一种多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：多氧霉素属于肽基核苷类抗生素，这类抗生素除了多氧霉素外，还包括新多氧霉素、白霉素、氨基嘌呤霉素、三原霉素和尼可霉素。多氧霉素在日本已经实现了商业化生产，并在农业上作为抗真菌农药广泛使用。多氧霉素是可可链霉菌阿索变种(5"trepfo/n7cescacaw'var.awe/w's)产生的，是第一个发现抑制真菌细胞壁几丁质生物合成的核苷类抗生素，主要用于防治植物病源真菌感染。多氧霉素的吡啶碱基核苷主要有尿苷、胸腺嘧啶、HMU(5-羟甲尿嘧啶)和5-羧酸尿嘧啶四种。结构上，多氧霉素是UDP-GlcNAc的结构类似物，竞争性抑制几丁质合成酶的活性(Endo，A.,Kakiki，K.,andMisato,T.1970.MechanismofactionoftheantifugalagentpolyoxinD./5acterio丄104:189-196;HoriM，EguchiJ，KakikiK,MisatoT.1974.Studiesonthemodeofactionofpolyoxins.VI.EffectofpolyoxinBonchitinsynthesisinpolyoxin-sensitiveandresistantstrainsofAlternariakikuchiana.(Tokyo).27(4):260-266)。多氧霉素作为农用抗真菌抗生素使用的优势在于1)毒性低，应用广泛，已在日本等国作为理想的生物农药应用于农业生产达30多年之久，不存在对环境的污染问题，是各国生产各种绿色食品的专家推荐首选用药。2)多氧霉素虽然已经应用数十年，但迄今未发现病原菌产生大规模的抗性。3)多氧霉素对作物非常安全，即使过量用药也不易产生药害。4)多氧霉素的使用浓度为50200ppm，有效作用剂量低，具有高效性。多氧霉素作用机制独特，它选择性地抑制真菌细胞壁的组成成份几丁质的合成。不同真菌细胞壁合成途径的相似性决定了这一产品的广谱性，多氧霉素对鞭毛菌、子囊菌、半知菌类二十五种真菌均有较强的抑制作用。多氧霉素除了作为农用抗真菌抗生素外，多氧霉素D对医学上重要的真菌有抑制作用。1991年Gottliebetal报道多氧霉素D处理白色念珠菌(Ca7&'c朋s)可以使其对上皮细胞的黏附率降低。这暗示多氧霉素某些组分可能在真菌引起疾病治疗上有应用前景。低浓度的多氧霉素D处理宫部旋孢腔菌(。C力Woi^7^肌'/aZ^3/2M)，形成渗透压敏感的原生质体样结构；高浓度下，能引起白色念珠菌成链化，末端的球状细胞对渗透压敏感，这些末端球状细胞经多氧霉素处理后放入水中会破裂，而在1.5MKC1溶液中发生质壁分离。由于多氧霉素对几丁质合成酶的抑制作用，白色念珠菌细胞可肿胀至原始大小的2到3倍(Endo，A.，Kakiki，K.,andMisato,T.1970.MechanismofactionoftheantifugalagentpolyoxinD./5a"e".o丄104:189-196;BeckerJM，CovertNL,ShenbagamurthiP，SteinfeldAS,NaiderF.1983.PolyoxinDinhibitsgrowthofzoopathogenicfungi^W肌'cro力^"e/"C力e鹏t力ar.23(6):926-929)。此外，多氧霉素还影响白色念珠菌萌发管的形成。从1965年多氧霉素首次从可可链霉菌中分离以来，以Isono为首的研究组通过底物添加，同位素示踪的方法推测出多氧霉素的合成途径，但至今还没有多氧霉素合成的基因被克隆的报道，对多氧霉素的生物合成的分子机制乃至对它的调控机制的研究至今仍属空白。研究表明，抗生素的生物合成涉及一系列复杂的生化反应，与此相关的基因成簇排列，它们的表达受到多水平多层次的调控。通常抗生素生物合成的调控主要在三个水平进行(1)途径特异性调控；(2)与抗生素和形态分化都相关的多效调控；(3)全局性调控。途径特异性调控基因(Pathway-SpecificRegulatoryGenes)只特异性地调控某种抗生素的生物合成。这些调控基因一般与抗生素生物合成基因成簇连锁在一起，调控它们的转录。大多数抗生素生物合成基因簇都包含途径特异性调控基因，有的是一个，有的是两个或更多。
发明内容本发明的目的是提供种多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的多氧霉素合成调控蛋白，名称为polR，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成调控功能的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列1由1112个氨基酸残基组成。为了使(a)中的polR分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的polR便于纯化，可在由序列表中序列l的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。表l.<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的polR可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的polR的编码基因可通过将序列表中SEQIDN2:2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端连上信号肽的编码序列，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因(pWy)也属于本发明的保护范围。所述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因(po_/y)的编码序列为自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列。上述多氧霉素合成调控蛋白的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一:1)序列表中序列2的DNA序列；2)编码序列表中序列1所示蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。其中，序列表中序列1是由3809个脱氧核苷酸组成，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列为编码序列。上述高严谨条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。含有上述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明的多氧霉素合成调控蛋白(1112aa)要比一般的抗生素生物合成调控蛋白(200-400aa)大很多，是一种新的抗生素调控蛋白。通过基因功能研究表明，当本发明的多氧霉素合成调控蛋白的编码基因po^的来源菌株可可链霉菌阿索变种中的po^被破坏，该菌株即失去了多氧霉素的产生能力，在/^7W被破坏的突变株中重新引入一个拷贝的/x^P基因可以使多氧霉素重新产生，表明该基因是一个多氧霉素合成正调控基因。实验证明，在可可链霉菌阿索变种中导入单个拷贝的po7y基因，可以使该菌株的多氧霉素产量提高2-3倍，说明本发明的多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因对多氧霉素的生产应用具有极其重要的意义，在提高多氧霉素产量(Polyoxin)方面具有极大的价值。图1为polR基因破坏突变株发酵液中多氧霉素的HPLC分析图谱图2为pSET152::po77质粒图谱图3为高产工程菌株中多氧霉素的活性检测图4为高产工程菌株产生多氧霉素产量的曲线图5为高产工程菌株中多氧霉素的HPLC分析具体实施例方式实施例i、多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因(po/y)的获得本发明以圈巻产色链霉菌中尼可霉素生物合成途径中结构基因s朋J作为探针筛选可可链霉菌cosmid文库，将筛选到的阳性克隆cosmid9A进行了亚克隆测序，并对其进行了序列测定及分析，共找到34个开放阅读框，其中p^7基因位于polyoxin生物合成基因蔟的侧翼。本发明的多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因(po7力的获得具体方法如下所述。1、探针的制备根据圈巻产色链霉菌^/7J基因的序列信息设计兼并引物(dxf:5'-GTGACCCTSATCCCSGACCTSATCGAG-3';dxr:5，-GACCGCGGCGGCGCGCAGRTCSGTSGC-3，)，以可可链霉菌阿索变种(6"trepto,ce51cacaojfvar.asoe"57'sstrain;购自CGMCC;AS4.1602)总基因组作为模板进行PCR扩增出466bp的DNA片段(序列表中序列3)，经过测序发现其编码的氨基酸序列与SanX同源性为70%，将该DNA片段用非放射性地高辛标记后作为基因克隆的探针。2、构建基因组cosmid文库提取可可链霄菌阿索变禾中(5Yreptcwycescscsoivar.ssoe/57's1strain;CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre);AS4.1602)总DNA，脉冲场电泳确保总DNA大小在200kb以上。选取限制性内切酶5"3iAX4对基因组进行酶切，控制酶切时间，保证酶切片段大小为30-50kb，将DNA片段用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行去磷酸化处理。将质粒supercosl(购自stratagene)用J力o/进行酶切回收，用CIAP进行去磷酸化处理，用fe/sHI进行酶切，得到分别两条6.9kb和lkbDNA片段作为载体臂。将酶切后的30-50kb的DNA片段与6.9kb和1kbDNA片段载体臂进行混合连接，连接产物用噬菌体包装蛋白进行包装转染￡coh'XblueMR菌株(购自stratagene)，涂布amp抗性LB平板，平均每1200个克隆即组成一个完整的可可链霉菌cosmid基因组文库。3、多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因(pWy)的获得将步骤1获得的466bp5朋I同源腦A片段作为探针，通过菌落杂交对步骤2获得的可可链霉菌的cosmid基因文库进行了筛选，将筛选得到的一个阳性克隆cosmid9A送与Invitrogen测序公司进行测序，将cosmid9A的测序结果(约40kb)进行分析，发现该序列侧翼显示了一个完整的开放阅读框(ORF)，将其命名为；o^。，^大小为3339bp，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列，编码一个由1112个氨基酸残基组成的蛋白质(PolR)，即序列表中序列1所示的氨基酸残基序列。在NCBI的蛋白质序列数据库中进行了同源性比较，发现PolR与链霉菌的抗生素生物合成调控蛋白(SARPs)(Liu,G.，Tian,Y.,Yang,H.，andTan,H.(2005)Apathway-specifictranscriptionalregulatorygenefornikkomycinbiosynthesisin5Yre/^o,ce51朋5Y5cArcwoge/e61thatalsoinfluencescolonydevelopment.#o/Mcro6io755:1855-1866)有较高的同源性，但它所编码的蛋白(1112aa)要比一般的抗生素生物合成调控蛋白(200-400aa)大很多，是一类新型的抗生素调控蛋白。结构预测分析发现该蛋白的氨基端存在一个大肠杆菌转录调控因子OmpR类型的DNA结合结构域(自序列表中序列1的氨基端的第30位到第110位氨基酸)。以可可链毒菌阿索变禾中(5Yr印to历yce51var.asoe/Li51strain;AS4.1602)总DNA作为模板，以P3:5，GCCGGTGGACGATGTTCG3，，P4:5，GAACGCTCCTGGTCGCTCATC3'为引物，进行PCR扩增，PCR体系为H2027ul，DMSO2.5ul，10XKODbuffer5ul，dNTP5ul，MgCl22ul(2mmol/L)，P3/P4浓度5pmol/ul各3ul，总DNA模板1.5ul(总DNA约50ng)，KODplus(TOYOBOCO.，LTD.Japan)lul，总体积50ul混匀，进行PCR，PCR程序为先95。C2min;然后94。C30s，55°C30s，68°C3.5min，共30循环；最后68°C延伸lOmin，结果得到3S09bp的片段，将该片段回收后进行测序，结果表明该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，即；o^基因片段，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列1的氨基酸残基序列。实施例2、po^基因的功能验证1、构建/^^阻断突变株并验证该突变对多氧霉素合成的影响1)p^y基因的破坏载体(pDR101)的构建在po^内部设计两个引物(Pl和P2);Pl:5'-GAACGCTCCTGGTCGCTCATC-3';P2:5'-ACGCCACCCTCCAGACCTACA-3'。以可可链霉菌阿索变种(5Yre/^，ycescscsdvssoe/75751strain;AS4.1602)总DNA作为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到长1885bp的DNA片段，经测序表明，该片段具有序列表中序列2的5'端第643—2527位核苷酸序列，将该片段命名位po^-7。将上述扩增得到的片段用平端插入到质粒pKC1139(BiermanM，LoganR，0BrienK,SenoET，RaoRN,SchonerBE(1992)PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStr印tomycesspp.Gene116:43-49)的fcoRV位点，获得重组载体，并对该重组载体进行酶切和测序验证，将经酶切和测序表明含有上述扩增得到的po7/-7片段的重组质粒命名位pKC1139::po^-7。将含有卡那霉素抗性基因DNA片段0eo」的质粒Supercosl(购自stratagene)，经和6kal双酶切后，回收1kb的DNA片段并用绿豆核酸酶进行平端化，插入到pKC1139::/^;-/质粒上的po77基因内部5)zal位点处，挑选卡那霉素片段插入方向与po^转录方向相同的重组质粒(pKC1139::poM-7::"eo)作为；a^基因的破坏载体，命名为pDR101。2)/70^基因破坏获得/70/y缺失突变株首先将pDR101转入Ecoh'ET12567(MacNeil，D.J.，Gewain，K.M.，Ruby，C.L.，Dezeny，G.，Gibbons,P.H.，andMacNeil,T.(1992)AnalysisofStreptoraycesavermitilisgenesrequiredforavermectinbiosynthesisutilizinganovelintegrationvector.Gene111:61-68.)，￡coZiET12567为dam—dcm—hsdS—菌株，将pDR101去除可能的限制与修饰，提取获得的Aco/iET12567转化子中的pDRlOl质粒，通过链霉菌PEGIOOO介导的原生质体转化的方法将pDRlOl转入可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)之中，以安普霉素为筛选标记阳性转化子。具体方法如下所述a.离心收集在YEME培养基(DifcoYeastExtract3g，DifcoTryptone5g，OxoidMaltExtract3g，Sucrose200g，加蒸馏水至lOOOral使用前加入下列灭过菌的溶液2ml2.5M的MgCl2.6H20溶液20ml质量百分含量为50%的Glucose溶液，50ml质量百分含量为10%的Glycine溶液)中培养约40小时的可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)菌体，用质量百分含量为10.3%的蔗糖溶液洗菌体2次；b.用2-4mg/ml的溶菌酶溶液(用原生质体缓冲液配置)悬浮步骤a得到的菌体，在3(TC酶解，至镜检形成原生质体；作用期间摇动试管几次，防止菌体沉到底部；c.在步骤b处理后的菌体中补加原生质体缓冲液(蔗糖103g，K2S040.25g，MgCl2*6H20,2.02g，微量元素液(ZnCl240mg，FeCl:i.6H20200mg，CuCl2.2H2010mg，MnCl2.4H20lOmg，Na2B407,10H2010mg，(NH4)爿07024.4H2010mg，加蒸馏水至1000ml)2ml，加蒸馏水至800ml，灭菌，用前每40ml加入灭过菌的下列溶液0.5ml质量百分含量为0.5。/。的KH2P04溶液，5ml质量百分含量为3.68%的CaCl22H20溶液，5ml质量百分含量为5.73%，pH7.2的TES溶液)过滤，获得原生质体悬液；d.将步骤c得到的原生质体悬液3000rpm离心10分钟，弃上清，用残余的原生质体缓冲液悬浮沉淀；加原生质体缓冲液洗1-2次，离心，弃上清，用残余的原生质体缓冲液悬浮沉淀；e.加入要转化的DNA(pDR101)，混匀，立即加入PEGIOOO溶液(用原生质体缓冲液配置)至终浓度25%(g/ml)，混匀，3分钟之内加入原生质体缓冲液，3000rpm离心7分钟，弃上清，用残余的原生质体缓冲液悬浮沉淀；f.加原生质体缓冲液，混匀，配成原生质体浓度约为108个/ml的原生质体悬浮液，每个R2YE平板(琼脂20g，蔗糖103g，MgCI26H2010.12g，K2S040.25g,微量元素液(ZnCl240mg，FeCl3.6H20200mg，CuCl2.2H20lOmg，MnCl2.4H2010mg，Na2B407.10H20lOmg，(NH4)gMoA^4H2010rag，加蒸馏水至1000ral)2ml，Difco酪蛋白氨基酸0.lg，DifcoYeastExtract5g，TES缓冲液(5.73%,pH7.2)lOOml，加蒸馏水至1000ml使用前加入灭过菌的下列溶液10ral质量百分浓度为0.5%的KH2P04溶液，4ml5mol/LCaCl22H20溶液，7mllmol/LNaOH溶液，20ml质量百分浓度为50%的Glucose溶液，15ml质量百分浓度为20%的L-proline溶液)用0.lml原生质体悬浮液涂布，28"C培养；16-24小时后每板加lul的安普霉素溶液(100mg/ml)。上述转化后的得到的抗安普霉素的转化子，随机挑选其中4个转化子转接至含有10ug/ml安普霉素(Apramycin)的YEME中富集菌体，经质粒提取、酶切验证，证明所得转化子都是转入pDRlOl质粒的阳性转化子。将上述筛选的其中一个转入pDRlOl质粒的阳性转化子转接至含有5ug/ml安普霉素的丽平板(琼脂10g，L一天冬酰氨0.5g，K2HP040.5g，MgS04.7H200.2g，FeS04.7H200.Olg，加蒸馏水至1000ml使用前加入灭菌的50ml10%甘露醇)上，2『C培养7天后，制备孢子悬液。经适当稀释后，以每个平皿104个孢子的浓度涂布在含有5ug/ml卡那霉素的MM平板上，于39°C咼温培养。pKC1139质粒具有温度敏感型复制子，在高于34X:条件下不能正常复制。因此，pDR101在39"C时不能自主复制，只有当pojy基因及其侧翼序列与可可链霉菌染色体发生了同源重组时——单交换或双交换的菌株才能在含有卡那霉素的基本培养基上生长。若发生了双交换，则卡那霉素抗性基因(/7)替换po77基因，此时菌落表现为KmrAms(对卡那霉素有抗性，而对安普霉素没有抗性)；若发生了单交换，则整个pDR101插入到染色体上，此时菌落表现为Ki^Anr(对卡那霉素和安普霉素均有抗性)。具体筛选方法如下所述挑取上述在含有卡那霉素的平板上39'C高温培养得到的转pDR101转化子，分别转移至含5ug/ml安普霉素的丽平板和含5ug/ml卡那霉素的羅平板上。筛选可以在卡纳霉素平板上生长，而不能在安普霉素平板上生长的转化子，即得到pDR101质粒中的卡那霉素抗性基因片段两边的po^基因同时与可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)基因组中的同源序列发生了双交换(同源重组)的转化子，即为po7W缺失突变株。将筛选得到的其中3株发生双交换的/^^缺失突变株接种在没有任何选择压力的丽培养基上，在28'C下培养，传5代后重新转接至分别含有5ug/ml卡那霉素的應培养基和含有5ug/ml安普霉素的醒培养基上，结果仍然是KmrAmS(对卡那霉素有抗性，而对安普霉素没有抗性)，说明通过双交换得到的这些;^^缺失突变株在遗传上是稳定的。3)po27缺失突变株的Southernblotting杂交验证将步骤2)得到的上述3株遗传上稳定的KnfAmS型po^缺失突变株接种于YEME培养基中，28°C，250rpm振荡培养30小时后分别提取总DNA，用U和M/e/双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，然后以地高辛标记的步骤l)扩增获得的1885bp的DNA片段为探针进行Southernblot杂交，以可可链霉菌阿索变种为对照；可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)的杂交信号从理论上推测应在2.4kb范围内，而双交换破坏株杂交信号应该在3.4kb范围内。杂交结果证明，步骤2)获得的KnfAirf型po7y缺失突变株出现的杂交信号带与理论上计算的分子量大小一致(3.4kb)，说明所得到的突变株都是正确的，即得到了将卡那霉素抗性基因DNA片段Oeo;插入可可链霉菌阿索变种基因组的po^基因中，从而使polR基因破坏，不能表达的突变株。2、p^y缺失突变株多氧霉素产量生物检测将Southernblotting杂交验证正确的polR基因破坏突变株或可可链霉菌阿索变禾中(5Yrepto/zycescaca。j'var.asoe/jsisstrain;AS4.1602)分别接种在YEME培养基中，在3(TC培养36h后，分别以1%的接种量在SP培养基(每L含有30g甘露醇，10g可溶性淀粉，5g中性大豆蛋白胨(neutralizedsoyap印tone)，8gDifcoYeastExtract)中进行二次发酵，120小时后用定量滤纸过滤下湿菌体烘箱烘至恒重检测菌体干重和发酵液滤液的抗真菌活性，并进行HPLC分析检测发酵液滤液的多氧霉素的量。发酵液滤液的抗真菌活性，是以长柄链格孢菌为指示菌检测多样霉素的活性1,从斜面转接长柄链格孢菌(购自CGMCCAlternarialongipesAS3.2875)到100ml的土豆汁培养基中，28°C振荡培养4天，匀浆处理5分钟，待用；2.在直径20cm的培养皿中，加入100ml含体积百分含量为20%步骤1培养得到的长柄链格孢菌菌液的PDA固体培养基；3.用打孔器在检测平板上打出小孔，分别在不同的孔内加入polR基因破坏突变株或可可链霉菌阿索变种发酵液50ul，28°C培养18-24小时，检测抑菌圈大小。结果表明，po7W缺失突变株发酵液无抗真菌活性(不产生抑菌圈)，表明不再产生多氧霉素，而所测菌体湿重与可可链霉菌阿索变种几乎没有差异。将polR基因破坏突变株或可可链霉菌阿索变种的上述培养发酵液上清液经过直径0.25陶的微孔滤膜过滤后，进行了HPLC分析，在突变株中没有检测到像可可链霉菌阿索变种那样出现的多氧霉素的吸收峰(HPLC分析图如图1所示，图1中A为可可链霉菌阿索变种的HPLC分析图谱，图l中B为polR基因破坏突变株的HPLC分析图谱，箭头所示的为多氧霉素的吸收峰)，结果表明/^^基因是多氧霉素生物合成所必需的。3、pa/Z缺失突变株的互补分析为了排除/^7^缺失突变株的表型是由于染色体上其它基因位点突变所造成的可能性，进行了突变株的遗传互补实验。即将本发明的po^基因转化步骤1获得的po^缺失突变株，用完整的po"基因将po^缺失突变株破坏的po^基因置换，若po^缺失突变株恢复了多氧霉素的产生能力，则进一步证明了po^基因是多氧霉素合成调控基因；具体方法如下所述1)互补转化质粒的构建以可可链霄菌阿索变禾中(5Y_repf(9/B/cescacaoivar.asoe7757'sstrain;AS4.1602)总DNA作为模板，设计引物P3和P4;以P3:5，GCCGGTGGACGATGTTCG3'P4:5，GAACGCTCCTGGTCGCTCATC3'为引物，进行PCR扩增，PCR体系为H2027ul，DMS02.5ul，10XK0Dbuffer5ul，dNTP5ul，MgCl22ul(2mmol/L)，P3/P4浓度5praol/ul各3ul，总DNA模板1.5ul(含总DNA约50ng)，K0Dplus(T0Y0B0CO.，LTD.Japan)lul，总体积50ul混匀，进行PCR，PCR程序为先95。C2min;然后94。C30s，55°C30s，68°C3.5min，共30循环；最后68°C延伸10min，结果得到3809bp的片段，将该片段回收后进行测序，结果表明该片段具有序列表中序列2的核苷酸序列，即po7i基因片段，自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸为编码序列，自序列表中序列2的5'端第304-381位核苷酸为启动子序列。将上述扩增得到的DNA片段，平端插入到pSET152(Bie雇nM'LoganR，OBrienK，SenoET，RaoRN,SchonerBE(1992)PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStr印tomycesspp.Gene116:43-49)的fcoRV位点上，得到重组载体，将重组载体进行酶切鉴定和测序鉴定，将酶切和测序鉴定表明正确的含有完整po^基因及其上游启动子的重组质粒命名为pSET152::po^(结构示意图如图2所示)。2)po^缺失突变株的互补转化及其转化子多氧霉素产生能力检测pSET152为链霉菌基因组整合型质粒，构建好的pSET152::/w^质粒通过原生质体转化的方法转入链霉菌后会整合到链霉菌基因组上，由于质粒本身携带了一个完整拷贝的polR基因，将其导入polR基因功能缺失的突变株中后，可以替代被破坏polR基因的功能，从而使缺失突变株多氧霉素产生能力恢复。将pSET152::po7y转入Aco7iET12567以去除可能的限制与修饰，然后通过PEG1000介导链霉菌原生质体转化的方法(原生质体转化的方法同步骤1中的步骤2)所述的方法)，将转化后的原生质体接种到含5ug/ml安普霉素的丽培养基上进行筛选培养，PSET152载体自身带有安普霉素抗性基因，再保证培养基含有安普霉素抗性压力下，转化polR功能缺失突变株得到的转化子具有安普抗性，从而保证了pSET152::po^正确整合到了基因组上。筛选得到的转化子即为转入pSET152::;x^阳性转化子。随机选取上述筛选得到的6株转化子在SP培养基中发酵，然后按照步骤2的方法进行多氧霉素生物活性检测，发现po7/基因互补后得到的转入pSET152::po7i的po7y缺失突变体恢复了多氧霉素的产生能力。实施例3、本发明的多氧霉素合成调控基因pW7在提高多氧霉素产量中的应用1、转入/o7;基因的工程菌株(转pSET152::po77工程菌株)的获得互补质粒pSET152::po^即可用于在可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)基因组上增加pWv—个拷贝，，由于pSET152::po77可以整合在可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)基因组上，随同染色体一起复制，所以用此质粒构建成的多氧霉素高产工程菌株(转pSET152::po^工程菌株)具有遗传稳定性。具体方法如下所述将pSET152::po7/转入￡co/iET12567以去除限制修饰，通过以PEG1000介导链霉菌原生质体转化的方法(原生质体转化的方法同实施例2的步骤1中的步骤2)所述的方法)，将转化后的原生质体接种到含5ug/ml安普霉素的MM培养基上进行筛选培养，筛选得到的抗安普霉素转化子即为转入pSET152::po^阳性转化子，即得到转pSET152::poJ7工程菌株。2、转入pSET152::pW/质粒的工程菌株的多氧霉素产量检测按照步骤1所述的方法，将pSET152转入￡co7/ET12567以去除限制修饰，通过以PEG1000介导链霉菌原生质体转化的方法以安普霉素为筛选标记，将pSET152转入可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)中得到转pSET152工程菌株。将步骤1筛选得到的3株转pSET152::po^工程菌株在SP培养基中发酵120小时，按照实施例2的步骤2所述的方法进行多氧霉素生物活性检测。结果如图3所示，结果表明发现3株工程菌的发酵液对指示菌株一赤星灰霉的抑菌圈都大于转pSET152的菌株和可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)的发酵液；图3中A为可可链霉菌阿索变种(AS4.1602);B为转pSET152的对照菌株；C、D、E分别为3株转pSET152::;o^工程菌株工程菌株。选取其中一个高产菌株在不同时间点测定多氧霉素产量，均高于可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)及含有空载体的对照菌株。为了排除转入单拷贝pSET152质粒可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)多氧霉素产量影响，构建了转pSET152工程菌株。将可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)、转pSET152的对照菌株、转pSET152::;o7/工程菌株分别用SP培养基进行发酵，不同时间点取出发酵液进行生物活性检测，以10%多氧霉素干粉(购自北京绿色农华植保科技有限责任公司)不同浓度稀释作为测试标准品，以长柄链格孢菌为指示菌用管碟法(白秀峰.钟大放1998《生物药物分析》93-114)测定不同时间点不同菌株发酵液产生的抑菌圈大小，并换算成多氧霉素浓度，以时间为横坐标，每毫升抗生素浓度为纵坐标作图，结果如图4所示。结果表明转pSET152::po^工程菌株在各个时间点多氧霉素产量都高于可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)、转pSET152的对照菌株，说明是由于;o^基因拷贝数的增加造成了多氧霉素产量的增加。其中，图4中A为可可链霉菌阿索变种(AS4.1602);參为转pSET152的对照菌株；B为转pSET152::po^工程菌株。用HPLC分析转pSET152::poy工程菌株多氧霉素的产量，并以CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre);AS4.1602)为对照，将发酵液上清液经过直径0.25陶的微孔滤膜过滤后，进行了HPLC分析，固定相为安捷伦公司20cmSB-C18反相柱，流动相为95%A.水相lOmmol四正丁基氢氧化氨(sigama)用冰醋酸调节ra至4.55%B.100%乙腈；流速lml/min，保留时间为10min为多氧霉素对应吸收峰(图5中箭头所示)，10minHPLC吸收峰提高显示多氧霉素产量显著增加。结果如图5所示，结果表明，发现转pSET152::^0//工程菌株的多氧霉素产量是可可链霉菌阿索变种(AS4.1602)产量150Pg/mL的2倍多，即达到34(^g/inL，HPLC的分析结果与生物活性检测结果一致。图5中A为可可链霉菌阿索变种(AS4.1602);B为转pSET152::/WW工程菌株。序列表<160〉3<210>1<211〉1112〈212>PRT<213〉可可链毒菌阿索变禾中(5"tre/^o/z7/cesvar.a5"oe/57'5"strain)<400〉1MetMetTyrAlaThrGluValHisGinProArgThrLeuThrAlaAsp151015LeuSerLeuGluAlaPheGlyValMetThrAlaArgArgGlySerGlu202530ProValHisLeuGlyProProArgHisArgAlaValLeuGlyLeuLeu354045MetLeuArgLeuGlyGinValValArgValAspGinLeuValAspGlu505560LeuTrpGlyAspLysProProArgArgProHisAlaThrLeuGinThr65707580TyrMetSerHisLeuArgArgAlaLeuThrSerGlyHisGlyLysAsp859095AlaGlyValAlaProLeuHisTyrArgAlaProGlyTyrValLeuAla100105110LeuAspProGinAlalieAspValCysArgPheAspGluMetValSer115120125ArgGlyGinGinHisAlaAlaGluGlyArgPheGlyGluAlaArgGlu130135140AlaLeuAspSerAlaLeuHisLeuTrpArgAlaAspProPheLeuAsp145150155160LeuThrSerTyrGluProLeuAlaGluGluSerAlaArgLeuGinHis165170175LeuArgThrAlaAlaValThrlieArgAlaGluAlaLeuLeuAlaLeu180GlyAspAlaArgThr195PheProSerAspGlu210ArgLeuGlyGinGin225ThrGinLeuSerGlu245ArgValHisLeuAla260AlaGlyGinArgAla275SerGluGluSerArg290AspProAlaThrThr305ProValAspAspAla325ProLeuProLeuPhe340ArgSerlieThrAla355ValGlyGinAlaGly370AlaHisAlaAlaGly385CysArgThrAlaGlu405LeuArgMetLeuGly420ArgLeuCysProAspThrValArgThr230GluVal185GluSerLeu200ValAlaAlalie215GluAlaLeuArgLeuGlylieLeuArgGluValProGly310AlaGluArg280AlaValHis265AlaAspAla250GluArgAlaPro295ThrGlyProGlyGlySerGlyGlyArgLeuLeu235ProLeuProValGly315ThrArgMet220TyrGlyGlyAspHis300HisArgGlu345GlySerAlaLeuGlu360LysThrGluGly375ValAlaTrp390GlyMetProGlyAlaThrCys410LeuGlyLeuArg395TrpProGlyProAspAla425ProThrValThrThrLeuGlu205ThrGluAspGlyArg285GlyArg330HisAlaLeuAlaHisLeu380ValValGlySerValTrpAspAsp190ValGlyArgAspAla270GluArgThrGlyProAlaHislieArgLeuTyrThrArg240LeuArg255AlaProProArgAlaAlaAlaArg320AlaSer335LeuArgSer350ThrAlaValLeu365AlaGinAlaThrArgGinValSer400GinAla415AlaProAsn430SerProGlu435AspAlaAspArgGlyAla450HisAspAlaLeuSer465LeuLeuLeuVslArg455Thr440GluGinThrGinGlu470GluAsnValHisAspValValValAspGly530HisLeu545GinGlyArgSerGlyGlyLeuAla500SerLeu485LeuLeuSerAsplieLeuArgHis475AlaVallie515ProLeuGinArgGluGluSer520LeuGly505GlyAlaAspGlyGlyAspProGly580LeuGly565AsnLeu535GluGluGinSer550ProAlaThrProLeu490ThrValAspValGinGlySerGin460AlaAspGlyAla445ArgPheLeuAlaAspArgArgGly525ThrAspProAla510AlaAspArg540GinThrLeuLeu555ValArgGlyLeuProTyrSerLeuHisAla595lieProThrGlyThrGlu610GlyLeuAlaProGlu625GlyThrGluThrProGlyAlaVal630LeuVal615LeuThrLeuAla600SerLeu585AlaSerVal570GlyGinLeuLeuAlaPro480ThrLeu495ValSerGluProValValAlaAla560TyrGlu575HisAlaArgAlaAlaMetAsp645ArgAlaValGluArgValLeuLeuLeuArgArgValArgAsp675AspVal660HisAspHisAlaArg680GluGlu665ThrThr650AlaLeuArg635ThrArg620GlyArg605ArgCysAla590GinValLeuArgLeuAlaAlaValLeuArgLeuValPheValLeuLeuAlaGluMetSerAspGinValLeu640LeuGlyAspThr655LeuLeuThrArg685GluGly670TyrArgGlyLeuSerAsp<table>complextableseeoriginalpage19</column></row><table>945950955960TyrSerHisAlaLeuValAlaAlaLeuAlaGluAspAlaAspAlaThr965970975AlaSerSerAlaAlaGluGlyLeuArglieAlaAspAlaHisGlyLeu980985990LeuHisTrpAlaAlaLeuLeuLysValCysArgGlyTrpAlaGinHis99510001005ArgLeuGlyThrProGlyAlaLeuAspAlaLeuLysAlaAlaValThr101010151020AspLeuSerValArgHisLeuArglieArgLeuProLeuHisLeuGly1025103010351040LeuLeuAlaHisAlaGinTyrAspAlaGlyAlaValGluAlaAlaArg104510501055AlaThrLeuArgArgAlaAlaArgGlulieArgAlaAlaGlyGluAsp106010651070AlaTyrLeuSerProAspLeuProPheAsnArgLeuProArgLeuGin107510801085ProProLeuProProArgGlyCysSerAspProThrGluHisLeuAla109010951100GlyLeuProArgArgSerGlyHis11051110〈210〉2<211〉3809〈212〉DNA<213〉可可链霄菌阿索变禾中(Streptcwycescacaoivar.asoe/57'sstrain)〈400〉2gccggtggacgatgttcgccgcgctgctgggcgccccggcgggccacagggcgtccacga60tcctggacaggctcacgggctgtccggcctcgagcaggagcagggccagcaccgcccgct120gcttgggcggccccgggggcagttccgcaccgtcccgccagatcctgatgggtcccagga180ccccgaaggcgatgtgtcgatccatgtcttcccacaagcccggccctgcggccgacgaaa240ctgaaatgcgctgatcagagtgtatgtggcaggctctccggcaggccgtggccgccaagt300ggagggagacgttccttggcttgttctcaccgtcagtgcaacgtcactctttccgcacag360gggcatgtgtagcctgctcgccgcacgtactgagcgagtggaaggcatatgcaccaggca420tgatgtatgcaacggaagtacaccagccccggactctgacggcggacctctcactcgaag480catttggcgtgatgacggcacggcggggcagcgagccggtgcacctcggacctccgaggc540accgggcggtcctcgggctgctgatgctgcgcctcggacaggtggtccgcgtcgaccagc600tcgtcgacgagttatggggcgacaaaccgccgcgccggccccacgccaccctccagacct660acatgtctcatcttcgacgggccctgacgtcgggtcacggcaaggacgccggggtggctc720ccctgcactaccgggcgcccggatacgtcctcgcgctggatccgcaggccatcgacgtgt780gccggttcgacgagatggtctcccgcggacaacagcacgccgccgagggccggttcggtg840aggcgcgcgaggcgctcgactccgcgctgcacctgtggcgggccgaccccttcctggatc900tcacgtcctacgagccgctggccgaggagagcgcacgcctccagcacctgcgcacggcgg%0ccgtgacgatccgcgccgaggccctgctcgccctcggcgacgcgcggaccacggtggagt1020ccctgcggcgcgaggtgatccgcttcccctcggacgaacgcatcgtggccgccctgatga1080ccggcctgtaccggctcggccagcagaccgaggcgctccgcctgtacgaacgtacgcgca1140cgcagctgtcggaggagctgggcgtggcaccgggcgacgacctgcggcgcgtccatctgg1200ccatcctgcggcacgsiactgggcggcgccgcaccggccgggcagcgggccgaggtgcggg1260cccggccggaccgcgagccccggagcgaggagagccgtxcgccggccgacgccgtccacg1320gccgcgccgccgaccccgcgacgaccggcaccggacccggcgggcacaccggcgcgcggc1380ctgtggacgacgccgccgggtccggcaggaccccggcccacgcgtcgccgcttccgctct1440tcgaagggcgcgaacacgccctggcctcgctgcgccgctccatcacggccgccctggagg1500gcagcggacatctcaccgcggtcgtgggtcaggccggggtgggca卿ccgaactgctgg1560cccaggccacggcgcacgccgccggatgggtcgccggaacccgggtggtccgggtgagct1620gccggaccgcggagggcatgccggcctgctgggtgtggcagcaggcgctgcggatgctcg1680gcggccccgacgcgctgccgggcgacaatgcgccccggctctgtccggaccctacggtga1740caacgctgtcagactcaccggagggagcggacgccgaccgccgggagcagacccagcagc1800gcttcctggcccacgacgccctgagtgaaacgattctgcgccacgcggacgacgctcccc1860tcctgctcgtcctcgagaacgtgcacctggcggaccgccccacgctcgacgtcctcgcac1920tgctcagcgacggcacacagggccgcgcggtgagcgtggtgatcagcgtccgggagtccg1980gtgtgggagccggagccg肌cccgacggcccgctccaggagttgctggccgactcccgca2040cggacgtcgtccacctcgacgacctgtccgaggaacaggtccagaccctcctcgcggccc2100agggcgggcccggcccggccacgcccgtggtgcgcggactctacgaacgcagcggcggga2160acccctacctgctcggccagctactggcacacgcgggtggtgcccgctccctgcacgccg2220cgcgcgcggcacgccaggtcctcaccgagatccccaccggcgtgtccagcatgctgcgcc2280gccgtctggccggactggccccggaggtcctgcgcgtgctcaggggatgcgcggtactcg2340ggaccgaggccgacctgaccctgctgaccaccgtgctcggcgacaccacccccggcgtcc2400gcgccgtggaggaggcgctgcgcaccggtctgctgcgccgcgaccacgatcacgcccgca2460ccctggtgttccgctacggcctggtacgcgacgtactgctcgccgagatgagcgaccagg2520agcgttccgacctgcacgcctgggcggtggacgtgctcggccgccaggccgacggccacc2580ccgcggcggcctcgcgcctggcgcaccacgcctggcaggcctcgctgaccctgcccccgg2640accaggtgctgccgtacctcgtgcgggccggcgagcaggccgccctggagagccggtacg2700accgcgcgcagacctggttccggcgcgcccacgcgctgctcacctccggcccctcggcga2760gcggtgcggccgcgcaggcgctgcaactgcgcaagcgcatcctccagatcgccaccgtca2820cccgcggatacggcgaccgggaggtcgtggccgagtcccagcgggtgctgagcatgtcac2880ccgccgcggtccaggagccggcactggtgttctcccagtgcatcgcccaactggtcaccg2940gacaccgggaggagagcgcccgccgcgcccatcagctgcgcgtcatggcgcagaacggcg3000acgcgcccgaagcccgcctgcacgaacggctcgcccacggcatcctgcacctgcccgacc3060gcaccgccgaggcgctggccgccctgacggaggccgagcagacggccgggaacctctccg3120ccgcccggctccggcagctcgcgcaccacacccagcacgacccccgattcctggccatga3180accaccggaccctcgctctgtcgctgctcggcgcccaggacgacgcgctcgccctggccc3240aggaactcctggcgctcaccggctgcgagggcacaccggtcgaccgggccagcgcccact3300actcccacgcgctggtcgccgccctcgccgaggacgccgacgccaccgcctcctccgccg3360ccgagggcctgcgcatcgccgacgcgcacggcctgctgcactgggcggccctgctcaagg3420tctgccgcggctgggcgcagcaccggctcgggacacctggcgcactcgacgccctcaaag3480cggccgtgaccgacctgagcgtccgccacctgcggatccgcctcccgctgcacctggggc3540tgctggcacacgcccagtacgacgcgggcgccgtcgaggccgcccgggcgaccctgcggc3600gggcggcccgggagatcagggccgcgggcgaggacgcctacctcagccccgacctgccct犯GOtcaaccggctgccgcgcctccagccgccgctgccgccccgcgggtgcagcgatccgacgg3720agcatctggccggcctgcccaggcgttccggccactgaccggtccaggccgctgacgagt3780cccggctcgcgacaagccccgtcctccca3809<210>3〈211〉466〈212〉DNA〈213〉可可链毒菌P可索变禾中(5YrepfOiT7/cescacao/var.asoewsisstrain)〈400〉3gcaccgcggctgacgccgtcgacccgggaccggcccaccccggcgaggaccctcgtggtcccaccgcccgccgcgcagatcgcccgcaggtcggtcgccgtgaggtcctggcccgtccgggaccctcagcgcgtagtcgtcctggacggcgtccatgccggtagccgtagcggtgctcccacacggcctcgctgatgagcggccatcagcgcgaagaagggctggctgtcgctgaacacgctcgacgggagccaggggccgttcggccgggtgggccgtgggtcaccacgcccatccggcgcagcacgtcgaactcgggtgtccatgccggggcccgtgatgtgcaccggcccgtxgcccccaggtgacgacctcgatcaggtccggcggcagggttgcggggtccagggcggtcagtcgccccctccccgggaggaccgagtccggccagcgccgacggtcacgg6012018024030036042046权利要求1、一种多氧霉素合成调控蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成功能的由(a)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因，具有自序列表中序列2的5'端第420—3758位核苷酸序列。4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述多氧霉素合成调控蛋白的编码基因的核苷酸序列为下述序列之一1)序列表中序列2的DNA序列；2)编码序列表中序列l蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。5、含有权利要求2-4中任意一项所述编码基因的重组表达载体。6、含有权利要求2-4中任意一项所述编码基因的工程菌。7、含有权利要求2-4中任意一项所述编码基因的转基因细胞系。8、权利要求1所述的多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因在多氧霉素生产中的应用。全文摘要本发明公开了一种多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多氧霉素合成功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明的多氧霉素合成调控蛋白及其编码基因对多氧霉素的生产应用具有极其重要的意义，在提高多氧霉素产量(Polyoxin)方面具有极大的价值。文档编号C07K14/36GK101195655SQ20071017892公开日2008年6月11日申请日期2007年12月7日优先权日2007年12月7日发明者钢刘,睿李,谢周杰,谭华荣申请人:中国科学院微生物研究所