内容并入作为参考。下面的具体实施例将仅被视为是举例说明性的，并且不以任何方式限制本说明书的范围。
实施例使用包含相应于HBV表面抗原特异性序列(HBVSAg)的片段的核酸序列来检测人B型肝炎病毒(HBV)基因组。使用下列引物TCG TGG TGGACT TCT CTC AAT TTT CTA GG，(SEQ ID NO1)和CGA GGC ATA GCAGCA GGA TGA AGA GA(SEQ ID NO2)来从HBV基因组来源PCR-扩增该HBVSAg片段。接着，将PCR-扩增的HBVSAg片段通过HincII限制酶切位点来亚克隆到修饰的PUC18质粒中。将由此获得的HBVSAg/PUC18质粒在大肠杆菌DH5α(E.coli DH5α)菌株中进行增殖。将从大肠杆菌中通过质粒提取分离的10μg该质粒随后用限制性内切核酸酶EcoRI进行消化，产生包含所述HBVSAg片段的～3kb的片段。将所述片段，双链DNA探针用作检测HBV的探针。在下面显示的是DNA探针的两条链之一的序列。该序列包含“夹”区域(以黑体字显示)，其提供独特的能量屏障来避免两条链的分离。
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将5×102到5×10-2拷贝数的HBV基因组重悬于20μl的1.0M的GuSCN和50mM的磷酸钾(pH6.0)中。接着，将15ng的探针加入HBV基因组溶液的每个中，随后加入20μl的苯胺以形成包含离液序列高的水性溶剂和疏水有机溶剂的双相系统。涡旋所述混合物并且在30℃温育15分钟以容许该复合体的形成。
如下分离所述复合体。将5M的氯化胍(guanidiniumchloride)与异丙醇加入上述混合物中。在涡旋和于14,000rpm离心5分钟后，将上清液倾去并且用75％的乙醇洗涤包含所述复合体的粒状沉淀，将其风干达10分钟，并且将其重悬在20μl的Tris-EDTA缓冲液中。
如下观察所述复合体。将0.2μl的PicoGreen dsDNA QuantitationReagent(获自Molecular Probe，Inc.并识别为#P-7581)加入10μl的重悬的核酸复合体。接着将5μl的标记的核酸复合体应用到显微镜载玻片上(获自Kevley Technologies并识别为#CFR)并将所述载玻片风干过夜。在荧光和光学装置下，通过显微镜以250x放大来观察所述复合体的集合物。
如下，还通过凝胶电泳来分析所述复合体。将10μl的核酸复合体应用到在0.5X TBE缓冲液中的水平1％琼脂糖凝胶中并且在4V/cm下电泳达8小时。接着用0.5μg/ml的溴化乙锭来将所述凝胶进行染色。在UV照明下，用红色滤光片来对凝胶进行拍照。从所述复合体的泳道观察到两条独特的带。两条带的大小分别是～10kb(松弛的)和～4kb(紧密的)。在相同的凝胶上，证实包含所述HBVSAg片段的核酸序列的大小是～2.8kb并且证实HBV基因组的大小是～3.2kb。因此，所述复合体的大小(即，～10kb松弛形式)比包含HBVSAg的核酸序列和HBV基因组的组合大小更高。
此外，如下通过用T7核酸内切酶I来消化将所述复合体进行片段化。将10μl的所述复合体用2单位的T7核酸内切酶I(获自New EnglandBioLabs，Inc.并将其识别为M0292S)在42℃，在15μl的50mM醋酸钾，20mMTris乙酸盐(pH7.9)，10mM的乙酸镁，1mM的二硫苏糖醇(DTT)中温育。将所述片段化的复合体用作原材料来进行另一轮的复合体形成。
其它实施方案可以将该说明书中公开的所有的特点以任何组合进行组合。可以用服务于相同，等价或相似目的的备选特点来取代在该说明书中公开的每个特点。因此，除非另外特别指出，公开的每个特点仅是一系列等价或类似特点的实例。
从上述说明书中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的主要特点，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和改进以将其适应于各种用途和状况。因此，其它的实施方案也在权利要求内。
权利要求
1.一种核酸复合体，其包括多个第一核酸，多个第二核酸，和多个第三核酸，其中互补于所述第二核酸的每个的第一核酸的每个，包含互补于所述第三核酸的每个的位点的序列；所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的1到1012倍；并且所述第一核酸，所述第二核酸，所述第三核酸交联以形成所述核酸复合体，当用溴化乙锭染色后在518nm处激发时，其发射605nm的荧光，其强度是未交联的第一，第二和第三核酸的强度的至少10倍。
2.权利要求1的核酸复合体，其中所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的103到108倍。
3.权利要求2的核酸复合体，其中所述第一和所述第二核酸各自是100到20,000个核苷酸的长度。
4.权利要求3的核酸复合体，其中所述第一和所述第二核酸各自是200到8,000个核苷酸的长度。
5.权利要求4的核酸复合体，其中所述互补序列具有10到20,000个核苷酸的长度。
6.权利要求5的核酸复合体，其中所述互补序列具有20到8,000个核苷酸的长度。
7.权利要求2的核酸复合体，其中所述互补序列具有10到20,000个核苷酸的长度。
8.权利要求7的核酸复合体，其中所述互补序列具有20到8,000个核苷酸长度。
9.权利要求3的核酸复合体，其中所述互补序列具有10到20,000个核苷酸的长度。
10.权利要求9的核酸复合体，其中所述互补序列具有20到8,000个核苷酸的长度。
11.一种检测核酸中靶位点的方法，其包括提供被怀疑包含靶位点的多个第一核酸，多个第二核酸，和多个第三核酸，其中互补于所述第二核酸的每个的第一核酸的每个包含互补于所述第三核酸的每个的靶位点的序列；并且所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的1到1016倍；如果所述第三核酸包含所述靶位点，将所述第一，第二和第三核酸变性并且定位于平表面，由此促进交联的核酸复合体的形成；和检测交联的核酸复合体的存在或不存在。
12.权利要求11的方法，其中所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的103到1013倍。
13.权利要求12的方法，其中所述第一和第二核酸各自具有100到20,000个核苷酸的长度。
14.权利要求13的方法，其中所述第一和第二核酸各自具有200到8,000个核苷酸的长度。
15.权利要求14的方法，其中所述互补序列具有10到20,000个核苷酸的长度。
16.权利要求15的方法，其中所述互补序列具有20到8,000个核苷酸的长度。
17.权利要求16的方法，其中所述变性通过在离液序列高的水性溶剂中混合所述第一，第二和第三核酸来实现。
18.权利要求17的方法，其中所述定位通过将疏水有机溶剂添加到所述离液序列高的水性溶剂中来实现，在所述两种溶剂之间的界面构成所述平表面。
19.权利要求18的方法，其中所述疏水有机溶剂是正丁醇，叔戊醇，环己醇，苯酚，对甲氧基苯酚，苯甲醇，苯胺，吡啶，嘌呤，3-氨基三唑，丁酰胺，己酰胺，硫代乙酰胺，δ-戊内酰胺，叔丁脲，亚乙基硫脲，烯丙基硫脲，硫脲，氨基甲酸乙酯，N-丙基氨基甲酸乙酯，N-甲基氨基甲酸乙酯，氰基胍，或其组合。
20.权利要求19的方法，其中所述疏水有机溶剂是苯胺。
21.权利要求18的方法，其中所述离液序列高的水性溶剂包含Mg2+，Ca2+，Na+，K+，NH4+，Cs+，Li+，(CH3)4N+，或其组合。
22.权利要求18的方法，其中所述离液序列高的水性溶剂包含甲苯磺酸盐-，Cl3CCOO-，SCN-，ClO4-，I-，Br-，Cl-，BrO3-，CH3COO-，HSO3-，F-，SO42-，(CH3)3CCOO-，HPO4-，或其组合。
23.权利要求22的方法，其中所述离液序列高的水性溶剂包含SCN-。
24.权利要求12的方法，其中所述变性通过在离液序列高的水性溶剂中混所述第一，第二和第三核酸来实现。
25.权利要求24的方法，其中所述定位通过将疏水有机溶剂加入离液序列高的水性溶剂中来实现，在所述两种溶剂之间的界面构成所述平表面。
26.权利要求25的方法，其中所述检测通过在用双链DNA嵌入荧光染料染色后，测定从交联的核酸复合体发射的荧光的强度来实现。
27.一种通过方法制备的核酸复合体，其包括提供多个第一核酸，多个第二核酸，和多个第三核酸，其中互补于所述第二核酸的每个的第一核酸的每个包含互补于所述第三核酸的每个的位点的序列，并且所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的1到1016倍；和将所述第一，第二和第三核酸变性并且定位于平表面，由此促进交联的核酸复合体的形成，当用溴化乙锭染色后在518nm处激发时，其发射605nm的荧光，其强度是未交联的第一，第二和第三核酸的强度的至少10倍。
28.通过权利要求27的方法制备的核酸复合体，其中所述第一核酸的数目和所述第二核酸的数目各自是所述第三核酸的数目的103到1013倍。
29.通过权利要求28的方法制备的核酸复合体，其中所述变性通过将所述第一，第二和第三核酸置于离液序列高的水性溶剂中来实现。
30.通过权利要求29的方法制备的核酸复合体，其中所述定位通过将疏水有机溶剂加入离液序列高的水性溶剂中来实现，在所述两种溶剂之间的界面构成平表面。
31.通过权利要求30的方法制备的核酸复合体，其还包括从水性溶剂和疏水有机溶剂的混合物中提取交联的核酸复合体。
32.通过权利要求30的方法制备的核酸复合体，其中所述疏水有机溶剂是正丁醇，叔戊醇，环己醇，苯酚，对甲氧基苯酚，苯甲醇，苯胺，吡啶，嘌呤，3-氨基三唑，丁酰胺，己酰胺，硫代乙酰胺，δ-戊内酰胺，叔丁脲，亚乙基硫脲，烯丙基硫脲，硫脲，氨基甲酸乙酯，N-丙基氨基甲酸乙酯，N-甲基氨基甲酸乙酯，氰基胍，或其组合。
33.通过权利要求32的方法制备的核酸复合体，其中所述疏水有机溶剂是苯胺。
34.通过权利要求30的方法制备的核酸复合体，其中所述离液序列高的水性溶剂包含Mg2+，Ca2+，Na+，K+，NH4+，Cs+，Li+，(CH3)4N+，或其组合。
35.通过权利要求30的方法制备的核酸复合体，其中所述离液序列高的水性溶剂包含甲苯磺酸盐-，Cl3CCOO-，SCN-，ClO4-，I-，Br-，Cl-，BrO3-，CH3COO-，HSO3-，F-，SO42-，(CH3)3CCOO-，HPO4-，或其组合。
36.通过权利要求35的方法制备的核酸复合体，其中所述离液序列高的水性溶剂包含SCN-。
37.通过权利要求30的方法制备的核酸复合体，其中所述第一和第二核酸各自具有100-20,000个核苷酸的长度。
38.通过权利要求37的方法制备的核酸复合体，其中所述第一和第二核酸各自具有200到8,000个核苷酸的长度。
39.通过权利要求38的方法制备的核酸复合体，其中所述互补序列具有10到20,000个核苷酸的长度。
40.通过权利要求39的方法制备的核酸复合体，其中所述互补序列具有20-8,000个核苷酸的长度。
41.通过权利要求37的方法制备的核酸复合体，其中所述互补序列具有10-20,000个核苷酸的长度。
42.通过权利要求41的方法制备的核酸复合体，其中所述互补序列具有20-8,000个核苷酸的长度。
43.一种多相系统，其包括以两相分离的疏水有机溶剂和离液序列高的水性溶剂，和在所述有机和水性溶剂之间的界面的多个核酸，其中所述有机和水性溶剂促进所述核酸的变性和定位。
44.权利要求43的多相系统，其中所述疏水有机溶剂是正丁醇，叔戊醇，环己醇，苯酚，对甲氧基苯酚，苯甲醇，苯胺，吡啶，嘌呤，3-氨基三唑，丁酰胺，己酰胺，硫代乙酰胺，δ-戊内酰胺，叔丁脲，亚乙基硫脲，烯丙基硫脲，硫脲，氨基甲酸乙酯，N-丙基氨基甲酸乙酯，N-甲基氨基甲酸乙酯，氰基胍，或其组合。
45.权利要求44的多相系统，其中所述疏水有机溶剂是苯胺。
46.权利要求43的多相系统，其中所述离液序列高的水性溶剂包含Mg2+，Ca2+，Na+，K+，NH4+，Cs+，Li+，(CH3)4N+，或其组合。
47.权利要求43的多相系统，其中所述离液序列高的水性溶剂包含甲苯磺酸盐-，Cl3CCOO-，SCN-，ClO4-，I-，Br-，Cl-，BrO3-，CH3COO-，HSO3-，F-，SO42-，(CH3)3CCOO-，HPO4-，或其组合。
48.权利要求47的多相系统，其中所述离液序列高的水性溶剂包含SCN-。
49.权利要求43的多相系统，其中所述疏水有机溶剂是正丁醇，叔戊醇，环己醇，苯酚，对甲氧基苯酚，苯甲醇，苯胺，吡啶，嘌呤，3-氨基三唑，丁酰胺，己酰胺，硫代乙酰胺，δ-戊内酰胺，叔丁脲，亚乙基硫脲，烯丙基硫脲，硫脲，氨基甲酸乙酯，N-丙基氨基甲酸乙酯，N-甲基氨基甲酸乙酯，氰基胍，或其组合；并且所述离液序列高的水性溶剂包含甲苯磺酸盐-，Cl3CCOO-，SCN-，ClO4-，I-，Br-，Cl-，BrO3-，CH3COO-，HSO3-，F-，SO42-，(CH3)3CCOO-，HPO4-，或其组合。
50.权利要求43的多相系统，其中所述核酸包括多个第一核酸和多个第二核酸，所述第一核酸的每个互补于所述第二核酸的每个。
51.权利要求43的多相系统，其中所述核酸包括来自样品的多个第三核酸，所述第三核酸的每个包含互补于所述第一核酸的每个的序列的位点。
52.权利要求50的多相系统，其还包括来自样品的多个第三核酸，所述第三核酸的每个包含互补于所述第一核酸的每个的序列的位点。
53.权利要求49的多相系统，其中所述核酸包括来自样品的多个第一核酸，多个第二核酸，和多个第三核酸，所述第一核酸的每个互补于所述第二核酸的每个并且包含互补于所述第三核酸的每个的位点的序列。
全文摘要
可以将该说明书中公开的所有的特点以任何组合进行组合。可以用服务于相同，等价或相似目的的备选特点来取代在该说明书中公开的每个特点。因此，除非另外特别指出，公开的每个特点仅是一系列等价或类似特点的实例。从上述说明书中，本领域技术人员可以容易地确定本发明的主要特点，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和改进以将其适应于各种用途和状况。因此，其它的实施方案也在权利要求内。
文档编号C07H21/04GK1965090SQ200580006217
公开日2007年5月16日 申请日期2005年2月28日 优先权日2004年2月28日
发明者王长宁 申请人:王长宁