一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法

专利名称：一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质纯化方法，具体地是涉及一种使用羧甲基离子交换色谱纯 化贻贝粘蛋白的方法。
背景技术：
贻贝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein, MAP),也叫紫贻贝足丝蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)来自海洋贝类紫贻贝，M^/7^e^to，它有在近海耐受波浪影响的 能力，它在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面 上，形成抗水的结合，从而将自己固定。在玻璃上的研究显示，蛋白胶形成了斑，从 斑延伸开，有很强的抗张强度(106- 107 newtoivmeter—2)，而斑内物质包含了贻贝粘蛋 白MAP。
贻贝粘蛋白含有L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-Dopa)，它由酪氨酸酶对酪氨酸残基的 作用形成。L-DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致了贻贝和特殊表面 纤维内强而持久的胶接，其生物粘附的机理很有趣。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性和 免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，作为医用手术尤其是眼科手术胶已经引起 注意。
全世界每年进行1100万例白内障手术，我国白内障的发病率非常高，50岁以上 人群中白内障发病率29.64%， 70岁以上人群发病率高达60%。随着社会老龄化的加 剧，这一数字还会上升。目前医生可以用两种闭和方式结束眼科手术让伤口自行愈 合或是用尼龙线缝合切口，每种闭合方法都各有缺点自愈有感染和眼内液体泄露的 危险；缝合会有感染发炎及血管发育异常的危险。而贻贝粘蛋白贻贝粘蛋白能在低浓
度下交联，并形成可注射到不规则形状部位的低粘性液体，这种溶液可凝固而填充到 指定空间，在几分钟内可封闭切口，少于缝合所需时间。贻贝粘蛋白还形成了一个不
可破坏的封条，在大于正常人眼压12倍的压力下不会使眼内液体发生泄露。贻贝粘蛋
白具有和眼角膜近似的折射率，不会干扰光线到达视网膜。
另外，贻贝粘蛋白的生物降解性质使其对环境很友好，也可用于其他领域，如通
用的生化粘接试剂、医用组织粘接及密封剂，医用愈伤基质，牙医粘接和密封剂，医 用设备表面涂层试剂，水下作业设备涂层等。
贻贝粘蛋白中L-DOPA含量高于11%，富含多酚基团，被认为是多酚蛋白质，它 适宜作为氢键色谱吸附剂的理想纯化目标，这种高选择性的反应使从紫贻贝足丝粗提 取物中一步纯化贻贝粘蛋白蛋白质成为可能。
贻贝粘蛋白纯化通常将以下技术组合应用提取、盐析、示差沉淀、离子交换色 谱、疏水相互作用色谱、反相色谱、亲和色谱和分子排阻色谱，但活性蛋白质收率低 仅为15%。工艺复杂，规模制备成本高、周期长，对pH值和盐浓度敏感而导致稳定 性难控制，有必要研究新的色谱方法获取高纯度、高活性的贻贝粘蛋白。
贻贝粘蛋白由于L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的含量高达11%而富含多酚基 团被认为是多酚蛋白质。L-DOPA在胶纤维形成过程中的反应性暴露在表面，其酚羟 基是氢键供体，可使用包含适当氢键受体吸附剂的氢键色谱进行分离；其苯环结构可 形成疏水键，可利用疏水相互作用进行分离；其赖氨酸氨基的正电荷，可形成静电键。 可利用贻贝粘蛋白结构中的这些特点，以上述氢键吸附、疏水作用、静电吸附三种原 理进行分离。
蛋白质这类生物药物或生物医学材料的分离纯化主要通过色谱技术及其组合，所 用介质材料主要是凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和、反相介质，其基质材 料有琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是目前生物医药研发和生产中 使用最为普遍的规模制备用分离介质，该基质具有高孔度(卯-96%)，即使在高浓度 下也能保持高的孔度；具有连接纤维的开放的结构；高的连通性有效保证了分子内物 质传递；大比表面积可提供了很高的吸附能力易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的 球形颗粒以满足不同领域的需求；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；低 的非特异性吸附使应用面较广；具有弹性及非脆性(较易实现柱子的再装填)又可通 过足够的交联步骤使介质具有刚性(有较高的耐压性能)；可用不同的活化步骤进行共 价交联而活化，可被大量配基取代而应用于多种吸附色谱技术。本发明所涉及分离纯 化的核心技术采用琼脂糖基质介质。

发明内容
本发明的目的在于克服使用传统的离子交换和凝胶过滤方法纯化贻贝粘蛋白收率
低的问题，采用琼脂糖基质的羧甲基离子交换凝胶CM Sepharose FF或CM S印harose HP结合凝胶过滤介质Superdex 200或Sephacryl S-200分离纯化贻贝粘蛋白，提高分 离纯化的选择性，提高活性贻贝粘蛋白的收率。 本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。
本发明提供的使用以羧甲基离子交换色谱结合凝胶过滤色谱为核心的分离纯化贻
贝粘蛋白的方法，包括如下步骤
1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸为提取溶齐1」，100 g贻贝足丝加300-1000 ml 提取溶剂，10-25。C浸提10-20 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀 悬浮于提取溶剂中；
2) 以10000-16000 r/min离心30-50 min或以45 滤膜过滤去除残渣，保留上
清；
3) 用S印hadex G-25或G-50去除小分子化合物，流动相为pH 2.0-6.0的10-80 mM 的醋酸钠缓冲液，添加0.1-0.6 M氯化钠，收集穿透峰；
4) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
5) 采用CM Sepharose FF或CM S印harose HP羧甲基离子交换介质，流动相 pH3-6，吸附流动相为0-0.5 M氯化钠，洗脱采用10-20柱体积内0.5-1.2 M氯化钠线 性梯度洗脱；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
7) 采用Superdex 200或Sephacryl S-200凝胶过滤介质，以0.1-0.6 M氯化钠和 0.5-4%柠檬酸或1-5%乙酸为流动相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
9) 用0.5-3。/。的柠檬酸4。C透析，4。C保存；
10) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度十二垸基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),硝酸银染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量标准蛋 白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
11) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色采用12-20%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pHlO)， 10-25 °C染色1-3 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。
本发明提供的使用以羧甲基离子交换色谱结合凝胶过滤色谱为核心的分离纯化贻 贝粘蛋白的方法，首次在贻贝粘蛋白的分离纯化中使用CM系列这种连接了羧甲基 (0-CH2COCT)的离子交换介质，较其他种类离子交换介质的选择性高、活性目标蛋 白质收率高。


图1为实施例1采用CM Sepharose FF介质结合Superdex 200介质分离贻贝粘蛋 白，使用紫外检测器280 nm进行在线检测的色谱图。
图2为实施例2采用CM Sepharose HP结合Sephacryl S-200介质分离贻贝粘蛋白， 使用紫外检测器280 nm进行在线检测的色谱图。
具体实施例方式
实施例1 、采用CM Sepharose FF介质结合Superdex 200介质分离纯化贻贝粘蛋白
1) 以0.5%高氯酸和2%乙酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加400 ml提取溶剂， 18°C浸提12 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂 中；
2) 以12000 r/min离心35 min，保留上清；
3) 用Sephadex G-25去除小分子化合物，流动相为pH 2.5的20 mM的醋酸钠缓 冲液，添加0.15M氣化钠，收集穿透峰-，
4) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
5) 采用CM Sepharose FF离子交换介质，流动相pH4，吸附流动相为0.1 M氯 化钠，洗脱采用10-20柱体积内0.5-1.2 M氯化钠线性梯度洗脱；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
7) 采用Superdex 200凝胶过滤介质，以0.2 M氯化钠和0.5%柠檬酸为流动相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
9) 用0,5y。的柠檬酸4。C透析，4。C保存；
10) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用18%浓度十二垸基磺酸钠(SDS)-聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),硝酸银染色，15。C染色2h，以高分子量标准蛋白质标 记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
11) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色采用15%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pHlO)， 15。C染色2h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。
得到纯度99%的贻贝粘蛋白。
实施例2、采用CM Sepharose HP结合Sephacryl S-200介质分离纯化贻贝粘蛋白
1) 以1%高氯酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加300 ml提取溶剂，15 °C浸提15 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其悬浮于提取溶剂中；
2) 以45pm滤膜过滤去除残渣，保留上清；
3) 用Sephadex G-50去除小分子化合物，流动相为pH 3.0的30 mM的醋酸钠缓 冲液，添加0.2M氯化钠，收集穿透峰；
4) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
5) 采用CM Sepharose HP离子交换介质，流动相pH5，吸附流动相为0.3 M氯 化钠，洗脱采用10-20柱体积内0.5-1.2 M氯化钠线性梯度洗脱；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
7) 采用Sephacryl S-200凝胶过滤介质，以0.4 M氯化钠和1.5%柠檬酸为流动相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；
9) 用1.5%的柠檬酸4 °C透析，4 °C保存；
10) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用15%浓度十二垸基磺酸钠(SDS)-聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),硝酸银染色，20。C染色2h，以高分子量标准蛋白质标 记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
11) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色采用12.5%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pHlO)， 20。C染色1.5h,贻贝粘蛋白将被特异性显色。
得到纯度98%的贻贝粘蛋白。
权利要求
1、一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法，结合凝胶过滤色谱，提供一种高收率的贻贝粘蛋白纯化方法。
2、 如权利要求1所述的使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下的步骤1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加300-1000 ml 提取溶剂，10-25。C浸提10-20 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其悬浮 于提取溶剂中；2) 以10000-16000 r/min离心30-50 min或以45 滤膜过滤去除残渣，保留上清；3) 用S印hadex G-25或G-50去除小分子化合物，流动相为pH 2.0-6.0的10-80 mM 的醋酸钠缓冲液，添加0.1-0.6 M氯化钠，收集穿透峰；4) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；5) 采用CM Sepharose FF或CM Sepharose HP离子交换介质，流动相pH3-6之 间，吸附流动相为0-0.5 M氯化钠，洗脱采用10-20柱体积内0.5-1.2 M氯化钠线性梯 度洗脱；6) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；7) 采用Superdex 200或Sephacryl S-200凝胶过滤介质，以0.1-0.6 M氯化钠和 0.5-4%柠檬酸或1-5%乙酸为流动相；8) 以Millipore CENTRIPLUS超滤膜浓縮馏分；9) 用0.5-3。/。的柠檬酸4。C透析，4。C保存；10) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，硝酸银染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量标准蛋 白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD;11) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色采用12-20%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用NBT-氨基乙酸溶液(pH10)， 10-25 。C染色l-3h，贻贝粘蛋白将被特异性显色。
全文摘要
本发明涉及一种使用羧甲基离子交换色谱纯化贻贝粘蛋白的方法。贻贝粘蛋白中含有L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)基团，其赖氨酸带有强正电荷，可形成静电键。采用CM系列这种连接了羧甲基(O-CH₂COO^-)的离子交换介质分离纯化贻贝粘蛋白，较其他种类离子交换介质的选择性高、收率高。采用强酸提取，以脱盐柱去除小分子化合物，利用琼脂糖基质的羧甲基离子交换介质结合凝胶过滤介质分离纯化贻贝粘蛋白，采用乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过四氮唑蓝特异性显色鉴别贻贝粘蛋白，提高了活性贻贝粘蛋白的收率。
文档编号C07K4/00GK101348518SQ20071017949
公开日2009年1月21日 申请日期2007年12月14日 优先权日2007年12月14日
发明者孟桂凤, 邢思亮 申请人:北京康铭优盛生化技术有限公司