专利名称：修饰纤维素酶催化提取薯蓣皂素的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用修饰纤维素酶提取薯蓣皂素的方法。属于由薯蓣植物提取薯蓣皂素的技术。
背景技术：
薯蓣皂素即薯蓣皂苷元，是甾体制药工业的重要中间体，由薯蓣属植物的根茎为原料经过酸水解、有机溶剂提取而得。薯蓣皂素的生产起初是由薯蓣植物的根茎为原料经直接酸水解提取制得，即Rothrok法。该方法在国内外一直被沿用，我国在50年代末开始采用该方法建立薯蓣皂素工厂，甚至在我国一些小企业中现在仍广泛使用。但是该方法却存在着一方面制得的薯蓣皂素的收率较低，只能提取出植物中45％的薯蓣皂素的成分；另一方面使得植物中大量的有效成分废弃掉，造成资源的严重浪费和环境的污染。
为了提高薯蓣皂素的收率，人们曾进行大量的研究工作和多种工艺改进，其中重要的发现之一是六、七十年代加拿大的Hardman和苏联的Paseshnichenko等人在酸水解前将植物原料进行预发酵一段时间后，可以达到提高薯蓣皂素收率的目的。但是此方法消耗时间较长，同时发酵过程会产生其它的副产物。
近年来，随着生物催化技术的发展，国内一些学者分别采用纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等进行生物催化处理后协同酸水解进行研究，结果能够使植物中65％～70％的薯蓣皂素成分提取出来。但是，随着生物酶催化反应的进行，底物降解生成的产物能够对生物酶产生抑制作用，加上原料含有较多的杂质，使得生物酶活力大大降低，不利于植物中与薯蓣皂苷结合的高分子物质的有效降解和断裂，于是酸水解的阻力没有得到有效的减小，从而限制了薯蓣皂素的收率和质量提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用具有较高活性的修饰纤维素酶催化提取薯蓣植物中的薯蓣皂素的方法。该方法具有薯蓣皂素提取率高、节约能源和环境污染低的特点。
为达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种修饰纤维素酶催化提取薯蓣皂素的方法，其特征在于包括以下过程1.三聚氯氰的纯化，配制质量浓度为6％～15％的三聚氯氰苯溶液，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰。
2.聚乙二醇的活化，按聚乙二醇4000与4A分子筛和无水碳酸钠的质量比为1∶2～6∶4～10将聚乙二醇4000、4A分子筛和无水碳酸钠加入溶剂苯中，常温搅拌30～60分钟后，过滤，去除4A分子筛和碳酸钠得到滤液，然后按照聚乙二醇4000与纯化的三聚氯氰的摩尔比为2～2.5∶1将步骤1制得的纯化的三聚氯氰加入到滤液中，常温条件下反应20～50小时。溶液再经浓缩，过滤，低温干燥，得到活化的聚乙二醇。
3.纤维素酶的修饰，将纤维素酶和步骤2制得的活化聚乙二醇按照质量比为1∶2～6加入到pH为5.0～7.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，控制温度为0℃～8℃，反应1～5小时。采用截留分子量为5000～10000的超滤膜分离出纤维素酶，低温冷冻干燥得到修饰纤维素酶。
4.薯蓣皂素的转化提取，把粉碎的盾叶薯蓣或穿龙薯蓣原料按照质量比为1∶3加入水中浸泡30～60分钟，再按照与盾叶薯蓣或穿龙薯蓣质量比2.0‰的比例将步骤3制得的修饰纤维素酶加入浸泡液中，控制温度50℃～60℃下催化作用反应4～7小时，然后用硫酸或盐酸调节体系的酸浓度为2mol/L～5mol/L，温度为98～108℃下水解，水解液采用5％的Na2CO3水溶液洗涤至中性过滤，将滤饼置于60～80℃烘箱中干燥，干燥后的固体物利用萃取剂120#汽油于索式提取器内萃取，萃取液经浓缩，过滤，低温干燥后得薯蓣皂素产品。
本发明的优点在于提高了纤维素酶抵制环境条件引起酶失活的能力，从而提高了酶的催化活性，在反应过程中始终保持较高的催化活性，减小了物料后续处理的阻力，有利于薯蓣属植物中的薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷元，从而提高了薯蓣皂素提取率，增加了产量，并且废物排放低。
具体实施例方式
实施例一将20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，重结晶两次后，得到纯化的三聚氯氰17.9g。在1000mL的三口烧瓶中加入5.0g的4A分子筛，10.0g无水碳酸钠，500mL苯和20.0g聚乙二醇4000，常温搅拌30分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.4613g，常温条件下反应36小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，然后在温度为-14℃下低温干燥，得到活化的聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入4.0g的活化聚乙二醇4000和pH为6.8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液100mL，调节温度为4℃，活化聚乙二醇4000充分溶解后加入1.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为5000的聚砜超滤膜分离得到修饰纤维素酶。
然后将100g 60～80目盾叶薯蓣粉末置于500mL三口烧瓶中，加入300mL水在温度30℃下搅拌45分钟，充分浸泡膨胀后，加入0.2g修饰的纤维素酶，控制反应温度50℃，修饰纤维素酶催化反应5小时；然后量取反应液体积为330mL，加入98％浓硫酸64.3mL调节水解体系酸浓度为3mol/L，于101℃进行酸水解2小时；水解后的盾叶薯蓣粉末再用5％的Na2CO3水溶液洗涤至中性，而后于60℃烘箱中干燥，并不时的翻动防止物料过干；将干燥后的水解物21.6g用500mL的120#汽油于索式提取器中提取7小时，然后用旋转蒸发器回收汽油，浓缩提取液，-4℃低温条件下产物结晶，砂芯漏斗过滤，最后在-15℃冷冻干燥箱中干燥得无色针状结晶2.2537g，提取率可达96％以上。产品经红外光谱测定，结果(IR(KBr)v cm-13452，1049，978，918，898，866)与文献相吻合(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，918，898，864)；熔点为197℃～198℃；元素分析结果为C77.98％，H10.19％与理论计算值(78.21％和10.21％)一致；高效液相色谱测定结果为产品纯度高达98.6％。
实施例二将10.0g三聚氯氰溶解于150mL苯中，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰8.7g。在1000mL的三口烧瓶中加入2.5g的4A分子筛，8.0g无水碳酸钠，400mL苯和10.0g聚乙二醇4000，常温搅拌40分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.2306g，常温条件下反应38小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14℃下低温干燥，得到活化的聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入8.0g活化聚乙二醇4000和pH为7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液200mL，调节温度为4℃，活化聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纤维素酶，反应2小时后用截留分子量为4000的聚砜超滤膜分离得到修饰纤维素酶。
将50.0g80～100目盾叶薯蓣粉末置于250mL三口烧瓶中，加入150mL水在温度25℃下搅拌45分钟，充分浸泡膨胀后，加入0.1g修饰纤维素酶，控制反应温度50℃，修饰纤维素酶催化6小时；然后后面的水解、中和、提取等操作方法按照实施例一，浓缩提取液，-4℃低温下产物结晶，砂芯漏斗过滤，最后在-15℃冷冻干燥箱中干燥得无色针状结晶1.2365g，提取率可达97％以上。产品经红外光谱测定，结果(IR(KBr)v cm-13450，1050，979，918，897，867)与文献相吻合(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，918，898，864)；熔点为198℃～200℃；元素分析结果为C77.95％，H10.20％与理论计算值(78.21％和10.21％)一致；高效液相色谱测定结果为纯度高达97.9％。
实施例三将20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰18.3g。在1000mL的三口烧瓶中加入8.0g的4A分子筛，12.0g无水碳酸钠，600mL苯和30.0g聚乙二醇4000，常温搅拌60分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.5535g，常温条件下反应40小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14.2℃下低温干燥，得到活化的聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入8.0g活化聚乙二醇4000和pH为6.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液200mL，调节温度为4℃，活化聚乙二醇4000充分溶解后加入2.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为4000的聚砜超滤膜分离得到修饰纤维素酶。
将50.0g80～100目穿龙薯蓣粉末置于250mL三口烧瓶中，加入150mL水在温度30℃下搅拌60分钟，充分浸泡膨胀后，加入0.1g修饰纤维素酶，控制反应温度55℃，修饰纤维素酶催化5.5小时；然后后面的水解、中和、提取等操作方法按照实施例一，最后浓缩提取液，-4℃低温下产物结晶，砂芯漏斗过滤，最后在-15℃冷冻干燥箱中干燥得无色针状结晶1.3684g，提取率可达97％以上。产品经红外光谱测定，结果(IR(KBr)vcm-13450，1050，979，918，897，867)与文献相吻合(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，918，898，864)；熔点为197℃～199℃；元素分析结果为C78.14％，H10.20％与理论计算值(78.21％和10.21％)一致；高效液相色谱测定结果为纯度高达95.6％。
实施例四将20.0g三聚氯氰溶解于300mL苯中，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰17.6g。在1000mL的三口烧瓶中加入4.0g的4A分子筛，9.0g无水碳酸钠，500mL苯和16.0g聚乙二醇4000，常温搅拌40分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.2952g，常温条件下反应40小时。溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14.2℃下低温干燥，得到活化的聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入12.0g活化聚乙二醇和pH为7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液100mL，调节温度为4.0℃，活化聚乙二醇4000充分溶解后加入3.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为5000的聚砜超滤膜分离得到修饰纤维素酶。
将100g60～80目的穿龙薯蓣粉末置于三口烧瓶中，加入300mL水在温度25℃下搅拌45分钟，充分浸泡膨胀后，加入0.2g经过聚乙二醇4000修饰的纤维素酶，控制反应温度60℃，纤维素酶催化5小时；然后后面的水解、中和、提取等操作方法按照实施例一，最后浓缩提取液，-4℃低温条件下产物结晶，砂芯漏斗过滤，最后在-60℃冷冻干燥箱中干燥得无色针状结晶2.6957g，提取率可达95％以上。产品经红外光谱测定，结果(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，920，897，866)与文献相吻合(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，918，898，864)；熔点为197℃～199℃；元素分析结果为C78.18％，H10.23％与理论计算值(78.21％和10.21％)一致；高效液相色谱测定结果为纯度高达97.8％。
实施例五将15.0g三聚氯氰溶解于250mL苯中，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰13.6g。在1000mL的三口烧瓶中加入5.0g的4A分子筛，10.0g无水碳酸钠，600ml苯和16.0g聚乙二醇4000，常温搅拌40分钟后，布氏漏斗过滤，除去4A分子筛和碳酸钠；滤液收集到三口烧瓶中，然后加入纯化的三聚氯氰0.2952g，常温条件下反应40小时，溶液经浓缩，布氏漏斗过滤，温度为-14.2℃下低温干燥，得到活化的聚乙二醇4000。在500mL的烧瓶中加入14.0g活化聚乙二醇4000和pH为7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液120mL，调节温度为5.0℃，活化聚乙二醇4000充分溶解后加入4.0g纤维素酶，反应2小时后利用截留分子量为5000的聚砜超滤膜分离修饰纤维素酶。
将100g80～100目穿龙薯蓣粉末置于三口烧瓶中，加入300mL水在温度30℃下搅拌60分钟，充分浸泡膨胀后，加入0.2g经过聚乙二醇4000修饰的纤维素酶，控制反应温度55℃，纤维素酶催化6小时；然后后面的水解、中和、提取等操作方法按照实施例一，最后浓缩提取液，-4℃低温条件下产物结晶，砂芯漏斗过滤，最后在-60℃冷冻干燥箱中干燥得无色针状结晶2.7153g，提取率可达96％以上。产品经红外光谱测定，结果(IR(KBr)v cm-13450，1049，980，920，897，866)与文献相吻合(IR(KBr)v cm-13450，1050，980，918，898，864)；熔点为197℃～199℃；元素分析结果为C78.20％，H10.20％与理论计算值(78.21％和10.21％)一致；高效液相色谱测定结果为纯度高达96.9％。
权利要求
1.一种修饰纤维素酶催化提取薯蓣皂素的方法，其特征在于包括以下过程1).三聚氯氰的纯化，配制质量浓度为6％～15％的三聚氯氰苯溶液，重结晶两次，得到纯化的三聚氯氰；2).聚乙二醇的活化，按聚乙二醇4000与4A分子筛和无水碳酸钠的质量比为1∶2～6∶4～10将聚乙二醇4000、4A分子筛和无水碳酸钠加入溶剂苯中，常温搅拌30～60分钟后，过滤，去除4A分子筛和碳酸钠得到滤液，然后按照聚乙二醇4000与纯化的三聚氯氰的摩尔比为2～2.5∶1将步骤1)制得的纯化的三聚氯氰加入到滤液中，常温条件下反应20～50小时，溶液再经浓缩，过滤，低温干燥，得到活化的聚乙二醇；3).纤维素酶的修饰，将纤维素酶和步骤2)制得的活化聚乙二醇按照质量比为1∶2～6加入到pH为5.0～7.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，控制温度为0℃～8℃，反应1～5小时，采用截留分子量为5000～10000的超滤膜分离出纤维素酶，低温冷冻干燥得到修饰纤维素酶；4).薯蓣皂素的转化提取，把粉碎的盾叶薯蓣或穿龙薯蓣原料按照质量比为1∶3加入水中浸泡30～60分钟，再按照与盾叶薯蓣或穿龙薯蓣质量比2.0‰的比例将步骤3)制得的修饰纤维素酶加入浸泡液中，控制温度50℃～60℃下催化作用反应4～7小时，然后用硫酸或盐酸调节体系的酸浓度为2mol/L～5mol/L，温度为98～108℃下水解，水解液采用5％的Na2CO3水溶液洗涤至中性过滤，将滤饼置于60～80℃烘箱中干燥，干燥后的固体物利用萃取剂120#汽油于索式提取器内萃取，萃取液经浓缩，过滤，低温干燥后得薯蓣皂素产品。
全文摘要
本发明公开了一种利用修饰纤维素酶提取薯蓣皂素的方法。属于由薯蓣植物提取薯蓣皂素的技术。该方法主要包括以下步骤将三聚氯氰溶解于苯中，重结晶后，按照一定的比例与在苯中经过分子筛和无水碳酸钠处理后的聚乙二醇反应，制得活化的聚乙二醇；活化聚乙二醇与天然纤维素酶以一定比例在柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液中反应，最后利用超滤膜分离制得的修饰纤维素酶；将修饰纤维素酶加入原料的水浸泡液之中，经催化，水解，中和，提取，结晶得到薯蓣皂素产品。本发明的优点在于修饰纤维素酶抵制环境和温度的能力增强，在较长时间内具有较高的催化活性，催化效果明显，此修饰酶特别适用于富含纤维素天然产物中有效成分的提取，具有广泛的通用性。
文档编号C07J71/00GK1966712SQ200610129228
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月7日 优先权日2006年11月7日
发明者张裕卿, 李滨县 申请人:天津大学