专利名称：：针对禽流感病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人和兽医学领域，特别地涉及在鸟类和哺乳动物中形成针对此类病毒的早期且强有力的免疫应答的新型嵌合抗原，其包含与刺激细胞和体液免疫系统的蛋白质分子相偶联的禽流感病毒的病毒亚单位。现有技术禽流感(AI)是全世界分布的呼吸系统疾病。这种高度接触传染性的疾病可以影响鸡、火鸡、鸭、鹅、珠鸡，以及广泛多样的驯养和野生鸟类。存在这样的可能性，即所有鸟类物种易被感染，其中迁移的水生物种是引起这种疾病的病毒的主要天然储库。驯养家禽中的禽流感病毒感染引起2种类型的疾病，根据其高或低水平的毒力而有区别。"低致病性"形式可以不引人注意地被忽略，并且一般仅产生轻度症状(例如刚毛状羽毛和产蛋量减少)。然而，高致病性形式在家禽中更快地传播。这种形式可以引起击数种内脏器官的疾病，其所具有的死亡率可以在48小时的时间段中达到直至90-100%。引起禽流感的病毒属于正粘病毒科(Oi^o迈/;roWW^e)。基于其抗原差异，将流感病毒分成A、B和C型。它的遗传物质是分节段的、具有负极性的核糖核酸(RAN)。流感病毒A和B具有8个区段，而流感病毒C仅有7个区段。病毒基因组为分节段的这一事实有利于遗传重组，从而引起具有不同于原始病毒的特征的病毒(Capua;Alexander(2004)AvianInfluenza:RecentDevelopments.AvianPathol.33:393-404)。病毒包膜包含2种主要糖蛋白一一血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA蛋白质是细胞受体的结合蛋白，它介导病毒包膜与细胞膜的融合，这对于病毒穿透靶细胞是重要的。这种蛋白质诱导中和抗体的应答。HA蛋白质上的突变引起更大或更小程度的抗原性变体。M蛋白质切割宿主细胞的唾液酸(这有利于病毒从细胞中释放)，降解粘液，并使得病毒容易接近组织。禽流感病毒A的NA同样也经历抗原变化。通常，禽流感病毒不感染除家禽和猪之外的其他物种。当H5N1毒林引起18人的急性呼吸系统疾病时(其中6人死亡)，于1997年在香港证实了由于禽流感病毒而引起的人感染的第一个病例。那些个体中的感染与由相同毒林产生的在香港的鸟类群体中高致病性禽流感的流行相一致。在2003年2月，当禽流感H5N1的爆发引起近期去中国南方旅行的家庭成员之一死亡时，在香港产生了新的警报。该家庭的另一个儿童在此次旅游期间死亡，但他的死因不明。近来，AI的另2个病毒毒林已在人中引起疾病。在香港，在1999年，在儿童中产生AIH9N2的2个轾度病例，并且在2003年12月中旬，报告了另一个病例。H9N2亚型在家禽中通常不是高致病性的。然而，于2003年2月在荷兰开始的高致病性H9N2禽流感病毒引起1名兽医在2个月后死亡，以及另外83人中的轻度疾病。从1997年至今，能够感染人的禽流感爆发已变得更频繁，并且该病毒已在亚洲和欧洲的大量国家中传播。迄今为止，HSN1毒林已是人类流感的主要致病因子。到2005年10月，已报告了200个被H5N1感染的人，其中死亡率为约55%。亚洲和欧洲的13个国家已受到影响，并且超过1亿2千万只鸟类已死亡或处于隔离检疫中。一般而言，AI的每次爆发导致成亿只鸟类的处死和卫生控制措施的采用，这就整体而言意味着很大的经济损失。在禽流感在家禽中爆发的期间，存在这样的风险，即已与受感染的鸟类或被此类鸟类的分泌物和排泄物污染的表面接触的人变得是接触传染的。感染在鸟类之间的散布增加直接感染人的机会。如果更多的人获得感染，那么随着时间过去风险也增加，如果被禽和人流感毒林同时感染，那么这些人还可以充当用于新亚型的出现的"混合受者"。具有足够的人流感病毒基因的这种新亚型可以容易地在人之间传播，并且将转化成完全可传播的大范围流行的毒林，如在1918年产生称为"西班牙流感"的大流行病的H1N1变体，其中2千5百万至5千万人死亡。立即优先的是终止大流行病在家禽群体之间的另外传播。这种策略对于减少人暴露于病毒的机会是有效的。通过使用针对目前流行的流感病毒毒株的有效疫苗来给处于暴露于受感染鸟类的高风险中的人接种疫苗，可以减少出现由禽和人流感毒抹而引起的人感染的可能性，并且这样减少了在这两种病毒毒林之间产生基因交换的风险。现今，为了预防在人中以及在鸟类中的该疾病，用于生产针对流感的疫苗的操作程序基于病毒在鸡胚胎中的繁殖。随后，将通过这种方式产生的病毒进行化学灭活，并进行半纯化。然而，此类技术无法应付可能的大范围流行的危机。通过这种操作程序，疫苗的开发和生产需要数月。在鉴定出潜在的毒林后，需要使用高生产性毒林来重新吸收它以获得足够的生长性质。此外，更重要的是，引起最近的动物流行病的H5毒抹与人中的许多感染病例相关，并且导致在用于疫苗生产的鸡胚胎中的致死。这些疫苗的生产另外意味着致病性毒抹的操作。由于这个原因，必需在BL3安全条件下进行工作，从而增加了在出现危机的情况下执行按比例扩大的过程和困难。已证实，由于针对流感的疫苗制剂中残留的蛋的蛋白质，对蛋具有急性过敏反应的人可以经历即刻的超敏反应。在1W6年，针对猪流感的疫苗与吉-巴综合征的频率增加相关(Schonberger等人(1979)SyndromefollowingvaccinationintheNationalImmunizationProgram,UnitedStates,1977-1977，Am.J.Epidemio，110—105-23)。迄今为止，使用随后的来自其他毒林的疫苗制剂，未观察到这种疾病的发生率的增加。基于细胞培养的病毒生产已作为用于替代在鸡胚胎中的生产系统的吸引人的备选方案而出现。该策略意指在细胞培养物中生产流感病毒，随后进行病毒纯化步骤。这种操作过程具有下述优点l)细胞培养物易于操作和在短时间段内扩大，2)在这些系统上生产的流感疫苗已在I期和II期临床试验中进行了评估，并且已证实是安全的并至少与在鸡胚胎中生产的那些一样有效(Brands等人(1999)Influvac:asaleMadinDarbyCanineKidney(MDCK)cellculturebasedoninfluenzavaccine.DevBiolStand.98:93-100;Percheson等人(1999)APhaseI，randomizedcontrolledclinicaltrialtostudythereactogenicityandimmunogenicityofanewsplitinfluenzaBvirusvaccinesgrowninmammalianeelIsorembryonatedchickeneggs.J.Virol.72:4472-7)。然而，这种策略仍具有局限性，即需要重新吸收的病毒，其允许获得高产量。该过程还可以在病毒基因中引入细胞系的特定突变，所述突变在原则上可以导致选择出特征在于HA蛋白质上的结构和抗原性变化的变体，从而可能导致有效性更低的疫苗。(Meiklejohn等人(1987)Antigendriftandefficacyofinfluenzavirusvaccines.JInfectDis.138:618-24;Robertson等人(1985)AlterationsinthehemagglutininassociatedwithadaptationofinfluenzaBvirustogrowthineggs.Virology143:166-74;Schild等人(1983)Evidenceforhost-cellselectionofinfluenzavirusantigenicvariants.Nature303:706-9)。在另外的局限性中包括l)致病性病毒的生产和操作需要高防护性的设施；2)—般而言，基于细胞培养的生产系统是昂贵的和技术上苛求的。针对流感病毒的保护是针对HA蛋白质(存在15种不同的亚型)以及以较低的程度针对NA蛋白质(具报道存在9种不同的亚型)的免疫应答的结果(Suarez,Schultz(2000)Immunologyofavianinfluenzavirus:areview.Dev.Comp.Immunol.24:269-283;Swayne，Halvorson，(2003)Influenza.In:Saif，Y.M.，Barnes,H.J.，Fadly，A.M.,Glisson，J.R.，McDougald，L丄，Swayne,D.E.(编辑).DiseasesofPoultry,第11版。IowaStateUniversityPress,Ames,IA，第135-160页)。针对内部蛋白质例如核蛋白或基质蛋白质的免疫应答不足以保证该领域中的保护。实际上，保护由包括在疫苗中的HA特定亚型提供。已通过将HA基因插入至活病毒栽体中来生产针对禽流感的疫苗，并且这些重组截体随后由于家禽免疫接种。活重组病毒载体疫苗的使用具有下述几个优点l)它们是不仅能够诱导体液应答还能够诱导细胞应答的活疫苗，2)它们可以在小鸡中施用并诱导早期保护。例如，基于禽痘病毒的重组体可以施用于1天大的鸟类，从而在1周后诱导针对马雷克病的早期保护(Arriola等人(1999)Experienciasdecampoenelusodevacunoscontrainfluenzaaviar.In;ProceedingsCursodeEnfermedadesRespiratoriasdelasAves,Asociaci6nNacionaldeEspecialistasenCienciasAvicolas:3-13)。这类疫苗使得能够容易地区别接种了疫苗的和受感染的鸟类，因为其不诱导针对禽流感病毒所共有的抗原如核蛋白或基质的抗体。然而，这些疫苗具有下述缺点它们可能较差地被复制，从而在已具有针对重组病毒载体的抗体的鸟类中诱导部分保护性免疫，这些抗体能够中和其疫苗功能(Lyschow等人(2001)ProtectionofchickensfromlethalAavianinfluenzavirusinfectionbylive-virusvaccinationwithinfectiouslaryngotracheitisvirusrecombinantsexpressingthehemagglutinin(H5)gene.Vaccine19:4249-4259;Swayne等人(2000)Failureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenpreimmunizedwithafowlpoxvaccine.AvianDis.44:132-137)。当重组病毒载体用于幼鸡中时，那么母体抗体的效应可以依所使用的病毒栽体的类型和所转移的母体抗体的水平而变。使用活重组载体的另一个局限性是宿主范围是有限的(例如，传染性喉气管炎病毒在鹅中不复制)，并且因此这些疫苗局限于其中功效已得到证实的物种。针对流感的有效疫苗候选物的产生需要显著变化，所述变化在可能的大流行病的情况下保证快速反应。主要基于使用重组HA的亚单位疫苗的利用构成了吸引人的备选方案，因为这种策略不涉及致病性病毒的操作，并因而它的生产不需要特殊安全条件。针对HA的抗体能够中和病毒并构成针对流感感染的天然免疫性的基础(Clements1992)"InfluenzaVaccines，，，inVaccines:NewApproachestoImmunologicalProblems,编辑RonaldW.Ellis,第129-150页(Butterworth-Heinemann，Stoneham,MA))。HA以三聚形式存在于病毒包膜上。每个单体作为通过单个二硫桥相偶联的2条链(HAl和HA2)而存在。HA在宿主细胞中作为分子量为大约85kDa的糖基化的前体多肽而产生，其随后分成HA1和HA2。HA分子中的抗原性变体负责流感爆发发生和免疫接种后感染的受约束的控制。迄今为止，已描述了这样的方法，其中使用基于杆状病毒的表达系统来产生重组HA，其作为针对流感的潜在亚单位疫苗(Smith等人，US5858368;Smith等人，US6245532)。在昆虫细胞中产生的HA已在人(在I期和II期临床试验中)和家禽中进行了评估，在这2种情况下证实了其安全性。然而，这类疫苗不是非常成功的，主要是由于能够诱导的中和抗体的低滴度。作为疫苗抗原的单独的HA具有极低的抗原性，这反映在抑制血细胞凝集的抗体的低滴度和减少的细胞应答。由于低抗原性，用这种抗原诱导有效的免疫应答需要施用高剂量和通常需要多次重复施用。由于这些不便以及为了提供针对禽流感的有效疫苗的需求，需要极高的生产体积，随之与基于细胞培养的任何生产系统有关的后续成本增加。除了这些局限性外，必需考虑与在家禽中施用多个剂量相关的后勤复杂性和额外的成本，其中在单个单位中待免疫接种的动物数目可以达到数万。因此，在预防禽流感中的重要问题是，迄今为止还不存在这样的亚单位疫苗，其能够在疫苗接种后产生早期且强有力的免疫应答，同时允许获得有利的成本/益处关系。发明描述本发明解决了上文提及的问题，提供了针对禽流感病毒的目的疫苗的嵌合抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原包含来自禽流感病毒包膜的HA的细胞外区段和CD154分子的细胞外区段。此类嵌合蛋白质诱导保护哺乳动物和鸟类免受禽流感病毒感染的早期免疫应答。此类疫苗抗原的获得不需要在蛋上进行繁殖，从而产生更纯的疫苗作为产物，因而具有更少的不利免疫反应。此外，不需要病毒灭活或从病毒中提取膜组分，从而避免抗原表位的变性和涉及在人中的疫苗安全性的其他缺点，所述缺点由其中残留的化学试剂引起。此外，在不存在蛋的情况下生产的流感疫苗避免了在通过蛋进行适应和传代期间出现的异质性。这导致获得对流感的流行性毒抹更佳地进行调整适应的疫苗，这导致高的功效。在本发明的一个实施方案中，利用了缺乏跨膜和细胞质结构域的HA的可分泌变体。HA的可分泌变体优选地与免疫系统的刺激序列(分子佐剂)相连接，这保证获得高滴度的针对流感病毒的中和抗体。在一个优选实施方案中，所述嵌合疫苗抗原的特征在于实质上包含具有禽类、猪或人起源的CD154分子的细胞外区段的氨基酸序列，所述氨基酸序列在序列表中分别鉴定为SeqID.No.6、SeqID.No.8和SeqID.No.4。在本发明的一个实施方案中，所述嵌合疫苗抗原的特征在于实质上包含病毒亚型H5(SeqID.No.2)、H7(SeqID.No.9)和H9(SeqID.No.10)的HA的细胞外区段的氨基酸序列。在本发明的范围内，术语"实质上"是指，为嵌合抗原的一部分的氨基酸序列与所编号的序列具有高度同源性，但由于这种抗原的高可变性，来自禽流感病毒的HA的任何氨基酸序列可以是本发明的目的嵌合抗原的一部分。此类嵌合抗原包括但不限于，流行的A亚型(H5N1)、亚型H9N1、病毒亚型H7的分离物、感染人的B型、以及感染其他哺乳动物和鸟类物种的流感病毒。为了本发明的目的，嵌合抗原可以通过重组、合成方法或者通过化学缀合来获得。编码HA的序列可通过常规的逆转录技术和随后的聚合酶链式反应(PCR)来产生。然而，在本发明的一个实施方案中，编码HA的序列全部是合成的，这保证在相当短的时间段中具有目的序列，而不需要在对于使用致病性病毒进行工作而言所需的特殊安全条件下进行工作。合成序列的使用还允许根据所需表达系统来优化密码子使用。以类似方式，关于HA的合成基因的设计允许掺入准确突变，所述突变将被翻译成在蛋白质一级结构中的变化，目的是增加其抗原性。在一个优选实施方案中，嵌合抗原是由亚单位HA1和HA2组成的异二聚体，其中C-末端序列融合有6组氨酸的肽，其促进该重组蛋白质的纯化，纯度水平可达高于98%。接下来，在组氨酸尾巴的C-末端上，融合了由4个重复的Gly4Ser单元(4G4S)组成的间隔肽。在间隔肽的C-末端序列上融合作为分子佐剂的CD154分子的细胞外结构域。位于HA和CD154分子之间的肽4G4S旨在对这2个分子赋予足够的立体自由度，以便获得正确的三维构象。本发明的目的嵌合分子HA-CD154可以是通过3个多肽HA-CD154的非共价结合而构成的三聚体。然而，依赖于所使用的表达系统，每个单体HA-CD154可以分成2种分子(HA1和HAVCD154)，从而产生异二聚体分子，其可以进行连接以形成异二聚体HAl-HA2/CD154的三聚体。相应于CD154细胞外结构域的氨基酸序列决定了这些分子中的三聚化。本发明的目的疫苗抗原的三聚结构对于嵌合分子与在免疫系统的专业抗原呈递细胞(APC)表面上的CD40受体的相互作用具有极大的重要性。一旦释放至血流中，本发明的疫苗抗原与免疫系统的APC细胞表面上的CD40受体特异性地相互作用。与CD40受体相互作用后，嵌合分子HA-CD154由APC细胞内在化，并随后在I类主要组织相容性复合物(MHC)系统的背景下进行加工和呈递。同时，这种嵌合蛋白与树突细胞(DC)的结合诱导在DC上的次级活化信号(CD80和CD86)和CCR-7趋化因子受体的水平增加，这导致载有HA的DC迁移至局部淋巴结。这些事件诱导了在经免疫接种的动物的脾中HA特异性的CD8+细胞毒性T淋巴细胞水平的增加。嵌合蛋白质HA-CD154还能够与B细胞特异性地相互作用。HA与B细胞表面上的IgM分子的起始相互作用促进嵌合分子的CD154部分与在抗原特异性B细胞表面上的CD40受体的相互作用。B细胞中的这种刺激诱导了嵌合分子的内在化以及其在II类MHC背景下的加工和呈递。这些事件导致CD4+T淋巴细胞的激活和随后的2型T辅助应答的激活，这诱导B细胞上的免疫球蛋白类别转换以及其成熟和增殖。在本发明的一个优选实施方案中，嵌合疫苗抗原从经基因改造的哺乳动物的乳中获得。本发明的目的疫苗抗原优选地在泌乳过程中在哺乳动物乳中产生。为此，生产可以在转基因动物的乳中完成，其中将编码所需蛋白质的序列插入至对乳腺特异的启动子的控制之下，或者借助于通过使用腺病毒载体直接转化非转基因动物的乳腺上皮。在其他优选实施方案中，在经基因改造的酵母的培养物中，或者基于与CD154分子的细胞外结构域相融合的HA的嵌合抗原。本发明的目的还在于能够在鸟类和哺乳动物中产生针对流感病毒的保护性免疫应答的疫苗组合物，其包含先前描述的嵌合抗原。在本发明的一个具体实施方案中，此类疫苗组合物在鸟类、猪和人中产生针对流感病毒的保护性免疫应答。所述疫苗组合物可以通过全身或粘膜途径而预防性地施用于动物(包括人)。通过用此类组合物进行疫苗接种，避免了与流感病毒感染相关的巨大的人、材料和经济损失。附图简述图1.分别在用AdHA和AdHACDp腺病毒栽体转导的山羊的乳中HA和HACDp抗原的表达。存在于腺病毒转导后第5天的乳清样品中的蛋白质通过7.5%SDS-PAGE在还原(*)或非还原(△)条件下进行分离。使用针对H5N3毒林的超免疫鸡血清，通过"Western印迹法"来进行抗原HA和HACDp的免疫鉴定。图2.显示出表型MutS的重组巴斯德毕赤酵母(尸/c//'a;7a^oWs)克隆的表达分析。存在于培养基中的所需蛋白质的Western印迹。泳道l:HA;泳道2:HACDh;泳道3:未转化的MP36;泳道4:分子量标准参照物。图3.用变体HA和HACDp进行疫苗接种的鸡中的免疫应答的比较。(A)取8个实验组(每个组10只鸡)，所述组接受l、3、6或12jagHA或HACDp的唯一皮下剂量。在疫苗接种后第28天，测定抑制血细胞凝集的抗体的滴度。结果显示为每组的算术平均值+/-标准差。(B)用6jLigHA和HACDp进行疫苗接种的鸡中的抑制血细胞凝集的抗体的动力学。数据显示为在每次取样时来自所述组的所有动物的算术平均值。图4.抑制血细胞凝集的抗体的动力学。疫苗在由箭头所指出的周时施用。不连续的线标明了1:80的滴度。实施例实施例1:获得编码病毒A/VietNam/1203/2004的血凝素以及人、猪和鸡CD154分子的细胞外结构域的基因区段。化学合成编码H5N1亚型的高致病性禽流感病毒A/VietNam1203/2004的HA分子的核苷酸序列。一级蛋白质序列得自国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的数据库，登录号AY818135。通过采用对于在山羊("pra力/rc^)中的表达进行了优化的密码子使用来进行合成，在序列表中鉴定为SeqIDNo.1。所述合成基因编码从氨基酸1到537的HA的氨基酸序列，其中去除了该蛋白质的跨膜和细胞质结构域(SeqIDNo.2)。在基因合成期间，将另外的限制位点KpnI和XhoI掺入编码序列的5'末端中。为了增加翻译效率，紧在起始密码子前掺入Kozak共有序列。在编码HA的片段的3'末端处以下述顺序包括NheI限制位点、编码6组氨酸区段的片段、限制位点EcoRI、终止密码子和限制位点EcoRV。此外，还化学合成编码人、猪和鸡CD154分子的细胞外结构域的基因。合成根据来自NCBI数据库的参考AJ243435(关于原鸡(^//i/sga/7"s))、AB040443(关于欧洲野猪("ro尸a))和X67878(关于智人(yo/ffow;7/e/^))来进行。为了合成原鸡CD154(SeqID-No.5)和欧洲野猪CD154(SeqID.No.7)分子，采用了为了在山羊中表达而进行了优化的密码子使用。人CD154(SeqID.No.3)的密码子使用未进行修饰。将编码由4个重复的Gly-Gly-Gly-Gly-Ser单元组成的肽的区段包括在所述3种分子的氨基末端上，以便确保其立体自由度。将限制位点EcoRI包括在编码CD154分子的细胞外结构域的片段的5'末端处。将SalI限制位点掺入至3'末端处(紧在终止密码子后)。源自合成核苷酸序列的所得到的多肽在序列表中鉴定为SeqID.No.6(关于原鸡)、SeqID.No.8(关于欧洲野猪)和SeqID.No.4(关于智人)。实施例2:血凝素表达盒的构建。对HA的人工基因进行KpnI/EcoRV消化，并随后插入事先用相同酶消化的表达栽体pAEC-SPT(Herrera等人(2000)BiochemBiophys.Res.Commun.279:548-551)中。所得到的载体命名为pHA。载体pHA用限制性核酸内切酶EcoRI(其在紧在HA的终止密码子之前的组氨酸尾巴后进行切割)和核酸内切酶SalI(其在载体pHA至HA的3'的多克隆位点中切割)进行消化。用核酸内切酶EcoRI和SalI从由GeneArt供应的质粒载体中移出CD154基因，并克隆在载体pHA中。由这些克隆过程产生3种哺乳动物表达载体pHA-CDp(包含鸡CD154的结构域)、pHA-CDh(包含人CD154的结构域)、pHA-CDc(包含猪CD154的结构域)。在所有情况下，HA的嵌合基因都在巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)的控制下。实施例3:包含HA基因的腺病毒栽体(AE1AE3)的构建。基于AdEasy系统来构建复制缺陷型腺病毒栽体(Tong-ChuanH等人(1998).AsimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenovirusesPNASUSA,95:2509-2514)。质粒pAdTrack-CMV用作转移载体。基于AdEasy的系统构成了重组腺病毒构建的快速和简单的备选方案。用核酸内切酶XhoI和SalI移出编码HA以及编码与CD154分子的人、猪和鸡变体的细胞外结构域相融合的HA的序列，并克隆在pAdTrack-CMV载体的XhoI位点中。所得到的载体(ptrack-HA、ptrack-HACDp、ptrack-HACDh、ptrack-HACDc)通过PmeI消化而线性化，并且与pAdEasy载体一起共电穿孔到菌林BJ5183内。为了获得感染性病毒粒子，将重组病毒基因组用核酸内切酶PacI进行消化，并转染到HEK-293细胞系中。产生了4种病毒载体Ad-HA、Ad-HACDp、Ad-HACDh和AdHACDc。所有载体在HEK-293细胞系中进行扩增，直至达到5xl0"集落形成单位(CFU)的滴度。产生的病毒通过在CsCl中的双重离心进行纯化，逆贮存緩冲液(lOmMTrispH8.0、2mMMgCl2、4%蔗糖)进行透析，并保持于-70'C以用于后续使用。实施例4:山羊乳腺上皮的直接转导。所使用的山羊处于泌乳期的第3个月并且每天产生1.3L乳的平均量。在第0天时，动物通过肌内途径接受10mg地西泮的剂量，以减少处理过程中的应激。动物进行彻底挤乳以便去除池(cisterna)中的大部分乳；乳腺通过用37'C的盐水溶液进行输注和随后挤乳来清洗2次。所有输注通过乳头的通道并使用与蠕动泵相偶联的导管来直接完成。输注緩慢进行，而同时对被输注的乳房实施按摩。在山羊中，乳房可以分成2个独立的一半。将补充有30mMEGTA并包含109CFU/ml的病毒载量的PBS溶液输注到每个乳腺内。对每个乳房的一半所输注的体积依乳房容量而变(作为平均值，600ml/乳房)。输注后，对乳房实施按摩，以促进溶液均匀分布达到全部管和小泡。第二天，通过挤乳来去除输注的溶液。通过PBS输注再次清洗乳腺，以便去除在池和输乳管中残留的可能极大量的腺病毒栽体。在输注后48小时开始从经输注的动物中收集乳，其通过人工挤乳来进行。每天进行2次挤乳，一次在早晨和另一次在下午结束时。将收集的大部分乳贮存于-70。C以用于后续的蛋白质纯化，而少量样品用于检测和定量每个批次中的HA变体的含量。乳中的HA变体的检测如下进行。将4体积的分离緩沖液(10mMTris-HCl，10mMCaCh)加入至150"1乳样品中，在冰上温育30分钟后，样品于4T在15OOOg下离心30分钟。回收乳清级分，并且通过7%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分离在10Hl中所含的蛋白质。将蛋白质转移至硝化纤维素滤器，并且通过使用鸡超免疫血清来检测HA的存在。作为二抗，使用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的小鼠抗鸡抗体。通过AmershamPharmaciaBiotech的增强化学发光(EnhancedChemil認iniscence，ECL)系统来显现免疫反应条带(图1)。HA的变体大部分以多肽链(HA0和HA0-CD154)形式产生，尽管在这2种分子中也可以观察到结构域HA1的存在。HA变体的定量通过在CIGB开发的H5特异性ELISA来进行。在用△E1AE3腺病毒载体进行输注的动物中，检测HA的变体直至输注后第11天，在收集的前7天期间，HA、HACDp、HACDh和HACDc蛋白质的表达平均值分别为0.94g/L、0.86g/L、0-78g/L、0.87g/L。实施例5:巴斯德毕赤酵母表达载体的构建。巴斯德毕赤酵母表达栽体pPSlQ用限制性核酸内切酶NaeI进行酶促消化，随后用碱性磷酸酶进行处理以用于末端去磷酸化以及HA、HACDp、HACDh和HACDc编码基因的进一步插入。通过用核酸内切酶BclI(其切割位点紧在HA的分泌肽之后)和SmaI(其切割位点紧在终止密码子之后)消化来移出编码蛋白质HA、HACDp、HACDh和HACDc的序列。所得到的末端用Klenow聚合酶进行处理以便使末端变平，并随后将每个条带克隆到pPS10栽体中，从而获得pPS-HA、pPS-HACDp、pPS-HACDh和pPS-HACDc酵母表达载体。在所有情况下，编码HA的不同变体的序列在醇氧化酶启动子(A0X1)的控制下并与酉良酒酵母(SaccAa/Y^/ceycere"yae)的Suc2的分泌肽相融合。在转化前，通过用限制性核酸内切酶SphI进行消化来打开质粒。通过4吏用表达载体pPS-HA、pPS-HACDp、pPS-HACDh和pPS-HACDc进行电穿孔来转化巴斯德毕赤酵母的菌林MP36。该菌林是在转化后获得His+表型的力/W营养缺陷型突变体。通过斑点印迹法鉴定的转化克隆通过Southern印迹法进行分析，以确定哪些已通过用重组质粒的表达盒替换巴斯德毕赤酵母的基因A0X1而发生了整合，其与表型Muts(曱醇的低使用)和His+相一致。A0X1的基因替换通过载体和基因组之间A0X1启动子和3'A0X1的区域的交换而发生。由于这些交换，在A0X1的编码区中发生缺失。具有Muts表型的重组菌林支持A0X2基因中的醇氧化酶(alcoholoxidase,A0X)产生，并且它在甲醇中具有低生长率。编码HA的不同变体的基因在可由甲醇诱导的A0X1启动子的调控之下。巴斯德毕赤酵母仅分泌低水平的自身蛋白质，并且其培养基不需要蛋白质补充物，因此，可以预期，分泌的异源蛋白质构成了培养基中的总蛋白质的大部分(直至80%)。通过向培养物中加入甲醇并使培养物的pH保持于8.0，在5L发酵罐中进行重组抗原的生产。如图2中所示，在巴斯德毕赤酵母中产生的大部分HA是糖基化的，并且分泌至培养基中。实施例6:HA、HACDp、HACDh和HACDc抗原的纯化。关于从山羊乳中纯化出HA、HACDp、HACDh和HACDc，通过于4'C在10000rpm下离心30分钟来去除脂肪。将无脂肪的乳在緩沖液Tris-HClpH8.0,CaCl210raM中进行1:5(v/v)稀释。于4X:下1小时后，通过在IO000rpm下离心30分钟来沉淀出酪蛋白。包含每种所述抗原的乳清通过在玻璃预滤器(5pM、0.8uM和2jaM的滤器)上进行系列过滤而得到澄清。将经澄清的乳清逆磷酸盐緩沖液(50mMNaH2P04pH8.0，150nMNaCl，10mM咪唑)进行透析，并且加载到Ni-NTASepharose柱上。进行使用50mM咪唑的洗涤步骤，并且用在磷酸盐緩沖液中的200mM咪唑洗脱下重组蛋白质。关于在巴斯德毕赤酵母中产生的抗原HA、HACDp、HACDh和HACDc的纯化，在终止发酵后，通过离心将细胞与培养基分开。包含重组抗原的培养基通过在5jaM、0.8iaM和2uM的滤器中进行系列过滤而得到澄清。纯化的其余步骤以类似于用于从乳中纯化抗原的程序的方式来进行。实施例7:基于HA和HACD疫苗抗原的疫苗组合物在鸡中的免疫原性的评估。免疫接种:在该试验中使用的HA和HACDp抗原通过非变性方法进行纯化直至超过98%的纯度，如可以通过SDS-PAGE的光密度测定法分析所测定的。蛋白质的身份借助于通过质谱法的氨基酸分析，和经由使用针对H5的超免疫血清的"Western印迹法"来证实。将这2种抗原在油佐剂MontanideISA720中进行配制。对于免疫接种，使用3周大的鸡。根据所使用的剂量，形成每组IO只鸡的8个组。4个组接受基于抗原HA的制剂，而另外4个组接受基于HACDp的制剂。动物通过经由皮下途径施用下列剂量来进行免疫接种l)ig、3|ag、6pg或12jug抗原，根据所述组，使用200m1的最终制剂。将与1ml注射器相连接的18G针头用于免疫接种。向该试验中引入不接受抗原的安慰剂组。在疫苗接种后第28天时获取用于分析血清学应答的血液样口CI0血细胞凝集抑制和ELISA:关于血细胞凝集抑制测定法(IHA)，将血清在U形底微量滴定板中进行系列稀释(起始稀释度1:2)。向每个孔中加入4个血凝素单位的经灭活的病毒抗原A/VietNam/1203/2004(通过针对在磷酸盐緩沖盐水(PBS)中的0.5%鸡红细胞悬浮液的滴定而事先测定的)。将混合物在室温下温育1小时，并且在这个时间过去后，向每个孔中加入相似体积的在PBS中的0.5%鸡红细胞。30分钟后读取血细胞凝集抑制的滴度。通过EUSA测定对H5特异的抗体。平板用0.5pg/孔的HA蛋白质进行包被，所述HA蛋白质由用AdHA载体感染的细胞培养物产生并从中纯化。通过ELISA获得的滴度表示为这样的更高稀释度，其给予大于以类似方式稀释的阴性样品的两倍平均值+标准差的光密度。细胞因子表达测定法:在疫苗接种后第30天无菌收集用6ygHA或HACDp免疫接种的鸡的脾。为了获得均勻的细胞悬浮液，将脾切成小碎片，并且通过具有120jjM的孔尺寸的钢滤器。细胞通过在1000rpm下离心IO分钟来进行收集并悬浮于PBS中。将细胞悬浮液以1:1(v/v)的比例緩慢地施加到Histopaque柱1083(Sigraa)上，并随后在1000rpm下离心30分钟。在界面环中收集单核细胞，用PBS洗涤3次，并调整至lxl()7细胞/mlRPMI1640培养基的浓度。细胞以5xl(T细胞/孔的比率播种在24孔平板中。为了实施淋巴组织增生测定法，细胞通过在18小时期间于41°C在5%c02中以lng/ml的浓度添加蛋白质HA来进行刺激。作为阴性对照，获取来自用安慰剂进行疫苗接种的鸡的脾的细胞。作为阳性对照，使用与伴刀豆球蛋白A(ConA)—起温育的脾细胞。在18小时后收集培养物，并且純化总核糖核酸(RNA)以评估细胞因子基因的诱导。总RM通过使用Tri-Reagent(Sigma)方法进行纯化。将RNA的样品悬浮于水中，并通过光谱测定法在260nm处进行定量。为了测定白介素2(IL-2)、干扰素Y(IFN-Y)和甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)的信使RNA的相对水平，一式三份地进行逆转录和PCR测定法(RT-PCR)，如Svetic和同事于1991年所描述的(Svetic，A.等人(1991)，CytokineGeneExpressionafterinvivoprimaryimmunizationwithgoatantibodytomouseIgDantibody.J，Immunol.147:2391-2397)。根据制造商的说明书，使用ReverseTranscriptionSystem试剂盒(Promega)，一式三份地逆转录■。在先前研究中，对于每个待分析的基因制备了在PCR的每个循环中扩增的DNA量的曲线图镨。在扩增曲线的指数区域内选择所使用的循环数目。循环的最佳数目对于il-12和ifn-y为35,而对于gapdh为28。在每个试验中都包括阳性对照细胞(与ConA—起温育)和阴性对照细胞(源自安慰剂组的和未刺激的)。组成型基因GAPDH在每次PCR中进行扩增，并用于保证在评估目的基因之前在每次反应中起始互补DNA的类似量。在PCR后，15ji1最终反应体系通过2%琼脂糖凝胶电泳进行分析并通过光密度测定法分析进行半定量。使用图像分析的计算机程序"KodakID"来测定条带的强度。结果报告为在目的条带中的像素强度值的平均值，以及报告为相对于关于组成型基因GAPDH而获得的强度而言的基因的相对表达(计算为这个值的平均值)。在鸡中获得的结果表明，包含疫苗抗原HA和HACDp的油包水制剂在经疫苗接种的动物中诱导体液和细胞免疫应答。在这2种情况下，免疫应答依赖于所使用的剂量(图3A)。在用6mgHA或HACDp进行疫苗接种的动物中抑制血细胞凝集的抗体的动力学显示，在疫苗接种后第4周，嵌合抗原HACDp能够诱导出IHA抗体的应答，其为在用HA抗原进行疫苗接种的动物中形成的应答的大约10倍(图3B)。此外，当外周血单核细胞暴露于抗原HA时，在用嵌合抗原HACDp进行疫苗接种的动物中观察到显著更高的IFN-y和IL-12的表达(表1)。这个结果显示，CD154与HA的融合能够诱导对于HA分子特异的在细胞水平上的强有力应答。表l:细胞介导的免疫应答<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>IFN-y和IL-12的体外生产的相对水平显示为组中所有动物的算术平均值。实施例8:基于HA和HACDh抗原的疫苗组合物在人中的免疫原性。在人中的临床试验中评估包含HA和HACDh蛋白质的疫苗组合物的安全性、反应原性和免疫原性。这两种蛋白质以高于98.5%的纯度水平获得，并且配制成吸收至氢氧化铝。作为选择标准，使用在过去6个月中未接受过任何疫苗接种并且未显示出任何流感症状的、25-40岁的健康男性。基于待接受的抗原的剂量(25|ag、50jag或lOOMg)和类型(HA或HACDh)形成每组8人的6个实验组。在第O周时，对每个志愿者进行免疫接种，并且4周后他们接受第二次免疫接种。施用通过肌内注射0.5ml组合物来进行。在疫苗接种时和在接下来的3周期间(以2周的间隔)获取血液样品。关于抑制血细胞凝集的抗体的水平的测定，用来自霍乱弧菌(W6r/0c力o/era)的破坏受体的酶处理血清样品，并随后于65。C进行加热以灭活非特异性的抑制剂。使用0.5%的鸡红细胞，通过微量滴定标准测定法来测定抑制病毒抗原A/VietNam/1203/2004的血细胞凝集的抗体。通过ELISA来评估对于病毒A/VietNam/1203/2004的H5蛋白质特异的IgG免疫球蛋白水平。平板用在细胞培养物中产生的HA蛋白质进行包被。接下来，进行每种血清的系列稀释。在充分洗涤后，向每个孔中加入在兔中产生并与HRP缀合的抗人IgG抗体。显色用3，3、5，5'四曱基联苯胺来进行。ELISA滴度表示为这样的更高稀释度，在该稀释度时包含抗原的孔的光密度至少是不含抗原的相应孔的2倍。通过在Ficol1Isopaque梯度(ICNBiomedicalInc.AuroraOH)中分离开来分离出外周血单核细胞(PBMC)，并进行冷藏以用于免疫学测定法。在解冻后，根据制造商的说明书将pbmc用于INF-yELISPOT(Ebioscience)。简而言之，平板用捕获抗体包被过夜。在2个洗涤步骤后，平板用RPMI-1640培养基封闭1小时。在每个孔中加入HA抗原并播种5xl()5个细胞。培养物在37。C、5%0)2下温育48小时。倾到出细胞，并使平板与缀合至生物素的抗干扰素抗体一起温育2小时。在2个洗涤步骤后，向每个孔中加入缀合至HRP的抗生物素蛋白。显色使用包含作为底物的3-氨基-9-乙基"t唑的溶液来进行。结果显示，包含HA和HACDh重组抗原的疫苗不产生局部不利反应。与在用HACDh嵌合蛋白进行免疫接种的志愿者中一样，在用HA进行免疫接种的志愿者中，细胞和体液免疫应答随所施用的蛋白质剂量而按比例地增加。然而，HA和HACDh变体之间的比较显示，嵌合蛋白所能够诱导的体液应答为相等剂量的HA的4.2倍(图4)，以及所能够诱导的细胞应答为由相等剂量的HA所产生的应答的5.2倍。实施例9:基于HA和HACDc抗原的疫苗组合物在猪中的免疫原性。使用重量为18-20kg的兰德瑞斯(Landrace)猪。根据待评估的抗原和剂量将动物分成6个实验组。每个实验组使用8只猪。对于HA和HACDc，评估20Mg、40mg和80jag的剂量。这2种疫苗抗原都配制为油包水乳状液，并且通过在颈部肌肉中经肌内途径注射2ml来进行接种。由佐剂和磷酸盐盐水溶液1:1(v/v)组成的安慰剂以类似方式进行接种。在疫苗接种时和在接下来的3个月期间每7天获取血液样品。在测定抑制血细胞凝集的抗体的滴度之前，用来自霍乱弧菌的破坏受体的酶处理血清样品，以便灭活非特异性抑制剂。使用0.5%的鸡红细胞，通过微量滴定标准测定法来测定抑制血细胞凝集的抗体的滴度。通过在用HA抗原刺激的PBMC中IFN-y和IL-12的RNA水平的相对估计来评估在细胞水平上的免疫应答。在经免疫接种的动物中未观察到正常临床参数的改变，这暗示不存在对于该疫苗组合物的不利应答。结果显示，包含重组抗原HA和HACDc的疫苗产生了极少的具有局部特征的不利反应。在这2个组中，观察到抑制血细胞凝集的抗体的滴度以及细胞应答的剂量依赖性，所述细胞应答表示为细胞在HA抗原存在下增殖和产生细胞因子的能力。在用HACDc嵌合抗原进行免疫接种的组中，不仅在体液水平上而且在细胞水平上观察到免疫应答的显著增强。该蛋白质能够诱导的抑制血细胞凝集的抗体的滴度为由相应剂量的HA所形成的抗体滴度的2.5倍。与在用相等剂量的HA进行免疫接种的猪中的那些相比较，在用HACDc嵌合抗原进行免疫接种的动物中，在IFN-y和IL-2表达水平方面的细胞应答能力也分别为4.5倍和6倍。实施例10:基于来自不同亚型的禽流感病毒的血凝素的嵌合抗原的表达。合成编码禽流感病毒A/Netherlands/33/03(H7N7)(SeqID.No.9)和A/HongKong/1073/99(H9N2)(SeqID.No.IO)的HA细胞外结构域的核苷酸序列。采用对于在山羊中的表达进行了优化的密码子使用来设计这2种基因，并且侧翼为限制位点XhoI(在5，处)和EcoRI(在3，处)。将这2种基因直接克隆到包含猪CD154分子的细胞外结构域的腺病毒转移载体pAdtrack中。使所得到的重组克隆转染至HEK-293T细胞系中，并且于72小时后检测在培养基中嵌合分子的表达。这2种融合蛋白质主要作为三聚体表达，并且可以通过单个步骤的固定化金属离子亲和层析法从培养基中纯化出来。包含病毒A/Netherlands/33/03(H7N7)和HongKong/1073/99(H9N2)的HA的嵌合变体的腺病毒转移载体通过同源重组而与包含在pAdEasy质粒载体中的腺病毒基因组相整合，从中产生并扩增出包含这2种蛋白质的腺病毒载体。在山羊乳中以高浓度产生与CD154的细胞外结构域融合的来自上文提及的分离物的HA。这种策略允许从合成基因为可得的那时刻开始在短于55天的时期中产生数克HA的嵌合变体。在这2种嵌合抗原纯化后，使用20jug/动物的固定剂量(在油包水制剂中)来进行在猪中的免疫原性实验，其中通过在颈部肌肉中进行肌内注射来进行施用。未观察到不利反应。血清学分析证实，这2种蛋白质都能够诱导强的体液免疫应答，其在疫苗接种后的前"天内达到高于l:800的抑制血细胞凝集的抗体的滴度。权利要求1.针对禽流感病毒的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原包含来自禽流感病毒包膜的HA蛋白质的细胞外区段和CD154分子的细胞外区段。2.根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原实质上包含来自禽类(SeqID.No.6)、猪(SeqID.No.8)或人(SeqID.No.4)的CD154分子的细胞外区段的氨基酸序列。3.根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其特征在于，所述嵌合疫苗抗原实质上包含来自病毒亚型H5(SeqID.No.2)、H7(SeqID.No.9)和H9(SeqID.No.10)的HA的细胞外区段的氨基酸序列。4.根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其经由重组方法、合成方法或者通过化学缀合来获得。5.根据权利要求1的嵌合疫苗抗原，其从经基因改造的哺乳动物的乳中获得。6.根据权利要求5的嵌合疫苗抗原，其通过乳腺的直接遗传转化而从非转基因哺乳动物的乳中获得。7.根据权利要求6的嵌合疫苗抗原，其中乳腺的直接遗传转化通过使用腺病毒载体来进行。8.根据权利要求5的嵌合疫苗抗原，其从转基因哺乳动物的乳中获得。9.根据权利要求4的嵌合疫苗抗原，其从经基因改造的酵母中获得。10.能够在鸟类和哺乳动物中产生针对禽流感病毒的保护性免疫应答的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含权利要求1-9中所描述的嵌合抗原。11.根据权利要求10的疫苗组合物，其能够在鸟类、猪和人中产生针对禽流感病毒的保护性免疫应答。12.根据权利要求10的疫苗组合物，其可以通过全身或粘膜途径而预防性地施用于动物。全文摘要本发明描述了针对禽流感病毒(AIV)的嵌合疫苗抗原。所述疫苗抗原基于与刺激细胞和体液免疫系统的蛋白质分子相偶联的病毒亚单位。所述嵌合抗原可以在保证嵌合分子(其构成了本发明的基础)的正确三维折叠的表达系统中产生。包含所述嵌合抗原的疫苗组合物在鸟类和经疫苗接种的哺乳动物中诱导早期且强有力的免疫应答，其中刺激了高滴度的抑制血细胞凝集的抗体和强有力的针对该病毒抗原特异性细胞应答。所述嵌合抗原以及所得的疫苗组合物可以作为用于预防用途的疫苗而应用于人和动物健康领域。文档编号C07K16/10GK101421302SQ200780013590公开日2009年4月29日申请日期2007年2月28日优先权日2006年2月28日发明者C·G·博洛托诺德罗,D·迪亚斯阿切尔,J·R·托莱多阿隆索,M·P·罗德里格斯莫尔托,N·E·菲格罗亚拜莱,O·桑切斯拉莫斯申请人:遗传工程与生物技术中心