专利名称：毒素偶联的Eph受体抗体的制作方法
技术领域：
本发明提供了釆用与毒素偶联的抗-EphA2或抗-EphA4抗体来诱 导癌细胞或其他超增生性细胞(hyperproliferative cell)的细胞死亡或停滞的 组合物和方法。
背景技术：
癌症 每年有120万美国人患上癌症。癌症是美国的第二大死因，如 果以这种趋势继续发展，预计到2010年癌症将称为第一大死因。肺癌和 前列腺癌是美国的头号男性癌症杀手。肺癌和乳腺癌是美国的头号女性癌 症杀手。在美国，每两名男性中就有一人将在其生命的某个时刻被诊断出 癌症。在美国，每三名女性中就有一人将在其生命的某个时刻被诊断出癌 症。目前的治疗方法，如外科手术、化疗和放疗，通常要么无效要么有严 重的副作用。转移 目前，癌症疗法可包括外科手术、化疗、激素疗法和/或放射治
疗以消除患者体内的肿瘤细胞(参见，例如，Stockdale， 1998，"癌症患者 管理原贝ll" (Principles of Cancer Patient Management),选自Rubenstein禾口 Federman编的《科学美国医学》(Scientific American: Medicine),第3 巻，第12章，第IV部分)。所有这些方法对于患者而言都有显著缺点。例 如，外科手术可能由于患者的健康问题而无法实施或者不为患者所接受。 此外，外科手术可能不能完全除去肿瘤组织。放疗仅当肿瘤组织对于辐射 的敏感性高于正常组织时才有效，且放疗也会引发严重的副作用。激素疗 法很少单独施用，且尽管有效也只是通常在已经用其他治疗方法除去大部 分癌细胞后用来预防或延迟癌症复发。Fc/FqR复合物的形成使效应细胞集中到抗原结合部位，这通 常在细胞内导致信号传导事件和重要的后续免疫应答，如释放炎性介质、 B细胞激活、胞吞作用、吞噬作用以及细胞毒攻击。介导细胞毒和吞噬效 应功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。表达FcYR的非特异性细胞 毒细胞识别结合于靶细胞的抗体并随后造成靶细胞溶胞的细胞介导反应 称为依赖于抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)(Raghavan等，1996， Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie等，2000， Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch等，2001， Annu Rev Immunol 19:275-290)。注意，介 导ADCC的主要细胞(primary cell), NK细胞仅表达FcyRIIIA，而单核细 胞表达FcyRI、 FcyRII和FcYRIII(Ravetch等，1991，同上)。
另一种重要的Fc配体是补体蛋白Clq。结合于Clq的Fc介导 称为依赖于补体的细胞毒性(CDC)的过程(回顾见Ward等，1995， Ther Immunol 2:77-94)。 Clq能够结合6种抗体，尽管结合两种IgG就足以激活 补体级联。Clq与Clr与Cls丝氨酸蛋白酶形成复合物从而形成补体途径 的C1复合物。抗体的一些关键特征包括但不限于对靶的特异性、能够介导 免疫效应机制、以及在血清中较长的半衰期，这些使得抗体以及相关免疫 球蛋白分子成为有力的治疗方法。许多单克隆抗体目前正处于开发阶段或 者已经在治疗上使用以治疗包括癌症在内的各种病症。这些抗体的例子包 括米迪缪尼公司麦迪免疫公司(Medlmmune)的Vitaxin , —种人源化的 整联蛋白av卩3抗体(例如，PCT公开WO 2003/075957);基因技术公司 (Genentech)的赫赛汀(Herceptin)⑧， 一种批准用于治疗乳腺癌的人源化抗 -Her2/neu抗体(例如，U.S. 5,677,171);塞图科公司(Centocor)的CNTO 95， 一种人整联蛋白av抗体(PCT公开WO 02/12501); IDEC/基因技术公司/ 罗氏公司(IDEC/Genentech/Roche)的Rituxan , —种批准用于治疗非霍奇 金淋巴瘤的嵌合抗-CD20抗体(例如，U.S. 5,736,137);以及免疫克隆公司 (ImClone)的Erbitux , —种抗誦EGFR抗体(例如，U.S. 4,943,533)。文中，术语"递送载体"指可用来将治疗药或预防药施用于对象， 尤其是人的物质。递送载体可优先将治疗/预防药递送到特定的细胞亚类。 例如，借助递送载体的固有特征或者通过与载体相偶联的部分、包含在其 内的部分(或者与载体结合的部分，从而使得该部分和该递送载体维持在一 起，进而使得该部分足以靶向递送载体)使递送载体靶向某些类型的细胞， 所述部分，例如，通过结合代表所靶向的细胞亚类特征性细胞表面分子而 特异性结合特定的细胞亚类。递送载体还可提高要递送的试剂的体内半衰 期和/或要递送的试剂的生物利用度。递送载体的非限制性例子是病毒载 体、病毒样颗粒、聚阳离子载体、肽载体、脂质体和杂交载体。在具体的 实施方式中，所述递送载体不直接偶联于结合EphA2和/或EphA4的部分。 在其他实施方式中，所述递送载体不是结合EphA2和/或EphA4的抗体。 文中，术语"肝配蛋白"或"肝配蛋白配体"指已经或将由Eph命 名委员会(Eph命名委员会，1997， Ce//，卯403-404)鉴定并认可的任何肝
配蛋白配体。本发明的肝配蛋白包括但不限于肝配蛋白A1、肝配蛋白
24A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白 B2和肝配蛋白B3。在具体的实施方式中，肝配蛋白多肽，尤其是肝配蛋 白A1，来自任何物种。在其他实施方式中，肝配蛋白多肽，尤其是肝配 蛋白A1，来自人。肝配蛋白多肽的核苷酸和/或氨基酸序列可在文献或公 共数据库(例如，GenBank)中找到，或者可采用精通本领域的技术人员已知 的克隆和测序技术来测定该核苷酸和/或氨基酸序列。例如，人肝配蛋白 Al变体1的核苷酸和氨基酸序列的GenBank登录号分别为NM_004428.2 和NP—004419.2。人肝配蛋白Al变体2的核苷酸和氨基酸序列的GenBank 登录号分别为NM_182685.1和NP一872626.1。文中，术语"人源化抗体"指非人(例如，鼠科)形式的抗体，该 抗体含有少量源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部
分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者抗体的超变区残基用非人物种， 例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类抗体(供者抗体)的具有所需特异性、亲 和力和结合能力的超变区残基替代。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架 区(FR)残基可被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可含有在受者抗 体或供者抗体中没有的残基。进行这些修饰可进一步优化抗体性能。人源 化抗体通常可含有至少一个，通常两个可变结构域的基本上全部(残基)， 其中所有或基本上所有的超变区对应于非人免疫球蛋白的，所有或基本上 所有的FR是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体还将任选包含免疫球蛋白 恒定区(Fc)的至少一部分，该部分通常是特异性结合于EphA2或EphA4多肽的人免疫球蛋白的一部分，已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加 而改变(即，突变)。
一些实施方式中，人源化抗体是衍生物。这种人源化 抗体在一个或多个非人CDR中包含氨基酸残基取代、缺失或添加。与非 衍生的人源化抗体相比，人源化抗体衍生物可具有基本相同的结合能力、
更好的结合能力或更差的结合能力。在具体的实施方式中，CDR的1、 2、 3、 4或5个氨基酸残基已被取代、删除或加入(即，突变)。有关人源化抗 体的更多细节见欧洲专利号EP 239,400、 EP 592,106和EP 519,596;国际
发明者C·巴赫, D·泰斯, H·吴, M·S·金奇, P·D·森特, 高长寿 申请人:米迪缪尼有限公司;西雅图基因公司