黄酮碳苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物中的应用的制作方法

专利名称：：黄酮碳苷类化合物在制备治疗和预防肝炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于制药领域，涉及通式I代表的黄酮碳苷化合物在制备预防及治疗肝炎药物中的应用。技术背景肝病是严重威胁人类健康的常见传染病、多发病之一，根据病因可分为病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、药物中毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝、遗传代谢性肝病和其他感染因子引起的肝炎。肝炎中以病毒性肝炎对人类危害最大，而病毒性肝炎中以乙肝和丙肝尤为突出。乙型肝炎是世界性疾病，全球约有3.5亿患者，我国是乙肝大国，乙肝表面抗原(HBsAg)阳性者约占总人口的1/10。目前全世界约有3亿(我国1,2亿)乙肝病毒携带者。近年来，国际医药界对防治肝炎药物研究工作比较活跃，主要针对抑制肝炎病毒复制、改善肝功能障碍、抗肝细胞脂质过氧化、免疫调节等方面进行研究。临床上常用的肝炎药物包括抗病毒类的干扰素、阿昔洛韦，免疫抑制剂环磷酰胺，保肝的水飞蓟素、联苯双酯等。目前，化学药物对于病毒性肝炎，尤其是慢性肝炎的防治尚无明确的疗效，并且存在着毒副作用等弊端。我国有着丰富的天然药物资源，在防治肝炎的临床应用等许多方面有着丰富的经验，并成功开发出茯芩多糖、甘利欣(甘草酸二铵)、水飞蓟素、联苯双酯等天然药物，并用于临床治疗，但由于肝炎发病机制较为复杂，多数药物疗效有限，对肝炎不能有效根治，故研究和开发出新一代的肝炎治疗药物是非常必要的。中药防治肝损伤作用主要为改善肝功能，降低血清谷丙转氨酶ALT、降低血清总胆红素Bil，增加血清白蛋白Alb;促进肝糖元合成，保护肝细胞，防止急慢性肝损伤造成的糖元合成障碍；改善肝细胞病理，对急性肝损伤能减轻细胞肿胀，防止脂肪变性、阻止肝纤维化；抑制肝胶原纤维、网状纤维增生。通常认为中药的抗肝伤作用在于能提高SOD或其他抗氧化酶活性，从而清除自由基，阻止肝细胞脂质过氧化，维持细胞膜的正常结构，避免细胞的损害。鸡骨草为豆科植物鸡骨草^fcn^omtom'eww:sHance和毛鸡骨草^6nw;noZfoHance的干燥全株。具有清热利湿、舒肝止痛、活血散瘀的功效，临床用于治疗急慢性肝炎、肝使化腹水、胃痛、风湿痹痛等症。主要分布于中国的南部地区，如广西、广东、福建及海南等。相思子属植物中鸡骨草治疗传染性肝炎疗效显著，从民间草药使用发展到中成药制剂，广泛应用于临床，现有鸡骨草冲剂、复方鸡骨草片、鸡骨草丸等剂型。目前国内外对药材鸡骨草和毛鸡骨草的化学成分研究较少，文献报道本植物分离得到脂肪酸、三萜、甾体、异黄酮等，已有的化学成分研究与药效活性筛选工作脱节，未能系统地阐明药材鸡骨草治疗肝炎的药效物质基础。文献报道鸡骨草提取物及鸡骨草中三萜皂苷槐花皂苷III和大豆阜苷I具有保肝降酶的活性(MiyaoH,efa/.KaikasaponinIIIandSoyasaponinI,majortriterpenesaponinsofJZvmomto;i/e腦-s，actonGOTandGPT:influenceontransaminaseelevationofratlivercellsconcomitantlyexposedtoCCUforonehour.刊a加flMeA'ai.1998，64(1):5-7.)。到目前为止，国内外均未明确提出鸡骨草治疗肝炎的药效物质基础，更无文献报道鸡骨草植物中治疗肝炎的有攻成分为黄酮碳苷类有效成分。为了寻找传统中药鸡骨草的治疗肝炎的药效活性成分，本发明对鸡骨草、毛鸡骨草进行系统的化学成分研究，结合与治疗肝炎相关的药效活性筛选，寻拔出本植物治疗肝炎的药效活性成分为5，7，4，-三羟基黄酮碳苷类化合物。
发明内容本发明所涉及的从豆科植物鸡骨草^nwcfl加om'e/wi'和毛鸡骨草/4&n^/mo肌j中提取分离的黄酮碳苷类化合物如通式I所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>1芹菜素-6，8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6，8-di-C-j3-D-glucopyranoside),Vicenin2芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(apigenin6-C-/f-D-glucopyranosyl-8-C-fl-Larabinopyranoside),Schaftoside3芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(apigenin6-C-a-L"Arabinopyranosyl-8-C-j3-D-Glucopyranoside)，Isoschaftoside本发明目的是提供通式I代表的化合物在制备预防及治疗乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎药物中的应用。本发明是同通过下述技术方案加以实现的，取广西产的毛鸡骨草药材^nw/noZfc经70%乙醇回流提取，减压回收至稠浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，正丁醇部分经硅胶、低压Cw柱及制备高效液相色谱分离纯化，分离得到化合物13。化合物l:淡黄色粉末(MeOH)，AlCl3反应阳性，提示为黄酮类化合物，mp235-236。C，结合13CNMR信息推断该化合物的分子式为C27H3o015。IR(KBr)Vn^cm":3397(OH)，1650(C=0)，1564(Ar),1512(Ar),1042(C-O)。力NMR(500MHz,DMSO-rf6)dppin:13.80(lH,s,C5-OH),10.33(IH,，C7-OH),9.40(IH,，C4'-OH),8.04(2H,d,J=8.7Hz,H-2'，6'),6.91(2H，d，/=8.7Hz，H-3'，5')，6.79(1H，s，3-H)，4.80(IH，(!，/=9.4Hz,H-l"ofGlc),4.71(IH，d，/=9.8Hz，H-l'"ofGlc)。13CNMR(125MHz，DMSO-rf6)dppm:163.7(C-2),102.2(C-3)，182.3(C-4),161.5(C-5),108.5(C-6)，159.9(C-7),105.1(C-8)，159.0(C-9)，103.9(C-IO)，121.4(C-l')，128.9(C-2',6'),115.9(C-3',5'),161.2(C-4'),73.9(C-l"ofGlc)，71,3(C-2"ofGlc),78.8(C-3"ofGlc),70.3(C-4"ofGlc)，81.1(C-5")，61.2(C-6"ofGlc)，72.3(C-l"'ofGlc),70.1(C-2'"ofGlc)，79.2(C-3'"ofGlc),70.5(C-4"'ofGlc),81.8(C-5"'ofGlc),59.7(C-6mofGlc)。根据以上数据，并与文献对照，鉴定化合物1为芹菜素-6,8-二C-葡萄糖苷(apigenin-6,8-di-C-j3-D-glucopyranoside,Vicenin)。化合物2:淡黄色粉末，AlCl3反应阳性，盐酸一镁粉反应阳性，mp.201-203°C;Positive-ESI-MSm/z:587[M+Na]+结合^、"CNMR信息推断化合物2的分子式为C26H28014。IR(KBr)v證cm-1:3365(OH)，1649(C=0)，1583(C=C)，1512(OC)，1092(C-O)。^NMR(500MHz,DMSCW6)dppm:13.79(1H，s,C5-OH)，8.09(2H，d，J=6.7Hz，H-2'，6')，6.91(2H，d,J=8.8Hz，H-3',5'),6,75(1H，s，H國3)，4.78(1H,d，J=9.4Hz，H-l"ofGlc)，4.71(1H，d，J=9.8Hz,H-l"'ofAra)。13CNMR(125MHz，DMSO-^)3ppm:163.7(C-2)，102.2(C-3)，182.0(C-4),161.1(C-5),108.5(C-6),159.5(C-7),104.3(C-8),159.5(C-9),103.6(C-IO)，121.3(C-l'),129.0(C國2'，6')，115.9(C-3',5'),161.1(C國4')，73.6(C-l"ofGlc)，70.9(C-2"ofGlc)，78.7(C-3"ofGlc),70.1(C-4"ofGlc)，81.3(C-5"ofGlc)，60.9(C-6")，74.5(C-l"')，69.1(C-2'"),75.0(C-3'"),68.8(C-4'"),70.7(C-5"')。根据以上数据，并与文献对照，鉴定化合物2为芹菜素-6-(:-葡萄糖-8-(:-阿拉伯苷(apigenin6-C-》-D-glucopyranosyl-8-C-a-L"arabinopyranoside,Schaftoside)。化合物3:淡黄色粉末，AlCl3反应阳性，盐酸一镁粉反应阳性，mp.200-201。C;Positive-ESI-MSw/z:587[M+Na]+，结合111、13CNMR信息推断化合物3的分子式为C26H280"。IR(KBr)v迈战cm":3362(OH),1649(C=0)，1582(C=C)，1520(C=C),1090(C-O)。工HNMR(300MHz,DMSO-^)dppm:13.80(5-OH)，7.99(2H,d,>/=8.4Hz,H-2'，6'),6.89(2H，d,/=8.2Hz,H-3',5')，6.73(1H，s,H-3)4.80(1H,d,J=9.2Hz,H-l"ofGlc)，4.65(1H,d,J=8.8Hz,H隱l"'ofAra)。13CNMR(75MHz,DMSO-d6)3ppm:163.5(C-2),102.3(C-3),181.8(C-4)，161.1(C-5),108.2(C-6)，161.1(C-7)，104.4(C扁8)，154.8(C-9)，102.3(C-10)，121.6(C-l')，128.7(C-2',6')，115.8(C-3'，5')，158.4(C-4')，74.3(C-l"ofAra)，74,0(C-2"ofAra)，71.0(C-3"ofAra)，70.0(C-4"ofAra),68.6(C-5"ofAra)，73.3(C-l'"ofGlc),70.6(C-2mofGlc),78.9(C-3"'ofGlc)，70.5(C-4"'ofGlc)，81.8(C-5'"ofGlc),61.2(C-6"'ofGlc)。综合以上信息，并与文献比较，化合物3的以上数据与异夏佛塔苷一致，故鉴定化合物3为6-C-arabinosyl-8-C-glycopyranosylapigenin。以上所示序菜素黄酮碳苷类化合物的植物来源可以是豆科相思子属植物鸡骨草omtoWe^f和毛鸡骨草^^nwwo/fc，也可以是在豆科植物其他属植物中分离，如山蚂蟥属植物广金钱草￡>^附0^"附507^70//"/。其来源也可以是化学合成，也可以是在某个黄酮类化合物的基础上进行结构修饰或生物转化。本发明进一步提出芹菜素黄酮碳苷类化合物或以其为基本活性成分的组合物在制备预防和治疗乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎药物的应用，。芹菜素黄酮碳苷类化合物或以其为基本活性成分的组合物可以与药学上可以接受的载体组成药物组合物，制成各种制剂，包括胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸、注射剂等。给药途径为口服、注射等。本发明对芹菜素黄酮碳苷进行了药效学试验进行活性评价。一、黄酮碳苷对CCl4致小鼠原代肝实质细胞损伤的保肝活性筛选1、肝细胞分离小鼠Z.p.戊巴比妥麻醉，背位固定，腹正中V形切口，使腹腔充分暴露，行门静脉插管，向肝脏灌注预温37'C的前灌流液(无钙镁Hank's平衡盐溶液，内含0.5mMEGTA、25mMHEPES，PH7.4),同时打开后腔静脉，尽量冲尽肝组织中残血，然后打开胸腔，剪断前腔静脉，结扎后腔静脉，再用预温372C的灌流液(含0.1%胶原酶、4mMCaCl2、0.8mMMgS04的HBSS)继续灌流，控制流速约6ml/min，持续灌流数分钟后，待肝组织韧性消失，轻压不易恢复，停止灌流，立即将肝脏转移入冷的无血清RPMI-1640液中，用眼科镊去除肝包膜，轻轻抖动，分散肝细胞，将此肝细胞悬液用100目滤网过滤，滤液以50g离心2min,沉淀为肝实质细胞(hepatocytes,HC)。2、CCl4致肝损伤与转氨酶的释放试验在96孔培养板中加入HC，每孔细胞数为2x104，于37。C，5%(302培养4匕肝细胞单层用William'sE培养液洗涤2次，给药预培养3小时，弃上清，再加入CC14(0.15%)和药物共培养2小时或只加CCU培养2小时，吸取上清按试剂盒说明测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活力。每组药物三个浓度(100、30、10jimol/L)，每个浓度三个复孔，二铵盐(30fAmol/L)。实验结果见表l。表1黄酮碳苷对CCl4致原代肝实质细胞损伤的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>CCI4致原代肝实质细胞损伤活性筛选结果显示，CCl4造模组的ALT和AST活性明显高于正常对照组(p<0.01)。黄酮碳苷类化合物l、2和3均剂量依赖性地抑制CCl4损伤后肝实质细胞ALT、AST水平的上升，保肝降酶活性与阳性药甘草酸二铵盐基本相当，相同浓度的保肝降酶活性优于阳性药甘草酸二铵盐。二、黄酮碳苷对BCG+LPS致大鼠原代肝细胞损伤的保肝活性筛选1、大鼠原代肝细胞分离参照二步胶原酶灌注技术分离获取大鼠原代肝细胞。取正常大鼠或卡介苗(BCG)致敏12d的大鼠，乙醚麻醉，开腹，分离肝门静脉并行门静脉插管，以37。C的无钙灌流液灌流肝脏，剪断下腔静脉，分离周围组织，采用IV型胶原酶灌流液循环灌流数分钟，取出肝脏转移4。CMEG培养液，用MEG培养液清洗2次，用眼科镊去除肝包膜，轻轻抖动，分散肝细胞，将此肝细胞悬液用100目滤网过滤，滤液以50g离心2min，弃上清液，沉淀加培养液混悬均匀，同条件重复离心3次。0.4%台盼蓝染色，光镜下计数细胞产量与活率，活率在95%以上的肝细胞用于进一步实验。2、大鼠原代肝细胞免疫性损伤模型的建立及药物活性筛选将分离的正常或BCG致敏大鼠肝细胞接种于24孔培养板上，用MEM培养液稀释成2.5x105细胞/孔，37°C，5%C02培养约16h后，换以不含血清和地塞米松的MEM培养液，BCG致敏大鼠的肝细胞用10mg/L的脂多糖(LPS)攻击，造成免疫型肝损伤细胞模型，分别加入测试及阳性药物，培养16h,收集培养孔内的细胞上清液，置-20。C冰箱保存，按照试剂说明操作，测试ALT、AST、LDH活性和NO含量。每组药物三个浓度(100、30、1Onmol/L)，每个浓度三个复孔，阳性药物为甘草酸二铵盐(30jxmol/L)。实验结果见表2。表2黄酮碳苷对BCG+LPS致大鼠原代肝细胞损伤的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>p<0.05，p<0.01vsmodelgroup结果显示，BCG+LPS造模组肝细胞上清液的ALT、AST及LDH活性及NO含量明显高于正常对照组。黄酮碳苷化合物l、2、3，在测定剂量范围内，均能显著抑制卡介苗联合脂多糖所致的免疫性损伤后肝细胞ALT、AST、LDH及NO水平的上升，且相同浓度下效果优于甘草酸二铵盐组。三、黄酮碳苷对酒精致大鼠原代肝细胞损伤的保肝活性筛选1、大鼠原代肝细胞的分离与培养参照二步胶原酶灌注技术分离获取大鼠原代肝细胞。2、大鼠原代肝细胞酒精性损伤模型的建立及药物活性筛选将分离的大鼠原代肝细胞接种于24孔培养板中，用高糖DMEM培养液稀释成5.0x105细胞/孔中培养，37°C，5免C02培养约24h后，24h后更换含有受试药物的新鲜培养基或空白培养基，培养lh，再加入100mmol/L无水乙醇共同培养8h，收集培养孔内的细胞上清液，i"-^rc沐箱膝，按照试剂说明操作，iraMT、mr、mds^sod含量。wmwwh^浓度(100、30、10nmol/L)，每个浓度三个复孔，阳性药物为甘草酸二铵盐(30jimol/L)。实验结果见表3。表3黄酮碳苷对酒精致大鼠原代肝细胞损伤的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>p<0.05,p<0.01vsmodelgroup酒精致原代肝实质细胞损伤活性筛选结果显示，酒精造模组的AST、LDH、MDA活性明显高于正常对照组，SOD水平明显高于正常对照组(p<0.01)。黄酮碳苷类化合物l、2和3均剂量依赖性地抑制酒精损伤后肝实质细胞AST、MDA水平的上升，升高SOD水平，保肝降酶活性与阳性药甘草酸二铵盐基本相当，提示化合物l、2、3均具有减小酒精性肝损伤细胞的损伤程度、降低脂质过氧化、提高内源性抗氧化能力，对酒精性肝损伤具有较好的防护作用，且相同浓度下效果优于甘草酸二铵盐组。权利要求1.下列通式I的5，7，4’-三羟基黄酮碳苷类化合物，其中R1代表葡萄糖或阿拉伯糖，R2代表葡萄糖或阿拉伯糖，2.通式I代表的化合物在制备预防及治疗乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎药物及保健食品中的应用。全文摘要本发明属制药领域，下列通式I的5，7，4’-三羟基黄酮碳苷类化合物在制备预防及治疗乙型肝炎、免疫型肝炎及酒精性肝炎药物和保健食品中的应用，其中R₁代表葡萄糖或阿拉伯糖，R₂代表葡萄糖或阿拉伯糖。文档编号C07H17/00GK101161668SQ200710134589公开日2008年4月16日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者刘卓伟,叶文才,靖尚,张陆勇,江振洲,豪汪,非熊,赵守训申请人:中国药科大学