用于制备羊毛硫抗生素的方法

专利名称：：用于制备羊毛硫抗生素的方法
技术领域：
：本发明涉及生物分子的制备。特别地，本发明涉及已知分类为羊毛硫抗生素(lantibiotics)的抗生素化合物的制备。优选地，本发明涉及那些羊毛碌Ot生素的纯化。
背景技术：
：羊毛硫抗生素是一类小肽抗生素，特征在于存在独特的、桥连的^5克醚氨基酸，即羊毛硫氨酸(lanthione)和3-曱基羊毛硫氨酸(3-methyllanthione)。该类成员包括枯草菌素、乳链菌肽、表皮肽、gallidermin(其为表皮肽的亮氨酸-6变体)、pep5、血管紧张肽转化酶抑制肽、Ro09-0198、肉桂霉素和耐久霉素。Pep5、表皮肽和Gallierdermin全部由葡萄球菌属的微生物天然生成。Gallidermin-生成菌抹鸡葡萄球菌(51.g"〃/"a"'wm)Tii3928(DSM4616)的发酵详细描述在EP-342486，Kellner等人，Eur.J.Biochem.177:53-59(1988)，H6rner等人，Appl.Microbiol.Biotech.30,219-225，和Ung隱ann等人，IstProc.Int.WorkshopLantibiotics,Tiibingen1991，第410-421页中。简言之，Gallidermin的发酵所用的培养基至少包括肉膏、氯化钙和氯化钠。所述进料溶液包括肉膏和葡萄糖。因此，羊毛硫抗生素的发酵所用的培养基非常复杂，且需要大量寡肽或多肽作为氨基酸来源。EP-508371A描述了一种基于色谱方法的羊毛硫抗生素的纯化策略。该方法包括多个色谦步骤，其费时、费材料且费成本。简言之，EP508371提供了一种羊毛硫抗生素纯化的方法，其包括获得包含羊毛硫抗生素的发酵培养基，和使所述培养基或由此衍生的包含羊毛硫抗生素的培养基进行连续的步骤吸附在苯乙烯二乙烯基共聚物基质上、阳离子交换色谱法(例如AmberliteXAD-1180)、疏水性相互作用色谱法、任选但优选阴离子交换色谱法、通过超滤和/或渗滤脱盐，和任选的冷冻干燥。当然，如果需要，可以使用额外的纯化步骤。通过该公开的纯化步骤获得约50%的产率。在其中描述的补料分批(fed-batch)方法产生840mg/L的容积产量。US2004/0072333Al描述了一种用于羊毛硫抗生素的蛋白水解纯化方法，其使用乳链菌肽作为实例。小心地，使用保留乳链菌肽不受影响的微调(finetuned)蛋白酶处理除去难于从粗纯化产物中除去的杂质肽。总之，本领域已知用于羊毛硫抗生素的制备方法很复杂，并且需要一些纯化步骤。因此，本领域需要用于羊毛硫抗生素的简单和便宜的生产方法。发明筒述本发明涉及羊毛硫抗生素的简单、省时的生产方法。本文所述的生产方法是基于新的发酵概念，与本领域描述的那些相比较，其使用较不复杂的培养基和筒单的一步或两步的纯化方法，其包括用无机盐初始沉淀的步骤。因此，本发明涉及一种用于制备羊毛硫抗生肽(lantibioticpeptide)的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛硫抗生肽。根据更优选的实施方案，所述纯化方法进一步包括纯化步骤(ii)使从步骤(i)的沉淀物获得的肽进行洗涤步骤、单独色谱纯化步骤、干燥步骤或结晶。根据另一个更优选的实施方案，所述发酵是在包括麦芽糖、氯化钙和水解酵母提取物的培养基中进行，所述酵母才是取物具有高含量的游离氨基酸和简单的寡肽，优选地，超过50%的所述酵母提取物的蛋白质(proteineous)组分是游离氨基酸。更优选地，所述发酵培养基不包含任何肉膏或胨膏。发明详述在本发明的实施方案之前，必须指出如本文和在所附的权利要求中使用的单数形式"一个"和"所述的"包括复数形式，除非上下文另有明确地规定。因此，例如提及"羊毛硫抗生素"包括此类羊毛硫抗生素的复数，提及"细菌"为指一种或多种细菌和本领域技术人员已知的其同等物，等等。除非另有定义，所有本文使用的技术术语和科技术语具有与如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管任何类似或等价于本文所述的那些方法和物质都可使用，但优选本发明所描述的方法、装置和物质。为了描述和公开可能与本发明所使用相关的已在出版物中报道的细胞系、遗传物质和方法，将本文提及的所有出版物引入本文作为参考。在这里引用的任何内容不应该被看作在先发明使本发明不具有首次公开的性质。而且，本文所述的且对公众未知的所有方法均认为是根据本发明的方法。本发明涉及用于生产羊毛硫抗生素的方法。羊毛硫抗生素为包含羊毛碌l氨酸的肽抗生素。典型地，羊毛硫抗生素为具有高含量的不饱和氨基酸(脱氢丙氨酸、脱氢oc-氨基丁酸)和硫醚氨基酸(内消旋羊毛硫氨酸，(2S,3S,6R)-3-曱基羊毛硫氨酸)的多环多肽抗生素。而且，已经在羊毛硫抗生素的某些成员中发现了赖氨酸丙氨酸(lysinoalanine)、3-羟基天冬氨酸和S-(2-氨基乙烯基)-D-半胱氨酸。示例性地，下述羊毛硫抗生素是本领域已知的乳链菌肽、枯草菌素、耐久霉素、肉桂霉素、血管紧张肽转化酶抑制肽、表皮肽、Ro09-0198、pep5、乳链3求菌素481和3147、mersacidin、阿狀力口定(actagardin)、变异菌素1140、gallidermin。这些羊毛硫抗生素的概述可在例如Kellner等人的(上述)或CurrentProteinandPeptideScience2005，no.6，第61-75页(Cotter等人)中找到。本文所述的生产方法优选适于生产表皮肽和gallidermin,更优选生产gallidermin,且最优选包含至少式I的结构基序的gallidermin:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>在此，应当理解如本文所述的用于制备羊毛硫抗生素的方法包括发酵步骤和纯化步骤。为了更清楚，分别更详细地描述这两个步骤。然而，对于发酵过程描述的每个实施方案可以与对于纯化步骤描述的任何实施方案依次组合，以完成最终制备过程。发酵过程对于羊毛硫抗生素的最佳化生产方法，现有技术中存在的普遍认识涉及将最大量的总的羊毛硫抗生素置于发酵步骤的方法。结果，包括肉膏(meatextract)和胨膏(peptoneextract)的富含营养和复杂的培养基常用于发酵过程。与此相反，本发明是基于发现了羊毛硫抗生素优选gallidermin的控制更好的发酵过程，促进了羊毛硫抗生肽的纯化，并因此得到了更有效的和经济的生产方法。令人惊奇地，发现本文所述的发酵过程能够通过简单的一步或两步纯化策略以"高度的纯度"从培养物上清液纯化羊毛^5克抗生素，所述纯化策略包括用无机盐初始沉淀的步骤。根据本发明，"高度的纯度"指相对于药物产品而言，产品纯度为至少90%(w/w)，优选至少92%,更优选至少94%,进一步优选至少96%,进一步优选至少98%,进一步优选至少99%。羊毛硫抗生素可以容易地在本领域已知的革兰氏(+)细菌中产生。例如，表皮肽和galidermin可以容易地在编码和表达用于表皮肽和/或gallidermin产生的相关基因的葡萄球菌中产生。现有技术中描述的例如gallidermin可以在鸡葡萄球菌属(Stop/^/ococcwsga〃/"an'wmWraz'w)Tii3928中有效地产生。该菌株详细描述在EPA-342486中。其已经由在Braunschweig,Germany的DeutscheSammlungAirMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)按no.4616目录号保藏。因此，本领域已知的任何菌抹都可用于产生如本文所述的羊毛硫抗生素。为了产生如本文所述的gallidermin,使用鸡葡萄球菌属(iSVap/^/ococcwga〃/wan.MmWra/")Tti3928(DSM4616)是最4尤选的。能够产生羊毛硫抗生素的微生物的发酵是本领域已知的。在任何适于特定微生物的条件下，按分批(batch)、补料分批(fed-batch)或连续方式用合适的接种物接种后，该微生物可以在液体培养基中发酵。葡萄球菌属微生物可以在需氧条件下发酵，优选在24至37。C的温度下，更优选在约5.6至8.5，优选在约6.0至8.0的pH下，最优选在约pH7.3下。用于发酵羊毛硫抗生素优选gallidermin,包含麦芽糖、钙源和酵母提取物。优选地，那些基础培养基(basalculturemedia)可包括防止发酵过程期间泡沫形成的添加剂。更优选地那些培养基不包括任何肉膏或胨膏。令人惊奇地发现，本领域所用的肉膏或胨膏包含高量的蛋白质组分，其对羊毛硫抗生素优选gallidermin的生产方法有不利影响。因此，根据另一个实施方案，此处提供的培养基由去离子水、麦芽糖、钩源、酵母提取物和至少一种消泡剂组成。作为钙源，优选地使用CaCl2。更优选地，使用的CaCl2的用量为约10至200mg/L培养基，甚至更优选约10至100mg/L，甚至更优选约20至80mg/L，甚至更优选约30至60mg/L，甚至更优选约40至50mg/L,最优选约42至48mg/L。然而，本领域技术人员也认识到在基础培养基之内的CaCl2的含量可通过其它合适的4丐源代替或部分代替，其中Ca"在所述培养基中以当量浓度是有效的(约90pM至1.8mM)。而且，本领域技术人员还认识到减少基础培养基中CaCl2或任何同等钓源的含量，并在发酵过程中连续地或不连续地进料。将优选地以麦芽糖一水合物使用的麦芽糖按约0.5至20g/L培养基(相当于约1.39至55.5mM的麦芽糖一水合物)的用量加入到基础培养基中。更优选地，麦芽糖在基础培养基中的含量为约1至5g/L，甚至更优选约2.5至7.5g/L，最优选约5g/L。然而，本领域技术人员也认识到通过麦芽糖的任何代谢性前体或任何同等的碳源代替或至少部分地代替麦芽糖，所述前体也可以被生产者消耗。然而，对于发酵过程的初始生长期，使用"间接碳源"是优选的。间接碳源为例如二糖、寡糖或多糖，比如麦芽糖，而不是葡萄糖。而且，本领域技术人员还认识到减少基础培养基中的麦芽糖、任何代谢性前体或合适的同等物的含量，并在发酵过程中连续地或不连续地进料。令人惊奇地发现，蛋白质源的来源和性质似乎对于羊毛硫抗生素的生产方法很重要，至少对于组合的发酵和纯化过程很重要，如本文所述的。与现有技术中描述的发酵过程相比较-所有都使用胨膏或肉膏-本文所述的羊毛硫抗生素的发酵所用的培养基包括作为优选的酵母提取物，优选地如单独的蛋白质和氨基酸源。然而，加入痕量不会不利地影响如本文所述的羊毛^i元生素的生产方法。优选地，将酵母提取物以如下用量加至基础培养基中约10至200mg/L培养基、甚至更优选约10至100mg/L、甚至更优选约20至80mg/L、甚至更优选约30至70mg/L、甚至更优选约40至60mg/L、最优选约50mg/L。然而，本领域技术人员还认识到减少基础培养基中的酵母提取物的含量，并在发酵过程中连续地或不连续地进料。优选地，大于约50%的所述酵母提取物的全部氨基酸为游离氨基酸和/或二肽。更优选地，大于约55%，甚至更优选大于约60%，甚至更优选大于约65%，甚至更优选大于约70%，甚至更优选大于约75%,甚至更优选大于约80%，甚至更优选大于约85%和最优选大于约90%的酵母提取物的全部氨基酸为游离氨基酸或二肽。根据另一个实施方案，如本文所述的，大于约50%,优选大于约55%，更优选大于约60%,甚至更优选大于约65%，甚至更优选大于约70%，甚至更优选大于约75%,甚至更优选大于约80%，甚至更优选大于约85%和最优选大于约90%的用于羊毛石克抗生素例如gallidermin的发酵所用的酵母提取物的氨基酸Asp、Glu、Asn、Gly、Ser、Thr、Ala和Arg为游离氨基酸或以二肽形式存在。所述基础培养基还可包括防止或降低发酵过程期间泡沫形成的消泡剂。可以将那些本领域技术人员已知的"消泡剂，，以合适的量加至所述基础培养基中。例如，消泡剂为离子型或非离子型表面活性剂，比如普流尼克酸(pluronicaicd)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、醇性EO/PO加合物例如GenapolEP等。优选地，使用聚乙二醇600和GenapolEP00244(Clariant,Germany)的混合物。所述发酵过程优选地在约24至37°C，优选在约28至37°C，甚至更优选在约32至37。C，甚至更优选在约35至37。C，最优选在约37°C下进行。pH值调节至约pH5.6至8.0。根据更优选的方式，在发酵开始时将pH值调节为约pH5.6至8.0，更优选约pH6.5至7.5,甚至更优选约6.8至7.5，最优选约7.0至7.5。所述发酵过程优选以补料分批方式进行。用于细菌发酵的补料分批方法对本领域技术人员而言是熟知的。简言之，用基础培养基充填生物发酵罐，并用细菌接种，优选具有2.0-20mL(OD60(TlO)的细菌培养物/L发酵罐肉汤。在发酵过程期间，不连续地或连续地加入包括合适的营养剂的进料混合物。因此，根据进一步的实施方案，以补料分批模式进行如本文所述的生产羊毛硫抗生素的发酵过程。优选地，如本文所述的发酵过程所用的进料-混合物包括至少一种能源和其它养分，所述其它养分优选为发酵过程期间被生产者所消耗。例如，所述进料混合物可包括碳源，优选地选自糖、糖醇、氨基糖、糖醛酸、氨基酸、甘油、甘油酯。根据如本文所述的方法的进一步的实施方案，所述进料混合物包括一种或多种单糖例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等，或其混合物。根据如本文所述的方法的进一步的实施方案，所述进料混合物包括糖优选单糖和一种或多种氨基酸，优选地选自Asp、Glu、Asn、Gly、Ser、Thr、Ak和/或Arg。根据如本文所述的方法的进一步的实施方案，所述进料混合物包括葡萄糖或由葡萄糖组成。现有技术中存在已知的几种进料策略，其可以用于以补料分批方式生产羊毛硫抗生素，优选gallidermin。优选地，在所述培养基内的p02移至低于80mbar，优选低于60mbar，甚至更优选低于40mbar后，开始进料。优选地，进料速率增加至约3-10kg/(m3h)，更优选约4-8kg/(m311),甚至更优选约5-7kg/(m3h),最优选约6.5kg/(m3h)。根据本文所述的发酵过程的进一步的实施方案，所述基础进料速率可以在发酵期间连续地和/或逐步地增加。例如，连续地增加率可以为约0.01-0.5kg/(m3h)，优选约0.05-0.3kg/(m3h)，更优选约0.1-0.25kg/(m3h),甚至更优选约0.15kg/(m3h)。进一步地，如本文所述的方法的更详细的进料策略描述在图1中。简言之，在培养基之内的p02移至低于80mbar，优选低于60mbar,甚至更优选低于40mbar后，按如下初始速率加入进料混合物约3-10kg/(m3h),更优选约4-8kg/(m3h)，甚至更优选约5-7kg/(m3h),最优选约6.5kg/(m3h)。所述初始进料速率连续地按如下增加率增加0.01-0.5kg/(m3h),优选约0.05-0.3kg/(m3h)，更优选约0.1-0.25kg/(m3h)，甚至更优选约0.15kg/(m3h)。优选地在p02恢复约100mbar之后，所述进料速率(在那时存在)一次性提高约1-2kg/(m3h)，优选约1kg/(m3h)。可选地，在培养基之内的p02将至低于80mbar，优选低于60mbar，甚至更优选低于40mbar后，按如下初始速率加入进料混合物约3-10kg/(m3h)，更优选约4-8kg/(m3h)，甚至更优选约5-7kg/(m3h)，最优选约6.5kg/(m3h)。所述初始进料速率在发酵过程中分两个步骤增加，每步为约0.5-2kg/(m3h),优选约1kg/(m3h)。所述发酵的终止似乎对如本文所述的整个生产方法很重要。令人惊奇地发现，当在假稳定期开始之前结束发酵过程时，可以使用如本文所述的单个纯化方法，得到高度纯化的羊毛硫抗生素，例如gallidermin。换言之，为了根据如本文所述的方法生产羊毛硫抗生素，将所述细胞培养物生长至不超过稳定期开始。术语"不超过稳定期开始，，的发酵过程指在pH<5.6，优选在6.0前停止。可选地，术语"不超过稳定期开始"的发酵过程指其中发酵罐之内的活细胞总数不进一步增加的发酵过程。而且，术语"不超过稳定期开始，，也指在pH〈6.0和活细胞总数不在增加之前停止发酵。细胞总数可以直接地或通过使用间接的方法，比如例如通过测定培养肉汤的浊度来估计。通常，当细胞数量增加时细胞培养物的浊度增加。例如，"浊度，，可以通过在600nm的波长下，每ml培养肉汤和一定时间测定的光密度(O.D.綱)估计。因此，术语"不超过稳定期开始，，也指对于10分钟的发酵，每ml发酵罐肉汤AO.D.細的值下降至小于0.1。优选地，每ml发酵罐肉汤和IO分钟发酵时间的AO.D.6oo的值下降至小于0.05，更优选小于O.Ol。因此，可选地，术语"不超过稳定期开始"也指在pH〈5.6,优选<6.0和/或对于IO分钟的发酵，每ml发酵罐肉汤的AO.D.6o。的值下降至小于0.1之前停止发酵。优选地，每ml发酵罐肉汤和10分钟发酵时间的AO.D.6oo的值下降至小于0.05，更优选大于0.01。纯化过程通常理解，为了增加羊毛硫抗生素例如表皮肽和gallidermin的产量，重要的是在发酵过程中除去那些产物，因为羊毛硫抗生素对生产者(细菌)本身有害，并且受到来自生产菌林分泌的蛋白酶类活性的影响。因此，将透析或不连续的吸附色谱步骤整合到发酵过程中(参见例如Ungermann等人(上述))，其使得羊毛硫抗生素从培养肉汤中连续分离。如本文所述的发酵过程不需要这样的方法，即使根据如本文所述的生产方法的进一步的实施方案可以使用这样的分离步骤。令人惊奇地发现通过初始盐沉淀步骤可以高产率和高纯度地从培养肉汤(培养物上清液)中纯化羊毛硫抗生肽，特别是gallidermin。术语"初始盐沉淀步骤"指在盐沉淀之前，所述培养肉汤不进行任何其它纯化步骤。然而，并不认为细胞分离或pH调节是纯化步骤。因此，本发明还涉及一种用于制备羊毛石危抗生肽优选gallidermin的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入盐，优选无机盐从细胞培养上清液中沉淀羊毛硫抗生肽。令人惊奇地发现，当接触盐优选无机盐时，羊毛硫抗生素显示出预想不到的沉淀性质。优选地，那些沉淀性质已经显示出与如本文所述的发酵过程组合(上述)。换言之，当根据如本文所述的方法发酵所述羊毛硫抗生素时，盐沉淀步骤的功效可能会增加。例如，用碱金属卣化物(alkalinehalogen)或硫酸铵盐的沉淀试验得到产物产率总计为约80至90%,纯度总计为约90至94%。盐沉淀过程-或盐析方法-为本领域技术人员所熟知的，且通常与进一步的纯化步骤组合使用。例如，盐析描述在Harris和Angal(eds.)inproteinpurificationmethods-apracticalapproach,OxfordUniversityPress1995中。然而，从来没有描述过简单的沉淀步骤会产生如此高的产品纯度和产率。对于进行如本文所述的沉淀步骤的合适的盐为无机盐。应当考虑所使用的盐的一些方面。盐的功效主要由阴离子的性质确定，多电荷阴离子是最有效的。功效的顺序为磷酸根>硫酸根>乙酸根>氯离子>(之后为Hofmeister系列)。尽管磷酸根比硫酸根更有效，实际上在中性pH下，磷酸根主要由HPO,或H2P(V组成，而不是最有效的P043-。一价阳离子是最有效的，NP^、K、N"。溶解度也是一个重要因素，因为需要高达几摩尔浓度的浓度。因此，许多钾盐在这方面不适合。因为可能变性的危险或溶解度改变，将存在盐溶解引起的温度略微增加。最终需要考虑的是得到的溶液的密度，因为聚集体密度和溶液密度之间的差异决定了离心分离的容易性。优选地，根据如本文所述的方法，使用下式的盐来沉淀所述羊毛硫抗生素MnXm，其中11=+1、+2,和m;l、-2、-3。甚至更优选的为无机盐，其特征在于X选自卣素离子(halogen)、磷酸根、膦酸根、硫酸根、磺酸根(sulphonyl),乙酸根，和其中M选自碱金属、碱土金属和铵。甚至更优选的为无机盐，其特征在于X选自卣素或硫酸根，和其中M选自碱金属、碱土金属和铵。甚至更优选的为无机盐，其特征在于当X为囟素时，M选自碱金属或碱土金属，而碱金属与卣素的组合是最优选的。优选的卣素为氯离子，优选的碱金属为钠和钾，而钠是最优选的。其结果是，使用氯化钠和氯化钾是最优选的，而与氯化钾相比，氯化钠甚至是更优选的。对于羊毛硫抗生素例如gallidermin的沉淀，最优选适合的是氯化钾和氯化钠，优选氯化钠是本文所述的进一步意想不到的发现。已经通过实施例2显示出，与更强的硫酸铵相比，使用氯化钠得到较高的产率和纯度。然而，可选地铵盐，优选硫酸铵，也显示出适合用于如本文所述的沉淀步骤。优选地，用无机盐的沉淀在至少1.6M或更高的盐浓度下进行。优选地，根据如本文所述的方法所用的盐浓度为约1.6至10M，更优选约1.6至5M，甚至更优选约2.5至4M，甚至更优选约3至4M。然而，如上所述，本领域技术人员认识到摩尔浓度的上限值由在使用的温度下盐的溶解度所限定。例如，在室温下，氯化钠在水中溶解至多4.2至4.4M。因此，i咸金属卣化物盐(alkalinehalogenosalt)，例如氯化钠的使用浓度优选地为约2.6M至4.5M,更优选约3.1M至4.2M，甚至更优选约3.2至3.5M,最优选约3.4M。根据如本文所述的沉淀步骤的进一步的实施方案，在沉淀前调节所述发酵肉汤至中性和/或弱碱性pH。因此，所述沉淀步骤优选在约7至10的pH下，更优选在约7.5至9的pH下，更优选在约7.8至8.8的pH下，最优选在约8.0的pH下进行。优选地，在上述范围内的弱石威性pH下与使用卣化物盐，优选碱性卣化物盐，最优选氯化钠的组合来沉淀是最优选的。根据如本文所述的沉淀步骤的一个进一步的实施方案，所述盐沉淀在室温(约20至25。C)或小于室温下进行。然而，本领域技术人员还认识到所述沉淀步骤也可以在稍高于或高于室温的温度下进行。通常，温度越高，所述产物受不利影响的危险越大。从经济的观点来看，通常的目标是在接近室温下进行所有的制备步骤。令人惊奇地发现，使用羊毛硫抗生素，优选用gallidermin,该方法进4亍的4艮好。对于本文所述的方法，已经表明在沉淀30分钟(在搅拌下)后，盐析出总计超过80%的产物。纯度总计为约大于90%。优选地，所述沉淀进行至少30分钟，优选在搅拌下进行。甚至更优选地，所述沉淀进行至少30分钟，但在纯度降低至低于约75%，优选地低于约78%，甚至更优选地低于约80%，甚至更优选地低于约82%,甚至更优选地低于约84%,甚至更优选地低于约86%,甚至更优选地低于约88%,最优选地低于约90%之前停止。可以通过标准定量的HPLC分析测定产物产率。根据进一步的实施方案，所述沉淀进行到直到盐析出总计至少约70%、优选约75%,甚至更优选直到75%，更加优选直到80%，甚至更优选直到82%，甚至更优选直到85%，甚至更优选直到90%的产物。但在纯度降低至低于约75%,优选地低于约78%，甚至更优选地低于约80%,甚至更优选地低于约82%，甚至更优选地低于约84%，甚至更优选地低于约86%,甚至更优选地低于约88%，最优选地低于约90%之前停止。根据进一步的实施方案，所述沉淀进行至少约30分钟至2小时，优选约30分钟至1小时，优选约30分钟。优选地，最初搅拌所述沉淀混合物至少30分钟，更优选30分钟。因此，如本文所述的用于羊毛硫抗生素的本发明的制备方法包括作为初始纯化步骤的盐沉淀约1小时，其中在搅拌下进行第一个30分钟。优选地，经30分钟并在搅拌下加入所述盐，然后继续搅拌30分钟。由此，应理解本文所述的方法可以包括对各个参数描述的任何变化，即使没有明确地提及参数的特定组合。例如，如本文所述的用于制备羊毛硫抗生素的方法也包括在沉淀步骤之前调节发酵肉汤至pH8.0至8.5，在室温下，在搅拌下，用3至4M的卣化物盐优选氯化钠沉淀至少30分钟，接着再搅拌30分钟。本文所述的方法也包括如本文所述的用于制备羊毛硫抗生素的方法，其中所述方法包括在沉淀前，调节发酵肉汤至pH7.5至9.0，在室温下用约3.4M卣盐优选氯化钠沉淀羊毛硫抗生素，直到盐析出至少80%的羊毛硫抗生素，但其中在纯度降低至总计低于90%之前停止沉淀步骤。根据进一步的实施方案，如本文所述的用于制备羊毛硫抗生素的方法的特征在于该纯化过程进一步包括纯化步骤使从所述沉淀步骤获得的肽进行洗涤步骤、单一色谱纯化步骤、干燥步骤或结晶。已经发现当用包含如沉淀所用的相同的盐和相同的盐浓度的溶液洗涤第一次沉淀物时可以进一步增加纯化，该第一次沉淀物优选通过离心或过滤分离，其中过滤最优选。任选地，与所述沉淀溶液相比，在所述洗涤溶液内的盐浓度可以稍微增加。优选地，所述洗涤体积相当于初始产物溶液体积的十分之一至一半，或十分之一至四分之三。在所述洗涤步骤之后，优选地通过离心或过滤步骤分离包含产物的沉淀物。所述离心和过滤步骤均是本领域技术人员所熟知的。因此，本文所述的方法涉及一种用于制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛石克抗生肽，并获得沉淀物，(ii)用包含如沉淀所用的相同的盐的溶液洗涤该沉淀物，并获得沉淀物。优选地，在沉淀步骤之前，除去细胞和如上所述调节pH。根据如本文所述的用于制备羊毛硫抗生素优选gallidermin的方法的一个进一步的实施方案，优选用初始体积的20分之一的水洗涤如上所述的直接从所述沉淀步骤或从用相同的盐的洗涤步骤获得的沉淀物。优选地，重复用水的洗涤步骤。在通过离心或过滤的各个洗涤步骤之后，获得包含产物的沉淀物，而过滤是最优选的。因此，本文所述的方法涉及一种制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛硫抗生肽，并获得沉淀物，(ii)任选地用包含如沉淀所用的相同的盐的溶液洗涤该沉淀，并获得沉淀物，(iii)任选地，用水洗涤步骤(i)或(ii)的沉淀物，并获得沉淀物，(iv)任选重复步骤(iii)。优选地，在沉淀步骤之前，除去细胞和如上所述调节PH。根据如本文所述的用于制备羊毛石克抗生素优选gallidermin的方法的进的沉淀物溶于合适的緩沖液，优选乙酸緩冲液，甚至更优选P/。(v/v)乙酸。因此，将(i)初始沉淀步骤的，或(ii)用于相同的盐的洗涤步骤的，或(iii)用水中，优选乙酸缓沖液，甚至更优选约1。/。至2。/。(v/v)的乙酸，最优选约1%的乙酸。根据进一步优选的实施方案，所述緩冲液也包括25至50。/。(v/v)的醇，优选乙醇。因此，优选的乙酸緩冲液包含约1至2%的乙酸和约15至50%,优选20至40%(>)，最优选々0。/。(v/v)的醇，优选乙醇。接着，将溶解的产物滴定至期望的pH,最后过滤并冷冻，或冷冻-干燥或结晶。用于冷冻、冷冻干燥或结晶的方法是本领域技术人员所熟知的，并且可以施用于所述羊毛辟ii元生素优选gallidermin的进一步加工。这些方法的实例描述在(Scopes，R.K.，ProteinPurification:PrinciplesandPractice.Springer,1993)中。因；t匕,本文所述的方法涉及一种用于制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛石克抗生肽，并获得沉淀物，(ii)任选地用包含如沉淀所用的相同的盐的溶液洗涤该沉淀，并获得沉淀物。(iii)任选地，用水洗涤步骤(i)或(ii)的沉淀物，并获得沉淀物，(iv)任选重复步骤(iii),(v)将步骤(ii)至(iv)的沉淀物溶解在乙酸緩沖液中，优选1%的乙酸，和(vi)将溶解的产物滴定至期望的pH，最后过滤并冷冻，或冷冻-干燥或结晶。优选地，在沉淀步骤之前，除去细胞和如上所述调节PH。可以通过制备HPLC或LPLC,优选地通过反相色谱法进一步提高所述产物的纯度至>98面积％。使用反相色谱法脱盐和/或纯化产品的方法是本领域才支术人员所熟知的，并描述在例如(Scopes，R,K,,ProteinPurification:PrinciplesandPractice.Springer,1993)中。例如，可以叶吏用的合适的色i普介质是AmberchromHPR10、XT20、cg300c和cgl61c(Rohm和Haas，PhiladelphiaUSA)等。因此，本文所述的方法涉及一种用于制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无^L盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛硫抗生肽，并获得沉淀物，(ii)任选地用包含如沉淀所用的相同的盐的溶液洗涤该沉淀，并获得沉淀物。(iii)任选地，用水洗涤步骤(i)或(ii)的沉淀物，并获得沉淀物，(iv)任选重复步骤(m)，(v)使从前述步骤(i)至(iv)的任一个中获得的羊毛硫抗生肽进行单一色谱纯化步骤，优选地，其中所述色谱纯化步骤为反相色谱法。优选地，在沉淀步骤之前，除去细胞和如上所述调节PH。根据进一步的实施方案，将如上所述的(i)直接从沉淀步骤，(ii)从用相同的盐的洗涤步骤，(iii)用水第一次、第二次或任何其它洗涤步骤获得的沉淀物负载到反相色谱柱上，然后，将其用水溶液洗涤，例如16%(v/v)的乙腈水溶液，优选与0.1。/。(v/v)的三氟乙酸水溶液等一起洗涤。然后，可以用乙腈的梯度溶液，优选20_40%(v/v)，例如213W/。(v/v)的乙腈水溶液等从所述柱洗脱产物。优选地，所述洗脱緩沖液还可以包含三氟乙酸等，优选约O.Ol至0.5。/。(v/v),更优选约0.1%(v/v)。然后，通过低压蒸馏从所述产物溶液中除去有机溶剂，将该产物滴定至期望的pH，最后过滤并冷冻，或冷冻干燥或结晶。可以调节产物从HPLC柱的收集以进一步提高纯度，其结果是产率降低。或者，将如上所述的(i)直接从沉淀步骤，(ii)从用相同的盐的洗涤步骤，(iii)用水第一次、第二次或任何其它洗涤步骤获得的沉淀物悬浮在包含乙醇和乙酸的含水緩冲液中。优选地，乙醇浓度为约5至50%(v/v)，甚至更优选20至45%(v/v)，最优选约40%(v/v)，且乙酸浓度为约0.1至10%(v/v)，优选约0.5至5%(v/v)，最优选约1.0%(v/v)。任选地过滤得到的产物溶液，而使用过滤步骤是优选的，并将其负载到低压反相色谱柱上，例如Amberchromcg300c(Rohm和Haas，PhiladelphiaUSA)。类似的反相色谱介质也是合适的，例如Amberchromcgl61c等。本领域技术人员通常会认识到选择用于实施如本文所述的方法的合适的反相色谱介质。然后，用合适的緩冲液洗涤所述柱，所述緩冲液包含例如乙腈和优选三氟乙酸的水溶液，优选约16%的乙腈和约0.1°/。的三氟乙酸的水溶液。然而，为了进行反相色谱，可以使用任何其它合适的包含有机溶剂和酸物质的含水緩沖液。优选地用强有机溶剂进行产物洗脱，例如用约60至90%(v/v)的乙腈的水溶液，优选地用约80%的乙腈的水溶液。然后，通过低压蒸馏从所述产物溶液中除去有机溶剂，将该产物滴定至期望的pH，最后过滤并冷冻，或冷冻干燥或结晶。如果在纯化过程期间使用三氟乙酸，则可以任选地通过本领域众所周知的标准方法从包含三氟乙酸的物质中将其除去。例如，可以通过用离子交换基质，优选阴离子交换基质(例如SAX，平衡离子碳酸氢根)培养包含三氟乙酸的物质，直到大部分三氟乙酸，优选大于90%,甚至更优选大于95%，最优选大于99.9%的三氟乙酸结合至所述离子交换基质，从而来获得不含三氟乙酸的物质。所需的离子交换基质的量取决于三氟乙酸的结合力和总量，但超过最大结合力最少10%。在培养至少30分钟后，从所述离子交换器分离溶液。在用十分之1-2的开始体积的乙腈水溶液的洗涤用緩冲液洗涤所述离子交换基质后，所述洗涤緩冲液优选地包含10-20%的乙腈水溶液，然后，低压蒸馏该混合溶液以除去乙腈，直到该溶液变成微混浊。也可以使用除去三氟乙酸或交换抗其它平衡离子的三氟乙酸-盐的其它众所周知的方法来生产游离碱或其它盐，如氢氯酸盐或者乙酸盐。根据进一步的实施方案，本文所述的方法涉及一种用于制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛硫抗生肽，并获得沉淀物，(ii)任选地用包含如沉淀所用的相同的盐的溶液洗涤该沉淀，并获得沉淀物。(iii)使从洗涤步骤(ii)获得的羊毛硫抗生肽进行单一色谱纯化步骤，优选地，其中所述色谱纯化步骤为反相色谱法，(iv)通过低压蒸馏从所述产物溶液中除去有机溶剂，(v)将其滴定至期望的pH,和最后将其冷冻干燥。优选地，在沉淀步骤之前，除去细胞和如上所述调节PH。实施例下述实施例有助于进一步阐述本发明；但其不应当被看作是限制此处所公开的本发明的范围。而且，下述实施例将阐述如本文所述的方法的一般性发明概念。实施例1:gallidermin的发酵冷冻培养(WCC):使用一'J、瓶鸡葡萄球菌GSto//^/ococcwga〃z'"an/w)(Tti3928;DSM4616)的冷冻原种(ZellbankBO-002;Kampagne1940122004033,Reference35/3/18)无菌接种琼脂板。在37°C下培养该琼脂培养物1天，接着在4°C下(用Parafilm-但该步骤不是必需的)培养1天。该培养物用于接种第一代种子。对于每次生产，必须使用新的小瓶。平板培养物培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>预培养物或第一代种子(2个摇瓶；500ml):将一片培养过的板(约0.5x0.5cm)无菌转移到两个500ml的被折流的(baffled)摇瓶(一折流板)中，其包含100ml的无菌接种培养基。在37。C下，在旋转混合器(140-180rpm)中培养所述接种的烧弁瓦16-18小时。最终产物的滴定度应当为>100mg/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>将第一代种子(2.0%)无菌转移到20L含有如在预培养物中相同的培养基(=种子培养基)的生物反应器中。在37°C，将在所述生物反应器中的4妄种缸或烧瓶或培养物培养至多24小时。在5-6小时后，出现p02变化，此时开始葡萄糖进料(进料分布图参见生产发酵的下面)。为了防止泡沫形成，在灭菌前加入0.05ml/L的GenapolEP0244和PEG600的1:1混合物。如果4吏用所述发酵罐作为用于生产发酵罐的接种物，则仅仅培养该培养物16-18小时，然后转移到生产生物反应器中(理由当转移时，产物滴定度应当为<200mg/L)。生产发酵所述生产发酵是在具有工作容积为1000L的1500L槽中进行(NB迄今为止20L发酵罐规模(IOL工作容积，设计1.5m3))。将无菌培养基冷却至37°C，并用第二代种子接种。接种物的含量为0.5%。发酵条件如下培养基与接种培养相同培养温度37°CpH:没有控制，但在接种时pH应当固定在6.3防止起泡使用0.5mL/L的Genapol和PEG600的1:1混合物搅拌器速率以300rpm开始通风速率0.5vvm试验两种不同的进料-分布图进料A:在p02变化后(5-6小时后)，开始进料，进料速率6.5kg/(m3h)，斜率常数0.15kg/(m3h)(A)。进料B:在进料5小时后，进料速率按1kg/(m3h)增加，斜率如上(B)。如上所述用于生产gallidermin的典型的发酵分布图显示在图1中。基于所有的发现，在相同的条件下(参见上述)，进行几次发酵以观察该方法是否强有效(robust)并可重现。图2显示了如本文所述的产生gallidermin的生产率的两个标准发酵的典型分布图。实施例2:gallidermin的纟屯化从如实施例1描述的发酵过程的培养物上清液开始，按下述方法纯化gallidermin:方法A:用石克酸铵沉淀在发酵后，通过离心除去细胞，并通过在室温下经30分钟并在同时搅拌下加入314g/1的硫酸铵(其相当于50%饱和)，来从不含细胞的上清液(pH6.7)中沉淀产物。在一个单独的试验中，测试具有多种浓度(饱和)硫酸铵的沉淀。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>再慢慢地搅拌该混悬液30分钟，然后通过过滤收集沉淀物。将该沉淀物溶于40%乙醇、1%乙酸水溶液(起始体积的1/4)中。产物的产率为87%，如通过分析HPLC测定的纯度为93.6面积％。可以通过制备HPLC进一步提高所述产物的纯度至>98面积％。所述色谱培养基为AmberchromHPR10(也相继使用XT20测试)。将该产物负载到柱上，然后，用16%的乙腈，0.1%的三氟乙酸的水溶液洗涤。用24-36%的乙腈从柱上梯度洗脱产物。方法B:用NaCl沉淀变型A:1.在发酵后，通过离心除去细胞，并通过在室温下经30分钟并在同时搅拌下加入200g/LNaCl,从不含细胞的上清液中沉淀产物。沉淀持续30分钟。la).在一个单独的试验中，测定沉淀时间对产物的产率和纯度的影响19(200g/LNaCl，pH6,7，室温):<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>lb).在进一步的试验中，测定NaCl浓度对产物产率和纯度的影响(沉淀时间30分钟，pH6.7,室温)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>lc).在进一步的试验中，测定沉淀前产物溶液的pH对产物产率和纯度的影响(沉淀时间30分钟，200g/LNaCl，室温)_<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2.离心该产物沉淀物，并用200g/L的NaCl溶液洗涤。洗涤体积相当于初始产物溶液体积的一半。3.再次离心该沉淀物，并将其悬浮在1/20初始体积的水中。4.离心后，将该沉淀物悬浮在1/20初始体积的水中，并再次离心。5.将产物沉淀物溶于1%的乙酸中，然后用NaOH溶液将其滴定至期望的pH，最后过滤并冷冻。变型B:1.发酵后，通过离心除去细胞，并通过在室温下经30分钟并在同时搅拌下加入200g/L的NaCl,来/人不含细胞的上清液中沉淀产物。沉淀持续30分钟。2.离心该产物沉淀物，并用200g/L的NaCl溶液洗涤。洗涤体积相当于初始产物溶液体积的一半。3.再次离心该沉淀物，并将其悬浮在1/20初始体积的水中。4.加入20%的乙醇、2%的乙酸的水溶液，得到％初始体积的最终容积。更大的体积也是可能的。5.过滤该产物溶液，并将其负载到Amberchromcg300c柱上(低压反相色谱法)。类似的反相色语介质也是合适的，例如Amberchromcgl61c等。用16%的乙腈、0.1%的三氟乙酸的水溶液洗涤该柱，然后，用80%的乙腈水溶液洗脱产物。6.通过低压蒸馏从产物溶液中除去乙腈。7.冷冻干燥该产物。总产率为57%,HPLC测得纯度为95%，含量为68%。变型C:1.发酵后，通过离心除去细胞，并用0.5M的NaOH将不含细胞的上清液调节至pH8.0。通过在室温下经30分钟并在同时搅拌下加入200g/L的NaCl和17g/L的Celite，来从不含细胞的上清液中沉淀产物。沉淀持续30分钟。2.过滤该产物沉淀物，并用三份200g/L的NaCl溶液洗涤。总的盐洗涤体积相当于初始产物溶液体积的四分之三。3.用一份水，相当于初始产物溶液体积的1/20洗涤该沉淀物。4.用三份40%的乙醇、1%的乙酸溶解该沉淀物。总体积为初始产物溶液体积的四分之一。5.过滤该产物溶液，并将其负载到AmberchromHPR10反相HPLC树脂的柱上。其它的反相HPLC树脂比如AmberchromXT20或Kromasil100A-10-C18也是适宜的。然后，用16%的乙腈、0.1%的三氟乙酸的水溶液洗涤该柱。用包含0.1%三氟乙酸的24-36%的乙腈水溶液从柱上梯度洗脱产物。6.通过低压蒸馏从产物溶液中除去乙腈。7.冷冻干燥该产物。典型地，获得>98面积％的纯度。可以调节产物从HPLC柱的收集以进一步提高纯度(其结果是产率降低)。变型D:1.发酵后，通过离心除去细胞，并用0.5M的NaOH调节不含细胞的上清液至pH8.0。通过在室温下经30分钟并在同时搅拌下加入200g/L的NaCl和17g/L的Celite，来从不含细胞的上清液中沉淀产物。沉淀持续30分钟。2.过滤该产物沉淀物，并用三份200g/L的NaCl溶液洗涤。总的盐洗涤体积相当于初始产物溶液体积的四分之三。3.用一份水，相当于初始产物溶液体积的1/20洗涤该沉淀物。4.用三份40%的乙醇、1%的乙酸溶解该沉淀物。总体积为初始产物溶液体积的四分之一。5.过滤该产物溶液，并将其负载到AmberchromHPR10反相HPLC树脂的柱上。其它的反相HPLC树脂比如AmberchromXT20或Kromasil100A-10-C18也是适宜的。然后，用16%的乙腈，0.1。/。的三氟乙酸(TFA)的水溶液洗涤该柱。用包含0.1%三氟乙酸的24-36%的乙腈水溶液从柱上梯度洗脱产物。6.通过下述方式除去TFA:直接用离子交换剂，优选阴离子交换剂(例如SAX，平衡离子碳酸氢根)处理来自所述HPLC柱的级分一次或两次，直到99.9%的TFA结合该离子交换剂。所需的量取决于结合力(TFA的总含量)，但超过最大结合力最少10%。在用离子交换剂反应30分钟之后，将全部混悬液倾入大的玻璃砂芯(glassfritt)中，所述溶液与离子交换剂分离。在用十分之1-2的起始体积的10-20%的乙腈水溶液(wfi样性质)洗涤该离子交换柱IEC树脂之后，然后在低压下蒸馏该混合溶液至除去乙腈，直到所述溶液变成微混浊的。也可以使用除去TFA或交换抗其它平衡离子的三氟乙酸根的其它众所周知的方法来生产游离碱或其它盐，如氢氯酸盐或者乙酸盐。7.冷冻干燥产物。典型地，获得>98面积％的纯度。可以调节产物从HPLC柱的收集以进一步提高纯度(其结果是产率降低)。权利要求1.用于制备羊毛硫抗生肽的方法，其包括发酵和纯化步骤，其中所述纯化步骤包括步骤:(i)通过加入无机盐从细胞培养上清液中沉淀该羊毛硫抗生肽。2.根据权利要求l的方法，其特征在于其进一步包括纯化步骤(ii)使从沉淀步骤i)获得的肽进行洗涤步骤、单一色谱纯化步骤、干燥步骤或结晶。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述无机盐包括组分Mnxm，其中n二+l、+2，和m二-l、-2、-3。4.根据权利要求3的方法，其特征在于X选自卣素离子、磷酸根、膦酸根、硫酸根、磺酸根、乙酸根，和其中M选自碱金属、碱土金属和铵。5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述盐优选地为碱金属卣化物，优选氯化钠或氯化4甲。6.根据权利要求1的方法，其特征在于使用无机盐的沉淀是在至少1.6M或更高的盐的浓度下进行的。7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于从所述发酵步骤得到的细胞培养上清液采集自细菌批料或补料分批细胞培养物，所述的培养物生长不超过稳定期开始；或者采集自连续的细菌细胞培养物。8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于发酵步骤所用的培养基中补充有酵母提取物。9.根据权利要求9的方法，其特征在于所述细菌细胞培养物为葡萄球菌属培养物，优选为鸡葡萄球菌培养物。10.根据权利要求1的方法，其特征在于所述羊毛硫抗生肽选自表皮肽、pep5或gallidermin,或其至少包括式I结构基序的变体。全文摘要本发明涉及已知分类为羊毛硫抗生素的抗生素化合物的制备。优选地，本发明涉及那些羊毛硫抗生素的纯化。文档编号C07K1/00GK101384612SQ200780005277公开日2009年3月11日申请日期2007年2月8日优先权日2006年2月13日发明者休伯特·米尔纳,克劳斯·海因茨曼,安德烈亚斯·沃纳,尤维·吉尔里克,尼古拉斯·M·肖,库尔特·艾尔,费边·怀尔,马丁·A·福尔杰申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司