替加环素和制备9-硝基米诺环素的方法

专利名称：：替加环素和制备9-硝基米诺环素的方法替加环素和制备9-硝^M若环素的方法本申请要求于2005年5月27日提交的美国临时申请号60/685291的优先权，其内^此引入作为参考。本文公开了制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中Ri和R2各自独立选自氢、直,支钩d-C6);^以及环:^,或者&和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4各自独立选自iiA直M^支M(CrC4);^;n为l-4。在一个实施方案中，Ri为氢，R2为叔丁基，R为-NR3R4，其中R3为曱J^LR4为曱基以及n为l，例如，替加环素(tigecycline)。替加环素H^为9-(叔丁基-甘氨SttJ^米诺环素(TBA-MINO)，化学名称为(4S，4aS，5aR，12aS)-9-[2-(叔丁基^^i-)乙itiJ^4，7陽X^二曱^i^4)曙l,4，4a，5，5a，6，ll,12a-八Ul0,12，12a-四羟基-l，ll-二氧^r2-并四苯甲酰胺，即在式1中，R!为氢，R2为叔丁基，R3为甲基，R4为甲^n为1。替加环素为甘氨酰环素抗生素，并ibl:半合成四环素(米诺环素)的类似物。替加环素为米诺环素的9-叔丁基甘氨Stt^衍生物，其结构如下所示替加环素为了应对抗生素耐药的4M^界范围内的iW，开发了替加环素。替加环素在体内和体外均具有超广镨抗菌活性。与四环素抗生素相似，甘氨^f、素抗生素通过抑制细菌的蛋白旨而起作用。替加环素是么^的四环素家族中的抗生素，并且为米诺环素的化学类似物。它可以用于对抗耐药菌，并已发现它在其它抗生素治疗^t时仍然有效。例如，它对以下樹生物有活性，所述微生物为抗曱氧西林的金黄色葡萄球菌(5te/^fococc鄉做mtt)、耐青霉素的肺炎M^菌(5^/7似cocc附/wie"附wiJae)、耐万古霉素的肠球菌(enterococci)(D.J.Beidenbach等人诊断微生物学和传染病(DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease)40:173"177(2001);H.W.Boucher等人^^t物剂和化疗(AntimicrobialAgents&Chemotherapy)44:2225-2229(2000);P.A.Bradford临床孩钍物学时事快^(CUn.Microbiol.Newslett.)26:163-168(2004);D.證atovic等^s^^生物剂和化疗(Antimicrob，AgentsChemother.)47:400404(2003);R.Patel等人诊断孩性物学和传染病38:177-179(2000);P.J.Petersen等人4^敞生物剂和化疗46:2595-2601(2002)和P.J.Petersen等人^t^t生物剂和化疗43:738-744(1999)，并且它对带有两种四环素主要耐药形式(外排和核糖体保护)之一的微生物有活性(C.Betriu等/s^#支生物剂和化疗48:323-325(2004);T.Hirata等人，抗厲i生物剂和化疗48:2179-2184(2004);和PJ.Petersen等人^tft生物剂和化疗43:738-744(1999)。替加环素可以用于治疗多种细菌感染，例如复杂性Wt感染(cIAI)、复杂性皮肤和M组织感染(cSSSI)、社区获得IW炎(CAP)和医院获得'f辦炎(HAP)，所述感染可能是由革兰氏P月性和革兰氏阳性病原体、厌氧菌以及金黄色葡萄球菌的甲氧西^4t感菌^^曱氧西林耐药菌;^(MSSA和MRSA)引起的。另夕卜，替加环素可以用于治疗或控制^jk动物中的由携有TetM和TetK耐药决定子的细菌引起的细菌感染。另外，替加环素可以用于治疗骨和关节感染、与导管有关的中性粒细胞减少、产#妇科感染，或者用于治疗其它耐药病原体，例如VRE、ESBL、肠的(enterics)、速生型分枝杆菌等。替加环素有一些缺点，因为它可能通过差向异构化而降解。差向异构化是四环素类中脊遏已知的降解途径，尽管降解的速率可以根据不同四环素而变化。比较而言，替加环素的差向异构^it率是快速的，甚至例如在温和的酸性条件下和/或在温和的升温条件下。关于四环素的文献^il了数种科学家用于尝试^H吏四环素差向异构体形成减到最少的方法。在一些方法中，当在碱性pH条件下在非水溶剂中进行时，四环素的钙、镁、锌或^^r属盐的形成限制了差向异构体的形成。(Gordon,P.N，StephensJr，C.R，Noseworthy，M.M.，Teare,F.W.，U.K.专利号901107)。在其它方法中(Tobkes，U.S.专利号4038315)，在酸性pH条件下形成金属复*,随后制备药物的稳定的固体形式。替加环素与其差向异构体在结构只有一点不同。在替加环素中，位于4位碳上的N-二曱基基团与相邻的氬为顺式的，如上述式I所示，而在差向异构^即Cr差向异构体)式n中，它们^匕M式的，如上面式n中所表明的方式。尽管认为替加环素差向异构体狄毒的，但是在某些情况中它可能缺乏替加环素的抗菌活性，因此，它可負M:不需要的降解产物。此外，当;W^^成替加环素时，差向异构化的量可能会增加。用于减少差向异构体形成的其它方法包括在处理过程中係特pH约大于6.0;避免与弱酸的共l^勿(例如甲酸盐、乙酸盐、磷i^L或硼^ik)^触；M免与湿气(包^7K溶液)^触。关于避免湿气，Noseworthy和Spiegel(美国专利号3026248)及Nash和Haeger(美国专利号3219529)建i^非水溶媒中制备四环素类似物的制剂以提高药i^急定性。然而，在这些公开中的大多l^^媒更适用于局部应用，而非胃肠夕卜应用。还已知四环素差向异构化为温度依赖性的，所以在低温生产和l&存四环素也可以斷氐差向异构体形成的速率(Yuen，P.H.,Sokoloski，T.D.，药学科学杂志(J.Pharm.Sci.)66:1648-1650,1977;Pawelczyk^E.，Matlak^B，Pol.药学和药理学杂志(J.Pharmacol.Pharm.)34:409-421，1982)。这些方法中的几种尝试用于替加环素，但是显然没有一个方法能够成功减少差向异构体的形成和氧化降解，同时又不引入其它降解产物。例如，/M/性pH"^H牛下，发现金属复^4勿对于差向异构体的形成或降解通常几乎没有作用。尽管^^1磷紋、乙離和杼檬狄緩沖液可提高^^状态的稳定性，但是它们似乎也能够加速冻干状态下替加环素的降解。然而，即使没有緩冲剂的存在，较其它四环素(例如米诺环素)而言，替加环素的差向异构4t^是一个^7严重的问题。除了C4-差向异构体外，其它杂质包括氧化副产物。这些副产物中的一些是由于所述分子的D环(为^J^I^的氧化而得到的。式3化^#(参见下面流-呈I)在C-ll和C-12a位较容易祐氡化。通过使用非溶剂沉淀分离式3化合物可能会出现氧化副产物和金属盐与产物共沉淀的问题，导致纯度极低。式34t^的母核的氧化和降解^a性^jS条件下可能更明显，并且因为处理时间通常较长并且^^物与磁接触时间较长，所以在较;W^練怍中情况更为严重。另外，在A^^^呈的^-个合成步骤中^T能得到降解产物，自这些降解产物中分离需要的4^^可^i繁瑣的。例如，由于它们的^#性，常身M/^支^(例如^^析或制备HPLQ无法用于^艮容易地纯^il些^^物。尽管一些四环素可以通过分配色譜(使用由硅藻土制备的柱子，所ii^土预先经含有^^剂如EDTA的緩冲固定相浸渍)纯化，城些技术具有极低的分离度、重现性和容量。这些缺点可能妨碍了;W^^成。HPLC也已^UU于纯化，但HPLC柱上^Mt成分的足够的分离度要求流动相中有离子对试剂存在。从流动相中的*试剂和离子对试剂中分离终产物可負^l:困难的。当小规模制备时，自沉^^得的不纯的化合物可以通过制备型反相HPLC纯化，当处理千克量的物质时，通it^相斜目色傳的纯化可能A^效并且昂贵的。因此，获得较以前所得到的更纯形式的至少一种式14^4勿仍是有需要的。使色镨法纯化应用减到最少的新合成方法也仍是有需要的。本文公开了用于生产四环素类4^物(例:i(t^加环素)的方法，通常如下面流程I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>Ri和R2均独立选自氢、直,支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者Ri和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直,支链(C广C4)絲；n为l-4。式2卩^物也已知为米诺环素或米诺环素衍生物。将式2化合物与至少一种硝化试剂M产生-N02取^J^形成式3^^7。例:i(魂过氢化^1，式3中的-N02取n^可以^^fci原为氨基，形成式4化合物。最终，将式4^^4勿iM匕产生式1化^4勿。本文公开了进行制备式i化合物的反应的方法，例如，硝化、还原以;sj^f匕M。^^//Hf了式1^^4勿的纯4匕方法。本文公开的方法可以形成需要的产物，同时减少终产物中存在的至少一种杂质的量，例如形成的差向异构体、存在的原料以;^ft化副产物。此类杂质减少可以在合成过程中的至少一个步骤中完成，即在辨化、还原和酰化反应的任何一个步骤中完成。本文7/^f的方法也可以有助于具有适当纯度的终产物的;JcM^成。里图i描述了制备替加环素的示例性流程。图2描述了制备替加环素的示例性流程。1Lindgren，F.T.(1988)J.Clin.Invest.81,561-568;Goldberg,I.J.,Le，N.，PatemkiJ.R.,Ginsberg,H.N.，Lindgren,F.T.,andBrown,W.V.(1982)J.Clin.Invest.70,1184-1192;Hide,W.A.,Chan,L.,andLi,W.國H.(1992)J.Lipid.Res.33,167-178)。胰酯酶主要负责膳食中脂质的水解。已描述了胰酯酶的多个变体，但它们的生理作用还未确定(Giller，T.，Buchwald，P.,Blum-Kaelin,D.,andHunziker，W.(1992)J.Biol.Chem.267,16509-16516)。这些酯酶基因编码的酯酶多肽大约为450个氨基酸长，并具有先导信号肽以利于分泌。酯酶蛋白由两个主要的结构域构成(Winkler，K.，D'Arcy,A.，andHunziker,W.(1990)Nature343,771-774)。氨基末端结构域包含催化位点，而认为羧基末端结构域负责底物的结合、辅助因子结合以及与细胞受体相互作用(Wong,H.，Davis,R.C.，Nikazy，J"Seebart，K.E.,andSchotz,M.C.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,11290-11294;vanTilbeurgh，H.,Roussel，A.,Lalouel，J,M.，andCambillau，C.(1994)J.Biol.Chem.269,4626-4633;Wong,H.，Davis,R.C.,Thuren,T.,Goers,J.W.，Nikazy,J,，Waite，M.,andSchotz，M.C.(1994)J.Biol.Chem.269,10319-10323;Chappell,D.A.,Inoue，I.，Fry,G.L,Pladet,M.W.，Bowen，S.L.，Iverius,P,H.,Laloud,J.-M.，andStrickland,D.K.(1994)J.Biol.Chem.269,18001-18006)。该家族成员间的氨基酸同源性整体水平是22-65%，而与酶功能相联系的局部区域具有对应于结构同源性的高同源性。甘油三酯酯酶家族的成员共同具有许多保守的结构特性。一个特性是"GXSXG"模式，其中中央丝氨酸残基是组成"催化三元组"的三个残基之一(Winkler，K.,D'Arcy，A.，andHunziker,W.(1990)Nature343，771-774;Faustinella，F.，Smith,L.C.，andChan，L.(1992)Biochemistry31,7219-7223)。保守的天门冬氨酸和组氨酸残基构成了催化三元组的平衡。19-23个氨基酸的小段("盖区域")形成两性螺旋结构，并覆盖了酶的催化口袋(Winkler,K.,D'Arcy，A"andHunziker,W,(1990)Nature343，771-774)。肝和脂蛋白酯酶的比较说明了该酶的甘油三酯酯酶和磷脂酶活性的差别部分上被此盖区域所调节(Dugi，K.A.,DichekH.L.,andSantamarina-Fojo,S.(1995)J.Biol.Chem.270,25396-25401)。甘油三酯酯酶具有不同程度的肝素结合活性。脂蛋白酯酶具有最高的肝素亲和力，该结合活性被定位在氨基末端结构域的其中R,和R2均独立选自氢、直M^支钩d-C6)烷基以及环烷基，或Rj和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直,支钩CrC4)絲；n为l画4。一个实施方案y^f"了硝化^i，其中硝化产物没有被分离。因此，在一个实施方案中，所ii^r法包括(a)^^少一种硝化试剂与至少一种式2化^;或其盐反应制^"有中间体的M^^4勿；和(b)进一步使该中间体^JI形成至少一种式1^b^。在一个实施方案中，中间体不^M^^^中分离。至少一种式2化洽物可以以游离碱或盐的形式提供。在一个实施方案中，至少一种式24^4勿为盐。本文所用"盐"可以原位制备或者通过将游离贴适当的^JI单独地制备。示例性的盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、氬碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、贿酸盐、乙酸盐、苯曱酸盐、柠檬酸盐、半M^酸盐、富马酸盐、雍乙酸盐、马来酸盐、琥銷酸盐、酒石酸盐、减酸盐和氯^C^t^盐。在另一个实施方案中，所述盐可以选自烷i^M盐和芳基^盐。在一个实施方案中，至少一种式2化合物可以以盐g或石诚盐形式提供。本文所用"硝化试剂，，是指可以向4^^中51入-NOz:^RJ^者将存在的取4J(J>#化为-N02取f^的试剂。示例'f4^'化试剂包括硝酸和硝缝，例如碱金属盐，如KN03。当硝化试剂为硝酸时，硝酸的浓度可以为至少80%，例如浓JL^85%、88%、90%、95%、99%或者甚至为100%。硝化试剂可以与至少一种式2^^勿在^M页域技"员认为适当的4封可溶剂中进行反应。在一个实施方案中，该^Jl^^L^和/或硫g存在下进行。在一个实施方案中，所使用的碗^i^克酸，例如，浓度至少为50%、60%、70%、80%、85%、90%或至少为95%。在一个实施方案中，相对于至少一种式2化合物而言，至少一种硝化试剂是摩尔过量的。适当的摩尔过量可以由^^页域"fit技权员确定，该过量包括^a^限于例如至少1.05，例如摩尔过量为1.05-1.75当量、例如摩尔过量为1.05-1.5或者为1.05-1.25或者为1.05-1.1当量。在另一个实施方案中，摩尔过量为1.05、1.1、1.2、1.3或1.4当量。在一个实施方案中，通it^一段时间内加U少一种硝化试剂，使得至少一种辟化试剂与至少一种式2^^f勿站。4^页域"f^技"员可以确定一时间段，在该时间段内加入4^量的硝化试剂以优化纽^f牛。例如，硝化试剂的加入可以通过例如HPLC监测，以控制所使用的至少一种硝化试剂的量。在一个实施方案中，至少一种硝化试剂的4r^量在至少l小时的时间段内加入，例如至少2小时、至少3小时、至少5小时、至少10小时、至少24小时的时间段，或者l小时至1周、l小时至48小时、1小时至24小时或者1小时至12小时的时间段。至少一种硝化试剂可以连续加入。在一个实施方案中，硝化试剂可以与至少一种式2化^[勿在0-25。C温度下反应，例如5-15。C、5^10。C或者10-15。C。本i^斤用"中间体"是指作为原#终产物之间的中间产物而形成的化r^4勿。在一个实施方案中，中间体为至少一种式2化/^勿的硝化产物。例如，所述中间体可以是至少一种式3化合物或其盐中间体可以以游离M盐存在，例如本i^斤公开的任何盐。在一个实施方案中，中间体为石J^JL。在一个实施方案中，中间体没有自M';^^中分离。本文所用"纽^^"是指包含至少一种化学反应产物的溶M浆状物，所述化学反应产物在试剂以及副产物例如杂质(包括有不需要的立体化学结构的化^4勿)、溶剂和^{可剩余^^试剂(例凟*会原料)之中。在一个实施方案中，中间体为硝化产物并存在于^J^';^物中，所ii^〉'^^也可以含有原^^剂(例如硝化试剂和/或至少一种式2^^)、副产物(例如式2或式3的CV差向异构体)。在一个实施方案中，M》V給物为浆状物，其中浆状物可以是含有至少一种固体和至少一种液^(例如水、酸或溶剂)的组合物，例如，固体悬浮M^ft体。在一个实施方案中，硝4^应产生中间体，同时产生少量的相应的Q-差向异构体。例如，当中间体为至少一种式3化合物时，硝化M导致式3的CV差向异构体形成，才娥高效斜目色il(HPLC)测定，该差向异构体的量少于10%。在另一个实施方案中，<:4-差向异构^#在的量少于5%、少于3%、少于2%、少于1%或少于0.5%。^-"步戮即硝'化、i￡yf、、iU匕)的HPLC^It提供在实施例部分中。在一个实施方案中，进行硝^^应，以致^^始原辨例如至少一种式2化合物)的量很低。在一个实施方案中，才娥HPLC测定，至少一种式2化合物以少于10%的量存在于硝化产物中，或者其量少于5%、少于3%、少于2%、少于1%或少于0.5%。在一个实施方案中，硝化反应可以;Wt进行。在一个实施方案中，"大^t莫"是指^J^至少lg的式2化合物，例如佳月至少2g、至少5g、至少10g、至少25g、至少50g、至少100g、至少500g、至少lkg、至少5kg、至少10&、至少25kg、至少501^或至少100kg。在一个实施方案中，还原形式为至少一种式4化合物或其盐在一个实施方案中，(1))中的另外的^1包4紐原中间体。在另一个实施方案中，所i^法还包括iW^^的中间体。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化^或其药学上可接受的盐的方法其中R为氢；R2为叔丁基；R为-NR3R4，其中R3为甲^iLR4为曱基，且n为l，该方法包括(a)^^少一种硝化试剂与至少一种式2化^4勿或其M应以制备包含中间体的^Jl';^^;和(b)使中间^ii一步纽，形成至少一种式14^^勿。在一个实施方案中，中间体没有^M^^^中分离。在一个实施方案中，至少一种式1化合物为替加环素。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的其中I^和R2均独立选自氢、直,支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R,和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直M^支钩d画C4)絲；n为l-4，该方法包括(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其M应盐的方法:产生浆状物；和(bM錄状物进一步^，形成至少一种式M^4勿。在一个实施方案中，&为氢；Rz为叔丁基；R为-NR3R4，其中R3为甲l^iLR4为曱基；并且n为l。在另一个实施方案中，至少一种式1化合物为替加环素。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式3化合物或其盐的方法其中R为-NR3Rj，其中R3和Rj均独立选自氢以;SjlM^支钩CrC4);^，该方法包括使至少一种硝化试剂与至少一种式2化^或其M应其中所iiA应在5-15。C温度下进行。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化洽物或其药学上可接受的盐的方法其中Ri和R2均独立选自氢、直,支钩CrC6)烷基以及环烷基，或者R;和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直M^支钩d-C4):^;且n为l-4，所ii^r法包括(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐^JS，产生含有中间体的^Jl';^^勿；和(b)使中间^i^一步纽形成至少一种式1^^/0其中(a)中的M在545'C温度下进行。在一个实施方案中，Ri为氢，R2为叔丁基，R3为甲基，Rt为甲基，且n为其中R=-NRsRp其中R3和R4均独立选自氢以及直旨支钩d-C4)烷基，该方法包括^j^少一种ii^试剂与A^';^^(例如M^^的浆状物)^^，所^ji^^4勿包含由至少一种硝化试剂和至少一种式24^^勿或其盐的^JI制备的中间个实施方案公开了制备至少一种式4化^b或其盐的方法:，所#法描述了"一锅法"工艺，其中在不^^^V^f勿中分离硝化产物的情况下，直接进行硝化和i^^步骤。在一个实施方案中，R为氢，R2为叔丁基，R3为曱基，R4为曱基，且n为本i^斤用"i^f、试剂"是指能够向4^^中引入氢的化学试剂。在一个实施方案中，还原试剂为氢。所述ii^反应可以在氢气气氛下，在由本领域技术人员确定的适当压力下进-f亍。在一个实施方案中，以1-75psi的压力例如1-50psi的压力或1-40psi的压力《^供氢。在另一个实施方案中，i^f、试剂在至少一种催化剂存在下提供。示例性催化剂包括但不限于稀土金属氧化物、含有第vm族金属的催化剂和含有第vm族金属催化剂的盐。含有第vm;jl^r属的催化剂的实例为4巴，例如钇炭。当催化剂为钇炭时，在一个实施方案中，催化剂的量相当于至少一种式2化^;(与至少一种贿化试剂M之前存在的)的量的0.1份至1份。在一个实施方案中，中间体为至少一种式34^4勿。在一个实施方案中，在式3^^中，R!为氢，R2为叔丁基，R3为曱基，R4为曱基，且n为l。^4页域技^A员可以确定ii^^的适当溶剂。在一个实施方案中，在"給之前，例如进^^f、A^之前，将^^^物与含有至少一种(d-C8)醇的溶剂混合。上i^少一种(CrCs)醇可以选自例如曱醇和乙醇。^2M页域技"员可以确定^^^的适当温度。在一个实施方案中，进行所述"^(例:W^f、)的温度为0-50。C，例如20-40。C或者26-28。C。在一个实施方案中，在所述;^^后(例:ft^f^JI后)，将得到的^、;^^4勿加至溶剂系统或与溶剂系统';^^，所it^剂系统含有(d-C8)支链醇和(d-C8)烃。在一个实施方案中，(d-Cs)支链醇为异丙醇。在一个实施方案中，(d-Cs)烃选自己烷、^i^辛烷。在一个实施方案中，在所述》'^^后(例:fta^^反应后)，将得到的^^^物在0-50。C(例如0-10。C)温度下加至溶剂系统。在一个实施方案中，所述方法另外包括将为固体或固体组合物的至少一种式4化M分离。在一个实施方案中，至少一种式4化合物以盐(例如本文中所述的^^f可盐)形式^L淀或分离。在一个实施方案中，固体组^4勿包含式4的Cr差向异构体，通过高效液相色谱测定，该差向异构体的量小于10%。在另一个实施方案中，C4-差向异构体的量小于5%、小于3%、小于2%、小于1%或者小于0.5%。在一个实施方案中，固体组#含有少于2%例如少于1%或少于0.5%的至少一种式2化合物，该量采用高效^f目色语测定。在一个实施方案中，i^^纽可以^Ml;W^进行。在一个实施方案中，"大^!^莫"是指使用至少lg式2化^^,例如使用至少2g、至少5g、至少10g、至少25g、至少50g、至少100g、至少500g、至少lkg、至少5kg、至少10kg、至少25kg、至少50kg或至少100kg。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化^/或其药学上可接受的盐的方法其中R!和R2均独立选自氢、直,支钩CVC6)烷基以及环烷基，或者&和Rz与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rt均独立选自氢以及直旨支钩d-C4)錄；且n为l-4，所^"法包括(a)使至少一种ii^试剂与^J^';a^(例如M';^^物的浆状物)混合，所述^;^^4勿含有至少一种硝化试剂与至少一种式2化r^4勿或其盐反应而制备的中间体<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>形成第二冲中间体；和(b)^^^Jl^^的中的第4中间_—步瓦应，制备至少一种式1^^4勿。在一个实施方案中，Ri为氩，R2为叔丁基，R3为甲基，R4为曱基，且n为1。在一个实施方案中，中间体为至少一种式3化洽物或其盐，第二种中间体为至少一种式4化合物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>在一个实施方案中，(b)中进一步纽包括i^f匕第4中间体。在一个实施方案中，在i^^^前，第4中间体可以以盐形式沉淀或分离。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式4化^4勿或其盐的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>其中R=-NRsRt,其中R3和R4均独立选自氢以及直H^支钩CH:4):^，所ii^r法包括将式3中间体或其盐还原在一个实施方案中，式3中间体可以存在于^J^^^的浆状物中。在一个实施方案中，所i^^包括将至少一种i^f、试剂与纽"^^混合。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的其中R!和R2均独立选自氢、直^支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N—^^形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rj均独立选自氢以^JL,支钩C广Cj)絲；且n为l画4，所ii^r法包才舌(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化洽物或其盐反应，制备^';^^物(b)无需U^;^^^中分离或沉淀^f可固体，将至少一种:^^试剂与^S混*^^以制备中间体；和(c)由所述中间体制备至少一种式1化合称。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法:盐的方法:其中Ri和R2均独立选自氢、直,支钩CrC6)烷基以及环烷基，或者R!和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直^支钩d-C4)絲；且n为l-4，所ii^法包括(a)在氢^4在下，将至少一种含有第vm族金属的催化剂与^i';^^4勿(例如^ji';^^物的浆状物)^^，所ii^ja^物由至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐的反应制备在一个实施方案中，所述至少一种含有第vm族金属的催化剂的j^目当于至少一种式2^^4勿(与至少一种硝化试剂^JI之前存在的)的量的0.1份至1份。本文公开的另一个实施方案为组合物，该组^4勿包含至少一种式4化合物或其盐其中R为-NR3R4,其中R3和R4均独立选自氢以及直^支钩CrC4);^，其中经高效、;^目色语测定，式4的CV差向异构^^在的量少于10%。在一个实施方案中，Ri为氢，R2为叔丁基，R3为甲基，R4为曱基，且n为本文公开的一个实施方案提供了制备至少一种式1化^4勿或其药学上可接受的盐的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中Ri和R2均独立选自氢、直,支钩CrC6)烷基以及环^4(例如(C3-C6)环^ft)，或者Ri和R2与N—起形成杂环，例如5-元环；R为-NR3R4，其中R3和Rt均独立选自氢以及直,支钩d-C4):^;且n为1-4，所述方法包括使至少一种式4化合物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>与至少一种氨itl^^4勿在jMl介质中反应。在一个实施方案中，M介质可以选自含7jc介质，并且如果不存在试剂碱时，还^^择至少一种减H^剂。在一个实施方案中，制备式I^^物的方法为制备替加环素或其药学上可接受的盐的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>在一个实施方案中，变量n为l，Ri为氢，R2为叔丁基，R3和R4各自均为甲基。在另一个实施方案中，变量n为l,R!和R2与N—起形成P比咯烷基，R3和R4各自均为甲基。至少一种式44t^4勿的盐可以是卣化盐，例如盐雖。所ii^介质可以是选自极性非质子溶剂或其溶剂^^4勿。在一个实施方案中，极性非质子溶剂选自乙腈、l二二曱錄乙烷、二曱基乙舰、二曱基甲酰胺、六曱基磷驗、NW二曱基乙烯脲、N，N，-二曱基丙烯脲、二氯曱烷、N-甲替加环素基P比咯烷酮、四氬吹喃以及它们的混合物。在另一个实施方案中，极性非质子溶剂选自乙腈、二甲基甲it^、NW-二甲基丙烯脲、N-甲基p比咯烷酮、四氢吹喃以及它们的^^。至少一种碱性溶剂可以是乙腈和NW-二曱基丙烯脲的^^物。在另一个实施方案中，至少一种碱'It^剂可以是7JC和N^，-二甲基丙烯脲的';^^。在另一个实施方案中，至少一种碱性溶剂为N^N，-二曱基丙烯脲。M介质可以是含7jc介质。在另外一个实施方案中，至少一种不含碱的碱性溶剂为不含碱的7K。在另一个实施方案中，纽介质可以是不賴剂碱的至少一种碱性溶剂。碱^^剂为能够接受(部分或者4^)质子的溶剂。试剂^lL指在反应开始时与至少一种式4化合物和至少一种氨iti^^物同时或者顺序加入的碱，并能够接受(部分或者4^P)质子。试剂^i可以指纽过程中加入的碱。至少一种氨sti^^4勿可以选自氨g卤化物、氨iti^,^^的氨i^酸酐。在一个实施方案中，氨^^f^物为至少一种式6的氨酰基卣化物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>6其中Ri和R2均独立选自氢、直^支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N—^形成杂环；n为l-4;且其中Q为选自氟、溴、氯和碘的卣素。在另一个实施方案中，Q为氯。式64^4勿的盐可以选自卤化盐。卣化盐指通过与卣素阴离子相互作用形成的任何盐，例如盐酸盐、氩溴酸盐和氢碟酸盐。在一个实施方案中，卣化盐为盐酸盐。至少一种式6的氨酰基卤化物可以通过下列方法获得，该方法包括AyfU少一种式7的酯或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>7与至少一种^iR2NH)反应，制名^至少一种羧酸，其中R]l和R2均独立选自氢、直,支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R!和R2与N—起形成杂环；X为选自溴、氯、氟和硤的离素；A为-OR6，其中选自直M^支钩CrC6)^^芳絲，例如芳^(d-C6)絲，例如，其中芳基为苯基；n为1-4;和B)使至少一种羧酸与至少一种氯化试剂反应，得到至少一种式6的氨it4化合物或其盐。在一个实施方案中，R和R6均可以为叔丁基。在另一个实施方案中，&和R2与N—起可以形成杂环，例如他咯烷；R6可以是芳烷基，例如千基。在另一个实施方案中，n为l。在另一个实施方案中，X为溴。在另一个实施方案中，至少一种式7的酯为盐酸盐。与式7的酯相比过量的胺R!R2NH可以存在于反应物中，以制备至少一种羧酸。在一个实施方案中，至少一种氯化试剂为亚》氯。在另一个实施方案中，至少一种羧酸与至少一种氯化试剂的纽包括加入催化量的二甲基甲,。与至少一种羧酸相比过量的氯化试剂可以存在于反应物中，以得到至少一种式6的氨StJ^^物。当&为芳烷基时，与至少一种胺^l后，至少一种式74^^的芳^^可以通过氢化雜以4寻到至少一种m。至少一种羧酸与氯化试剂的反应可以在55。C-85。C(例如80。C-85。C、更例如55。C)的温度下进行。在一个实施方案中，可以加入另外量的氯化试剂以助于^完全，例如使#^^1度小于4%。至少一种羧酸与至少一种氯化试剂^完成后，将得到的混悬液&虑以除去盐，例:i(喊丁胺盐go式6的氨it^卤化物可以以HC1盐分离，或者采用无机斷例如盐酸)处理以制备氨g卣化物的盐。在另一个实施方案中，至少一种式6的氨it4卣化物可以通过下面方法获得，该方法包括使至少一种式8的J^酸或其盐8其中Rs选自直絲支钩d-C6)烷基，且n为1-4，与至少一种氣化试剂反应，得到至少一种式6的蕃4^卣化物或其盐。在另一个实施方案中，至少一种式8的羧酸为卤化盐，例如盐酸盐。至少一种式84^4勿与至少一种氯化试剂的反应时间可以为1-50小时，例如2-45小时、更例如1-3小时。至少一种式8的羧酸的粒子大小小于150賴米，例如小于110微米、更例如50-100微米。具有指定粒子大小的式8化合物可以通过研磨该^^物获得。至少一种式4化合物与至少一种氨^4^^^的反应可以在0。C-30。C的温度下进行，例如20。C-25。C、例如10。C-17。C、例如0。C-6。C、更例如2。C-8。C。所M应的时间可以为1-24小时，例如0.5~4小时、更例如2-8小时。在反应中可以^^)相对于式4化合物的量为过量的氨itJ^^物。在一个实施方案中，该过量可以是3当量的氨iti^^对l当量的至少一种式4^^4勿。在另一个实施方案中，含水介质与至少一种式44^物的比例可以是6:lw/w或5:1(似、比)。在一个实施方案中，将氨^J^^4勿加AiU給到至少一种式4^f^4勿的含水溶液中。在一个实施方案中，当M介质为含水介质时，含水介质的pH可以调节至pH4-9，例如5-7.5、例如6.3-6.7、例如7.0-7.5、更例如6.5、"口例如7.2。在调节pH1tT以加X7JC。调节pH可以涉Wj加A/喊，包括但不限于氢氧化铵。氢氧化铵的浓度可以为25。/。-30%。在另一个实施方案中，可以佳月斷例如盐酸)调节pH。在pH调节期间A^I介质的温度可以为-5。C-25。C，例如5。C-8。C，更例如0。C-5。C。调节pH后，可以将至少一种有才/L^剂或溶剂';^^加至含7]C介质中。在一个实施方案中，所述至少一种有才/l^剂;;^^物可以包含曱醇和二氯甲烷。甲醇的^1可以为5%-30%，包括^限于20%-30%。在另一个实施方案中，至少一种有4;i^剂或溶剂';^^包含四氢呔喃。';^^的温;l可以为i5°c-25°c。在一个实施方案中，含7K介质可以用至少一种极,^^子溶剂和至少一种极性非质子溶剂的混^进行萃取。在一个实施方案中，所述至少一种极性非质子溶剂包括二氯甲烷，所^少一种极'歸子溶剂包括甲醇。在另一个实施方案中，含7K介质可以用至少一种极性非质子溶剂例如二氯曱烷萃取。该萃取可以在-5。C至25。C(更例如在0。C-5。C)的温度下进行。在另一个实施方案中，每次萃:^，可以^^水介质的pH调节至7.0-7.5,例如7.2。萃:fiUt程可以重复进行，例如，最多至IO次。在一个实施方案中，合并的有枳岸^^可以用干燥剂例如石;!L^钠处理。有机萃^^也可以采用活性炭例如NoritCA-l处理。通过it^虑除去固^f寻到溶液。在一个实施方案中，可以将该溶^得到式1化合物。自所iiA^获得的式i化合物可以在至少一种有才;i^剂或溶剂〉v^物中结晶。在一个实施方案中，有机溶剂^^包含曱醇和二氯曱烷。结晶可以例如在-15。C至155。C进行，例如0。C陽15。C，更例如2。C-5。C。在另一个实施方案中，萃取后，得到的至少一种极性质子溶剂和至少一种极性非质子溶剂的有机';^^物可以经,得到浆状物，将其&虑得到至少一种式1^S^。^ijl和i^虑可以例如在0。C-5。C进行。制备式l化^4勿的方法可以^^]大于5g的式4胺进行，例如大于10g、例如大于50g、例如大于100g、例如大于500g、例如大于1kg、更例如大于10kg。一个实施方案公开了通狄i^斤述的贿方法制备的4^4勿，包括但不限于式1化合物、式4化合物、式6化合物、式7化合物、式8化合物以及它们的盐。另一个实施方案包括含有通it^i^斤述的任何方法制备的^^物的组合物。该组合物可以另外包含药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述组合物可以包含至少一种式1化洽物或其药学上可接受的盐其中n为l,Ri和R2与N—起形成叔丁基，R3和Rt均为甲基。在另一个实施方案中，所述组合物可以含有至少一种式l化合物或其药学上可接受的盐，并Jii含有少于0.5%的至少一种式1化^或其药学上可接受的盐的C-4差向异构体其中Ri和R2均独立选自氢、直,支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N^形成杂环；R为-NR3R4,其中R3和R4均独立选自氢以及直^支钩CrC0;^;且n为l-4。在另一个实施方案中，所述组合物可以含有替加环素或其药学上可接受的盐以及少于0.5%的替加环素或其药学上可接受的盐的C-4差向异构体在一个实施方案中，通it^文所述《封可方法制备的式1化^含有经高效液相色谱测定的少于10.0%的杂质，例如少于5%的杂质、例如少于2%的杂质、更例如1-1.4%的杂质。在另一个实施方案中，式1化^4勿含有经高效'^目色语测定的少于1.0。/。的Cr差向异构体，例如少于0.5%的CV差向异构体、更例如少于0.2%的O差向异构体。在一个实施方案中，式M^4勿含有经高效';M目色i普测定的少于1%的米诺环素，例如少于0.6%的米诺环素。在另一个实施方案中，式1化#含有少于5%的二氯甲烷，例如少于2-3%的二氯曱烷。本发明的一个实施方案包M，J备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中I^和R2均独立选自氢、直M^支钩CrC6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rj均独立选自氢以及直#支钩d-C4);^;且n为l-4，所ii^r法包括A)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其ife^应替加环素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>制^^有至少一种式3化合物或其盐的^J^^4勿浆状物:式3B)将至少一种i^f、试剂与上^^';^^浆状物混合以制备至少一种式4化合物或其盐和Q使至少一种式4化合物与至少一种氨St^ft^^在^I介质中反应，所述^J^介质选自含7K介质和至少一种无试剂碱的碱'^^剂。通过该方法制备的式I化合物可以是替加环素。本发明的另一个实施方案包^^备至少一种式1化合物或其药学上可接受的式l其中Ri和R2均独立选自氢、直旨支钩CrC6)烷基以及环烷基，或者Ri和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直旨支钩d國C4);^;且n为l-4，盐的方法:所粉法包括A)^^少一种i^^试剂与^I';^^浆状物〉V^，所i^状物^"有至少一种式34^物或其盐和B)使至少一种式4化合物与至少一种氨iti^^在^JI介质中反应，所述^JI介质选自含7K介质和至少一种无试剂碱的碱性溶剂。在另一个实施方案中，通iUi^法制备的式I化合物可以是替加环素。本发明的一个实施方案提供了纯化至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中Ri和R2均独立选自氢、直,支H(d-C6)烷基以及环烷基，或者Rr和R2与N—^i形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rj均独立选自氢以及ii^支钩d-C4)絲；且n为l國4，所^r法包括A)^^少一种式i化合物与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶制^^至少一种式4化合物或其盐剂混合得到第一种混合物，B)将第一种混合物在0。C-40。C的温度下混合至少15分钟-2小时，和C)得到至少一种式1混合。如本文所用，术语"得到"是指以有价值的纯度水平分离得到混合物，所m度7JC平包括f旦不限于大于90。/Q、95%、96%、97%、98。/。和99。/。的纯度7JC平。所iii^度7K平可以通过高效液相色谱侧定。在一个实施方案中，纯化至少一种式1化合物的方法包括下列步骤A)使至少一种式1化合物与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂混合得到第一种混合物，B)将第一种混合物在30。C-4(TC混合一段时间，C)将第一种混合物冷却至15。C-25°C,使该混合物静置(不再混合)第二歐时间，D)将第一种混合物冷却至0°C-6°C,使该混合物静置(不再^^)第三段时间，E)得到至少一种式混合物。在一个实施方案中，该方法包括至少一种式1化^吻，其中n为l,Ri为氢，R2为叔丁基，R3和R4均为甲基。另一个实施方案包括至少一种式H^^勿，其中n为l，！^和R2与N—起形成p比咯烷基，R3和R4均为甲基。与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂混合的至少一种式1化合物可以以选自固体、浆状物、》'昆悬^溶液的形i^^供。在一个实施方案中，至少一种极性非质子溶剂可以选自丙酮、1^2-二氯乙烷、乙酸曱酯、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、二氯曱紗乙酸乙S旨。在另一个实施方案中，至少一种极性非质子溶剂可以选自丙酮和二氯曱烷。在另一个实施方案中，至少一种极性质子溶剂可以选自甲醇、乙醇、异丙醇^k丁醇。在另一个实施方案中，至少一种极性质子溶剂可以是甲醇。至少一种极性非质子溶剂和至少一种极'l^t子溶剂的组合可以包含丙酮和甲醇。另一个实施方案提供了至少一种极性非质子溶剂(二氯曱烷)和至少一种极性质子溶剂(曱醇)的组合。在另一个实施方案中，至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂的组合可以包含乙酸甲酯和曱醇。式1化洽物可以例如与等体积的至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂混合。在一个实施方案中，第一种^^f勿可以例如^^第一段时间(30^#N2小时)，同时温度为15。C-25'C，然后混合第二险时间(30^^-2小时)，同时温度为0。C-2°C。在一个实施方案中，第一段时间和第二歐时间均为1小时。在另一个实施方案中，该方法可以包括将第一种"^物于15。C-25。C混合至少30^4中-2小时，然后将第一种^^i^應游到固体。该方法可以另外包括将上述固体与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂(例如等^P、)在15。C-25。C温度下^^第一段时间(30分钟-2小时)，过滤以得到第二种固体。在另一个实施方案中，这些^^it^虑步骤可以重复2-15次。用于纯化式1化洽物的方法可以另外包括由第一种》V^4勿获得固体，将该固体与至少一种极'^t子溶剂和至少一种极性非质子溶剂混合以获得第^H1^^物。第J^t';^^物可以例如包含甲醇和二氯甲烷，其甲醇:二氯甲烷的体积比为1:5-1:15。在一个实施方案中，第4^^物可以在30。C-36。C的温度下混合，然后itid以获得溶液。在另一个实施方案中，溶液中极'f錄子溶剂的^l可以^f氐至低于5%的7片平，该溶液可以例如在0°C-6°C的温度下';^^—段时间(例如30彿2小时)，然后雌。在一个实施方案中，可以将第一种混M混合10-20分钟，例如15分钟。在一个实施方案中，将第一种^^/冷却至15。C-25。C,将该^^物可以静置(不混合)第二险时间(30分钟-3小时，例如1小时-2小时)。将第一种';^^进一步^H卩至0。C-6。C，将其静置(不';^^)第三段时间(30^4中-2小时，例如l小时)。获得式1化r^可以包Mit^少一种选自减少热原的滤器和^^清it^虑器的滤器过滤本i^斤述的^f可^^。如本文所乂^f,可以采用才械';t^i殳^例如搅拌器或搅拌机)进行^^。^給也可以受到式1^^4勿在溶剂系统中的溶觯性的影响。提高温度可以增加溶解性。在一个实施方案中，当至少一种式1化合物与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极4錄子溶剂混合时，该至少一种式14^物可以以其药学上可接受的盐的形式使用。当至少一种式i化^4勿作为本发明方法的产物获得时，则该至少一种式1化合物可以以其药学上可接受的盐的形式回收。在另一个实施方案中，当式M^4勿通it^发明的方法获得时，可以通b口入酸将该4^4勿转化为其药学上可接受的盐。带正点残基的延伸处(Ma,Y"Henderson,H.E.,Liu，M,S"Zhang,H.，Forsythe,I.J.,Clarke-Lewis,I.，Hayden,M.R.，andBrunzell,J.D.J.LipidRes.35,2049-2059)。已经报道了编码人胰酯酶、肝酯酶和脂蛋白酯酶的基因序列(分别是GenBank序号弁M93285、#J03540和tfM15856)。人肝酯酶和胰酯酶的信使RNAs分别大约是1.7和1.8千碱基长。人脂蛋白酯酶基因产生3.6和3.2千碱基的2个mRNA转录本。(Ranganathan，G"Ong,J.M"Yukht，A"Saghizadeh，M.,Simsolo，R.B.,Pauer,A.,andKern,P.A.(1995)J.Biol.Chem.270,7149-7155)。影响酯酶活性的化合物本发明涉及通式(I)的化合物及其衍生物(包括但不局限于多晶型物、异构体和前体药物、其几何或光学异构体)，以及这些化合物的药学可接受的酯、醚和氨基甲酸酯，其所有的溶剂化物和水合物及其所有的盐，其中《4和R2分别独立选自如下构成的组氢、(Vd3烷基、d-C2o卤代垸基、C2-d3烯基、C2-d3炔基、C4-C6环烷基、CrC6环烯基、Crd3烷氧基烷基、d-Cs垸基环烷基、CrCV烷基环烯基、Crd3烷氨基、Crd3芳氨基、C(0)d-C6垸基、0-C(0)CrC6垸基、杂环烷基、芳基、垸芳基、C(O)芳基和O-C(O)芳基；其中每一个上述基团可以任选具有l-6个独立选自氢、卤素、硝基、氨基、氰基、异氰基、硫代、d-C6垸基、环烷基、芳基、烷氧基和芳氧基基团的取代基团。然而，本发明的R,和R2不是甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、苯基和羟基。在另一个具体实施方式中，本发明涉及通式(II)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>式l其中n为l,Ri为氢，R2为叔丁基，且R3和R4均为甲基。本发明的一个实施方案包4绅J备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中Ri和R2均独立选自氢、直旨支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者Ri和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rt均独立选自氢以及直#支钩C广C4)絲；且n为l-4，所ii^r法包括A)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>式2以制备^^^^f勿(例如M^^浆状物)，该^^^4勿包含中间体，例如至少一种式3化合物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>式3Byf经少一种^f、试剂与所ii^';^4勿浆状物';^^以制备第^中间体，例如至少一种式4〗^物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>cM嫂^t中间体与至少一种氨^&^^勿在^i介质中瓦虔以获得至少一种式l化合物。在一个实施方案中，所ii^Ji介质选自含7K介质和至少一种无试剂碱的碱'I^^剂。另外的步骤可以包括例如至少下列步骤之一D)使至少一种式1化合物与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂^^以得到第一种^^4勿，E)将第一种〉V^4勿在如0°C-40°C的温度下';^^至少一段时间，例如15分钟-2小时，和F)得到至少一种式1化合物。在一个实施方案中，可以将所公开的方法的任何中间体分离或者^定出来。在另一个实施方案中，所公开的^f可方法的两步或更多步骤为"H本发明的另一个实施方案包^^备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中Ri和R2均独立选自氢、直旨支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rj均独立选自氩以及直旨支M(d-C4);^;且n为l-4，所ii^"法包括A)^J^少一种i^^试剂与M^^4勿(例如^i^^4勿浆状物)';^^，所述混^4勿^^有至少一种式3化合物或其盐式3以制备至少一种中间体，例如式4^^或其盐:B)使该中间体与至少一种氨itj^^在选自含7jC介质的^jS介质中反应，获得式1^^。在一个实施方案中，^JS介质可以选自至少一种无试剂碱的碱性溶剂。另外的步骤可以包括例如至少下列步骤之一C)使至少一种式1化合物与至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂^^以得到第一种^^^，D)将第一种:^^4勿在例如0°C-40°C的温度下';^^至少一段时间，例如15分钟-2小时，并且E)^寻到至少一种式14^4勿。本发明的另外的实施方案包M，J备至少一种式1化M或其药学上可接受的盐的方法式l其中R!和R2均独立选自氢、直,支钩CrC6)烷基以及环烷基，或者Rj和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氩以及直#支钩d-C4)g;且n为l-4，所3^法包括A)使至少一种式4化合物或其盐在一个实施方案中，式3中间体可以存在于^J^^^的浆状物中。在一个实施方案中，所i^^包括将至少一种i^f、试剂与纽"^^混合。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的其中R!和R2均独立选自氢、直^支钩d-C6)烷基以及环烷基，或者R和R2与N—^^形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和Rj均独立选自氢以^JL,支钩C广Cj)絲；且n为l画4，所ii^r法包才舌(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化洽物或其盐反应，制备^';^^物(b)无需U^;^^^中分离或沉淀^f可固体，将至少一种:^^试剂与^S混*^^以制备中间体；和(c)由所述中间体制备至少一种式1化合称。本文公开的另一个实施方案为制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法:盐的方法:作为非限定性实例，替加环素可以^i^与一种或多种药学上可接受的赋形剂';a^，并且可以以下列形式口月峰药片剂、胶嚢、可^lt散剂、颗粒剂或含有例如约0.05-5%助悬剂的混悬剂、含有例如约10-50%蔗糖的糖浆剂、含有例如约20-50%乙醇的酏剂等；或者以无菌溶液剂或混悬剂的形式肠胃外给药，所述混悬剂在等'^h质中并含有约0.05-5%的助悬剂。这些药物制剂可以含有例如约25%至约90%的活性成分以及载体，更通常含有约5%至60%(重量)的活性成分。其它制剂在美国专利号5494903和5529990中进行了讨论，其内#此引入作为参考。术语"药学上可接受的盐"是指本发明^^勿的船口成盐或*口成盐。药学上可接受的盐为能够###^^勿活性并且不会对患者产生任何有害或不需，用的任啊盐，所述患者为给予上述盐的以;^上下文中提到的给予上述盐的患者。药学上可接受的盐包括金属复合物以;sj^A^有机酸的盐。药学上可接受的盐包括金属盐，例如铝盐、钙盐、牵組、做、锰盐;sj^合盐。药学上可接受的盐包括紗，例如乙離、天冬氨舰、^^MJk、芳基^UL、axetil、辆酸盐、苯甲酸盐、碳敏盐、硫舰盐、酒石經盐、丁酸盐、舰酸4丐、樟脑^Ul、碳錄、氯條曱錄、cilexetil、柠^UL、絲啦、edisylic、estolic、曱舰盐、esylic、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖離(gluceptic)、葡糖酸盐、錄啦、羟乙雌、羟乙ife^^l^^J申妙、环乙^Jt、hexylresorcinoic、hydrabamic、氢溴酸盐、盐酸盐、氢硖酸盐、羟基萘甲酸盐、羟乙基^M盐、乳、孝l4t雖、马来雖、苹果缝、丙二^Jt、扁桃雜、曱^^t^L、曱基硝^(methylnitric)、甲^^L^ilL(methylsulfuric)、粘啦、粘康舰、^t^盐(napsylic)、硝醋、草雖、对-硝基曱磺舰、朴缝、泛醋、磷舰、磷緣盐、磷酸二氬盐、邻仁甲缝、聚半孝UI醛醋(polygalactouronic)、丙亂7械舰、鄉亂琥珀缝、^4離、对^J^t缝、^Hl、石诚盐、鞣酸盐、酒石酸盐、teodic、甲^t^盐等。药学上可接受的盐可以衍生自^J^，包括但不限于半皿酸。其它可接受盐可以在例如Stahl等人药用盐小:i^、^4#^用ii:(PharmaceuticalSalts:Properties,Selection,andUse),Wiley-VCH;第一;&(2002年6月15曰)中找到。除非在实施例中以及另外特别说明处，在本说明书和权利要求中^U的所有数字均应理解为在所有情况中被术语"约，，^^。因此，除非特别说明，本说明书和附加的权利要求中给出的数字^lt均为近似值，它们可以才娥本发明所寻求获得的所需'^t而变化。^-"个数字l^该按照有效数字的位数以及常M^似方法解释，但至少，不应当限制与权利要求等同原则(doctrine)范围内的实施。尽管《^:了本发明宽范围的数值范围和*;近似值，但是，在M实施例中给出的数值却尽可^Br确W战。然而，^f可数值内^^含有由各实^;则定中出现的标准差所不可i^地导致的误差。下列实施例以非限制性方式阐述本发明。实施例硝化才娥美国专利3226436公开的方法制备米诺环素。在下列M下进行HPLC分析:柱InertsilODS35nm，25x0.46cm流动相80%A+20%B,其中A=90%(0.05MKH2P04+5mL三乙胺/L磷缝+H3P04,至pH6)/10。/o乙腈，用H3P04调节至pH3.06=乙腈1.0mIVmin检测250nm比较实施例l:9-硝^j^M若环素的制备该实施例描述了米诺环素的^f^Mi，其中硝化产物进行了分离。将13.44g的米诺环素对-li^^ilL(即[4S"(4a，12aa)國4，7國X^二曱狄基)画1，4，43，553，6，11，123-八|^3，10，12，123画四羟基-1，11画二氧^^2-并四苯甲1^对-H^t^L)在搅拌下緩ft^口至50mL^^滅中。将溶液^P至0-15。C。緩,A^斷90。/。，0.6mL)，将该溶液于0-15。C撒泮1-2小时，直到用HPLC测M应完成。#^有中间体9-硝^M若环素辨^iL(即[4S"(4a，12aa)-9-硝基-4，7-^(二甲J^4)-l，4,4a，5，5a，6，ll,12a-八ilr3，10,12，12a國四羟基-l，ll曙二li/Rr2-并四苯甲酰胺石MjL)的溶^W^半下于20^^中内4^多至300g的水和水中。用28%氢氧化铵7jC溶液将M物的pH调节至5.0-5.5，同时##^显度在0-8匸。滤出沉淀并用7K洗、/^(2xl0mL)。将固体在氮气流下真空干燥，得到9g9-硝^M若环素硫魁粗品。HPLC分析(面积°/。)显示纯度为90%，含有C4-差向异构体的量为1.5%。MS(FAB):m/z503(M+H)，502(M+)。在其等电点处通i^冗淀^y^K溶液中分离产物。粗品石皿盐的摩尔收率为45%。下面表1列出了其它硝化方法的数据表l<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>可以看到9-硝^M若环素的分离导致产生较高量的杂质。比较实施例2:9-硝^j^M若环素的制备本实施例描述了米诺环素的硝化，其中硝化产物进行了分离。将2-L多颈玻璃^f樣配J^M^拌器、热电偶、液体添加导管、氮气管、通向30。/0(wt)苛'l"械洗涤塔的排气管。向烧瓶中加入石滅66°Be(1507g，819mL,15mol)。将溶液^H卩至0-2。C。在0.7小时内于0-14。C将米诺环素.HCl(效价92.7。/。，311&0.5811101)在^#下加至上述石爐中。加完后，将';^^于0°(:"^#0.5小时获得黄色溶液。3小时内加A^'^(硝酸根衬95.9%,48g，32mL，0.73mol，1.25摩尔当量)，同时将';^^4勿^^在o-2。c。将';^^于o。c^^半o,3小时(暗红色/黑色溶液)。HPLC分析(面积％)显示0%米诺环素、75.6%9-硝l^M若环素、8.2。/o最大量的单个杂质(LSI);相对米诺环素的保留时间(RRT^2.08。将22-L多颈玻璃烧g配Ji4M^搅拌器、热电偶以及带有氮气保护的冷凝器。向烧瓶中加入6704g(8540mL)异丙醇(IPA)和1026g(1500mL)庚烷。然后将该溶液冷却至0-5°C。将9-硝^ift诺环素^I:^^4勿在2小时内于0-39。C转移至所述22-L烧瓶，得到黄色浆状物。将该浆状物在34-39。CM橫2小时，然后^#至20-34。C并在20-34'C搅4半14.6小时。在20-25。C制备异丙醇3028g(3857mL)和^:660g(965mL)的溶液^^在该温度下(4:1，IPA:庚烷的体积比)。在真空及氮气保护条降下，将上ii^状物在30-cm直径的布氏漏斗上用sWWhatman滤纸过滤。将得到的湿滤饼#^多U配有才;i4^t^半器和氮气保护的4-L玻璃Erleiimeyer烧瓶中。于23-26°C，在0.5小时内通ii^口入1608mL上述制备的IPA/Jb^^液使滤饼成为浆状物。将该浆状物如上所述再次过滤。将湿滤附口上所述再成浆两次(共三次)。ft^一次过滤后，将滤饼在真空中于氮气保护下4械0.2小时。将产物在4(TC、23-11mmHg真空中干燥48小时，至干燥失重(LOD,80。C，1小时，〉49mmHg真空)值为1.54。得到的9-硝J^M若环素石i^it的重量为380.10g，HPLC强度=76.3%(以硫^11^计)，总杂质=34.6%，最大单个杂质(LSI)9.46。/o(RIOM).94)。米诺环素.HCl的收+=86%。经产物和原料的强度校正的收率=71%。可以看出分离9-硝^M若环素4^4勿使得产物含有较大百分比的杂质。实施例1下面表2中列出了采用比较实施例2中所駄法进行的硝化实验，其中下列变量可以修改:硝2^o入时间、M温度、贿酸的摩尔当量(相对于米诺环素HC1)、*^4>变。##本^^斤^^开的方法，这些反应均没有进行淬灭或进行产物分离。所用的^^一的^^斤工具是HPLC分析。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>=4.00%;单个杂质=0.35%;差向异构体^*=1.0%。强度=83.0%;总杂质=5.0%;单个杂质=2.7%;差向异构体^1:=1.1%。絲HPLC^^斤在下列M下i^f亍:柱InertsilODS35,，25x0.46cm流动相80%A+20%B，其中A=90%(0.05MKH2P04+5mL三乙胺/L磷雌+H3P04，至pH6)/10%乙腈，用H3P04调节至pH6.0B-乙腈1.0mL/min糊250nm实施例1本实施例描述了氢化AJl,其中没有分离9-硝lJM若环素中间体。将10.1g米诺环素对-t/fJ^^JlL在^^下緩lt^口至27mL^U克酸中。将该溶液^卩至0-2。C。緩ft^口A^肖^(0.6mL，卯。/0)，将该溶液于0-2。C^#1-2小时直到HPLC测狄应完成。硝化反应完成后，将舍有中间体9-硝^JM若环素硫酸盐的溶絲,下#^多至150mL异丙醇和1200mL甲醇中，同时^^显度低于10-15。C。在10o/。把炭催化剂(50。/o湿的)存在下将该溶液于26-28。C、40psi氬化3小时。氢化完貼，滤出催化剂，将溶液于0-5。C、^i^半下緩慢倒至250mL异丙醇中。过滤4寻到固体(3.4g)。HPLC测定粗品纯度(面积％)为卯％。Cr差向异构絲在的量为0.9%。MS(FAB):m/z473(M+H)，472(M+)。实施例2本实施例描述了氩^^应，其中没有分离9-硝^M若环素中间体。将84.3g米诺环素对-ll^^ilL在搅拌下緩'lt^口至368g浓硫酸中。将该溶液^H卩至10-15°C。緩十i^口A^斷6.0mL，发烟)。将溶液于10-15。C微1-2小时直到HPLC测^^示反应完成。硝^^应完成后，^^有中间体9-硝lJM若环素石,嫩盐的溶絲搅拌下转移至0.3Kg曱醇中，同时^^显度低于10-15。C。在10%钇炭催化剂(50%湿的)^在下将该溶液于26-28。(、50psi氢化2-3小时。氩化完話，滤出催化剂，将溶液于0-5。C、搅拌下緩l"曼倒入0.6kg异丙醇和0.3Kg正庚院中，滤出固体。将湿的固体于0-5。C溶于100g水中。将';^^,,分离并弃去有才M目。向7JCf目中加入14.4g浓HC1。用氢氧化糾溶液的pH调节至4.0土0.2。加入100mg硫酸钠，将该溶液用100mg的9"^J^M若环素种晶。将混合物于0-5。C撒J半4小时，将产物过滤肝燥得到28.5g固体。HPLC(面积％)测定的纯度为96.5%，含有0.9%的C4-差向异构体。MS(FAB):m/z473(M+H)，472(M+)。收率54.2%。比较实施例1本实施例描述了氢^^1，其中9-硝JjM若环素中间^i行了分离,(251kg"克酸66。Be中，搅拌以除去HC1。3小时20^4中内加入7.48kg硝酸，发烟100%(硝酸根^1:95.9%，1.26当量)。HPLC分析显示有>1%的米诺环素剩余。因此，加入031kg硝酸，，，100%(硝酸根^|:95.5%,0.05当量)。HPLC显示仍然有>1%的米诺环素剩余。再一;W口入0.74kg硝酸，飾100%(硝酸根^1:95.5%，0.12当量)。因为HPLC检测再次显示有>1%的米诺环素剩余，再一;i^口入l.llkg硝酸，发烟100%(硝酸根^*95.5%，0.19当量)，》^剩余<1%的米诺环素。将贿化纽"^4勿于0-36。C#^多至21.5份IPA/3.3份絲(1120kgIPA/171kg^^)的溶液中。过滤浆状物(it^虑时间较长)，用EPA/Jb院4:1洗涤，于NMT40。C干;^NMT的LOD为60/。，得到70.9kg的减皿(粗品收率97%),用于絲纽。实施例3本实施例描述了象/f版应，其中没有分离9-硝l^t诺环素中间体。将25.0米诺环素丑<:1(94.4%效价)于5-15。C加至100加仑絲中的7.3份(1831^"克酸66。Be中，搅拌以除去HC1。于9-15。C,在78^4中内向该^H中加入2.5015kg硝酸，85%(硝酸才艮衬86.6%，1.25当量)。HPLC分析显示有>1%的米诺环素剩余。再加入0.261kg硝酸，85%(硝酸根^t86.6%,0.13当量)。因为HPLC^^则再;i^示有〉P/o米诺环素剩余，再次加入0.261kg硝酸，85%(硝酸根^*86.6%，0.13当量)。HPLC^"测显示仍然有>1%米诺环素剩余，再;W口入0.174kg硝酸，85%(硝酸根^#86.6%,0.09当量)，jH^t在1.7%米诺环素原料剩余时，纽似乎iii'J平台。将硝化^J^V^物于-20至10。C转移至4.2斷106kg)甲醇中。将淬灭物调节至4-10。C，^i^f、反应中那才ff吏用。比较实施例2本实施例描述了氬化M，其中9-硝:i^M若环素中间^f皮分离。将104kg米诺环素.1:1(90.3%效价)于0-10。C加至300加仑錢中的4.8份(502kg)硫酸66。Be中，搅拌以除去HC1。于0-6。C、100rpm条件下，在3小时内加入15.2kg发烟硝斷100.4%，1.25当量)。HPLC#^显示有>1%的米诺环素剩余，再W口入0.69kg賴硝斷100.4%，0.06当量)，》^米诺环素<1%。于0-36。C将硝化〉V^4勿转移至21.5份IPA/3.3份絲的溶液中。i^虑浆状物(过滤时间较长)，用EPA/庚院4:1洗涤，于NMT40。C干;^NMT的LOD为6。/。，得到140kg硫缝(95。/o粗品收率)，用于还原反应。实施例4本实施例描述了氢化M，其中9-硝^M若环素中间体没有被分离。于5-15。C，将104米诺环素HCl(90。/o效价)加至7.3斷763kg)石嫩66°Be中，搅拌以除去HC1。于5-15。C、120rpm^f牛下，在1小时内力口入14.9kg发烟硝斷100%，1.25当量)。HPLC分析显示有>1%的米诺环素剩余，再;W口入0.69kg发烟硝斷1000/。，0.06当量)，jtb^，米诺环素<1%。于-10至-20。C，将硝化;^^4^多至4.2斷440kg)甲醇中。将淬灭物调节至4-10。C，如^^^中那才ff^。比较实施例3本实施例描述了氩^^1,其中9-硝^M若环素中间^f紛离。溶剂/试剂的比例是相对于硝化^JI之前最初时加入的米诺环素。t嫩实施例4的9-硝^&^诺环素石;W^JI^^物在2240kg(21.5份)异丙醇和342kg(3.3份)庚院中淬灭l小时，同时##^亥批';^^物的温度在0-36°〇。将得到的浆状物于30-36。C撒泮2小时，然后冷却并于19-25。C搅拌1小时。将一半的浆状物过滤，用3x205kgIPAA^(4:l)v/v洗涤，于NMT40。C干;^NMT的LOD为6。X)。i^虑和干燥花费16天(其中的7天，湿滤饼在按计划关闭设备期间在氮气中闲置)，得到58kg硫酸盐。另一半浆状物^橘中并冷冻直到可有效过滤。将其冷冻12天，然后再加至絲中并于0-6。C搅拌2天,然后调节至19-25°C,过滤，用3x205kgIPA/J^(4:l)v/v洗涤，于NMT40。C干;^NMT的LOD为6%。过滤肝絲费6天时间，得到82kg硫離。于19-25°C,将两批9-硝^M若环素石i^HL溶于672kg(6.5份)曱醇和8.4kg(0.08份)注射用7j<<USP)中，^JI70psig氢*2.74kg(0.026份艸巴炭(湿的，1C)o/o(w/w))将其^f、为9-tJ^M若环素石J^IL氢化>^需要10.5小时，致使没有可检测到的原料。将9-^J^诺环素石^^^:^綠i^虑以除去催化剂，于0-27。C在1660kg(16份)IPA/710(6.8份)庚烷的溶液中淬灭1小时。将得到的混^4勿调节至19画25。C并搅拌1小时。将9-feJ^M若环素石MjL浆状物在Nutsche滤器上过滤，用2x162kg(每次1.5份)EPA/Jb^(4:l)Wv洗涤，于40。C干;^LOD少于4%。过滤、洗、^p干絲费10天时间，得到94.0kg的9"^J^M若环素硫醋。it^虑后，在母液中观^到固体。将这些物质过滤，用113kglPA/M(4:l)v/v洗涤，于40。C干;^LOD少于4。/。。回收得到24.1kg,作为一单独批次^^"。自米诺环素得到的9-^J^t诺环素石皿盐的粗品总量收率为84%。将94.0kg"笫一批次"干燥的9"^J^i诺环素硫^ilL和0.084kg(0.0008份p克酸钠溶于538kg(5.17份)注射用7K(USP)中，^P至0-6。C。因为初始pH为1.16，所以需要0kg盐^(20。Be)将9-iJ^M若环素硫敝溶液的pH调节至1.1+/-0.1。将48.3kg(0.46份)盐酸试剂加至9-^J^t诺环素溶液中，形成9-tJjM若环素盐。将561^(0.54^)28%的氢氧化^^4.0kg(0.039^)盐酸试剂加至上iii^液，得到pH为4.0+/-0.2的批次。然后将该批次于0-6。C撒f半90分钟，同时1呆证卩11为4.0+/-0.2。最初的pH读数为4.05pH"^"立。将该批4Nutsche滤器上itE，用预冷却至2-8。C的2x33kg(每次(U份)注射用7jC(pH调节至4.0)洗涤，然后用2x26.1kg(0,25份)丙酮(预^HP至2-8。C)洗涤，于NMT40。C干:^NMT的湿度^J:为7.0。/0。分离得到43.2kg的9-^J^M若环素HC1，按米诺环素HC1计算的收率为40%。24.1kg"第4匕次吁燥的9-tJ^诺环素硫崎通过盐改变得到的)的处理方法与前面四个部分中所述的方法相似，同时使用比例量的试剂。回收得到的另外9.9kg的9-Hi^M若环素HC1，显示另外增加9.2%的收率。包括两批次的总批次收率为53.1%。实施例5本实施例描述了象/f版应，其中9-硝l^M若环素中间体没有被分离。溶剂/反应物的比例相对于硝化^I之前最初时加入的米诺环素。kg(4,2份)曱醇中，同时保"^i亥批次的温度在-20至-10。C，搅4f:4;l为130RPM.将淬灭糸匕次调节至4-10。C,用50psig氢气和52kg(0.5份"巴炭(湿的，10。/。(w/w))将其还原为9-tJjM若环素Am盐。该象/f^应需要5小时，结絲示无可检测的原料。将9"^J^诺环素硫^L^^^过滤以除^^化剂，在1241kg(12份)IPA/537kg(5.2份)庚烷的溶液中于17-23。C淬灭30分钟。然后将得到的"^4勿^HP至-18至-12'C并^4半1小时。将得到的9-iJjM若环素石t^t浆状物分成两份在Nutsche滤器上过滤，用预冷却至0-6。C的共3.6份IPA/庚^(2:l)v/v和5061^(4.9份)冷賊洗涤。两份过滤和洗涤需要99小时(由于滤器大小的限制，分成两伤^>虑)。将9-KJ^i若环素石危^湿滤饼于0-6。C溶于150kg(1.4份)注射用水(USP)，上层有才;Wir分离弃除。于0-6。C，将25.7kg(0.3份)盐酸20。Be加至9-fJJM若环素硫離溶液，使其转化为9-itJ^M若环素HC1。将28%氩氧化铵加至纽';^^物中，得到pH为4.0+/-0.2的批次;这^Jf]了49.5kg(0.48份)氢氧化铵。将0.15kg亚石1<^钠(0.0014份)加JX^;^^^勿中。将该批次用5g的9-tJjM若环素HCl种晶，微3小时，同时用28%氢氧化钩需要0.05份)4械其pH为4.0+/-0.2。将该批;"Nutsche滤器上:ltj虑，用预^#至2-8。C的1^i主射用7K(pH调节至4.0)洗涤,然后用0.2份异丙醇(预^卩至2-8。C)洗涤，于NMT50'C干;^NMT的LOD为10.0%,NMT的湿度^i:为8.0%。分离得到63.1kg的9-iJ^M若环素HC1，按米诺环素HCI计算的收率为59%。下面表4列出了比较数据。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>1周期为自米诺环素.HCl到9-^M若环素HCI的时间。2第一和第^比次的M收率3不包括处理期间出现的设备关闭的7天，不包括处理第^比次的时间,表4显示没有进行分离的^J^V^4勿的氬化纽得到含有较低量杂质和Cr差向异构体的产物。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>实施例1N-叔丁基甘氨耖醋于45-50°C,向叔丁斷1.57L)和甲^(1.35L)的混^4勿中加入溴乙酸叔丁酯(420mL)。将';^^于50-60。C"E4半1小时，温度在1小时内升高至75。C。于75°C反应2小时后，将濕^/冷却至-12i3。C，使其静置l小时。过滤收集固体，蒸馏浓缩滤液(30-40。C，25-35mmHg)至体积为825mL。将得到的舰液冷却至20-25。C,加入6NHCl(1.45kg)。3小时后，分离各相，将7j^目蒸馏絲(30曙40。C,25-35mmHg)至^M、为590mL。加入异丙醇(2.4L),将';^^蒸馏^it(15-20。C，10-20mmHg)至体积为9卯mL。将得到的浆状物于30分钟内^HP至-1213。C并静置1小时。it^虑收集固体，用i-PrOH洗涤，干辨45:B'C,10mmHg)24小时得到目标产物(407.9g，86%)。实施例2N國叔丁基甘氨酸铋盐驗在20^4中内向磨为细粉的N-叔丁基甘氨雖醋(250.0g)、曱^(U4L)和DMF(7.1g)的混合物中加入ilL5滅氯(143inL)。将混合物升温至80-85。C，加热3小时。^HP至20。C后，在氮气气氛下&虑收集固体，用甲苯洗涤，干^(40。C，10mmHg)16小时得到目标产物(260.4g，93.8%)。纯度(HPLC面积％):98.12%。实施例3替加环素在搅拌下，15分钟内向9-iJ^t诺环素'Ha(140.0g)和^(0-4。C)7K(840mL)的';^^4勿中加入N-叔丁基甘氨酸酰lljL缝(154.0g)。将';^^于0-4°C^#1-3小时。加AjL氧化钩126g，30。/o)使得pH为7.2，同时##^显度为0-10。C。加入甲醇(930mL)和CH2Cl2(840mL)，将混合物于20-25。C搅拌l小时，同时通*入氢氧化钩13.5g，30。/oyf橫pH为7.2。分离各相，将固体与有机絲并。7jC层用CH2Cl2(lx840mL，3x420mL)萃取，—次萃:|0±程中保持^^物的pH为7.2。向^f的有才Avi:中加入甲醇(200mL)得到溶液。将该溶糊水洗、^(2x140mL)，然后在搅拌下用碗酸钠干樹140g)30分钟。将混*过滤，滤液经蒸馏浓缩(20。C，15-25mmHg)至体积为425mL。向该濕合物中加入CH2Cl2(1.4L)，重复蒸馏2次。将得到的悬浮液冷却至(KTC并搅拌1小时。it^虑收集固体，用0-5°C的CH2Cl2(2xl50mL)洗涤，干^(65-70。C，10mmHg)24小时，得到目才示产物(120.0g，75%)。纯JL(HPLC面积％):98.9%,C-4差向异构体衬0.12%。实施例3A替加环素在,下，于50^4中内向9-feJ^^诺环素'HC1(100.0g)和^(0-4。C)7K(600mL)的;^^中加入N-叔丁基甘氨酸酰氯盐妙(110.0g)。将^^于0-4。C充分搅拌1.5小时。加入氬氧化钩112g,28%)使得pH调节至7.2,同时^#^显度在0-5。C。加入二氯甲烷(600mL)，再加入甲醇(440mL)，将混合物于0-5。C搅拌30分钟，通ii^口入氬氧化钩10.0g，28%)^#pH为7.2。将^/^4勿在15^4中内温热至20-25。C。加入甲醇(244mL)并分离各相。7jC层用CH2Cl2(lx600mL，3x300mL)萃取，^次萃取期间将^^4勿的？11调节至7.2。向^#的有机层中加入甲1|(144mL)得到'溶液。将该溶^JU7jO冼;^(2xl00mL)，然后在,下经石j^^钠(100g)干燥30分钟。将混^4勿过滤，滤液蒸馏浓缩(20。C，80-120mmHg)至体积为400mL。向该"^4勿中加入CH2Cl2(1.0L),重复蒸馏2次。将得到的悬浮液^P至0-2。C并搅拌l小时。过滤收集固体，用0-5。C的CH2Cl2(2xll0mL)洗涤，干燥(65-7(TC，20mmHg干燥18小时，然后3-5mmHg干燥16小时)#到目标产物(82.4g，71.7%)。纯度(HPLC面积。/。)98.5。/。和C-4差向异构体0.28%。实施例4N-叔丁基甘氨酸酰HJL紋^f又丁斷88g)溶于300mL曱苯中。将、;^^加热至45-50。C，1小时内加入117.5g溴乙酸叔丁基酯，保^^显度为50"60。C。将混M加热至75。C，加热2小时。然后将^JI^^^^HP至12-15'C并搅拌1小时。滤出固体并用冷甲苯洗涤。弃去为叔丁胺氢溴酸盐的固体。将滤液冷却至10-12°C,将HC1气体鼓泡通入0.5小时。将^^于10-12。C餅3小时，然后&虑收集产物，用冷甲苯洗涤。产物于40-50。C真空干燥得到107g的N-叔丁基甘氨皿g。MS:m/z187(M+)。将上面制备的N-叔丁基甘氨醋酸盐(7g)加至35mL甲苯中。加入iL^tt(11.6mL),将浆状物于75-80。C加热l小时。将悬浮液冷却至20。C,过滤收集固体,用2x15mL曱苯洗涤。得到的固体于40。C真空干燥得到4.4经产物(收率65%)，将其避湿^#并直接用于下一步骤。实施例5替加环素于0-5。C，将9-tJ^M若环素(10.00g)分;W口至60mL水中。分)W口入叔丁基甘氨酸舰盐雖(10,98g)，同时寸^M^显;1在0-5。C。^^半40-60^4中后，向^';^^4勿中滴力口加入30o/o氬氧化铵调节pH至7.2，同时寸^^显度在0-5。C。向溶液中加入83mL曱醇，然后加入60mL二氯曱烷。搅拌15分钟后，分离各相。水相用4x40mL二氯曱烷萃取，每一次萃取前将pH调节至7.2。向合并的有才M目中加入10mL曱醇，将溶^l]石^^钠干燥。it^虑后，将溶^得到悬浮樹净重51g)。将悬浮液于5-10。C搅拌l小时，然后过滤。固体用2x10mL冷二氯曱烷洗涤，然后干燥得到8.80g产物(收率76.8%)。纯度(HPLC面积。/o):98.4%且C-4差向异构体为0.1%。MS(FAB):m/z586(M+H);585(M+)。实施例6N-叔丁基甘氨酸酰HJL缝#^又丁斷1.5kg)溶于1.35L甲苯中。将^^加热至45-50°C,1小时内加入548g溴乙酸叔丁酯，同时^^^显度在50-60。C。将混合物于75。C加热3小时。然后将M^^^MP至12-15。C并搅拌1小时。滤出固体，用冷甲苯洗涤。弃去为叔丁胺氬溴g的固体。通过蒸馏除去溶剂将滤^ii^至800mL。将、;^ifl液^H卩至25。C，向';^^中力口入900mL的6NHCl。于20-25。C^t半3小时后，分离各相。弃去有才M目，将7jCf目絲至^^p、为600mL。向棘液中加入异丙醇(2.4L)。将浆状物糾至-12至-9。C，》0.5小时。过滤收集产物，用冷异丙醇洗涤，然后于40-50。C真空干燥得到408g固体。NMR纯度>95%。MS:m/z187(M+)。将上面制备的N-叔丁基甘氨,酸盐(250g)加至13L的甲7.5mL的DMF中。加入i!L5皿氯(143mL)，将浆状物于80-85。C加热3-4小时。将悬浮液^P至20。C,it^虑收集固体，用2x250mL曱苯洗涤。固体于40。C真空干燥得到260g(收率82%)产物。纯度(HPLC面积。/o):98.2%。实施例7替加环素于0-4。C，将9-tJ^M若环素'Ha(140.0g)分^口至840mL水中。在充分搅拌下，在15^4中内加入叔丁基甘氨^fbl^L離(154g)，同时将温度##在0-4。C。将溶液撒泮l-3小时。用30%氢氧化铵将^^^勿的？11调节至7.2±0.2，同时^I^显度在0-10。C。向溶液中加入曱醇(930mL)和840mL二氯甲烷，于20-25。C搅泮l小时。分离各相。7M目用3x600mL二氯曱烷萃取，^f有木W目，干燥并、雄至^、约为500mL。将得到的悬浮液^卩至0-2。C并^卩l小时。过滤固体^-f燥得到120g产物(收率75。/。)。纯度(HPLC面积。/o):98%,C-4差向异构体0.1%。MS(FAB):m/z586(M+H);585(M+)。实施例8p比咯絲乙紗舰将p比咯幾14.2g)溶于40mL曱基叔丁絲中。将溶液^H卩至0至-5。C。在搅拌下滴加加M乙酸爷酯(22.9g)。将粘稠的白色浆状物于0-5°C0.5小时。滤出固体，用甲基^又丁基醚洗涤。，滤液得到213gp比咯烷基乙酸节酯。#^基酯(21.0g)溶于200mL甲醇，加入4.0g的10%Pd/C催化剂(50%，湿的)。将溶液于40psi氩化6小时。i^虑除鄉化剂，用甲醇洗涤。滤'^it得到11.8gp比咯絲乙酸，为无色油状物。将15.8gp比咯絲乙邮15mL的甲基-叔丁基醚中形成浆状物。加入乙腈(15mL)，将悬浮液冷却至0-5。C。搅拌下加入HC1^1^(120mL，1.0M)。^t^4寻到的白色沉J定物，用甲基叔丁基醚洗涤，干燥得。纯度(GC/MS面积％):98%。MS:m/z129(M+)。实施例94S^4a,12aa)l-4,7-J^(二曱J^&)-9-(p比咯^^)乙it^氨基l-l,4,4a,5，5a,6,lU2a-八llr3,10,12,12a画四羟基-Ul-二氧^r2-并四客甲,将p比咯絲乙斷7.7g)悬浮于7mL乙腈中。^Hp至0-5。C后，在搅拌下緩慢加入5.3mL亚Am氯。将悬浮^p热至55°C。将黑色溶液于55。C保持0.5小时，然后^Hp至室温，得到p比咯^乙酖IUlMl。将4娥上面实施例4中所述制备的9-^J^M若环素盐雖(5.0g)悬浮于5.0mL水中。将悬浮液^HP至-15。C。向该悬浮液中滴加加AJi述制备的p比咯;^乙酰IUL,溶液，将温度##低于22°C。将黑色纽';^^物于22-25。C搅拌3小时。向濕合物中加7^]<<2mL)，用30%氢氧化##11调节至6.5±0.2。溶糊6xl5mL的CH2Cl2萃取。收集有机萃W^并于40。C浓缩。向浓缩液中加入无水乙醇(10mL)，将浆状物于5-7。C搅拌l小时。过滤固体并于40。(:真空干燥得到3.5§产物。纯度(HPLC面积y。)98.7%,C-4差向异构体0.4。/。。MS(FAB):m/z586(M+H);585(M+)。实施例10替加环素于10-15°C，将9-tJ^M若环素(4.0g)分;W口至10mL乙腈和5mLDMPU中。分^口入叔丁基甘氨,lljL,(4.4g)，寸^^显JL在10-15。C。,2小时后，向纽^/^中緩'lt^r入10mLMeOH和17mL水，##^显度在10-17。C。向^1^^物中滴加氩氧化钩30%),调节pH至7.2,保#^显度在5-8。〇。向溶液中加入15mL二氯甲烷。搅拌15分钟后，分离各相。7jCf目用2x20mL二氯甲烷萃取，每次萃取前调节pH至7.2。向合并的有才M目中加入700mgNoritCA-l(活性炭)和10g硫酸钠，然后i^虑';^^。滤饼用2x20mL二氯甲烷洗涤。将溶液，并将得到的悬浮液于5-8。C搅拌16小时。过滤后，固体用2xl0mL冷二氯曱烷洗涤，然后干燥得到2.38产物(收率50%)。纯度(HPLC面积。/o):95.2%，C國4差向异构体0.5%。MS(FAB):m/z586(M+H);585(M+)。实施例11-19替力口环素实施例11-19才財居实施例10的方法进行，^il:剂修改如下所示。实施例溶剂收率结果111DMPU50%tt:952%,差向异构体:0.5%,sm:3.35%12DMPU-H20(1:1)48%乡嫂:98.1%,差向异构体:0.5%，sm:0.7%13DMPU-MeCN收率60"72%,需要充分后处理14THF—政'没有完成"15MeCN—16CH2C12—"未完^JS，，17THF:H20(6:1)—反应不成功18NMP—M"在小^t莫时进行的Mr"导itsji完全，19DMF258%未知杂质1.5%实施例20N画叔丁基甘氨舰氯盐離向叙沐才A^搅拌器、热电偶、S沐通向30。/0(wt)苛性碱的洗涤塔的氮气导管的冷凝器和250-mL压力平微口液漏斗的5-L多颈烧瓶中加Aj"成粉的N-叔丁基甘氨缝舰(436g，2.60mol，d(0.5)=103|nm)、曱^(1958g，2263mL)和NW國二甲基甲1^(13.6&14.4mL，0.19mol)。于20-23。C，在33^4中内通过250-mL加液漏斗将亚石j(Lilfe^(405g，248mL，3.40mol)加至白色浆状物中。将浆状物在1小时内緩'lt^口热至8(TC,然后于80。C搅拌3小时。3小时后，通&蓴层色谱^;则显示纽完成(<2%原料)。将絲色悬浮絲32^4中内^P至20。C,然后于15-20。C搅拌32分钟。在15-cm布氏漏斗上用#42Whatman滤纸通过真空过滤收集固体。于20-25。C，将滤饼用三份甲苯洗'^(每次272g,314mL)。湿滤饼在氮气保护下抽滤干燥20分钟。然后将产物在23mmHg真空烘箱中于38。C干燥21.21通过HPLC面积测定纯度。sm=起始原料9-氨基米诺环素2采用异丙醇-乙酸乙酯淬灭反应混合物，然后在水和二氯曱烷之间分配。浓缩有机相，然后用曱苯稀释，最后分离产物。小时，产生1.23%的干燥失重。得到的叔丁M基乙酰氯HCl的重量462g,GC强度=91.0%，瓜鉴定=阳性。由叔丁1^J^乙酸HC1计算的收^960/0。产物和原料强度^￡的收率=87%。实施例21N-叔丁基甘氨舰氯盐離向装西沐才;i^搅拌器、热电偶、S沐通向25。/。(wt)苛性碱的洗涤塔的氮气导管的冷凝器和250-mL压力平液漏斗的5-L多颈烧瓶中加A^成粉的N-叔丁基甘氨紋雖(450g，2.68mol，d(0.5)=664|im)、甲^(2863g，3310mL)和二甲基甲ib^(15g，15mL，0.21mo1)。于19-22。C,在19^4中内通过250-mL加液漏斗将亚石滅氯(422g，259mL，3.54mol)加至白色浆状物中。将浆状物在7.1小时内緩'lt^口热至79°C,然后于79-82'C撒泮44小时。于3小时时通ii^层色i普检测，发5L^I未完全。加入另外261111<42&0.3511101)亚石滅氯。总共27小时后，薄层层析显示反应仍未完全，再加入261111^(42&0.3511101)亚《舰氯。总共44小时后，于79-82。C，TLC显示反应完4^〈4。/o起始叔丁M基乙酸HCl)。将深褐色悬浮^17^4中内^P至25。C，然后于21-25。C37^I中。在2-L净li^璃皿漏斗上真空i^虑收集固体。滤饼于20-25。C用六份甲苯洗'^(每次洗涤282g，325mL)。湿滤饼在氮气保护下抽滤干燥16分钟。然后将产物在23mmHg真空烘箱中于38匸干燥26.1小时，产生0.75%的干燥失重。获得的叔丁&^乙絲HCl的重量-395g,GC强度=89.5%，IR鉴别-阳性。由叔丁_&#^乙酸1:1计算的收+=79%。产物和原料强度校正的收+=71%。实施例22替加环素于0-6。C，将9-iJ^iM若环素HC1(43.0kg)溶于258kg(6.0份)注射用水中。将N-叔丁基甘氨酸酰氯HC1(47.3kg，1.1份，3.01当量)緩lt^口至该糸b^液中，同时保"M^亥批^^温度在0-6。C。将站:^^^搅拌1小时，测定剩余0.2%的赵台原辨不需要另外的N-叔丁基甘氨^氯HC1)。然后用321^(0.7份)28%氩氧化铵和2kg试剂盐斷过量重调(readjustovershoot)辦GAR-936^Jl';^^物调节至pH7.2+/-0.2。初始pH等于0.42，最终pH等于7.34。于0-7。C，向M^^中力口入二氯甲^(342kg，8份)和148kg(3.4份)甲醇。因为pH为7.09,不需要调节。将该批次温热至19-25。C。力口入曱醇(83kg，l,9份)，分离出下层的有才M目。然后将7jOf目中存留的产物用1x342kg(8份)和3x172kg(4份)二氯甲烷萃^ii有机相，同时用28%氬氧化^##11在7.2+/-0.2。将曱醇(491^，1.14份)加至得到的二氯甲像甲醇溶液中，将其用2x43kg(l份)注射用7jO冼涂，然后用43kg(l份)硫酸钠干燥。然后进行三次真空蒸馏除去曱醇，在第二次和第三次蒸馏之前加入568kg(13,2份)二氯曱烷。母液中曱醇的残留7JC平低于0.21。/。。过滤该批次，用2x60kg(1.4份)预^(0-6。C)二氯甲烷洗涤。得到的粗品物质不干燥，以湿滤饼分离(72.5kg，干重38.2kg，以干燥失重计算)，由9-^J^M若环素HC1计算收率为77%。湿滤饼分析显示米诺环素=1.26%，单个最大杂质=037%，C-4差向异构体=0.50%。实施例23替加环素于0-6。C，将9-iJ^M若环素HC1(61.0kg)溶于258kg(6.0份)注射用水中。将N画叔丁基甘氨酸itllHCl(67.1kg，1.1份,3.01当量)緩lt^口至该^tb^液中，^#^亥糸匕温;^在0-6。C。将^1〉'^^4勿撒泮3.5小时，测定还有0.13%起始原料剩^(不需要另外的N-叔丁基甘氨^blQ。用45kg(0.7份)28%的氩氧化劍寻^^^调节为pH7.2+/-0.2。初始pH为0.82，最终pH为7.07。于0-6。C,向^jS》V給物中加入二氯曱烷(485kg，8份)和2101^(3.4份)甲醇。因为pH仍然在所期范围内(7.04)，不需^"i^f，节。将该批次温热至19画25。C。加入曱醇(118kg，l,9份)，分离下层的有才M目。然后采用1x4851^(8份)和3x244kg(4份)二氯曱烷将存留在7J^目中的产物萃i^ii有才;i4目中，同时用28%氢氧化铵将？11##在7.2+/-0.2。向得到的二氯曱像曱醇溶液中加入曱醇(70kg，1.14份)，然后用2x61kg(l份)注射用水洗涤，用611^(1份)石jH^钠干燥。然后进行三次真空絲以除去曱醇，在第二次和第三次蒸馏之前加入805kg(13.2份)二氯曱烷。母液中曱醇的残留7jC平低于0.05%。it^虑该批次，用2x85kg(1.4份)预^(0-6。C)二氯甲烷洗涤。得到的粗品产物不干燥，分离得到湿滤^(103kg,干重53.4kg，以干燥失重计算)，由9-iJj^诺环素HC1计算收率为76%。比较实施例24替加环素单盐^实施例24A:9-氯乙^ttJ^M若环素在装酉沐才;l^^J半器、热电偶和l-L加液漏斗的3-L圆底烧瓶中将二氯甲烷(1.3L)^HP至0-2。C。在搅拌下分^p入重结晶的9-tJ^M若环素盐酸盐(400g)。10^4中内加AX乙^(428mL)，同时^M^显;1在0-2。C。将^1》'^^搅拌10分钟，然后^P至-22。C。然后加入280g氯乙酸酐的540ml二氯甲烷溶液，加入的i4JL^保i^显度不会升高至5。C以上。用另外的132ml二氯曱烷冲'^口液漏斗。开始加入酸酐后15^4中，用HPLC定量分析纽^^^。当勤会原料的量小于2%时，用680mL的0.05M碳^lL钠溶液淬X^。将^^4勿^#15分钟，然后##至51分液漏斗中。分离各相。分离二氯甲斜目，用另外680mL的0.05M碳^iL钠溶液洗涤。将经洗涤的二氯甲^^液滴加至17L的10:1正庚脉异丙醇^^(15.4L正^^pl.54L异丙醇)中。将浆状物微5^4中，然后放置10分钟。弃去上清液，^;定物給阻的多孑U^璃烧结漏斗过滤。固体用2L的10:1正Jb^:异丙醇洗涤。将固体于40。C真空干燥得到550g粗产物。实施例24B:替加环素于室温下(25-28。C),#^且品9-氯乙^J^M若环素(100g)在充分搅拌下緩隄加至装酉沐搅拌器和热电偶的l-L两颈圆底烧瓶中的500mL叔丁胺中。加入碘4t4内(10g)，将A^^^于室温下餅7,5小时。通过HPLC监测纽，当起始原料剩余<2%时，加入100ml甲醇，^Mt转蒸发4:Ui于40。C除去溶剂。向残留物中力口入420mL曱醇和680mL水。将溶液^卩至0-2。C，用浓HCl(91ml)调节至pH7.2，得到体积为1300mL的^Jl';^^物。用7jC)f其稀释至6.5L,用浓HC1(12mL)将pH调节至4.0-4.2。将洗、^Ht的Amberchrom(CG161cd)(860g)加至上ii^液中，将^^^t半30^4中，调节pH至4.0-4.2。滤出树脂，余下的7JC溶^f过HPLC对产物进行定量分析，并Ji&存在^8。C。树脂在48L的20。/0曱醇的7jC溶液(4L甲醇+16L水)中浆化。将悬浮液搅拌15分钟，调节pH为4.0-4.2。滤出^f脂，对滤液进行产物定量分析。用4.8L的20。/o曱醇水7K溶液萃W^脂三次以上。收集所有的树脂萃W^和上面步骤余下的7K溶液，用30%氩氧化铵将pH调节至7.0-7.2。7JC溶液用6x2.8L二氯曱烷萃取，每次萃取之间将pH调节至7.0-7.2。将收集的二氯甲烷萃^it过250g无7K硫酸钠过滤，浓缩至500mL并^HP至0-3。C。产物结晶后，将浆状物于0-3。C^^半l小时。过滤固体，用2x50mL冷二氯甲烷洗涤，于40。C真空干燥得到26g固体。实施例24C:替加环素单盐,将替加环素(49g，0.084mol)在搅拌下分次溶于500mL注射用水中。溶舰过中孔漏斗过滤,用420mL注射用7jC洗涤。将溶液冷却至0-2。C,滴加加入5.6mL浓HC1，保^^显JL在0-2。C。初始pH为8.0，最终pH为6.0。在-30。C冻结样品并在-15°。冷冻干燥将溶液冻干。存;^显度升高至21。C，持续2小时。将得到的固^K49，6g)研磨并l&存于4-5。C。元素分析C(52,92。/o理论值，51.75%实测值)；11(6.73%理论值，6.75%实测值)；N(10.65。/。理iMi，10.32%实测值)；Cl(5.4%理论值，5.5%实测^1)0膽实施例25替加环素单盐,实施例25A:9-氯乙酰rtJj^诺环素将二氯甲烷(325mL)^H卩至-5至0°C，10分钟内分^口入9-^JjH诺环素盐舰(100g)。加A^乙斷77,6g)，同时^#^显>^在-10至-5"€。于20-25。C通过搅拌制备97%氯乙酸酐(70g)的二氯甲烷(133mL)溶液，45^4中内将其加至^混合物中，同时^^^^物的温度在-10至-2。C。#^有氯乙酸酐溶液的用31mL二氯曱烷冲洗，将沖洗^口A^I';^^物中。搅拌30分钟后，通过HPLC;j^测纽以确^jS是否完成。30^4中内加入碳^iL钠7K溶^(185mL，0.05M)，同时^^纽:^^的温度在0-5。C。^f半10^4中后，分离各层，向有才;i4:中加入石l^钠(15g)。将混合物于0-5匸搅拌15分钟并过滤。得到的滤饼用二氯曱烷(2x38mL)沖洗,将^4f的滤';^20^4中内转移至4.19L的10:1M:异丙醇中，随后用15mL二氯曱烷沖洗滤';^i瓶。将得到的悬浮液于20-25。C搅拌15分钟，然后过滤。滤饼用680mL的10:1^::异丙醇冲洗，于37-40。C干樹5-10mmHg)24小时。纯度(HPLC面积。/。)78.1。实施例25B:替加环素于0-10。C，将9-氯乙酰tJjM若环素(100g)在剧烈搅拌下加至點沐搅拌器、热电偶和冷凝器的2-L多颈圆^i克瓶中的483mL叔丁胺中。加入》制t4内(16g)，将^J^^物于33-38'C搅拌4小时。通过HPLC^^测^I:^^^C^^Ji是否完全，然后~卩至5-10。C。10^4中内力口入甲醇(300mL)，然后通过蒸馏(10-17。C，68mmHg)将纽溶^it至350mL。向'棘液中力口AJ^二份甲醇(600mL)，将混^4勿蒸馏浓缩至350mL。加入曱醇(46mL)和冷7jC(565mL)，同时^#^1温度低于30。C。将溶液冷却至0-5。C，用100mL的HC120。Be将pH调节至4.0。将溶液4^多至5-L多颈烧瓶中，用500mL水冲洗，然后用11^7]<#释。于0-5。C搅拌1小时,加入经洗涤的Amberchrom⑧(CG161)树脂3，将得到的悬浮液于20-25。C^f半30^4中。将悬浮液过滤，将得到的湿滤饼加至340mL的5:l7K:曱醇溶液中。将滤液放置。于20-25。C搅拌30分钟后，将悬浮液i^虑，将得到的湿滤饼加至第二份340mL的5:17jc:甲醇溶液中。将该第二份滤^iit^。将该悬浮液^±>虑，将得到的湿滤饼加至第三份340mL的5:l7jC:甲醇溶液中。it^虑后，将第三份滤液与第一和第二^^虑液合并，令卸至0-5。C。用11mL的28%氬氧化铵将pH调节至7.0。将溶液于0-5。C搅拌16小时，如果需要的话，将pH调节至7.0，于22-25。C搅拌l小时，如果需劉寻pH调节至7.0。7jC溶液用二氯曱戮5x980mL)萃取，对于每次萃取而言，将pH调节至7.0。#^#的有才;^目#^多至分液漏斗中，分离水层。有才Av^中加入100g石JL^钠，于20-25。C^4半l小时。将悬浮舰it^土垫过滤，滤饼用250mL二氯甲烷冲洗。滤^it过蒸馏(-5至5。C,150mmHg),至150mL，然后冷却至0-5。C(l小时)。将得到的悬浮液过滤，滤饼用0-5。C二氯甲戮2x30mL)冲洗。湿滤饼在二氯甲烷(335mL)和甲醇(37mL)中于26-32。C搅3将183g过滤并匀化的Amberchrom⑧(CG161M)树脂加至340mL的5:1水:曱醇溶液中制备经洗涤的Amberchrom⑤(CG161M)树脂。于22-25'C搅拌1小时后，将悬浮液过滤得到湿滤饼，将其抽滤干燥。将湿滤饼于20'C在340mL的5:l水:曱醇溶液中搅拌l小时，然后过滤。将该方法再重复一次以得到所述经洗涤的树脂。拌直到获得溶液。溶舰it^藻土过滤，用二氯甲烷(2xl5mL)冲洗硅藻土，通过蒸馏(-5至5。C，150mmHg)浓缩至54mL。将自过程重复二次，第一;W口入335mL二氯甲烷，并#^积减少至55-70mL,然后加入254mL二氯曱烷，并且刷f^F、减少至90-105mL。将得到的悬浮液于0-5。C撒泮l小时，然后&虑并用-l(TC的二氯曱^(2x25mL)洗涤。将固体于35-40。C干燥16小时，然后于45-50。C干燥27小时。纯度(HPLC面积"/o):97.7%，C-4差向异构体1.23%。纯化实施例1替加环素#^且品替加环素(110.0g)和乙酸甲酯(1.65L)的^^4勿^^Hf加热至30-35。C，15分钟内加入甲醇(550mL)。于30-35。CiU后，将该温热的溶'^itit^藻土(36g)过滤，滤饼用乙酸甲酯洗涤(2xl06g)。将滤^t过蒸馏(20。C，150mmHg)、;^至550mL。加入乙酸曱酯(l.lL)，将得到的悬浮液通过蒸馏(20。C，150mmHg)浓缩至550mL。将该步骤重复，然后将,液冷却至04°C，并冷却1小时。过滤收集得到的固体，用0-5。C的乙酸曱酯(2xl50mL)洗涤。将固体真空干燥(65-70°C，10mmHg)lOO小时，得到98.0g(收率89.1%)目标产物。纯度(HPLC面积％):98.8%和C-4差向异构体0.55%。实施例2替加环素于0-4。C，将9-^J^M若环素.HC1(140.0g)分;W口至840mL水中。在充分搅拌下，15^4中内加入叔丁基甘氨舰綠紗(154g)，同时^^^显;1在0曙4。C。将溶液搅拌l-3小时。用30%氩氧化#4^^物的？11调节至7.2:±0.2，同时##温度在0-10。C。向溶液中加入甲醇(930mL)和840mL二氯曱烷，将其于20-25°C撒泮1小时。分离名—目。7]<相用3x600mL二氯甲烷萃取，^f有糸l^目，干燥并，至^P、约为500mL。将得到的悬浮液^HP至0-2'C并^HP1小时。将固^it滤并干燥得到120g产物(收率75%)。纯度(HPLC面积。/。)98%，C-4差向异构体0.1%。MS(FAB):m/z586(M+H);585(M+)。实施例3替加环素#^实施例2所述制备的替加环素(15.00g)加至113mL丙酮和113mL甲醇中。将悬浮液于20-25。C^4半l小时，然后^HP至0-2。C。搅拌l小时后，将悬浮液^±>虑并洗涤得到12.55g产物(收率83.7%)。纯度(HPLC面积％)>99%，C-4差向异构体0.4%。实施例4替加环素#^实施例2所述制备的替加环素(105g)加至800mL丙酮和800mL曱醇中。将悬浮液^4^Hf加热至30-35。C,加热15分钟，然后冷却至20-25。C。于20-25。C放置l小时后，将悬浮液冷却至0-4'C，放置1小时。将固^it滤、洗、M干燥得到83g产物(收率79%)。纯度(HPLC面积％):>99%,C-4差向异构体:0.4%。实施例5替加环素向装酉沐才;i^搅拌器和氮气保护装置的l-L多颈烧瓶中加入943g湿的粗替加环素4、甲醇(305g，386mL)和丙酮(291g，368mL)。将混合物于16-23。C搅拌4小时。将浆状物在9-cm布氏漏斗上用#1Whatman滤纸过滤。湿滤饼用甲醇(87g，110mL)于20-25。C洗涤。将湿滤饼在氮气保护下抽滤干燥0.1小时。将湿滤辨75.3g)转移回l-L多颈烧瓶中，加入曱醇(233g，295mL)和丙酮(244g，309mL)的溶液。将浆状物于15-20。C搅拌5.5小时。将浆状物在9-cm布氏漏斗上用#1Whatman滤纸过滤。湿滤饼用曱醇(70g，88mL)于18-24。C洗涤。将湿滤饼在氮气保护下抽滤干燥O.l小时。将湿滤辦59.0g)^f多回l-L多颈烧瓶中，加入甲醇(195g，247mL)和丙酮(187g，236mL)的溶液。将浆状物于18-24。C撒泮3小时。将浆状物在9-cm布氏漏斗上用針Whatman滤纸过滤。湿滤饼用曱醇(55g，70mL)于20-25。C洗涤。将湿滤々并在氮气保护下抽滤干燥0.1小时。将湿滤斷48.98，样，用于高效'期目4粗品替加环素由米诺环素.HC1(得自供应商Interchem)制备。色if(HPLQ分析(总杂质,.62。/。、米诺环素=0.17%、C-4差向异构#^).35%、最大的其它单个杂质=0.05%)。将湿滤辦48.9g)转移至西沐真空蒸馏设备的2-L多颈烧瓶中。向湿滤饼中加入甲醇(90g，114mL)和二氯曱烷(1023g，772mL)的预混合溶液。将浆状物于15-20。C揹拌得到红色溶液。将溶液于13-17。C、330mmHg真空下蒸馏0.8小时至160mL，得到橙色浆状物。向2-L^f瓦中加入二氯甲^(818g，617mL)，将浆状物于6-13。C、817mmHg真空下再次蒸馏0.7小时至183mL。加入二氯曱烷(635g，479mL)，将浆状物于6-7。C、817mmHg真空下再次蒸馏0.6小时。将得到的橙色浆状物^P至0-5。C，于0-5。C放置，撒泮2小时。将浆状物在7-cm布氏漏斗上用#1Whatman滤纸过滤。湿滤饼用二份69g(52mL)的二氯甲烷于0。C洗涤。将湿滤饼在氮气保护下抽滤干燥5分钟。湿滤々軒48.7g^取得的样品用于高效^目色镨分析(总杂质=0.49%、米诺环素=0.12%、04差向异构体=032%、其它杂质=0%)。然后将湿滤饼于25。C、真空度〈10mmHg条件下干燥57.5小时，至二氯甲烷的7JC平为2.2%，得到32.3g替加环素(收率34.2%)。用由米诺环素'HC1(得自供应商Hovione和NipponKayaku)制备的粗品替加环素进^i亥方法。采用每种来源的米诺环素.HC1为勤会原料，4MI上妙法制备的替加环素中存在的杂质的tb^'J^4l和2中。这些表显示该方法提供了替加环素的良好收率及^7K平的杂质。表l米诺环素，HC1来源替加环素的处理阶段终产喊加环素中的总杂质(%)回收的米诺环素.HC1(0/。)终产4械加环素中的C4差向异构#<0/0)NipponKayaku粗品粗品0.710330.26NipponKayaku純化品纯化品0.260.130.13Interchem粗品粗品0.660.170.29Interchem纯化品纯化品0380.100.15Hovione粗品粗品0.640.180.32Hovione纯化品纯化品0390.130.14表2实验NipponKayakuInterchemHovione性状描述橙色粉末橙色粉末橙色粉末产量(g)28.532336.4强度(％)'10099.699.6总杂质(％)20.130.230.25LSI(%)[RRTJbrl40.13米诺环素(％)0.130.100.13差向异构Wy。)0.130.150.14二氯甲夠％)1.32.22.1曱斷％)0.0010扁0.002丙酮(％)0扁brl5brl0.001brl6brl异丙斷％)0.002brl7brl曱夠pm)brl8brlbriNW二曱基曱^(ppm)bri9brlbrl7j<(KF，％)1320.720.51灼^^留物(％)0.0390.0050.014ER阳性阳性阳性-219.4-213.4-218.7结晶性符合符合符合收率(％)212624收率(妙后，％)10243027由米i新mino)计算的收率(。/。)101213由米"^(mino)计算的收^(^jE后，％)w1113141.在无水、无溶剂*下。2.不包括差向异构体。3.最大的单个杂质(LSI)，除了C-4差向异构体和米诺环素夕卜。相对于GAR-936的相对保留时间(RRT)。4.brl:低于报告卩^(reportinglimit),对于HPLC为0.05%。5.0.0005%的brl。6.0.0003%的brl。7.0.0030%的brl(单个样品)。8.2ppm的brl。9.63ppm的brl。10.原^产物强度的校正。实施例6替加环素带正点残基的延伸处(Ma,Y"Henderson,H.E.,Liu，M,S"Zhang,H.，Forsythe,I.J.,Clarke-Lewis,I.，Hayden,M.R.，andBrunzell,J.D.J.LipidRes.35,2049-2059)。已经报道了编码人胰酯酶、肝酯酶和脂蛋白酯酶的基因序列(分别是GenBank序号弁M93285、#J03540和tfM15856)。人肝酯酶和胰酯酶的信使RNAs分别大约是1.7和1.8千碱基长。人脂蛋白酯酶基因产生3.6和3.2千碱基的2个mRNA转录本。(Ranganathan，G"Ong,J.M"Yukht，A"Saghizadeh，M.,Simsolo，R.B.,Pauer,A.,andKern,P.A.(1995)J.Biol.Chem.270,7149-7155)。影响酯酶活性的化合物本发明涉及通式(I)的化合物及其衍生物(包括但不局限于多晶型物、异构体和前体药物、其几何或光学异构体)，以及这些化合物的药学可接受的酯、醚和氨基甲酸酯，其所有的溶剂化物和水合物及其所有的盐，其中《4和R2分别独立选自如下构成的组氢、(Vd3烷基、d-C2o卤代垸基、C2-d3烯基、C2-d3炔基、C4-C6环烷基、CrC6环烯基、Crd3烷氧基烷基、d-Cs垸基环烷基、CrCV烷基环烯基、Crd3烷氨基、Crd3芳氨基、C(0)d-C6垸基、0-C(0)CrC6垸基、杂环烷基、芳基、垸芳基、C(O)芳基和O-C(O)芳基；其中每一个上述基团可以任选具有l-6个独立选自氢、卤素、硝基、氨基、氰基、异氰基、硫代、d-C6垸基、环烷基、芳基、烷氧基和芳氧基基团的取代基团。然而，本发明的R,和R2不是甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、苯基和羟基。在另一个具体实施方式中，本发明涉及通式(II)的化合物幾分别为624kg和481kg)。残留的甲醇^^1.07%。将该批次^P至0-6。C并搅泮1小时。将该批次it^虑，用3x59.7kg(每次1.1^)预冶《-13至-7。C)的二氯曱烷洗涤，于不高于60卩的温度干燥至干燥失重<2.5%。将产物研磨得到31.7kg替加环素，为第一批产物。由结晶器中残留产物组成的第^比产物又得到2.5kg产物。由粗品替加环素计算，两批产物的收率为64%。尽管通iW本发明实施方案以及其非P艮定性实施例的讨论描述了本发明，但是才娥本说明书和^L利要求书，本领域技^A员可以想到其它实施方案和变通方案，它们也包含在本发明的预期范围内，所以本发明的范围应该只能由权利要求来解#定义。权利要求1.制备至少一种式1化合物或其药学上可接受的盐的方法其中R1和R2均独立选自氢、直链和支链(C1-C6)烷基以及环烷基，或者R1和R2与N一起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直链和支链(C1-C4)烷基；且n为1-4，所述方法包括(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应，制备包含中间体的反应混合物；和(b)使中间体进一步反应形成至少一种式1化合物，其中所述中间体没有从反应混合物中分离。2.根据权利要求1的方法，其中&为氢、R2为叔丁基、R3为甲基、R4为甲基，且n为1。3.根据权利要求2的方法，其中所述至少一种式1化合物为替加环素或替加环素HC1。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述至少一种硝化试剂选自硝酸盐和硝酸。5.根据权利要求4的方法，其中所述至少一种硝化试剂为硝酸。6.根据权利要求5的方法，其中所述硝酸的浓度为至少80%。7.才娥权利要求1-6中任一项的方法，其中所述至少一种硝化试剂相对于至少一种式2化合物为摩尔过量的。8.才娘权利要求7的方法，其中摩尔过量至少为1.05当量。9.才財居权利要求1-8中任一项的方法，其中(a)中的反应是在酸存在下进行的。10.才歸权利要求9的方法，其中所述的酸为硫酸。11.才^^权利要求1-10中任一项的方法，其中(a)中的反应是在5-15。C的温度下进行的。12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述至少一种式2化合物选自盐。13.根据权利要求12的方法，其中所述至少一种式2化合物的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸盐、富马酸盐、羟乙酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、石克酸盐和氯笨璜酸盐。14.根据权利要求12的方法，其中所述至少一种式2化合物的盐选自烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。15.根据权利要求1-14中任一项的方法，其中所述中间体为盐。16.根据权利要求15的方法，其中所述中间体为硫酸盐。17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述中间体为至少一种式3化合物或其盐18.根据权利要求17的方法，其中由高效液相色谱所测定，所述至少一种式3化合物的量为有机成分总量的至少80%。19.根据权利要求17的方法，其中由高效液相色谱所测定，所述反应混合物包含的式3Cr差向异构体的量少于10%。20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中(b)中进一步反应包括还原所述中间体。21.根据权利要求20的方法，其中所述还原形成至少一种式4化合物或其盐22.根据权利要求20的方法，另外包括酰化还原的中间体。23.根据权利要求1-22中任一项的方法，其中(a)中的反应包括提供至少1g量的至少一种式2化合物。24.制备至少一种式l化合物或其药学上可接受的盐的方法其中R!为氢；R2为叔丁基；R为-NRsR4，其中R3为甲基且R4为甲基;且n为1，所述方法包括(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应制备含有中间体的反应混合物；和(b)使中间体进一步反应形成至少一种式1化合物，其中所述中间体没有从反应混合物中分离。25.根据权利要求24的方法，其中所述至少一种式1化合物为替加环素或替加环素HC1。26.制备至少一种式l化合物或其药学上可接受的盐的方法:其中Ri和R2均独立选自氢、直链和支链(d-C6)烷基以及环烷基，或者&和R2与N—起形成杂环；R为-NRsR4，其中R3和R4均独立选自氢以及直链和支链(d-C4)烷基；且n为l-4，所述方法包括(ayf吏至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应制备浆状物；和(b)使浆状物进一步反应形成至少一种式1化合物。27.根据权利要求26的方法，其中&为氢；112为叔丁基；R为-NRsR4，其中R3为甲基且R4为曱基；且n为l。28.根据权利要求26的方法，其中所述至少一种式1化合物为替加环素或替加环素HC1。29.制备至少一种式3化合物或其盐的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R为-NR3R4,其中R3和R4均独立选自氢以及直链和支链(d-C4)烷基，所述方法包括使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中所述反应在5-15。C的温度下进行。30.制备至少一种式l化合物或其药学上可接受的盐的方法:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R,和R2均独立选自氢、直链和支链(d-C6)烷基以及环烷基，或者&和R2与N—起形成杂环；R为-NR3R4，其中R3和R4均独立选自氢以及直链和支链(d-C4)烷基；且n为1-4，所述方法包4舌(a)使至少一种硝化试剂与至少一种式2化合物或其盐反应制备含有中间体的反应混合物；和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(bM吏中间体进一步反应形成至少一种式1化合物，其中(a)中的反应在5-15。C的温度下进行。31.根据权利要求30的方法，其中R!为氢、R2为叔丁基、R3为甲基、R4为甲基且n为1。32.化合物或其盐，该化合物或其盐是根据权利要求1-31中任一项的方法制备的。33.根据权利要求32的化合物，其中&为氢、R2为叔丁基、Rs为曱基、R4为甲基且n为1。34.根据权利要求33的化合物，其中所述至少一种式1化合物为替加环素或替加环素HC1。35.组合物，该组合物包含根据权利要求1-31中任一项的方法制备的化合物或其盐。36.根据权利要求35的组合物，其中R!为氢、R2为叔丁基、R3为甲基、R4为甲基且n为1。37.根据权利要求36的组合物，其中所述至少一种式1化合物为替加环素或替加环素HC1。38.根据权利要求35的组合物，另外包含至少一种药学上可接受的载体。39.组合物，该组合物包含至少一种式3化合物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R为-NR3R4,其中R3和R4均独立选自氢以及直链和支链(C1－C4)烷基，其中经高效液相色镨测定，式3的Cr差向异构体存在的量少于10%。40.根据权利要求39的组合物，其中&为氢；R2为叔丁基；R为_NR3R4，其中R3为甲基且R4为曱基；且n为l。全文摘要本发明公开了制备和纯化例如替加环素的四环素类化合物的方法。还公开了通过这些方法制备的四环素组合物，例如替加环素组合物。文档编号C07C231/02GK101228111SQ200680026438公开日2008年7月23日申请日期2006年5月25日优先权日2005年5月27日发明者A·J·图佩,A·P·米朔德,A·S·皮尔彻,J·J·麦考利三世,J·M·奥尔内,L·克里什楠,M·贝纳池茨,P-E·萨姆,S·戴格内奥特申请人:惠氏公司