专利名称：免疫原性改变的C1q家族成员蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性下降的C1q超家族(“C1q SF”)成员变体。特别地，公开了脂连蛋白和CTRP1的变体，其结合一种或多种人II型MHC分子的能力下降。
背景技术：
免疫原性是蛋白治疗剂的开发和利用的主要障碍。尽管针对非人蛋白产生的免疫应答通常是最严重的，而基于人的蛋白的治疗剂也具有免疫原性。免疫原性是对被视为外来物的物质所产生的一系列复杂的应答，诱导生成中和抗体和非中和抗体，形成免疫复合物，活化补体，活化肥大细胞，产生炎症和过敏性反应。
数种因素会影响蛋白免疫原性，包括但不限于蛋白质序列、给药路径和频率，以及患者群体。免疫原性可能以多种方式限制蛋白质治疗剂的功效和安全性。中和抗体的形成会直接降低功效。由于结合中和抗体或者非中和抗体通常会导致蛋白质治疗剂被迅速从血清中清除，从而间接地降低其功效。当发生免疫反应时，可能会产生严重的副作用，甚至死亡。当中和抗体与内源性蛋白质发生交叉反应并阻断其功能时，产生一类特定的副作用。
脂连蛋白也被称作为30kDa的脂肪细胞补体相关蛋白(ACRP30)，是一种专门在分化的脂肪细胞中表达的分泌型血清蛋白。在脂连蛋白与补体因子C1q三个亚单位、西伯利亚花栗鼠蛋白(Siberian chipmunkprotein)HP-20、-25和-27、CORS26、CTRP-5以及G-蛋白偶联受体互作蛋白之间存在很高的序列相似性。所有脂连蛋白类似物都含有相似的分子结构，包括N-末端胶原结构域，接着为C-末端球状三聚结构域。脂连蛋白的球状三聚体的晶体结构揭示了其与细胞因子TNF家族之间存在意想不到的同源性。尽管初级序列之间缺乏同源性，但TNF-α和脂连蛋白之间的结构特征高度保守。脂连蛋白和TNF-α都通过关键的保守疏水残基发生三聚化，都具有一种十链果冻卷饼型折叠拓扑结构(ten-strand jelly-roll foldingtopology)，并且都形成钟形同三聚合低聚物。参见，例如Scherer等人，J.Biol.Chem.270(45)26746-91995，完全引入作为参考。
代谢试验已经证明了脂连蛋白在调控葡萄糖和脂肪平衡中的作用。脂连蛋白通过增加组织脂肪氧化来提高胰岛素敏感性，导致循环脂肪酸水平下降并且降低肝脏和肌肉中的细胞内甘油三酯的含量。该蛋白还抑制血管内皮细胞表达黏着分子，以及抑制由巨噬细胞生成细胞因子，从而抑制在动脉硬化症早期中发生的炎症过程。
脂连蛋白被推定具有抗高血糖、抗动脉粥样化以及抗炎的特性，并且可能用于治疗与胰岛素抗性相关的疾病，包括2型糖尿病、肥胖、脂肪营养不良疾病，以及其它与葡萄糖和脂肪的代谢调控相关的状况。脂连蛋白还被证明有利于预防心血管疾病，包括动脉硬化症和冠状动脉疾病，以及有利于预防和治疗肌肉的疾病和肝脏疾病，参见，例如Berg等人，TrendsEndocrinol.Metab.1384-89(2002)，Diez和Iglesias Eur.J.Endocrinol.148293-300(2003)，Xu等人，J.Clin.Invest.11291-100(2003)，WO00192330以及WO02100427，全部引入作为参考。
已经鉴定了球状脂连蛋白和全长脂连蛋白的两种受体，AdipoR1和AdipoR2。AdipoR1在骨骼肌中大量表达，而AdipoR2主要在肝脏中表达。这两种受体被预测含有七个跨膜结构域，但是在结构和功能上完全不同于G蛋白偶联受体。使用小干扰RNA进行的表达和抑制试验表明，这些受体介导了脂连蛋白对脂肪酸氧化和葡萄糖摄取的作用，并且使AMP激酶增加。
C1q-TNF相关蛋白1(CTRP1)也被称作为zsig37和C1QTNF1，在内皮细胞和血管平滑肌中高度表达，已经证明其能够结合暴露在急性血管损伤部位上的胶原。已经发现，CTRP1是胶原诱导的血小板活化的潜在抑制剂，在血管损伤部位局部起作用以防止形成阻碍动脉的凝块。已经发现，在与心脏病发作和卒中相关的斑块破裂的动物模型中，以及在血管手术如血管成形术的模型中，CTRP1处理会防止血流被阻断。与用于抑制栓塞(thrombotic occlusion)的其它试剂不同，在动物模型中进行的试验证明CTRP1对血液凝结没有显著的系统性作用。由于其在防止血小板活化和动脉阻塞的潜在作用，以及由于其施用显然不会发生流血并发症，在治疗各种与血管损害相关的状况中，包括冠状血管成形术、颈动脉内膜切除术和卒中(stroke)，CTRP1具有临床用途。参见例如美国专利US6,803,450；US6,566,499；和US6,265,544，全部完全引入作为参考。其它C1q SF成员包括CTRP2、CTRP3、CTRP4、CTRP5、CTRP6和CTRP7。参见Wong等人，PNAS，第110卷，第28期10302-7(2004)，完全引入作为参考。
与所有蛋白质一样，当C1q SF成员被用作治疗剂时可能会引起不期望的免疫应答。因此，可以通过预先完全(pre-emptively)降低C1q SF成员的潜在免疫原性，以便开发基于C1q SF成员的治疗剂。已经开发出多种方法来调节蛋白质的免疫原性。在某些情形下，已经观察到PEG化能够通过从空间上阻碍接近抗体的抗原限制位，从而降低产生中和抗体的患者的比例(参见，例如Hershfield等人，PNAS 1991 887185-7189(1991)；Bailon.等人，Bioconjug.Chem.12195-202(2001)；He等人，Life Sci.65355-368(1999)，全部完全引入作为参考)。由于已经观察到聚合物的免疫原性高于可溶的蛋白质，因此，提高蛋白质治疗剂的溶解特性的方法也可以降低免疫原性。
一种降低免疫原性的更常用方法包括以蛋白质序列中的抗原限制位以及主要负责刺激免疫系统的结构为靶点进行诱变。通过随机替换溶剂暴露残基来降低对多组已知中和抗体的结合亲和性，已经获得部分成功(参见例如Laroche等人，Blood 961425-1432(2000)，完全引入作为参考)。由于抗体成员的高度多样性，降低对已知抗体的亲和性的突变通常会导致生成另一组抗体，而不是消除免疫原性。然而，在某些情形下，通过用极性中性残基替换疏水性的和带电荷的残基，可能降低表面抗原性(参见Meyer等人，Protein Sci.10491-503(2001)，完全引入作为参考)。
另一种方法用于破坏T细胞活化。由于MHC分子的多样性仅包括约103个等位基因，而抗体成员估计为约108并且T细胞受体成员更多，去除MHC-结合抗原限制位提供一种更容易处理的降低免疫原性的方法。通过在一条蛋白质序列中鉴定和去除或者修饰II型MHC结合肽，可以避开分子水平的免疫原性。先前已经报道了去除这种抗原限制位，以生成免疫原性较低的蛋白质；参见例如WO98/52976、WO02/079232和WO00/3317，全部完全引入作为参考。
虽然可以鉴定预期能够使免疫原性降低的MHC-结合抗原限制位中的突变，大部分氨基酸取代在功能上是不利的。结果，大部分用上述方法鉴定的免疫原性降低的序列将与蛋白质的结构和/或功能不相容。为了使去除MHC抗原限制位成为一种降低免疫原性的可行方法，努力同时保持蛋白质的结构、稳定性和生物学活性是至关重要的。
仍然需要新的免疫原性下降的C1q SF成员蛋白。免疫原性下降的C1qSF成员变体可被用于治疗大量C1q SF成员响应的状况。
发明概述按照上述目的，本发明提供新的C1q SF成员蛋白，与天然存在的C1q SF成员蛋白相比，其具有降低的免疫原性。在其它方面，本发明在于工程化或者设计用于治疗用途的免疫原性较低的蛋白质的方法，该蛋白质具有治疗用途所需的C1q SF成员活性。
本发明的一个方面是C1q SF成员变体，与亲本C1q SF成员相比，其对一种或多种II型MHC等位基因的结合亲和性下降，并且其显著地保持天然的自然存在的C1q SF成员的活性。
在另一个方面，本发明提供编码C1q SF成员蛋白变体的重组核酸、表达载体和宿主细胞。
在其它方面，本发明提供生产C1q SF成员蛋白变体的方法，包括在适合表达C1q SF成员蛋白变体的条件下，培养本发明的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含C1q SF成员蛋白变体或者本发明的核酸和药学载体。
在另一个方面，本发明提供用于预防或者治疗C1q SF成员响应的异常的方法，包括给患者施用C1q SF成员蛋白变体或者本发明的核酸。
其它方面，本发明提供用于筛选II型MHC单体型潜在患者的方法，以鉴定极可能对野生型C1q SF成员或者C1q SF成员变体治疗剂产生免疫应答的个体。
按照上述目的，本发明提供C1q SF成员变体蛋白，与野生型C1q SF成员蛋白相比，其包括具有至少一个氨基酸插入、删除或取代的氨基酸序列。
附图简介
图1显示工程化免疫原性较低的C1q SF成员衍生物的方法。
图2显示使用IVV技术体外检测C1q SF成员肽或蛋白质的免疫原性的方法的图示。
发明详述“9-mer肽结构(9-mer peptide frame)”和语法同等成分在此是指位于感兴趣的蛋白质中的9个氨基酸的线性序列。可以分析9-mer结构结合一种或多种II型等位基因的倾向性。“等位基因”和语法同等成分在此是指基因的可替代形式。特别地，在II型MHC分子中，等位基因包括DRA、DRB1、DRB3/4/5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1分子的全部天然存在的序列变体。“命中”和语法上的相同词汇在此是指在矩阵方法范围内，一种特定的肽被预期能够结合特定的II型MHC等位基因。在优选实施方案中，命中被定义为与随机的肽序列具有结合分值最高约5％、3％或者1％的结合亲和性的肽。在另一种实施方案中，命中被定义为具有超过某些域值的结合亲和性的肽，例如被预测以至少100μM或10μM或1μM的亲和性结合MHC等位基因的肽。“免疫原性”和语法上的同义词在此是指蛋白质引发免疫应答的能力，包括但是不限于生成中和抗体和非中和抗体、形成免疫复合物、活化补体、活化肥大细胞、产生炎症和过敏性反应。“降低的免疫原性”和语法上的同义词在此是指当与野生型蛋白质相比，活化免疫系统的能力下降。例如，如果与野生型蛋白质相比，蛋白质变体激发滴度较低的中和抗体或者非中和抗体或者在较少患者中激发中和抗体或者非中和抗体，则认为其具有“降低的免疫原性”。在一个优选实施方案中，产生中和抗体的可能性下降至少5％，下降至少50％或90％是特别优选的。因此，如果野生型蛋白质在10％患者中产生免疫应答，免疫原性降低的蛋白质变体将在不多于9.5％的患者中产生免疫应答，在少于5％或者少于1％的患者中产生免疫应答是特别优选的。如果与亲本蛋白质相比，蛋白质变体与一种或多种MHC等位基因的结合下降，或者如果其在减少的部分患者中诱导T细胞活化，则认为该蛋白质变体具有“降低的免疫原性”。在一个优选实施方案中，T细胞活化的可能性下降至少5％，下降至少50％或者90％是特别优选的。“矩阵方法”及其语法上的同义词在此是指使用矩阵来计算肽-MHC亲和性的方法，该矩阵包含与特定的MHC等位基因相互作用的肽的各个位置上每个可能残基的分值。通过对肽的各个位置上所观察的氨基酸的矩阵值进行求和，可获得特定的肽-MHC互作的结合分值。“MHC-结合抗原限制位”和语法上的同义词在此是指能够以适当的亲和性结合一种或多种II型MHC等位基因以形成MHC-肽-T细胞受体复合物并随后使T细胞活化的肽。MHC-结合抗原限制位是线性的肽序列，该序列包括至少约9个残基。“亲本蛋白质”用于此是指随后被修饰以生成蛋白质变体的蛋白质。所述亲本蛋白质可以是野生型的或者天然存在的蛋白质，或者变异的或者工程化形式的天然存在的蛋白质。“亲本蛋白质”是指蛋白质本身，包含该亲本蛋白质的组合物，或者编码该亲本蛋白质的任何氨基酸序列。因此，“亲本C1q SF成员蛋白”用于此是指被修饰来生成C1q SF成员蛋白变体的C1q SF成员蛋白。“患者”在此是指人和其它动物，特别是哺乳动物和生物体。因此，该方法适用于人的治疗和兽医应用。在优选实施方案中，患者是哺乳动物，在最优选实施方案中，患者是人。“蛋白质”在此是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质由天然存在的氨基酸和肽键或者合成的肽模拟结构(peptidomimetic structure)制成，所述肽模拟结构即，“类似物”如拟肽[参见Simon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(209367-71(1992))，这通常取决于合成方法。例如，同苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为可用于本发明目的。“ 氨基酸”还包括氨基酸残基，如脯氨酸和羟脯氨酸。D-和L-氨基酸都可以使用。“C1q SF成员响应的疾病或者状况”和语法上的同义词在此是指可以从用C1q SF成员处理中获益的疾病、异常和状况。可以从用C1qSF成员或者C1q SF成员的增强剂或抑制剂的处理中获益的异常的例子包括但是不限于，与胰岛素抗性相关的疾病如2型糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受下降(IGT)、X综合症、脂肪营养不良疾病包括HIV相关的脂肪营养不良、厌食以及与葡萄糖和脂肪代谢调控相关的其它状况、心血管疾病包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病，以及血管干涉后的血管狭窄(restenosis)。C1qSF成员是有益于促进肌肉生长、处理肌肉废物和其它与肌肉相关的异常、预防和治疗肝脏疾病以及多种与血管损伤相关的状况，包括冠状动脉成形术、颈动脉内膜切除术和卒中。“处理”在此是指包括用于疾病或异常的治疗性处理，以及预防性或抑制性措施。因此，例如，在患病之前成功施用C1qSF成员蛋白变体可能可以治疗该疾病。作为另一个例子，在出现疾病的临床症状后成功施用C1q SF成员蛋白变体以消除该疾病症状，包括对该疾病的“治疗”。“处理”还包括在出现该疾病后施用C1q SF成员蛋白变体，以根除该疾病。在疾病发作后或者在已经出现临床症状后成功施用试剂，可能根除临床症状以及可能缓解该疾病，进一步包括“治疗”该疾病。“需要处理”的那些患者包括已经患有疾病或异常的哺乳动物，以及那些趋向于患有该疾病或异常的那些个体，包括该疾病或异常将被预防的那些个体。“C1q SF成员变体核酸”和语法上的同义词在此是指编码C1q SF成员蛋白变体的核酸。由于遗传密码子的简并性，通过不改变C1q SF成员变体的氨基酸序列的方式简单地修饰该序列的一个或多个密码子，可以制备极其多的核酸，这些核酸都编码本发明的C1q SF成员蛋白。“C1q SF成员蛋白变体”及其语法上的同义词在此是指非天然存在的C1q SF成员蛋白，其与野生型或者亲本C1q SF成员蛋白相差至少一个氨基酸的插入、删除或者取代。C1q SF成员变体的特征在于预先确定的变异特性，一种使其不同于C1q SF成员蛋白序列的天然存在的等位基因变体或者种间变体的特征。C1q SF成员变体通常具有与天然存在的C1q SF成员相当的生物学活性或者已经被特别地工程化以具有其它生物学特性。C1q SF成员蛋白变体可能在N末端、C末端或者内部含有插入、删除和/或取代。在优选实施方案中，C1q SF成员蛋白变体具有至少1个区别于天然存在的C1q SF成员序列的残基，有至少2个、3个、4个或5个不同残基是更加优选的。C1q SF成员蛋白变体可能具有进一步修饰，例如改变稳定性或者可溶性或者使得能够或者防止翻译后修饰如PEG化或糖基化的突变。对C1q SF成员蛋白变体进行翻译时修饰或者翻译后修饰，包括但是不限于一条或多条侧链或者末端合成衍生化、糖基化、PEG化、循环排列(circular permutation)、环化、与蛋白质或者蛋白质结构域融合，以及添加肽标签或标记。“野生型或者wt”或其语法上的同义词在此是指存在于自然界中发现的氨基酸序列或者核苷酸序列，并且包括等位基因变体；也就是未故意修饰的氨基酸序列或者核苷酸序列。在优选实施方案中，野生型的脂连蛋白序列为SEQ_ID NO1，而野生型CTRP1的序列为SEQ_ID NO2。
鉴定C1q SF成员中的MHC-结合抗原限制位通过所谓的抗原加工，从蛋白质中获得MHC-结合肽。首先，通过细胞内吞或者吞噬作用，将蛋白质运输到抗原呈递细胞(APC)中。然后多种蛋白质水解酶将蛋白质裂解为许多肽。然后将这些肽加载到II类MHC分子上，生成的肽-MHC复合物被转运到细胞表面。相对稳定的肽-MHC复合物被存在于幼稚型T细胞表面上的T细胞受体识别。该识别事件是起始免疫应答所必需的。因此，阻断形成稳定的肽-MHC复合物是一种防止不期望的免疫应答的有效方法。
决定肽-MHC互作亲和性的因素已经用生化方法和结构方法表征。肽以延伸构象结合的方式结合II型MHC分子中的沟槽。虽然结合II型MHC分子的肽通常长约13-18个残基，而9个残基区域负责大部分的结合亲和性和特异性。肽结合沟槽被细分为“口袋”，一般命名为P1到P9，其中各个口袋包含与该肽中的特定残基相互作用的MHC残基组。大量多态残基朝向MHC分子的肽-结合沟槽。鉴定位于各MHC分子的各个肽-结合口袋内层的残基，可确定该肽结合特异性。相反，肽的序列决定了其对各个MHC等位基因的亲和性。
数种用于鉴定蛋白质序列中的MHC-结合抗原限制位的方法在本领域是已知的，可用于鉴定C1q SF成员中的抗原限制位。可用序列信息确定特定的肽-MHC互作的结合分值(参见例如Mallios，Bioinformatics 15432-439(1999)；Mallios，Bioinformatics 17942-948(2001)；Sturniolo等人，Nature Biotech.17555-561(1999)，全部完全引入作为参考)。可能采用基于结构的方法，在该方法中，特定的肽按照计算被置于特定MHC分子的肽-结合沟槽中，并且确定互作能量(例如，参见WO98/59244和WO02/069232，全部完全引入作为参考)。这种方法被称作为“穿引”法(threading)。可替代地，可以采用纯粹的实验方法；例如，对一组来源于感兴趣的蛋白质的重叠肽进行实验，测试其诱导T细胞活化和/或免疫应答的其它方面的能力(参见例如WO02/77187，完全引入作为参考)。
在一个优选实施方案中，用矩阵方法计算C1q SF成员序列中的各个9个残基框架的MHC-结合倾向性分值(参见Sturniolo等人，同上文；Marshall等人，J.Immunol.1545927-5933(1995)，以及Hammer等人，J.Exp.Med.1802353-2358(1994)，全部完全引入作为参考)。也可能考虑仅一个亚组的这些残基的分值，或者考虑鉴定位于感兴趣的9个残基框架之前和之后的肽残基。该矩阵包括特定氨基酸与不同的人II型MHC分子中的肽结合口袋互作的结合分值。在最优选实施方案中，矩阵中的分值从实验性的肽结合研究中获得。在可替代的优选实施方案中，从实验定性的等位基因到其它具有相同或者相似的位于口袋内层的残基的其它等位基因，推定得到特定氨基酸结合到特定口袋上的分值。通过推定产生的矩阵被称作为“虚拟矩阵(virtual matrix)”。
在优选实施方案中，用矩阵方法来计算各种感兴趣的肽结合各种感兴趣的等位基因的分值。然后可用数种方法确定特定的肽是否将以显著的亲和性结合特定的MHC等位基因。在一个实施方案中，将感兴趣的肽的结合分值与一大组参比肽的结合倾向性分值比较。与参比肽相比具有大结合倾向性分值的肽可能结合MHC，并且被划分为“命中者(hits)”。例如，如果结合倾向性分值处于对那个等位基因的可能结合分值的最高的1％中，其被评分为在1％的域值时的“命中”。计算各种肽在一种或多种域值时的命中总数。在某些情形下，结合分值可能直接对应于预测的结合亲和性。然后，命中者被定义为被预测以至少100μM或者10μM或者1μM的亲和力结合的肽。
在优选的实施方案中，使用范围在0.5％到10％的一种或多种域值计算蛋白质中的各个9-mer结构的命中数量。在特别优选的实施方案中，使用1％、3％和5％的域值计算命中数量。
在优选实施方案中，MHC-结合抗原限制位被确定为结合数个II类MHC等位基因的9-mer结构。在特别优选的实施方案中，MHC-结合抗原限制位被预测在5％域值时结合至少10个等位基因，和/或在1％域值时结合至少5个等位基因。这种9-mer结构尤其可能在人群的许多成员中引发免疫应答。
在优选实施方案中，MHC-结合抗原限制位被预测结合在至少0.01-10％人群中存在的MHC等位基因。可替代地，为了处理与特定II型MHC等位基因相关的状况，MHC-结合抗原限制位被预测结合在至少0.01-10％相关患者群体中存在的MHC等位基因。
一些小组已经获得了关于在不同人种和种族中存在的不同MHC等位基因的数据，例如National Marrow Donor Program(NMDP)；例如参见Mignot等人，Am.J.Hum.Genet.68686-699(2001)，Southwood等人，J.Immunol.1603363-3373(1998)，Hurley等人，Bone Marrow Transplantation 25136-137(2000)，Sintasath Hum.Immunol.601001(1999)，Collins等人，TissueAntigens 5548(2000)，Tang等人，Hum.Immunol.63221(2002)，Chen等人，Hum.Immunol.63665(2002)，Tang等人，Hum.Immunol.61820(2000)，Gans等人，Tissue Antigens 59364-369，和Baldassarre等人，TissueAntigens 61249-252(2003)，全部完全引入作为参考。
在优选实施方案中，预测包含十分普遍的MHC等位基因的MHC异二聚体的MHC结合抗原限制位。在至少10％的美国人群中存在的II型MHC等位基因包括但是不限于DPA1*0103，DPA1*0201，DPB1*0201，DPB1*0401，DPB1*0402，DQA1*0101，DQA1*0102，DQA1*0201，DQA1*0501，DQB1*0201，DQB1*0202，DQB1*0301，DQB1*0302，DQB1*0501，DQB1*0602，DRA*0101，DRB1*0701，DRB1*1501，DRB1*0301，DRB1*0101，DRB1*1101，DRB1*1301，DRB3*0101，DRB3*0202，DRB4*0101，DRB4*0103，和DRB5*0101.
在优选实施方案中，预测包含适度普遍的MHC等位基因的MHC异二聚体的MHC结合抗原限制位。在1％到10％的美国人群中存在的II型MHC等位基因包括但是不限于DPA1*0104，DPA1*0302，DPA1*0301，DPB1*0101，DPB1*0202，DPB1*0301，DPB1*0501，DPB1*0601，DPB1*0901，DPB1*1001，DPB1*1101，DPB1*1301，DPB1*1401，DPB1*1501，DPB1*1701，DPB1*1901，DPB1*2001，DQA1*0103，DQA1*0104，DQA1*0301，DQA1*0302，DQA1*0401，DQB1*0303，DQB1*0402，DQB1*0502，DQB1*0503，DQB1*0601，DQB1*0603，DRB1*1302，DRB1*0404，DRB1*0801，DRB1*0102，DRB1*1401，DRB1*1104，DRB1*1201，DRB1*1503，DRB1*0901，DRB1*1601，DRB1*0407，DRB1*1001，DRB1*1303，DRB1*0103，DRB1*1502，DRB1*0302，DRB1*0405，DRB1*0402，DRB1*1102，DRB1*0803，DRB1*0408，DRB1*1602，DRB1*0403，DRB3*0301，DRB5*0102，和DRB5*0202.
还预测包含较不普遍的等位基因的MHC异二聚体的MHC-结合抗原限制位。例如，可以从IMGT/HLA序列数据库中获得在人和其它物种中存在的MHC等位基因的信息。
在特别优选的实施方案中，确定各种肽的免疫原性分值，其中所述分值取决于具有一种或多种在多种域值时被命中的MHC等位基因的人群比例。例如，可以使用方程Iscore＝N(W1P1+W3P3+W5P5)，其中，P1是在1％时命中的人群比例，P3是在3％时命中的人群比例，P5是在5％时命中的人群比例，各个W是加权因子，而N是校正因子。在优选实施方案中，W1＝10，W3＝5，W5＝2，选择N使得可能分值的范围在1到100。在该实施方案中，Iscore大于或者等于10的抗原限制位是优选的，Iscore大于或者等于25的抗原限制位是特别优选的。
在其它优选实施方案中，MHC结合抗原限制位被确定为位于“嵌套的(nested)”抗原限制位中的9-mer结构，或者重叠的9个碱基结构，每个结构被预测会结合极其多个等位基因。这种序列尤其可能引发免疫应答。
优选的MHC结合抗原限制位是那些被预测在3％域值时结合在至少5％的人群中存在的MHC等位基因的抗原限制位。脂连蛋白中的优选MHC结合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1残基109-117；抗原限制位2残基111-119；抗原限制位3残基122-130；抗原限制位6残基157-165；抗原限制位8残基160-168；抗原限制位9残基166-174；抗原限制位11残基175-183；抗原限制位12残基175-184；抗原限制位13残基202-210。
特别优选的MHC结合抗原限制位是那些被预测在1％的域值时结合在至少10％的人群中存在的MHC等位基因的抗原限制位。脂连蛋白中的特别优选MHC结合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1残基109-117；抗原限制位2残基111-119；抗原限制位3残基122-130；抗原限制位9残基166-174。
CTRP1中的优选的MHC-结合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位1残基150-158；抗原限制位3残基172-180；抗原限制位5残基185-193；抗原限制位11残基202-210；抗原限制位13残基209-217；抗原限制位14残基218-226；抗原限制位16残基230-238；抗原限制位17残基247-255；抗原限制位19残基267-275。
CTRP1中的特别优选的MHC-结合抗原限制位包括但是不限于，抗原限制位3残基172-180；抗原限制位14残基218-226；抗原限制位16残基230-238；抗原限制位17残基247-255。
MHC-结合抗原限制位的确认在优选实施方案中，通过测量包含各个被预测的抗原限制位的肽引发对该肽的免疫应答的程度，实验证实上面预期MHC-结合抗原限制位的免疫原性。然而，可能从抗原限制位预测进行到去除抗原限制位，而不需要证实抗原限制位的中间步骤。
数种在下面更加详细讨论的方法可被用于实验性证实抗原限制位。例如，来自相匹配的供体的数组幼稚型T细胞和抗原呈递细胞用含有感兴趣的抗原限制位的肽刺激，可监控T细胞活化。还可能首先用感兴趣的完整蛋白刺激T细胞，然后再用来源于完整蛋白的肽刺激。如果可以从已经对脂连蛋白产生免疫应答的患者中获得血清，可能检测对特定表位应答的成熟T细胞。在优选实施方案中，采用Elispot分析，监控由被激活的T细胞生成干扰素λ或者IL-5，还可能使用T细胞活化或者增殖的其它指示剂，例如含氚的胸苷掺入或者生成其它细胞因子。
患者基因型的分析和筛选HLA基因型是对特定自体免疫性疾病(参见例如NepomClin.Immunol.Immunopathol.67S50-S55(1993)，完全引入作为参考)和感染(参见例如Singh等人，Emerg.Infect.Dis.341-49(1997)，完全引入作为参考)的易感性的主要决定因素。此外，存在于个体中的MHC等位基因组会影响某些疫苗的功效(参见例如Cailat-Zucman等人，KidneyInt.531626-1630(1998)和Poland等人，Vaccine 20430-438(2001))，全部完全引入作为参考)。HLA基因型还赋予个体对脂连蛋白治疗剂产生不期望的免疫应答的易感性。
在优选实施方案中，确定与引发对脂连蛋白的免疫应答的易感性升高或降低相关的II型MHC等位基因。例如，检测用脂连蛋白治疗剂处理的患者中是否存在抗脂连蛋白的抗体，并对II型MHC进行基因分型。可替代地，使用来源于大量被基因分型的供体的细胞，进行T细胞活化分析，如上面描述的那些分析。赋予对脂连蛋白免疫原性的易感性的等位基因被定义为是与那些不引发免疫应答的个体相比，更普遍存在于那些引发免疫应答的个体中的等位基因。类似地，赋予对脂连蛋白免疫原性的抗性的等位基因被定义为与那些引发免疫应答的个体相比，极不常见于那些不引发免疫应答的个体中的那些等位基因。还可能采用纯粹的计算技术来鉴定可能识别脂连蛋白治疗剂的等位基因。
在实施方案中，用基因型相关数据来鉴定极其可能或者特别不可能对脂连蛋白治疗剂产生免疫应答的患者。
活性的、免疫原性较低的变体的设计在优选实施方案中，上面确定的MHC-结合抗原限制位用可替代的氨基酸序列替换，生成免疫原性降低或者消除的活性脂连蛋白变体。可替代地，修饰MHC-结合抗原限制位来导入一个或者多个在蛋白质加工过程中容易被裂解的位点。如果抗原限制位在结合MHC分子之前被裂解，其将不能引发免疫应答。有数种可能策略用于整合鉴定免疫原性较低的序列的方法和鉴定结构和活性序列的方法，包括但是不限于下面提供的那些方法。
在实施方案中，针对一个或多个上面鉴定的9-mer抗原限制位，分析一种或多种可能的可替代9-mer序列的免疫原性以及结构的和功能的相容性。然后，将优选的可替代9-mer序列定义为那些具有低的预测的免疫原性和极可能保持构造和活性的序列。可能仅考虑最可能包括被保持构造的(structured)、活性的、低免疫原性的变体的9-mer序列亚组。例如，不必考虑包含高度不保守的突变或者提高可预测的免疫原性的突变的序列。
在优选实施方案中，与野生型抗原限制位相比，各个抗原限制位的免疫原性较低的变体被预测结合在较小部分的人群中存在的MHC等位基因。在特别优选的实施方案中，各个抗原限制位的免疫原性较低的变体被预测结合在不多于5％的人群中存在的MHC等位基因，结合在不多于1％或0.1％的人群中存在的MHC等位基因是最优选的。
取代矩阵在另一个特别优选的实施方案中，取代矩阵或者其它基于知识的评分方法被用于鉴定可能保留野生型蛋白质的结构和功能的其它序列。这种评分方法可用于量化特定取代或者一组取代的保守程度。在大多数情形下，保守突变不会显著地破坏蛋白质的结构和功能(参见例如，Bowie等人，Science 2471306-1310(1990)，Bowie和Sauer Proc.Nat.Acad.Sci.USA 862152-2156(1989)，以及Reidhaar-Olson和Sauer Proteins 7306-316(1990)，全部完全引入作为参考)。然而，非保守性突变会动摇蛋白质的结构并降低活性(参见例如，Lim等人，Biochem.314324-4333(1992)，完全引入作为参考)。包括但是不限于BLOSUM62的取代矩阵定量测量序列和靶结构之间的相容性，可用于预测非破坏性的取代突变(参见Topham等人，Prot.Eng.107-21(1997)，完全引入作为参考)。使用取代矩阵来设计性能改进的肽已经被公开；参见Adenot等人，J.Mol.Graph.Model.17292-309(1999)，完全引入作为参考。
取代矩阵包括但是不限于，BLOSUM矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8910917(1992)，完全引入作为参考，PAM矩阵，Dayhoff矩阵等等。对取代矩阵的综述，参见例如HenikoffCurr.Opin.Struct.Biol.6353-360(1996)，完全引入作为参考。构建基于感兴趣的特定蛋白质及其类似物的比对的取代矩阵也是可能的；参见例如Henikoff知Henikoff Comput.Appl.Biosci.12135-143(1996)，完全引入作为参考。
在优选实施方案中，各个被考虑的取代突变的BLOSUM 62分值为零或者更高。按照该衡量标准，优选的取代包括，但是不限于
此外，当与野生型的9个残基的抗原限制位的BLOSUM 62分值相比，9个残基的MHC-结合抗原限制位的替代序列的BLOSUM 62总分优选仅适度地下降。在优选实施方案中，9-mer变体的分值至少为野生型分值的50％，至少67％、75％、80％或90％是特别优选的。
可替代地，选择替代序列，使得BLOSUM分值的绝对下降最小化；例如各个9-mer的分值优选下降小于20，分值下降小于约10或者约5是特别优选的。选择精确值来生成替代序列库，该序列库容易进行实验处理，并且充分多样化以包含大量活性的、稳定的、免疫原性较低的变体。
在优选实施方案中，在充分暴露于溶剂的位置上优先导入取代突变。如本领域所知，暴露于溶剂的位置通常比位于蛋白质核心中的位置更耐受突变。
在优选实施方案中，在非高度保守的位置上优先导入取代突变。如本领域所知，对于蛋白质功能、稳定性或者结构来说，在蛋白质家族成员中高度保守的位置通常是重要的，而通常修饰非高度保守的位置而不显著地影响蛋白质的结构的或功能的特性。
丙氨酸取代在可替代的实施方案中，进行一个或多个丙氨酸取代，无论丙氨酸取代是保守的或者非保守的。如本领域所知，插入充足的丙氨酸取代来破坏分子间的互作。
在优选实施方案中，选择9-mer变体，使得已经被或者可以被鉴定为用于维持脂连蛋白的结构或功能的特别关键的残基保持其野生型的特性。在可替代的实施方案中，生成不保持野生型活性的脂连蛋白变体可能是期望的。在这种情形下，已经被鉴定为对功能来说是至关重要的残基被特别地靶向来进行修饰。
与人的糖尿病和/或脂连蛋白减少症(hypoadiponectinemia)相关的脂连蛋白残基包括G84、G90、R92、Y111、R112和I164；C36(小鼠中的C39)参与二硫键，并且一般认为其对于六聚体和大分子量(HMW)的多聚体的组装来说来说是关键的；残基G84和G90也参与了HMW多聚体的形成；R112、I164和Y159可能影响三聚体形成，这些位置上的突变会导致来自细胞的分泌减少。已经报道，六聚体和HMW同种型能够激活NF-κB路径，而三聚体不具有该性能；寡聚状态还影响激活AMP活化的蛋白激酶的能力(参见Waki等人，J.Biol.Chem.27840352-40363(2003)，Tsao等人，J.Biol.Chem.27850810-50817(2003)，以及Kishida等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.306286-292(2003)完全引入作为参考)。球状结构域而不是全长的六聚体脂连蛋白增加小鼠肌肉中的脂肪酸氧化并且导致体重下降(参见Tomas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9916309-16313(2002)，Fruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)完全引入作为参考)，已经报道，较高层次的寡聚形式在减少葡萄糖输出的活性较低(参见Pajvani等人，J.Biol.Chem.2789073-9085(2003)完全引入作为参考)。HMW形式的脂连蛋白与抑制内皮细胞凋亡和赋予其血管保护活性相关(参见Kobayashi等人，Circ.Res.94e27-31(2004)完全引入作为参考)。胶原结构域中的赖氨酸(小鼠残基68、71、80和104)的羟基化和糖基化与哺乳动物细胞中的全长脂连蛋白的胰岛素致敏化作用相关(参见Wang等人，J.Biol.Chem.27719521-19529(2002)完全引入作为参考)。
蛋白质设计方法共同使用蛋白质设计方法和MHC抗原限制位鉴定方法来鉴定稳定的、活性的和免疫原性最小化的蛋白质序列(参见WO03/006154，完全引入作为参考)。由于大部分用其它技术鉴定的免疫原性降低的序列不能够保持足够的活性和稳定性以用作治疗剂，上述方法的组合提供了显著优于降低免疫原性的现有技术的优点。
蛋白质设计方法可以鉴定非保守的或者不可预期的突变，该突变赋予期望的功能特性和降低的免疫原性，还鉴定了保守突变。非保守突变在此被定义为不包括在上述表1中的所有取代；非保守突变还包括意外地存在于特定结构中的突变，例如蛋白质表面上的疏水残基的突变和蛋白质核心中的极性残基的突变。
此外，蛋白质设计方法可以鉴定补偿性突变。例如，如果被导入来降低免疫原性的特定的第一个突变还降低稳定性或活性，那么蛋白质设计方法可用于寻找一个或多个在使免疫原性降低的同时还起恢复稳定性和活性的其它突变。类似地，蛋白质设计方法可以鉴定使免疫原性降低而同时保持活性和稳定性的两个或多个突变的组，即使其中的一个或多个突变孤立地不能赋予期望的特性。
大量多种用于生成和评价序列的方法是已知的。这些方法包括但是不限于，序型分析(sequence profiling)(Bowie and Eisenberg，Science 253(5016)164-70，(1991))，残基配对潜能(Jones，Protein Science 3567-574，(1994))，以及旋转异构体文库选择(Dahiyat和Mayo，Protein Sci 5(5)895-903(1996)；Dahiyat和Mayo，Science 278(5335)82-7(1997)；Desjarlais和Handel，Protein Science 42006-2018(1995)；Harbury等人，PNAS USA92(18)8408-8412(1995)；Kono等人，ProteinsStructure，Function andGenetics 19244-255(1994)；Hellinga和Richards，PNAS USA 915803-5807(1994))全部完全引入作为参考。
蛋白质设计自动化_(PDA_)技术在特别优选的实施方案中，使用蛋白质设计自动化(PDA_)技术，实现改进的脂连蛋白变体的合理设计(参见美国专利US6,188,965；US6,269,312；US6,403,312；WO98/47089和USSN09/058,459、09/127,926、60/104,612、60/158,700、09/419,351、60/181,630、60/186,904、09/419,351、09/782,004和09/927,790、60/347,772和10/218,102；以及PCT/US01/218,102和U.S.S.N.10/218,102、U.S.S.N.60/345,805；U.S.S.N.60/373,453和U.S.S.N.60/374,035，全部完全引入作为参考)。
PDA_技术结合了生成大量序列多样性的计算设计算法结合实验性的高通量筛选来发现具有改进特性的蛋白质。计算部分使用原子水平的评分函数(function)，侧链旋转异构体取样以及高级优化方法，以精确地捕获蛋白质序列、结构和功能之间的关系。该计算以蛋白质的三维结构开始，采用优化蛋白质的一种或多种特性的策略。然后，PDA_技术探究包括在被靶向用于设计的位置上的所有相关氨基酸(如果需要，包括非天然的氨基酸)的序列空间。这通过对允许的氨基酸的构象状态进行取样并用参数化的和实验确认的函数进行评分来实现，上述函数描述控制蛋白质结构的物理力和化学力。然后用强大的组合搜索算法来搜索最初的序列空间，其可能构成1050条序列或更多，并迅速返回易处理数量的预期满足设计标准的序列。有用模式的技术从组合序列设计到区分优先的选择优化单个位点取代。
PDA_技术已经被应用于许多系统中，包括重要的药学蛋白和工业蛋白，并且在蛋白质优化中具有被证实的成功记录。
PDA_利用三维结构信息。在最优选实施方案中，用X射线结晶学或者NMR技术确定脂连蛋白的结构，这些技术在本领域是熟知的。小鼠脂连蛋白的球状三聚体(氨基酸110-247)的晶体结构以2.1_的分辨率分辨(参见Shapiro和Scherer Curr.Biol.8335-338(1998)完全引入作为参考)；人脂连蛋白的结构用本领域已知的同源建模方法来衍生化。
在优选实施方案中，矩阵方法计算结果用于鉴定抗原限制位中的哪个9个氨基酸位置对各个特定的等位基因“命中”的全部结合倾向性的贡献最大。该分析考虑哪个位置(P1-P9)被这样的氨基酸占据，该氨基酸始终对评分中域值以上的等位基因的MHC结合亲和性具有显著贡献。然后，矩阵方法计算用于鉴定所述位置上的氨基酸取代，该取代将降低或者消除预测的免疫原性，而PDA_技术用于确定哪种具有降低的或被消除的免疫原性的替代序列与维持蛋白质的结构和功能相容。
在可替代的优选实施方案中，首先由本领域技术人员分析各个抗原限制位中的残基，鉴定可能与维持蛋白质的结构和功能相容的替代残基。然后，计算筛选生成的序列组，鉴定免疫原性最小的变体。最后，在PDA_技术蛋白质设计计算中，更彻底地分析各条免疫原性较小的序列，鉴定保持蛋白质的结构和功能并且降低免疫原性的蛋白质序列。
在可替代的优选实施方案中，分析对抗原限制位的亲和性具有重要贡献的各个残基，鉴定氨基酸取代亚组，其可能与保持蛋白质的结构和功能相容。可以数种方式实施该步骤，包括PDA_计算或者由本领域技术人员观察。生成含有所有可能的氨基酸组合的序列，这些氨基酸在各个位置上被选择考虑。可以用矩阵方法计算来确定各种序列的免疫原性。对结果进行分析，鉴定免疫原性显著下降的序列。可以进行其它的PDA_计算来确定哪种免疫原性最小的序列与保持蛋白质的结构和功能相容。
在可替代的优选实施方案中，将来自肽结合倾向矩阵的伪能级(pseudo-energy terms)结合到PDA_技术计算中。这样，可能在单个计算步骤中选择活性的并且免疫原性较低的序列。
组合的免疫原性降低策略在优选实施方案中，用多种方法生成具有期望的功能特性和免疫学特性的蛋白变体。例如，将取代矩阵与PDA_技术计算联合。用于降低免疫原性的策略包括但是不限于，那些在2004年12月3日申请的USSN11/004,590中公开的那些，完全引入作为参考。
在优选实施方案中，对一种或多种II型MHC等位基因的结合亲和性降低的蛋白质变体被工程化，以提高可溶性。由于蛋白质聚合会引起不期望的免疫应答，因此，提高蛋白质的溶解性可以降低免疫原性。
在其它优选实施方案中，对一种或多种II型MHC等位基因的结合亲和性降低的蛋白质变体进一步用PEG或者另一种分子衍生化来修饰。如本领域所知，PEG会从空间上干扰抗体结合或者改善蛋白质溶解性，从而降低免疫原性。在特别优选的实施方案，采用理性PEG化方法，2004年9月30日申请的USSN 10/956,352，完全引入作为参考。在优选实施方案中，用PDA_技术和矩阵方法计算，从感兴趣的蛋白质中去除多个MHC-结合抗原限制位。
生成变体用大量本领域知晓的方法制备本发明的脂连蛋白变体以及编码其的核酸。
在优选实施方案中，通过总基因合成，或者通过定点突变编码亲本脂连蛋白的核酸，制备编码脂连蛋白变体的核酸。包括模板指导的连接、循环PCR、盒式诱变、定点诱变或者其它技术的方法在本领域是熟知的，并且可被使用(参见例如Strizhov等人，PNAS 9315012-15017(1996)，Prodromou和Perl，Prot.Eng.5827-829(1992)，Jayaraman和Puccini，Biotechniques 12392-398(1992)，以及Chalmers等人，Biotechniques 30249-252(2001)，全部完全引入作为参考)。
在优选实施方案中，将脂连蛋白变体克隆到适当的表达载体中，并且在大肠杆菌中表达(参见McDonald，J.R.，Ko，C.，Mismer，D.，Smith，D.J.和Collins，F.Biochim.Biophys.Acta 109070-80(1991)，完全引入作为参考)。在可替代的优选实施方案中，在哺乳动物细胞、酵母细胞、杆状病毒或者在体外表达系统中表达脂连蛋白。大量表达系统以及用于其中的方法在本领域是已知的(参见Current Protocols in Molecular Biology，Wiley &Sons，and Molecular Cloning-A Laboratory Manual-第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(2001)，完全引入作为参考)。对密码子、合适的表达载体和合适的宿主细胞的选择将取决于大量因素，并且容易按需要优化。
在优选实施方案中，在表达后纯化或者分离脂连蛋白变体。标准的纯化方法包括电泳、分子的、免疫学的和层析技术，包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析和反向HPLC层析，以及层析聚焦。例如，使用标准的抗重组蛋白的抗体柱，纯化脂连蛋白变体。超滤和双过滤技术结合蛋白浓缩也是有用的。对合适的纯化技术的一般指导参见Scopes，R.，ProteinPurification，Springer-Verlag，纽约，第3版(1994)，完全引入作为参考。所需的纯化程度将随着期望用途而改变，有些情形下必需是不纯化的。
已经公开了在细菌中表达并纯化脂连蛋白的操作(参见Ouchi等人，Circulation 1002473-2476(1999)，Fruebis等人，Proc Natl Acad Sci USA982005-2010(2001)，Fruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)，Yamauchi等人，Nat Med 7941-946(2001)，Yamauchi等人，Nat.Med.7941-946(2001)，Hu等人，Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu WuLi Xue Bao(上海)351023-1028(2003)，全部完全引入作为参考)，以及哺乳动物表达系统(参见Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)，Tsao等人，J.Biol.Chem.27729359-29362(2002)，全部完全引入作为参考)。
分析变体活性用大量方法中的任何一种检测本发明的脂连蛋白变体的活性，包括但，是不限于本文描述的那些。用酶联免疫吸收分析(ELISA)测量脂连蛋白浓度(参见例如Arita等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.25779-83(1999)完全引入作为参考)。分析与动脉粥样硬化斑块形成相关的过程的体外方法包括单核细胞附着到内皮上、髓样分化、巨噬细胞因子生成和吞噬作用(Ouchi等人，Circulation 1002473-2476(1999)完全引入作为参考)，脂肪在培养的巨噬细胞中的沉积Ouchi等人，Circulation 1031057-1063(2001)完全引入作为参考)，人大动脉平滑肌细胞增殖和迁移(参见Arita等人，Circulation 1052893-2898(2002)，Waki等人，J.Biol.Chem.27840352-40363(2003)完全引入作为参考)。体外测量胰岛素敏感性的方法包括分析胰岛素介导的对原代肝细胞中产生葡萄糖的抑制(参见Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)完全引入作为参考)。已经使用各种小鼠模型，包括大量摄取脂肪/蔗糖饮食的野生型小鼠、ob/ob(肥胖糖尿病)、NOD(非肥胖糖尿病)或者链脲霉素处理的小鼠(参见Berg等人，Nat.Med.7947-953(2001)，Fruebis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 982005-2010(2001)，Yamauchi等人，Nat.Med.7941-946(2001)，全部完全引入作为参考)，进行胰岛素敏感性和脂肪代谢的体外分析；测量项目包括体重下降、血浆葡萄糖、游离脂肪酸和甘油三酯水平，以及肝脏和肌肉中的甘油三酯含量。
确定变体的免疫原性在优选实施方案中，实验确定脂连蛋白变体的免疫原性，证实该变体相对于亲本蛋白，具有下降的或者被消除的免疫原性。
在优选实施方案中，用离体T细胞活化分析来实验测定免疫原性。在这种方法中，来自匹配供体的抗原呈递细胞和幼稚T细胞用肽或者完整的感兴趣蛋白攻击一次或多次。然后，用大量方法检测T细胞活化，例如，通过监控细胞因子的生成或者测量含氚胸苷的摄取。在最优选的实施方案中，用Elispot分析监控干扰素γ生成(参见Schmittel等人，J.Immunol.Meth.，2417-24(2000)，完全引入作为参考)。其它的合适T细胞分析包括公开在Meidenbauer等人，Prostate 43，88-100(2000)；Schultes，B.C和Whiteside，T.L.，J.Immunol.Methods 279，1-15(2003)；以及Stickler等人，J.Immunotherapy，23，654-660(2000)中的那些方法，全部完全引入作为参考。
在优选实施方案中，用于上述T细胞活化分析中的PBMC供体将包含通常存在于需要治疗脂连蛋白响应的异常的患者中的II型MHC等位基因。例如，对于大多数疾病和异常来说，期望检测包含在人群中普遍存在的全部等位基因的供体。然而，对于与特定MHC等位基因相关的疾病或异常来说，筛选赋予对脂连蛋白应答异常的易感性的等位基因是更加合适的。
在优选实施方案中，将PBMC供体或者对野生型脂连蛋白或者脂连蛋白变体产生免疫应答的患者的MHC单体型与未产生应答的患者的单体型比较。用该数据指导临床前的和临床的研究，以及辅助鉴定极可能对脂连蛋白治疗剂有利地或者不利地应答的患者。
在可替代的优选实施方案中，在转基因小鼠系统中测量免疫原性。例如，可以使用完全或者部分表达人II型MHC分子的小鼠。
在其它实施方案中，通过将脂连蛋白变体施用给一种或多种动物，包括啮齿类和灵长类，并监控抗体形成，来检测免疫原性。由于非人灵长类中的MHC分子的序列以及肽结合特异性与人的序列以及肽结合特异性十分相似，具有定义的MHC单体型的非人灵长类是特别有用的。类似地，使用表达人MHC肽-结合结构域的遗传工程化小鼠模型(参见例如Sonderstrup等人，Immunol.Rev.172335-343(1999)以及Forsthuber等人，J.Immunol.167119-125(2001)，全部完全引入作为参考)。
制剂和施用给患者一旦被制备，本发明的C1q SF成员蛋白变体和核酸可用于许多应用中。在优选实施方案中，将C1q SF成员蛋白变体施用给患者，治疗C1q SF成员响应的异常。
本发明的药物组合物包括适合施用给患者的形式的C1q SF成员蛋白变体。在优选实施方案中，药物组合物是水溶形式的，例如以药学上可接受的盐提供，这是指包括酸加成盐和碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指那些与有机酸和无机酸形成的盐，并且保持游离碱的生物有效性，并且在生物学上或者其它方面不会是不期望的，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而有机酸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸，乙磺酸、p-甲苯磺酸、水杨酸等。“药学上可接受的碱加成盐”包括来源于无机碱的那些盐，无机碱如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等等。特别优选的是铵、钾、钠、钙和镁盐。来源于药学上可接受的无毒性的有机碱的盐包括伯胺盐、仲胺盐和叔胺盐，取代的胺包括天然存在的被取代的胺、环胺和碱金属离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。
药物组合物还包括一种或多种如下成分载体蛋白如血清白蛋白；缓冲液如NaOAc；滤膜如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；结合剂；甜味剂和其它调味品；着色剂；和聚乙二醇。添加剂在本领域是熟知的，可用于各种制剂中。
组合施用药物组合物。此外，该组合物可以与其它治疗剂组合施用。
本发明的C1q SF成员蛋白变体，优选为无菌水溶液形式，可以用各种方式施用，包括但是不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、经皮、腹腔内、肌肉内、胃肠外、肺内、阴道、直肠或者眼内施用。在某些情形下，例如，Clq SF成员蛋白变体作为一种溶液或者喷雾剂直接应用。根据导入的方式，可用各种方法配制药物组合物。在优选实施方案中，将治疗有效量的C1q SF成员蛋白变体施用给需要处理的患者。“治疗有效量”在此是指一种对所施用的对象产生作用的剂量。精确剂量将取决于处理的目的，可由本领域技术人员使用已知技术确定。在优选实施方案中，制剂中的治疗活性的C1q SF成员蛋白变体的浓度在约0.1-约100重量％之间变化。在另一个优选实施方案中，C1q SF成员蛋白变体的浓度在0.003-1.0摩尔的范围内，剂量为每公斤体重0.03、0.05、0.1、0.2和0.3毫摩尔是优选的。如本领域所知，根据C1q SF成员蛋白变体的降解、全身性和局部呈递和新蛋白酶合成速度、以及年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、药物互作和状况的严重性进行调整是必需的，可由本领域技术人员通过常规试验来确定。
在可替代的实施方案中，可施用C1q SF成员变体的核酸；即，可使用“基因治疗”方法。在该实施方案中，将C1q SF成员变体的核酸导入患者的细胞中，以体内合成治疗有效量的C1q SF成员蛋白变体。导入C1q SF成员变体的核酸，可使用许多方法，包括但是不限于用脂质体、病毒(通常是逆转录病毒)载体转染，病毒衣壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等人，Trends in Biotechnology 11205-210(1993)，完全引入作为参考)。在有些情形下，期望用靶向靶细胞的试剂提供核酸来源，例如特异于细胞表面膜蛋白或者靶细胞的抗体，靶细胞上的受体的配体等。当使用脂质体时，结合与内吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质被用于靶向和/或用于促进摄取，例如，趋向于特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、在循环中发生内在化的蛋白质的抗体、靶向细胞内定位和提高细胞内半衰期的蛋白质。受体介导的内吞作用技术已公开，例如，Wu等人，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；以及Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.873410-3414(1990)，全部完全引入作为参考。关于基因标记和基因治疗的操作的综述参见Anderson等人，Science 256808-813(1992)，完全引入作为参考。
实施例实施例1.鉴定C1q SF成员中的MHC-结合抗原限制位使用亲本C1q SF成员序列脂连蛋白(SEQ_ID_NO1)和CTRP1(SEQ)_ID_NO2)，进行矩阵方法计算(Sturniolo，同上文)。
预测如下等位基因的抗原限制位，这些等位基因的每一种在至少1％的美国人群存在中DRB1*0101，DRB1*0102，DRB1*0301，DRB1*0401，DRB1*0402，DRB1*0404，DRB1*0405，DRB1*0408，DRB1*0701，DRB1*0801，DRB1*1101，DRB1*1102，DRB1*1104，DRB1*1301，DRB1*1302，DRB1*1501，和DRB1*1502.
表2.预测存在于C1q SF成员中的MHC-结合抗原限制位。给出了Iscore、等位基因的数量以及在1％、3％和5％的域值时命中的群体的百分比。当采用1％的域值时，特别优选的抗原限制位被预期影响至少10％的群体。
表3.预测存在于C1q SF成员中的MHC-结合抗原限制位。预测在1％、3％、5％和10％的截止值时结合各个等位基因的DRB1等位基因分别用“1”、“3”、“5”或者“10”标示。
实施例2.鉴定C1q SF成员中的MHC-结合抗原限制位的免疫原性适当降低的序列对采用1％的域值时被预测会结合在至少10％的美国人群中存在的等位基因的MHC-结合抗原限制位进行分析，鉴定免疫原性适当降低的变体。在各个抗原限制位上，在满足如下要求条件下考虑所有可能的氨基酸取代组合(1)各个取代在BLOSUM62取代矩阵中的分值为零或更高，(2)各个取代能够使得对至少一个所考虑的MHC等位基因的结合能力下降，并且(3)一旦将足够的取代完全导入以防止任何等位基因在1％的域值时的命中时，不在该序列中增加其它取代。
对替代序列的免疫原性和结构相容性进行评分。优选的替代被定义为是那些被预测不结合上述在1％的域值所检测的17种等位基因的任何一种的序列，其BLOSUM62总分至少为野生型分值的80％。
表4.免疫原性适当较低的C1q SF成员变体。B(wt)是野生型9-mer的BLOSUM62分值，I(alt)是含有一种或多种被预测在1％域值时结合其它9-mer的MHC等位基因的美国人群的百分比，对于表4所列的所有变体来说，该百分比为零，B(alt)是替代9-mer的BLOSUM62分值。
表4.A.i免疫原性适当较低的脂连蛋白抗原限制位A1变体(残基109-117；YVYRS AFSV)；B(wt)＝45。
表4.A.ii免疫原性适当较低的脂连蛋白抗原限制位A2变体(残基111-119；YRSAFSVGL)；B(wt)＝44。
表4.A.iii免疫原性适当较低的脂连蛋白抗原限制位A3变体(残基122-130；YVTIPNMPI)；B(wt)＝49。
表4.A.iv免疫原性适当较低的脂连蛋白抗原限制位A9变体(残基166-174；VYMKDVKVS)；B(wt)＝44。
表4.B.1.免疫原性适当较低的CTRP1抗原限制位B3变体(残基172-180，VNLYDHFNM)；B(wt)＝52。
表4.B.ii.免疫原性适当较低的CTRP1抗原限制位B14变体(残基218-226，VVILFAQVG)；B(wt)＝41。
表4.B.iii.免疫原性适当较低的CTRP1抗原限制位B16变体(残基230-238，IMQSQSLML)；B(wt)＝40。
表4.B.iv.免疫原性适当较低的CTRP1抗原限制位B17变体(残基247-255，WVRLYKGER)；B(wt)＝52。
实施例3鉴定由PDA_技术确定的MHC-结合抗原限制位的免疫原型适当较低的序列表5.对感兴趣的抗原限制位中的各个位置进行分析，鉴定可能与维持蛋白质的结构和功能相容的氨基酸取代亚组。对各个9-mer抗原限制位的每个位置进行PDA_技术计算，并保存各个位置的相容氨基酸。在这些计算中，在感兴趣位置的5_范围内的侧链允许改变构象，但是不允许改变氨基酸的同一性。然后分析抗原限制位变体的免疫原性。将野生型9-mer抗原限制位的PDA_能量和Iscore值与变体比较，记录被预测的免疫原性较低的并且PDA_能量在野生型的5.0 kcal/mol之内的变体序列亚组。在下面的表格中，E(PDA)是用PDA_技术计算确定的能量，与野生型相比，Iscore锚定(Anchor)是针对抗原限制位的Iscore，而Iscore重叠(Overlap)是所有重叠抗原限制位的Iscore的总和。
表5.A.i.脂连蛋白抗原限制位A1的免疫原性较低变体。
表5.A.ii.脂连蛋白抗原限制位A2的免疫原性较低变体。
表5.A.iii.脂连蛋白抗原限制位A3的免疫原性较低变体。
表5.A.iv.脂连蛋白抗原限制位A9的免疫原性较低变体。
表5.B.i.CTRP1抗原限制位B3的免疫原性较低变体。
表5.B.ii.CTRP1抗原限制位B14的免疫原性较低变体。
表5.B.iii.CTRP1抗原限制位B16的免疫原性较低变体。
表5.B.iv.CTRP1抗原限制位B17的免疫原性较低变体。
虽然上面已经描述了前述发明，对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本发明的保护范围下进行各种改变和实施其它实施方案。包括专利、专利申请(临时的、有效的和PCT)以及出版物的所有在此引用的参考文献都全部完全引入作为参考。
对C1q超家族成员的规则的、细胞外结构域(下划线)进行分析，这些结构域是通过检查蛋白质数据库结构来确定的。
脂连蛋白(SEQ_ID1)
MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNCTRP1(SEQ_ID2)MGSRGQGLLLAYCLLLAFASGLVLSRVPHVQGEQQEWEGTEELPSPPDHAERAEEQHEKYRPSQDQGLPASRCLRCCDPGTSMYPATAVPQINITILKGEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGERcKSHYAAFSVGRKKPMHSNHYYQTVIFDTEFVNLYDHFNMFTGKFYCYVPGLYFFSLNVHTWNQKETYLHIMKNEEEWILFAQVGDRSIMQSQSLMLELREQDQVWVRLYKGERENAIFSEELDTYITFSGYLVKHATEA
权利要求
1.非天然存在的脂连蛋白变体，其与野生型脂连蛋白(SEQ.ID.1)相比具有降低的免疫原性，其中所述蛋白变体包含至少两个氨基酸修饰。
2.权利要求1的蛋白变体，其中至少一个氨基酸修饰是对选自如下的抗原限制位进行的抗原限制位A1(残基109-117)、抗原限制位A2(残基111-119)、抗原限制位A3(残基122-130)、抗原限制位A4(残基128-136)、抗原限制位A5(残基136-144)、抗原限制位A6(残基157-165)、抗原限制位A7(残基158-166)、抗原限制位A8(残基160-168)、抗原限制位A9(残基166-174)、抗原限制位A10(残基167-175)、抗原限制位A11(残基175-183)、抗原限制位A12(残基176-184)和抗原限制位A13(残基202-210)。
3.权利要求1的蛋白变体，其中至少一个修饰选自如下位置109、110、111、112、113、114、115、117、119、122、123、124、125、127、128、130、166、167、168、169、171、172和174；其中位置109上的可能修饰选自Q、H、N、R、E、K、G、A、D、T、S、L、P、V、M和I；其中位置110上的可能修饰选自Q、K、N、L、D、A、E、T、S、P、Y、H、F、G、M、I和W；其中位置111上的可能修饰选自P、N、H、A、W、S、D、R、K、T、E、Q、G和V；其中位置112上的可能修饰选自K、D和G；其中位置113上的可能修饰是A；其中位置114上的可能修饰是G；其中位置115上的可能修饰选自Y、H和M；其中位置117上的可能修饰选自T、S和A；其中位置119上的可能修饰选自Q、K、E、T、S、R、A、N和D；其中位置122上的可能修饰选自K、E、H、D、R和Q；其中位置123上的可能修饰选自I、P、E、T、A、Q、S和N；其中位置124上的可能修饰选自E和D；其中位置125上的可能修饰选自E、D、Y、Q、N、S、V、T、L、H、K、R、W、F、G和P；其中位置127上的可能修饰选自K、D和G；其中位置128上的可能修饰选自V、T、Q、A、S、H、N、L、E、D、I、G、K和R；其中位置130上的可能修饰选自L、V、N、Q、E、M、D和A；其中位置166上的可能修饰选自T、S和A；其中位置1 67上的可能修饰选自F、H、A、E、G、D和W；其中位置168上的可能修饰选自A和G；其中位置169上的可能修饰选自A、E、W和T；其中位置171上的可能修饰选自T、A、S、G和N；其中位置172上的可能修饰选自R、Q、G、E和D；其中位置174上的可能修饰选自A和G。
4.权利要求1的蛋白变体，其中至少一个修饰是选自位置109、110、111、112、122和166；其中位置109上的可能修饰选自Q、H、N、R、E、K、G、A、D、T、S和P；其中位置110上的可能修饰选自D、A、E、T、S、P、G和W；其中位置111上的可能修饰选自P、N、H、A、S、D、R、K、T、E、Q和G；其中位置112上的可能修饰是D；其中位置122上的可能修饰选自K、E、H、D、R、Q；其中位置166上的可能修饰选自T、S和A。
5.非天然存在的CTRP1蛋白变体，其与野生型CRTP-1蛋白(SEQ.ID.2)相比具有降低的免疫原性，其中所述蛋白变体包含至少两个氨基酸修饰。
6.权利要求5的蛋白变体，其中至少一个氨基酸修饰是对选自如下的抗原限制位进行的B1(残基150-158)、抗原限制位B2(残基171-179)、抗原限制位B3(残基172-180)、抗原限制位B4(残基178-186)、抗原限制位B5(残基185-193)、抗原限制位B6(残基186-194)、抗原限制位B7(残基188-196)、抗原限制位B8(残基192-200)、抗原限制位B9(残基193-201)、抗原限制位B10(残基194-202)、抗原限制位B11(残基202-210)、抗原限制位B12(残基208-216)、抗原限制位B13(残基209-217)、抗原限制位B14(残基218-226)、抗原限制位B15(残基220-228)、抗原限制位B16(残基230-238)、抗原限制位B17(残基247-255)、抗原限制位B18(残基248-256)和抗原限制位B19(残基267-275)。
7.权利要求5的蛋白变体，其中至少一个修饰选自位置172、174、175、177、178、180、218、219、220、221、223、224、226、230、231、232、233、235、236、238、247、248、249、250、252、253和255；并且其中位置172上的可能修饰选自A、D、G、N、S和T；其中位置174上的可能修饰选自A、D、E、G、H、K、N、P、Q、R、S、T、V和W；其中位置175上的可能修饰选自A、D、E、G、I、K、L、M、N、P和T；其中位置177上的可能修饰选自D、E、G和Q；其中位置178上的可能修饰选自H、K和Y；其中位置180上的可能修饰选自A、D、E、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y；其中位置218上的可能修饰选自A、G、N、S和T；其中位置219上的可能修饰选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S和T；其中位置220上的可能修饰选自A、D、G、L、N、S、T和V；其中位置221上的可能修饰选自A、D、E、F、G、I、K、N、P、Q、S、T、W和Y；其中位置223上的可能修饰选自E、N和Q；其中位置224上的可能修饰选自D、E和G；其中位置226上的可能修饰选自D和E；其中位置230上的可能修饰选自A、D、G、H、E、Q和K；其中位置23 1上的可能修饰选自T、N、S、E、A、D和G；其中位置232上的可能修饰选自E和D；其中位置233上的可能修饰选自A、P和G；其中位置235上的可能修饰选自P、E、A、T、K和Q；其中位置236上的可能修饰选自E、A、P、D、G、Q、I、M和H；其中位置238上的可能修饰选自K、M、A、Q、S、T、N、G、D、V、R和E；其中位置247上的可能修饰选自G、S、A、D、N、P、E、Q、M、K和L；其中位置248上的可能修饰选自M、A、S、T、G和P；其中位置249上的可能修饰选自K、S、Q、T、V、A、N、P、E、D和G；其中位置250上的可能修饰选自E、T、Q、N、V、S、A、K、G和P；其中位置252上的可能修饰选自L、R、T、N、P、E、S、H、Q、A、D、G、W、Y和F；其中位置253上的可能修饰是E；其中位置255上的可能修饰选自K、N、P、T、D、E、H和L。
8.权利要求5的蛋白变体，其中至少一个修饰选自位置172、174、175、218、219、220、230、235、236、238、247、248、249、250和252；并且其中位置172上的可能修饰选自A、D、G、N、S和T；其中位置174上的可能修饰选自D和E；其中位置175上的可能修饰选自E和P；其中位置218上的可能修饰选自A、G、N、S和T；其中位置219上的可能修饰是D；其中位置220上的可能修饰是D；其中位置230上的可能修饰选自A、D、G、H、E、Q和K；其中位置235上的可能修饰是E；其中位置236上的可能修饰是D；其中位置238上的可能修饰选自T、N、G、D、R和E；其中位置247上的可能修饰选自G、S、A、D、N、P、E、Q和K；其中位置248上的可能修饰选自A、S、T和P；其中位置249上的可能修饰选自E和D；其中位置250上的可能修饰选自E和P；其中位置252上的可能修饰选自E、D、W、Y和F。
全文摘要
本发明涉及非天然存在的Clq超家族成员蛋白质变体，其具有降低的免疫原性。更具体地，本发明涉及免疫原性下降的脂连蛋白变体和CTRP1蛋白变体。
文档编号C07K14/74GK101018807SQ200580024618
公开日2007年8月15日 申请日期2005年5月17日 优先权日2004年5月21日
发明者香农·A·马歇尔, 格雷戈里·L·穆尔, 阿瑟·J·奇里诺, 约翰·R·德斯贾莱斯 申请人:赞科股份有限公司