专利名称：：与抗砷相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与抗砷相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：砷自被发现以来就以其毒性而闻名。砷是环境常见污染物之一，砷可能通过抑制DNA修复并发突变(Lieta7.，1989)，并且可以诱导姊妹单体交换(Jhaeta丄，1992)、基因扩增(RossmanandWolosin，1992)、非整倍性(Gurre"〗，1993)和染色体畸变(Jha"s7.,1992)。砷在水生生物中易富集，使得水产品中的砷含量往往比陆生动植物高几倍到几十倍，人等动物若摄入过多的砷则会引起癌变，因此，人们越来越关注砷对水产养殖产品的安全性问题，水产品国际贸易往来中对砷的检测要求也越来越高。砷中毒对动物和人类的毒性危害已受到广泛关注，但其中作用机理仍不十分清楚，尤其对鱼类毒性机制更是处于非常薄弱的环节。随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，鼠和人体分离到一些抗砷基因片段，还很难进行砷抗性综合性分析，抗(耐)砷机制的研究逐步深化(Romach"a厶2000)。在生物进化的过程中，许多生物产生了抗(耐)砷的生理机制。水环境中生活的鱼类体内很容易富集砷，它们只有产生应答砷毒的抗性机能，才能不被环境淘汰。而鲇鱼生活在水体底部，各类有害物质的综合富集量一般高于其它水生生物，具有掠食性特征的鲇鱼应该只有进化出比其它鱼类抗(耐)砷毒能力更强的应答机制才能够很好的生存和繁衍，因此鲇鱼可能具有比其他植食性和杂食性鱼类更强的抗(耐)砷能力。但是砷对鲇鱼的毒作用机理与抗(耐)砷基因的研究未见报道，因此加强该方面的研究工作具有理论意义和实际意义。
发明内容本发明的目的是提供一种蛋白，该蛋白能增加鱼类的抗砷能力。本发明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质-(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗重金属相关的由(a)衍生的蛋白质。所述重金属具体可为砷。本发明的另一个目的是提供一种编码上述蛋白的基因。本发明所提供的编码上述蛋白的基因为如下l)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的另一个目的是提供一种含有上述任一种基因的重组表达载体。所述重组表达载体具体可为在表达载体pCMVnramp的fc^/和&7/酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pCMVnra即-5"i^!7A含有上述任一种基因的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育抗重金属鱼的方法。本发明所提供的培育抗重金属鱼的方法，是将上述任一种重组表达载体导入鱼的受精卵细胞中，培养得到抗重金属鱼。其中，重金属可为砷、镉等。所述鱼具体可为鲇鱼。实验结果表明转入重组表达载体pCMVnra卿-5"i力Z4鲇鱼与转入空载体pCMVnramp鲇鱼相比，其肝脏代谢砷的能力显著增强。因此本发明的抗砷相关蛋白及其编码基因，以及培育抗重金属鱼的方法将对改善水生生物抗砷等其它重金属的表现特征方面具有重要意义，在鱼的育种中有巨大的应用前景。图1为6^M基因在鲇鱼基因组中的拷贝数分析。图2为鲇鱼SiATA基因在砷胁迫条件下的表达特征。图3为5""M转基因鲇鱼砷含量测定实验结果。图4为在砷胁迫下的转入重组表达载体pCMVnramp-5X4Z4鲇鱼与转入空载体pCMVnramp鲇鱼照片。图5为在砷胁迫下的转入重组表达载体pCMVnramp-5X4Z4鲇鱼与转入空载体pCMVnramp鲇鱼肝脏组织比较实验结果。具体实施例方式本发明所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。实施例l、鲇鱼cDNA文库的构建以及5WMcDNA克隆，序列分析以0.lmg/LNaAs02诱导兰州鲇(&7wrws^3/^力oi/eT2W's)幼苗15天，采用SuperscriptPlasmidSystemwithGatewayTechnologyforcDNASynthesisandCloning(Invitrogen)构建姑鱼cDNA文库，按照InvitrogenLifeTechnologiesInstructionManual操作。首先禾U用RNAgentsTotal■IsolationSystem(Promega)提取鲇鱼幼苗总RNA，利用PolyATtractmRNAIsolationSystems(Promega)分离出mRNA，然后在含有7fet/位点的Oligo(dT)锚定引物作为反转录引物合成cDNA第一链以及cDNA第二链，在cDNA第一链末端连接5"W/接头，然后定向插入载体中，插入DNA片段大于lKb。鲇鱼幼苗cDNA文库的库容为lXl()e个克隆，重组率达97%，建成鲇鱼cDNA文库。以鼠AsnalcDNA(源于Masm/sc"7i/s，注册号为NM019652)为探针筛选了2.5X105未扩增斑得到4个阳性斑，其插入片段为1023bp，具有完整的阅读框，编码由341个氨基酸残基组成的蛋白。鲇鱼cDNA全序列及氨基酸序列分别如序列表中的序列l和序列2。实施例2、5X4Z4基因在鲇鱼基因组中的拷贝数分析利用CTAB法提取兰州鲇(57"/7/s7朋z力oi/e/^is)基因组DNA，通过0.8%琼脂糖凝胶检测提取的鲇鱼基因组DNA，选择完整、纯的基因组DNA样品。利用经同位素a」卞标记的5X4Z4cDNA编码区(序列1)为探针，与经三种限制性内切酶(HindIII、Sall、Xhol)消化的20网鲇鱼基因组DNA，通过毛细管作用被原封不动地转移到尼龙膜(Nylon+)上，进行Southern杂交分析，并经过高严谨度洗膜(高严谨毒的条件是0.5XSSC，0.1XSDS，65'C)。结果如图1所示通过HindIII、SalI、XhoI3种酶消化，产生了清晰的杂交带。在5X4Z4cDNA中没有发现HindIII、SalI、XhoI酶切位点，说明5X4M在鲇鱼基因组DNA是以单拷贝数存在。实施例3、鲇鱼SiATA基因在砷胁迫条件下的表达特征提取经O.lmg/LNaAs02诱导的兰州鲇(5Y7i/2t^7a加力owe/7w's)幼苗的总RNA，取相同质量(20ug)的各样品在变性1.2%琼脂糖凝胶中分离，将RNA转移至带正电荷的尼龙膜上(Nylon+)，利用经同位素a-32p标记的57^Z4cDNA编码区(序歹ll1)为探针(Takaralabelinganddetectionkit,TakaraBioTech(dalian)Co.Ltd)，提取的总RNA与cDNA探针进行Northern杂交分析。结果如图2所示，其中脑、心脏、肾、肝脏、鳃、骨骼肌肉都有表达，在不同组织&'力MmRNA累积量不同。5"WZ4基因在肾中转录水平高，脑、肝脏、鳃转录水平低于肾。5""M基因在骨骼肌肉中只能检测到痕量转录水平。实施例4、培育代谢砷转基因鲇鱼的方法(一)重组表达载体的构建提取实施例1中用0.lmg/LNaAs02诱导兰州鲇(&7〃riAs7朋z力卯e/2Ws)幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。以该反转录得到的cDNA为模板，用(TF):5:ACCA|GAATT(^ATGCACCTGATGTIGAG-3，(TR):5'-AACA^TCG^GCGAAIGTGTTGACITTG-3'进行PCR扩增，对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果得到1000bp左右的DNA片段，回收纯化PCR产物，对该PCR产物进行测序，测序结果表明，得到的PCR产物具有序列表序列1的核苷酸序列。该核苷酸序列编码序列表中序列2的SiATA蛋白。用fc^/和5"aJ/限制性内切酶酶切该PCR产物；将pCMVnramp质粒表达载体(Promega)经限制性内切酶fcov/和5^/酶切进行酶切；将5^M基因插入到表达载体pCMVnramp的i5bov/和5"a7/酶切位点，得到pCMVnramp-i^Z4。(二)、培育转基因鱼苗采用显微注射法进行鲇鱼转化。兰州鲇(577w^asj朋Ww朋w's)亲鱼来自宁夏水产研究所繁殖实验基地，肌肉注射激素，用L服H-A人工催产。采集高质量成熟卵子和精子，干法受精获得大量鲇鱼受精卵，加水激活后取上层优质浮卵于10-14"C条件下培养，取1-2细胞期的胚胎用于显微注射。显微注射DNA溶液的配置将用限制性内切酶5^J/将重组表达载体pCMVnramp-5X4M线性化，并将其溶解于Tris-HCl(pH:7.6)溶液中，使其终浓度为100ngAC，用0.02Mm滤器过滤除菌后作为注射液。采用Nikon公司的拉针仪和磨针仪，制成针尖约为4-9Mm注射针，针尖要求尖锐，能够刺穿受精卵膜，并且Nikon公司的显微注射仪将转基因表达载体射入鱼单细胞期受精卵动物极细胞质内。每卵注射50pL上述外源DNA溶液(浓度为50ng/uL)。在荧光显微镜下，检测出转化子的胚胎存活率。筛选出产生绿色荧光的转基因胚胎，检测AWM在体内的整合和表达，证实SiATA能够在鲇鱼胚胎内超表达。将显微注射受精卵置于培养皿中，用Danieau's液培养(1.74mol/LNaCl，21mmol/LKC1，12,1/LMgS04,18mmol/LCaCl2，150,1/LHEPES，pH:7.6)，每5小时换培养液。孵化后转入无菌的暴气自来水中培养。得到转入重组表达载体pCMVnramp-5X4M仔鱼，仔鱼孵化3天后开始饲喂。按照上述方法，将空载体pCMVnramp用限制性内切酶&7/线性化后，转入鱼中，培育得到转入空载体pCMVnra即的仔鱼，作为对照。(三)、转基因鲇鱼砷代谢特征检测取转入重组表达载体pCMVnramp-5"WM的鲇鱼苗和转入空载体pCMVnramp的鲇鱼苗，体长均5cm，体重约45g。饵料为水蚯蚓。饲养鱼苗采用过滤自来水，水质参数pH:7.3±0.27，碱度186.65±22.4mg/L，Cr乂13mg/L，K+、Na+〈24.3mg/L，Ca2+<29,5mg/L，P<0.01mg/L，H2S、Hg、As未检出。水温2226"C。实验用水族箱规格为200craX100cmX75cm，整体并联lkw罗磁鼓风机增氧设备一套。实验前14d，将鱼苗投放到水族箱以适应环境。取4只水族箱，分别加入1200L水，分别加入NaAs02至终浓度为0.lmg/LNaAs02。向其中的2只水族箱分别放入20尾上述转入重组表达载体pCMVnramp-57力M的鱼苗，另外2只水族箱分别放入20尾上述转入空载体pCMVnra^)的鱼苗。每24h换一次含有O.lmg/LNaAs02的水。在培养第4d、7d、14d、21d分别采集5尾转入重组表达载体pCMVnramp-57/1M和转入空载体pCMVnramp的鱼肝脏，进行砷含量测定，如图3所示。砷含量测定分别称取上述组织样品0.5000g置于高压消解罐中，加入7mL浓HN03和lmL浓HC104，在微波消解系统中消解。温度下降后，样品用灭菌去离子水转移至lOOmL烧杯，置电热板上，170'C赶酸至消解液剩约lmL，冷却后，用5%(V:V)盐酸转移至25mL比色管中，加入5%抗坏血酸和5%硫脲各5mL，用5%盐酸定容至25mL，混匀，放置30min后上机测定。仪器测定条件还原试剂1%NaBH4溶液+0.3MNaOH溶液；载流2%(V:V)盐酸；载气Ar(99.99%)，流量0.4L/min;屏蔽气Ar(99.99%)，流量0.8L/min;负高压260V;灯电流50mA;原子化器高度12mm。输入参数样品质量(g)、稀释体积(mL)、位置号、样品空白，并选择mg/kg浓度单位，逐步将炉温升至所需温度，稳定后测量，连续用标准空白进样，待读数稳定后，在转入试样测量之前，先进行试剂空白消化液进样，空白测定，仪器自动扣除空白值。测定样品。样品中砷含量按下式计算X=(C「C。)V/1000m(其中X—试样中砷的含量(mg/kg)，d—试样消化液测定浓度(ng/mL)，C。一试剂空白液测定浓度(ng/mL)，V—试样消化液的总体积(mU，m—试样质量(g)。)表l相同浓度的各待测样品在相同条件下测得的含砷量的结果mg/kg<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果如表1和图3所示被NaAs02染毒转入重组表达载体pCMVnramp-5X4"鲇鱼比转入空载体pCMVnramp鲇鱼肝脏组织砷代谢增强。在砷胁迫下的转入重组表达载体pCMVnramp-5X4M鲇鱼和转入空载体pCMVnramp鲇鱼见图4。砷胁迫下的转入空载体pCMVnramp鲇鱼肝脏表现为肝组织坏死，细胞肿大，细胞核丢失，有空洞，细胞界限不清，有脂质聚集，而转入重组表达载体pCMVnramp-鲇鱼肝组织健康，如图5所示。序列表<160〉2〈210〉1<211>1023〈212〉DNA〈213〉鲇属兰州鲇(5Y7〃2tas2朋^o〃e/7w'50<400>1atggcagcttcagtggaagcacgttaaaaaatataatagaggcgttgggaa羅gacatgagcgtcctcatcatctccacttctccaaggtccccaccaaCCg3gtttgggtgtggccgsatgggcaageiagatgatgcaagctatgccgaggttatgagacggctcctacaggccacacctgggccgcctcatgcagatatgctggggctgggtgata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