专利名称：一种胡萝卜子转脂多肽制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗菌多肽类化合物的提取、分离、纯化方法， 尤其是胡萝卜子转脂多肽制备方法，并通过该方法获得的胡萝卜子转 脂多肽作为药品、保健食品、食品、抗氧化剂、药品增效剂，药品配 方等及植物转基因抗病原体研究和应用。
背景技术：
抗菌肽是一类具有广谱高效杀菌活性的碱性多肽类物质，含有
10 100个氨基酸残基，成熟的抗菌肽来源于前体蛋白的水解，大多
数抗菌多肽由于富含碱性氨基酸而带净正电荷。由于最初被发现的是
其抗细菌功能，因而被命名为抗菌肽(antibacterial p印tides， AMPs)。根据植物多肽抗生素的氨基酸序列及二级结构，可将植物多 肽抗生素分为9类，包括硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、转月旨蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)、橡胶素 (heveins)、打结素(knottins)、凤仙花素(lb-AMPs)和新近发现 的荠菜素(sh印herdins)、蜕皮素(snakins)、环肽(cyclotides) 等。它们共同特点是具有广泛的抗真菌、细菌、抗HIV、抑制a淀粉 酶活性、抗氧化和紧縮子宫等作用。抗菌多肽作为抵御外界微生物的 第一道防线，有着强大而广泛的抗菌功能，是动物尤其是昆虫非特异 性免疫系统的重要组成部分。随着研究的不断深人，人们发现某些抗 菌肽还对部分真菌、原虫、病毒甚至癌细胞具有明显的杀伤作用，是 一类具有重要潜在应用价值的活性物质。尽管抗菌多肽作为古老的天 然抗微生物的物质，担负了极其重要的免疫功能，可是受到的关注也 比较少。目前，抗生素滥用导致的病原菌产生耐受力是困扰许多国家的一 个难题。寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一 问题最有效的 途径。抗菌肽具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生 耐药性等优点，是理想的抗生素替代品。植物，特别是植物种子在生 长过程中常会受到微生物侵袭，抗菌肽是直接参与^制微生物繁衍、 生长、繁殖的重要化学防御工具之一，因此在植物中寻找具有活性的 抗菌肽具有重要的理论及应用价值。
转脂蛋白(LTPs: Lipid transfer protein):是具有在两个细胞膜之 间转移磷脂功能的多肽。它是由60 90个氨基酸组成的小分子量的 蛋白质，它的结构是四个二硫的桥键结合中间形成水性隧道成结构。
胡萝卜的入药部位是全草，种子和根。胡萝卜富含3胡萝卜素， P胡萝卜素是一种抗氧化剂，可防止细胞变性，放慢老龄化的进程。 胡萝卜种子是驱风剂，兴奋剂，对胀气，多风绞痛，呃逆，痢疾， 慢性咳嗽有一定疗效，它还具有抗细菌和抗真菌特性。胡萝卜子油有 助于控制发痒的头皮，并提供必需的营养物质，促进头发的生长。
大量文献检索所知，目前国内外没有任何有关芹菜子、莳萝子、 胡萝卜子等药食用植物资源活性多肽类化合物的研究报道。在国内植 物多肽类化合物的研究尚处于初始阶段，研究范围小，研究主要集中 在药理、基因表达研究和综述等方面，对于多肽类化合物的化学研究 文献很有限，而且使用的方法中植物多肽类化合物回收低，不适用于 大规模制备，这很大程度上限制了多肽类活性化合物的应用和工业化 生产。
发明内容
本发明目的在于，提供一种胡萝卜子转脂多肽制备方法，采用提 取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，通过该方法获得的 胡萝卜子转脂多肽通过液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯 萎病的转脂多肽；通过Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为
N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝
氨酸-丝氨酸-异亮氨酸，该序列与烟草、大米、玉米转脂蛋白的氨基
酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、热稳定性和具有很强
的抗棉花枯萎病活性。可作为制备药品、保健食品、食品、食品添加 剂或药品增效剂的应用。同时还可作为制备植物转基因抗病原体的应 用，是转基因研究培育增强抗病植物的最佳物质基础。为利用新疆伞 形科属维药多肽类化合物的新药开发研究提供可行实验方法。
本发明所述的一种胡萝卜子转脂多肽制备方法，该方法采用提 取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，具体操作按下列步
骤进行；
a、 将胡萝卜子用液氮冰冻研磨进行细胞破碎；
b、 利用pH 6. 8-8. 5磷酸钠缓冲溶液提取胡萝卜子总蛋白、脱盐、 剃度季氨盐沉淀、离心得到胡萝卜子总多肽，提取温度为0-15°C， 时间30 min-5 h;
c、 将胡萝卜子总多肽进行热处理，温度50—IO(TC的水浴中处 理5—50分钟，得到热稳定性多总肽； '
d、 胡萝卜子总多肽应用阴离子交换层析方法分离总阴离子多肽；
e、 胡萝卜子总阴离子应用阳离子交换柱得到总阳离子多肽；
f、 胡萝卜子总阳离子多肽脱盐，冷冻干燥得到总多肽粉。 步骤b胡萝卜子总蛋白质利用分子量限制在1000 Da透析袋进行脱盐。
步骤b利用低温离心机离心除去沉淀，专速为200-12000prm ， 4 。C，离心l-60分钟。
步骤d利用纤维素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换柱层析，在 pH 7. 1-9. 0缓冲溶液分离阴离子性多肽。
步骤e利用羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换柱层析，在pH 4.0-6.8缓冲溶液得到胡罗卜子总阳离子多肽。
通过液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯萎病的转脂多 肽。 .
通过Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸 -异亮氨酸。
所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、保健食 品、食品、抗氧化剂或药品增效剂的用途。
所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作为制备植物转基因 抗病原体的用途。
本发明所述的方法实验步聚为
1. 取胡萝卜子粉用液氮冰冻破碎胡萝卜子细胞。
2. 液氮处理过的胡萝卜子粉在缓冲溶液中在4。C搅拌提取2h， 并冷冻离心机离心取上层溶液，冷冻干燥得到总蛋白质；
3. 胡萝卜子总蛋白质在85。C水浴上热处理15分钟，并冷冻离 心去热变性高分子量蛋白质，并离心取上清液；
依次相对饱和度为1 30%的硫酸氨沉淀蛋白质提取溶液，并4 'C下放置12小时，梯度沉淀3次，取上清液；
4. 将取上清液低温离心机离心，取上清液用饱和度为30 80% 的硫酸氨沉淀，并4'C下放置12小时梯度沉淀3次，低温离心机离 心得到胡罗卜子总多肽，并低温干燥机干燥得到粉末胡罗卜子总多 肽；
5. 取胡萝卜子豆总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限 制在IOOO Da透析袋用pH 8.9的NH4Ac缓冲液透析过夜；
6. 将透析袋过pH 8.9的MUc缓冲液平衡5次的纤维素二乙 基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱，并收集与阴离子柱子未结合的 馏分收集、合并；
7. 阴离子交换柱子未结合的溶液中在搅拌下滴加醋酸(HAc)，
调节调溶液pH6.0，并过pH6.0的NH4Ac缓冲液平衡5次的阳离子 羧甲基纤维素TSK-650M柱子，被填料吸附的阳离子多肽,利用0-1M剃 度浓度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac缓冲液洗脱，并收集280nm有自外 吸收的洗脱液合并，用交联葡聚糖-G-15层析柱子脱盐，得到阳性胡 罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多肽.
8.总多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在以下剃度溶剂系统 分离得到单体多肽类化学成分。高效液相溶剂系统为溶剂A: TFA (0.1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波长226 nm;剃度 (%/min) : 0-5%/0-5 min， 5-60%/5. 1-35 min; 60%/35. 1-40 min; 60-5%/40. 1-45 min。
本发明所述方法获得的胡萝卜子转脂多肽，通过Edman降解法确 定其部分N-端氨基酸序列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸 -谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸。该序列与其他 来源转脂蛋白部分N-端序列一直性比较见表 . 表本发明胡萝卜子转脂蛋白部分N-端序列与其他来源转脂蛋白部
分N-端序列一直性比较
非专一性转脂多 肽(nsLTP)的来源残基数N-段序列同一性，％
胡罗卜籽10ISCGqVTSSI100
玉米10ISCGQVASAI90
大米10ISCGQVMSY^70
烟草10I工CGQVTSML" 70
橙子1060
菠菜籽10I工CGMVSSKL50
图1为本发明胡萝卜子中转脂蛋白的液质联用色谱(LC-MS)图
具体实施例方式
实验材料
磷酸钠缓冲溶液的配制用歸P。4 (10 mM)， NaH2P04 (15 mM)， KC1 (100 mM)，EDTA(1.5 mM)，和(PVP)聚乙烯吡咯烷酮(1. 5%)搅拌 溶解成pH 7. 3溶液.此缓冲溶液在4°C搅拌2 h并分别加硫脲和 PMSF溶解在异丙醇至最终浓度分别达到2和l mM即可待用.
,0.05M ， pH8. 9的HAc/MUc缓冲液的配制称取3. 75克NH4Ac 在搅拌下用酸度计来滴加氨水至溶液pH 7. 1-9.0。
0.05M ， pH6.0的HAc/NH4Ac缓冲液的配制称取3. 75克NH4AC 在搅拌下用酸度计来滴加醋酸至溶液pH 4.0-6.8。
阴离子交换柱准备纤维素二乙基氨乙基-SN-23柱子利用 0. 05M ， pH 7.1-9.0的HAc/NH4Ac缓冲液平衡5次。
阳离子交换柱的准备:羧甲基纤维素TSK-650M柱子利用0. 05M ， pH 4. 0-6. 8的HAc/歸c缓冲液平衡5次。
实施例1
取新鲜胡萝卜子清洗，用液氮冷冻粉碎，粉碎样品用pH 7.3磷 酸钠缓冲溶液在温度4"C搅拌提取2 h，将提取液冷冻离心取上层溶 液，冷冻干燥得到总蛋白质； '
将胡萝卜子总蛋白质在85'C水浴上热处理15分钟，冷冻离心取 上清液；
将上清液分别用饱和度为1-10%的硫酸氨4。C下放置12小时， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小时，20-30%的硫酸氨4。C下放置12 小时进行梯度沉淀3次，取上清液，离心；
将离心后的上清液分别用饱和度为30-50%的硫酸氨4"C下放置 12小时，50-60%的硫酸氨4'C下放置12小时，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小时进行梯度沉淀3次，低温离心，温度4'C，转速12000 prm，时间1分钟，得到胡萝卜子总多肽，并低温干燥得到粉末胡萝 卜子总多肽；
取胡萝卜子总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限制在
1000 Da透析袋用pH 7.1的NH4Ac缓冲液，采用截流分子量为1 kD 的透析膜对缓冲溶液透析24小时；
将透析袋用0. 05M ， pH 7. 1的HAc/MUc缓冲液平衡5次的纤维 素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱层析，并收集与阴离子柱
子未结合的馏分收集、合并；
将阴离子交换柱子未结合的溶液再用0.05M ，pH4.0的HAc/MUc 缓冲液平衡5次的羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换树脂柱层析， 得到阳离子多肽；
将阳离子多肽用0-1M剃度浓度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac缓冲液 洗脱，并收集280nm有自外吸收的洗脱液合并，用交联葡聚糖-G-15层 析柱子脱盐，得到阳性胡罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多 肽；
将总多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶剂系统分离得 到单体多肽类化学成分；高效液相溶剂系统为溶剂A: TFA (0. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波长226 nm;剃度(％/min): 0-5%/0-5 min， 5-60%/5. 1-35 min; 60o/Q/35. 1-40 min; 60_5%/40. 1-45 miru
通过本发明所述方法获得的胡萝卜子转脂多肽，经过反相高效液 相色谱分离得到，并液质联用色谱确定其分子量为'9624的抗棉花枯 萎病的转脂多肽。同时经Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列 为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸 -丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸。该胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、保 健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用，同时也 可作为制备植物转基因抗病原体的应用。
实施例2
取新鲜胡萝卜子清洗，用液氮冷冻粉碎，粉碎样品用pH 6.8磷 酸钠缓冲溶液在温度0。C搅拌提取30分钟，将提取液冷冻离心取上 层溶液，冷冻干燥得到总蛋白质；
将胡萝卜子总蛋白质在5(TC水浴上热处理5分钟，冷冻离心取 上清液；
将上清液分别用饱和度为1-10%的硫酸氨4"C下放置12小时， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小时，20-30%的硫酸氨4"C下放置12 小时进行梯度沉淀3次，取上清液，离心；
将离心后的上清液分别用饱和度为30-50%的硫酸氨4'C下放置 12小时，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小时，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小时进行梯度沉淀3次，低温离心，温度4'C，转速200 prm， 时间60分钟，得到胡萝卜子总多肽，并低温干燥得到粉末胡萝卜子 总多月太；
取胡萝卜子总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 8.0的NH4Ac缓冲液，采用截流分子量为1 kD 的透析膜对缓冲溶液透析24小时；
将透析袋用0. 05M ， pH 8. 0的HAc/NH4Ac缓冲液平衡5次的纤维 素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱层析，并收集与阴离子柱 子未结合的馏分收集、合并；
将阴离子交换柱子未结合的溶液再用0. 05M ， pH 5. 0的HAc/NH4Ac 缓冲液平衡5次的羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换树脂柱层析， 得到阳离子多肽；
将阳离子多肽用0-1M剃度浓度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac缓冲液 洗脱，并收集280nm有自外吸收的洗脱液合并,用交联葡聚糖-G-15层 析柱子脱盐，得到阳性胡罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多 肽；
将总多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶剂系统分离得
到单体多肽类化学成分；高效液相溶剂系统为溶，A:TFA(O. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波长226 nm;剃度(％/min): 0—5%/0—5 min， 5—600/0/5. 1—35 min; 60%/35. 1—40 min; 60—5%/40. 1-45 min。
通过本发明所述方法获得的胡萝卜子转脂多肽，经过反相高效液 相色谱分离得到，并液质联用色谱确定其分子量为9624的抗棉花枯 萎病的转脂多肽。同时经Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列 为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸 -丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸。该胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、保 健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用，同时也 可作为制备植物转基因抗病原体的应用。
实施例3
取新鲜胡萝卜子清洗，用液氮冷冻粉碎，粉碎样品用pH 8.0磷 酸钠缓冲溶液在温度1(TC搅拌提取3h，将提取液冷冻离心取上层溶 液，冷冻干燥得到总蛋白质；
将胡萝卜子总蛋白质在75t水浴上热处理35分钟，冷冻离心取 上清液；
将上清液分别用饱和度为卜10%的硫酸氨4t:下放置12小时， 10-20%的硫酸氨4'C下放置12小时，20-30%的硫酸氨4"下放置12 小时进行梯度沉淀3次，取上清液，离心；
将离心后的上清液分别用饱和度为30-50%的硫酸氨4'C下放置 12小时，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小时，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小时进行梯度沉淀3次，低温离心，温度4°C ，转速1000 prm， 时间10分钟，得到胡萝卜子总多肽，并低温干燥得到粉末胡萝卜子 总多肽；
取胡萝卜子总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 8.5的NH4Ac缓冲液，采用截流分子量为1 kD 的透析膜对缓冲溶液透析24小时；
将透析袋用0. 05M ， pH 8. 5的HAc/MUc缓冲液平衡5次的纤维 素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱层析，并收集与阴离子柱 子未结合的馏分收集、合并；
将阴离子交换柱子未结合的溶液再用0.05M ，pH'6.0的HAc/MUc 缓冲液平衡5次的羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换树脂柱层析， 得到阳离子多肽；
将阳离子多肽用0-1M剃度浓度的NaCl在pH 6. 0的N仏Ac缓冲液 洗脱，并收集280nm有自外吸收的洗脱液合并,用交联葡聚糖-G-15层 析柱子脱盐，得到阳性胡罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多 肽；
将总多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶剂系统分离得 到单体多肽类化学成分；高效液相溶剂系统为溶剂A:TFA(O. 1%); B: C腦;流速1 ml/min;紫外吸收波长226 nm;剃度(％/min): 0-5%/0-5min， 5-60%/5. 1-35 min; 60%/35. 1-40min; 60-5%/40. 1-45 min0
通过本发明所述方法获得的胡萝卜子转脂多肽，经过反相高效液 相色色谱分离得到，并液质联用色谱确定其分子量为9624的抗棉花 枯萎病的转脂多肽。同时经Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序 列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨 酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸。该胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、 保健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用，同时 也可作为制备植物转基因抗病原体的应用。
实施例4
取新鲜胡萝卜子清洗，用液氮冷冻粉碎，粉碎样品用pH 8. 5磷 酸钠缓冲溶液在温度15'C搅拌提取5h，将提取液冷冻离心取上层溶 液，冷冻干燥得到总蛋白质；
将胡萝卜子总蛋白质在IO(TC水浴上热处理50分钟，冷冻离心 取上清液；
将上清液分别用饱和度为1-10%的硫酸氨4。C下放置12小时， 10-20%的硫酸氨4。C下放置12小时，20-30%的硫酸氨4。C下放置12 小时进行梯度沉淀3次，取上清液，离心；
将离心后的上清液分别用饱和度为30-50%的硫酸氨4"C下放置 12小时，50-60%的硫酸氨4。C下放置12小时，60-80%的硫酸氨4°C 下放置12小时进行梯度沉淀3次，低温离心，温度4°G，转速2000 prm， 时间40分钟，得到胡萝卜子总多肽，并低温干燥得到粉末胡萝卜子 总多肽；
取胡萝卜子总多肽加蒸馏水至完全溶解，并利用分子量限制在 1000 Da透析袋用pH 9. 0的NH4Ac缓冲液，采用截流分子量为1 kD 的透析膜对缓冲溶液透析24小时；
将透析袋用0. 05M ， pH 9. 0的HAc/丽4Ac缓冲液平衡5次的纤维 素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换树脂柱层析，并收集与阴离子柱 子未结合的馏分收集、合并；
将阴离子交换柱子未结合的溶液再用0.05M ，pH'6.8的HAc/MUc 缓冲液平衡5次的羧甲基纤维素TSK-650M阳离子交换树脂柱层析， 得到阳离子多肽；
将阳离子多肽用0-1M剃度浓度的NaCl在pH 6. 0的NH4Ac缓冲液 洗脱，并收集280nm有自外吸收的洗脱液合并，用交联葡聚糖-G-15层 析柱子脱盐，得到阳性胡罗卜子总多肽成分，冷冻干燥得到粉末总多 肽；
将总多肽利用碳十八柱子反相高效液相，在剃度溶剂系统分离得 到单体多肽类化学成分；高效液相溶剂系统为溶，jA:TFA(O. 1%); B: CH3CN;流速1 ml/min;紫外吸收波长226 nm;剃度(。/。/min): 0-5%/0-5min， 5-60%/5.卜35min; 60%/35. 1-40 min; 60_5%/40. 1-45miru
通过本发明所述方法获得的胡萝卜子转脂多肽，经过反相高效液 相色色谱分离得到，并液质联用色谱确定其分子量为9624的抗棉花 枯萎病的转脂多肽。同时经Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序 列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨 酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸。该胡萝卜子转脂多肽作为制备药品、 保健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用，同时 也可作为制备植物转基因抗病原体的应用。
权利要求
1、一种胡萝卜子转脂多肽的制备方法，其特征在于采用提取、分离、纯化从胡萝卜子中制备转脂多肽，具体操作按下列步骤进行；a、将胡萝卜子用液氮冰冻研磨进行细胞破碎；b、利用pH 6.8-8.5磷酸钠缓冲溶液提取胡萝卜子总蛋白、离心，剃度季氨盐沉淀、离心，脱盐、离心得到胡萝卜子总多肽，提取温度为0-15℃，时间30min-5h；c、将胡萝卜子总多肽进行热处理，温度50-100℃的水浴中处理5-50分钟，离心分离热不稳定的多肽，得到热稳定性总多肽；d、胡萝卜子总多肽应用阴离子交换色谱方法分离总阴离子多肽；e、胡萝卜子总阴离子应用阳离子交换色谱方法得到总阳离子多肽；f、胡萝卜子总阳离子多肽脱盐，冷冻干燥得到总多肽粉。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b胡萝卜 子总蛋白质利用分子量限制在1000 Da透析袋进行脱盐。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤b利用低 温离心机离心除去沉淀，专速为200-12000prm ， 4°C，离心1-60分钟。
4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤d利用纤 维素二乙基氨乙基-SN-23阴离子交换柱层析，在pH7. 1-9.0缓冲溶液分离阴离子性多肽。
5、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤e利用羧 甲基纤维素TSK-650M阳离子交换柱层析，在pH 4.0-6.8缓冲溶液得到胡罗卜子总阳离子多肽。
6、 根据权利要求1所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽， 其特征在于通过高效液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯萎病的转脂多肽。
7、 根据权利要求1所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽， 其特征在于通过Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为N-异 亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸 -丝氨酸-异亮氨酸。
8、 根据权利要求1所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作 为制备药品、保健食品、食品、抗氧化剂或药品增效剂的用途。
9、 根据权利要求1所述的制备方法获得的胡萝卜子转脂多肽作 为制备植物转基因抗病原体的用途。
全文摘要
本发明涉及一种胡萝卜子转脂多肽制备方法和应用，采用提取、分离、纯化方法从胡萝卜子中制备转脂多肽，通过该方法获得的胡萝卜子转脂多肽经液相色谱分离得到分子量为9624的抗棉花枯萎病的转脂多肽；经Edman降解法确定其部分N-端氨基酸序列为N-异亮氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-苏氨酸-丝氨酸-丝氨酸-异亮氨酸；该序列与烟草、大米、玉米转脂蛋白的氨基酸序列具有高度一直性；并具有很好的水溶性、热稳定性和具有很强的抗棉花枯萎病活性。可作为制备药品、保健食品、食品、食品添加剂、抗氧化剂或药品增效剂的应用。同时还可作为制备植物转基因抗病原体的应用，是转基因研究培育增强抗病植物的最佳物质基础。
文档编号C07K14/415GK101200494SQ200710180048
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者吕俏莹, 阿不力米提·伊力, 阿吉艾克拜尔·艾萨 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所