脑膜炎奈瑟球菌多肽的制作方法

专利名称：：脑膜炎奈瑟球菌多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及脑膜炎奈瑟球菌(A^'^ehflmem'wg"/^fo)领域。
背景技术：
：脑膜炎奈瑟球菌(脑膜炎球菌)是对人体有致病性的非运动性革兰阴性双球菌。它在咽部繁殖，引起脑膜炎(偶尔不引起脑膜炎，而引起败血症)。所有致病性脑膜炎球菌都具有多糖荚膜。这些多糖构成现有疫苗对抗脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的基础，但它们不适用于对抗血清组B。因此，非常需要深入研究，以鉴定出用于免疫对抗血清组B的其它抗原。这类其它抗原包括蛋白质、脂多糖和外膜囊泡。参考文献1-7公开了衍生自脑膜炎球菌血清组B的基因组序列的各种多肽，他们选择特定序列用于疫苗。参考文献8共解开了血清组A毒株的基因组序列。本发明的目的是提供用于开发预防和/或治疗脑膜炎球菌感染的疫苗的其它多肽。具体说，一个目的是提供用于预防和/或治疗脑膜炎球菌性脑膜炎的改进疫苗的多肽。该多肽也可用于诊断目的，并作为抗生素靶点。
发明内容多肽本发明提供含有实施例所述脑膜炎球菌氨基酸序列的多肽。这些氨基酸序列是SEQIDNO:2-78中的偶数序列。因此，有39个氨基酸序列，它们被称为B269一mz，"w是01和50之间的数字(ll个B269_w数字没有序列02、03、04、05、06、07、08、09、10、12禾B40)。两个优选序列是B269—32和B269_37。本发明也提供包含与实施例所述脑膜炎球菌氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列的多肽。根据具体序列，序列相同性程度优选大于50%(如60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。这些多肽包括同系物、直向同源物、等位基因变体和功能突变体。通常认为，两个多肽序列的相同性达到50%或更高则表明其功能等同。对任何具体SEQID而言，序列相同性程度优选大于本文表II中(B)和(A)列的值，更优选大于该SEQID的(C)、(B)和(A)列的所有值。与实施例的脑膜炎球菌序列相比，这些多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)连续氨基酸取代，即用另一具有相关侧链的氨基酸取代当前氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四类(l)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的替换不会对生物活性产生重要影响。相对于实施例的脑膜炎球菌序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸的缺失。相对于实施例的脑膜炎球菌序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(如1、2、3、4或5个氨基酸)。本发明还提供含有实施例所述脑膜炎球菌氨基酸序列的片段的多肽。该片段应包含该序列中至少"个连续氨基酸，根据具体序列，"是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个)。该片段可包含该序列的至少一个T细胞表位，优选B细胞表位。可凭经验确定T-和B-细胞表位(如利用PEPSCAN[9,10]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[ll]、基于矩阵的方法[12]、T表位[13]、神经网络[14]、OptiMer和EpiMer[15，16]、ADEPT[17]、Tsites[18]、亲水性[19]、抗原性指数[20]或参考文献中所述的方法等)。其它优选片段是(a)本发明脑膜炎球菌多肽的N末端信号肽，(b)脑膜炎球菌多肽，但不含其N-末端信号肽，(c)脑膜炎球菌多肽，但不含其N末端氨基酸残基。可以多种方式制备本发明多肽，例如化学合成(全部或部分)，用蛋白酶消化较长多肽，由RNA翻译，由细胞培养物纯化(如通过重组表达)，由生物体本身制备(如细菌培养后，或直接从患者制备)等。产生长度<40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成[22，23]。尤其优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc[24]化学的方法。也可部分干活完全利用酶促合成[25]。作为化学合成的替代方式，可利用生物合成，例如，可通过翻译产生多肽。这一过程可以在体外或体内进行。生物学方法通常仅限于产生基于L-氨基酸的多肽，但可通过操作翻译机器(如氨基酰基tRNA分子的翻译机器)引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[26]。然而，包含D-氨基酸时，优选使用化学合成。本发明多肽的C末端和/或N末端上可能有共价修饰。本发明多肽可采取各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体、多聚体、颗粒、变性多肽等)。本发明多肽优选以纯化或基本纯化，即基本不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)、特别是不含其它脑膜炎球菌或宿主细胞多肽的形式提供，本发明多肽的纯度通常为至少约50重量％，通常至少约90%，即组成中少于约50%，更优选少于约10%(如5%)是其它表达的多肽。本发明多肽优选为脑膜炎球菌多肽。本发明多肽优选具有表I所列的相关序列的功能。本发明多肽可连接于固体支持物。本发明多肽可包含可检测标记(如放射性或荧光标记，或生物素标记)。术语"多肽"指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支链聚合物，可包含修饰的氨基酸，可被非氨基酸打断。该术语也包括天然或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；这些修饰包括例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以是单链或结合的链。本发明多肽可以是天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽的糖基化模式)。本发明提供含有序列-X-Y-或-Y-X-的多肽，其中-X-是上述氨基酸序列，-Y-不是上述序列，即本发明提供融合蛋白。多肽编码序列的N末端密码子不是ATG时，该密码子将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met，该密码子是启动密码子时发生这种情况。本发明提供产生本发明多肽的方法，该方法包括在诱导多肽表达的条件下培养本发明宿主细胞的步骤。本发明提供产生本发明多肽的方法，其中所述多肽部分或完全用化学方式合成。本发明提供含有两种或多种本发明多肽的组合物。本发明也提供式NH2-A-[-X-L-]"-B-C00H代表的杂交多肽，其中X是上述本发明多肽，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C末端氨基酸序列，"是大于l的整数。w的值为2《，；c的值一般是3、4、5、6、7、8、9或10。"优选为2、3或4;更优选2或3;最优选^2。在各个w值的情况下，-X-可以相同或不同。在[-X-L-]的各个w值的情况下，接头氨基酸序列-L-可能存在或不存在。例如，当"=2时，杂交体可以是NH2-X广L广X2-L2-COOH、NH2-X广X2誦COOH、NH2陽X广L广XrCOOH、NH2-X广X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(艮卩Gly，其中"=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，组氨酸标签(艮卩His，其中"=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。-A-和-B-是任选序列，一般较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导多肽运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即His，其中"=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。本领域技术人员显然了解其它合适的N末端和C末端氨基酸序列。可利用各种测试来评估本发明多肽的体内免疫原性。例如，可通过重组方式表达多肽，并借助免疫印迹用其筛选患者血清。多肽和患者血清之间的阳性反应表明该患者已对所研究蛋白质产生免疫应答，即该蛋白是免疫原。也可利用该方法鉴定优势免疫蛋白。抗体本发明提供结合本发明多肽的抗体。他们可以是多克隆或单克隆抗体，可通过任何合适方法(如重组表达)产生。为了提高与人免疫系统的相容性，该抗体可以是嵌合或人源化抗体(如参考文献27和28所述)，或者可采用完全人抗体。抗体可包含可检测标记(例如，用于诊断试验)。本发明抗体可连接于固体支持物。本发明抗体优选为中和性抗体。单克隆抗体特别可用于鉴定和纯化它们指向的单个多肽。本发明单克隆抗体也可用作免疫实验、放射性免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)等的试剂。在这些应用中，可用可分析检测的试剂，如放射性同位素、荧光分子或酶来标记抗体。通过上述方法产生的单克隆抗体也可用于本发明多肽的分子鉴定和表征(表位作图)。优选以纯化或基本纯化的形式提供本发明抗体。通常，抗体所在组合物中基本不含其它多肽，例如，小于卯重量％，通常小于60%，更通常小于50%的组合物由其它多肽组成。本发明抗体可以是任何同种型(如IgA、IgG、IgM,即a、Y或P重链)，但通常是IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明抗体可具有K或X轻链。本发明抗体可采取各种形式，包括完整抗体，抗体片段如F(ab')2和F(ab)片段、Fv片段(非共价异源二聚体)，单链抗体如单链Fv分子(scFv)，小抗体，寡抗体(oligobody)等。术语"抗体"并不提示任何具体来源，包括通过非常规方法如噬菌体展示获得的抗体。本发明提供检测本发明多肽的方法，该方法包括以下步骤(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明抗体接触生物样品；和(b)检测所述复合物。本发明提供检测本发明抗体的方法，该方法包括以下步骤(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明多肽接触生物样品(如血液或血清样品)；和(b)检测所述复合物。核酸本发明提供含有实施例所述脑膜炎球菌核苷酸序列的核酸。这些核酸序列是SEQIDNO:l-77中的奇数序列。本发明也提供包含与实施例所述脑膜炎球菌核苷酸序列具有序列相同性的核苷酸序列的核酸。本发明也提供可与实施例所述的脑膜炎球菌核酸杂交的核酸。可以在不同"严谨性"的条件下进行杂交反应。提高杂交反应严谨性的条件是本领域众所周知的，且已公开过[如参考文献29的第7.52页]。相关条件的例子包括(严谨性逐渐提高的顺序)培育温度25。C、37°C、50'C、55。C和68。C;缓冲液浓度10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC(其中SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其它缓冲液体系的等同条件；甲酰胺浓度0%、25%、50%和75%;培育时间5分钟-24小时；1个、2个或多个洗涤步骤；洗涤培育时间l、2或15分钟；洗涤溶液6xSSC、1xSSC、O.lxSSC或去离子水。杂交技术和其优化方法是本领域众所周知的[例如，参见参考文献29-32等]。在一些实施方式中，本发明核酸与靶核酸在低严谨条件下杂交；在其它实施方式中，它们在中等严谨条件下杂交；在优选实施方式中，它们在高严谨条件下杂交。一组示范性的低严谨杂交条件是50'C和10xSSC。一组示范性的中等严谨杂交条件是55t:和1xSSC。一组示范性的高严谨杂交条件是68t:和0.1xSSC。也提供含有这些序列的片段的核酸。它们应包含脑膜炎球菌序列中的至少"个连续核苷酸，根据具体序列，"是IO个或更多个(如12、14、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更多个)。本发明提供式5'-X-Y-Z-3'表示的核酸，式中-X-是由x个核苷酸组成的核苷酸序列；-Z-是由z个核苷酸组成的核苷酸序列；-Y-是由(a)SEQIDNO:1-77中奇数序列之一的片段，或(b)(a)的互补物组成的核苷酸序列；和所述核酸5'-X-Y-Z-3'既不是(i)SEQIDNO:1-77中奇数序列之一的片段，也不是(ii)(i)的互补物。-乂-和/或7-部分可包含启动子序列(或其互补物)。本发明也提供编码本发明多肽和多肽片段的核酸。本发明包括包含与序列表所述序列互补的序列的核酸(如反义核酸或探针核酸，或用作引物的核酸)，以及实际显示取向的序列。本发明核酸可用于杂交反应(如Northern或Southern印迹，或核酸微阵列或'基因芯片，)和扩增反应(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)和其它核酸技术。本发明核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记形式等)。本发明核酸可以是环状或分枝状核酸，但通常是线性核酸。除非另有说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方式可利用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式的每条链。引物、探针以及反义核酸通常是单链。本发明核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它嗜血杆菌或宿主细胞核酸，通常其纯度至少为约50重量％，通常至少为约90%。本发明核酸优选为流感嗜血杆菌核酸。可以多种方式制备本发明核酸，这些方式包括例如，完全或部分化学合成(如DNA的亚磷酰胺合成)，用核酸酶(如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(如使用连接酶或聚合酶)，由基因组或cDNA文库制备等。本发明核酸可连接于固体支持物(如珠、平板、滤纸、膜、玻片、微阵列支持物、树脂等)。可用，例如放射性或荧光标记、或生物素标记标记本发明核酸。在准备将核酸用于检测技术时，例如核酸是引物或探针时，这特别有用。总的来看，术语"核酸"包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。本发明核酸采取RNA形式时，它可能具有或不具有5'帽。本发明核酸包含上述脑膜炎球菌序列，但它们也可包含非脑膜炎球菌序列(例如上述式5'-X-Y-Z-3'表示的核酸)。这尤其可用于引物，因此引物可包含与PCAV核酸靶点互补的第一序列和不与核酸耙点互补的第二序列。引物中的这类非互补序列优选位于互补序列的5'—侧。典型的非互补序列包含限制性位点或启动子序列。可以多种方式制备本发明核酸，这些方式包括例如，化学合成(至少部分)、用核酸酶(如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(如使用连接酶或聚合酶)，由基因组或cDNA文库制备等。本发明核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸的"克隆载体"，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的"表达载体"，设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的"病毒载体"，或具有一种以上载体类型的属性的"穿梭载体"。优选的载体是质粒。"宿主细胞"包括单个细胞或细胞培养物，它可能是或已经是外源核酸的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，这些后代与原始亲本细胞不一定完全相同(形态或总DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明核酸体内或体外转染或感染的细胞。应理解，核酸是DNA时，RNA序列中的"U"被DNA中的"T"所替代。相似地，应理解，核酸是RNA时，DNA中的"T"被RNA序列中的"U"所替代。用于核酸时，术语"互补物"或"互补"指沃森克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也可能使用诸如I(嘌呤肌苷)等碱基，与嘧啶(C或T)互补。该术语也提示了方向5'-ACAGT-3'的互补物是5'-ACTGT-3'，而不是5'-TGTCA-3'。例如，可使用本发明核酸产生多肽；作为检测生物样品中的核酸的杂交探针；产生额外的核酸拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链体的寡核苷酸。本发明提供产生本发明核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化学方式合成。本发明提供包含本发明核苷酸序列的载体(如克隆或表达载体)和用这种载体转化的宿主细胞。本发明也提供一种包括扩增脑膜炎球菌核酸序列中所含模板序列的引物(如PCR引物)的试剂盒，该试剂盒包括第一引物和第二引物，第一引物与所述模板序列基本互补，第二引物与所述模板序列的互补物基本互补，其中所述引物中具有相当互补性的部分确定所扩增模板序列的末端。第一引物和/或第二引物可包括可检测标记(如荧光标记)。本发明也提供包括第一和第二单链寡核苷酸的试剂盒，它们能够扩增单链或双链核酸(或其混合物)所含的脑膜炎球菌模板核酸序列，其中(a)所述第一寡核苷酸包含与所述模板核酸序列基本互补的引物序列；(b)所述第二寡核苷酸包含与所述模板核酸序列的互补物基本互补的引物序列；(C)所述第一寡核苷酸和/或所述第二寡核苷酸包含不与所述模板核酸互补的序列；和(d)所述引物序列确定所扩增模板序列的末端。特征(c)的非互补序列优选位于引物序列的上游(即5'—侧)。所述(c)序列中的一个或两个序列可包含限制性位点[如参考文献33]或启动子序列[如34]。第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸可包括可检测标记(如荧光标记)。所述模板序列可以是基因组序列的任何部分。本发明提供检测本发明核酸的方法，该方法包括以下步骤(a)在形成双链体的杂交条件下使本发明核酸接触生物样品；和(b)检测所述双链体。本发明提供一种检测生物样品(如血液)中的脑膜炎球菌的方法，所述方法包括在杂交条件下使本发明核酸接触生物样品的步骤。该方法可包括核酸扩增(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)或杂交(如微阵歹廿、印迹、与溶液中的探针杂交等)。本发明提供一种制备耙序列的片段的方法，其中所述片段是通过延伸核酸引物制备的。靶序列和/或引物是本发明核酸。引物延伸反应可包括核酸扩增(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA等)。本发明核酸扩增可以是定量扩增和/或实时扩增。在本发明的某些实施方式中，核酸的长度优选为至少7个核苷酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300个核苷酸或更长)。在本发明的某些实施方式中，核酸长度优选至多为500个核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸或更短)。本发明的引物和探针，以及用于杂交的其它核酸的长度优选为10-30个核苷酸(如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)。药物组合物本发明提供含有以下组分的组合物(a)本发明多肽、抗体和/或核酸；和(b)药学上可接受的载体。这些组合物可能适合用作免疫原性组合物，或诊断试剂，或疫苗。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。'药学上可接受的载体'包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的载体。合适的载体一般是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。本领域技术人员熟知这类载体。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型载体。药学上可接受的赋形剂的充分讨论参见参考文献141。本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。本发明组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨酯)，如吐温80。去污剂的含量水平通常较低，如<0.01%。本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml。本发明组合物通常含有缓冲剂。一般是磷酸盐缓冲剂。本发明组合物，特别是冻干时或含有由冻干材料重建的物质时，可含有糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，其含量为，例如约15-30mg/ml(如25mg/ml)。可在冻干前将冻干组合物的pH可调整至约6.1。本发明多肽可与其它免疫调节剂联用。具体说，组合物通常含有疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含矿物质的组合物本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[如参见参考文献35的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选(具有)吸附性。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[36]。特别优选磷酸铝，尤其是在包含流感嗜血杆菌(HzV/7we"zfld糖抗原的组合物中，典型的佐剂是P04/A1摩尔比在0.84和0.92之间的无定形羟基磷酸铝，含量为0.6mgAl"/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100pgA产/偶联物/剂。当组合物中含有一种以上偶联物时，不需要吸附所有偶联物。B.油乳剂适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献35第10章；也参见参考文献37](5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。C.皂苷制剂参考文献35的第22章I皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(0"///"/"sopo"an'a)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜OS肌'tocor"ato)(墨西哥菝葜)、满天星(Gy/wop/n7/a;flm'cw/fl^)(婚纱花)和肥皂草(S叩o^n'a0历"'《朋//"(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾卩QH-C。制备QS21的方法参见参考文献38。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[39]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献35的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献39-41中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[42]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献43和44。D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白。病毒体和颗粒通常无病原性、不能复制，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Q0-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白pl)的蛋白。VLP在参考文献45-50中有进一步描述。-.病毒体在(例如)参考文献51中有进一步描述。E.细菌或微生物衍生物适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-0-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选"小颗粒"形式见参考文献52中所述。3dMPL的这种"小颗粒"小到足以在过滤除菌时通过0.22pm膜[52]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基垸基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC529[53,54]。脂质A衍生物包括大肠杆菌(&c/^WcWaco//)，如OM-174的脂质A衍生物。(例如)参考文献55和56中描述了OM-174。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。CpG可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献57、58和59公开了可能的类似取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献60-65中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[66]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，例如CpG-AODN，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献67-69中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选是CpG-AODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5'端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3'端相连接形成"免疫聚体"。参见例如，参考文献66和70-72。细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选该蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素"LT")、霍乱("CT")或百日咳("PT")菌。参考文献73中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献74中描述了将其用作胃肠道外佐剂。毒素和类毒素优选包含A和B亚单位的全毒素形式。优选A亚单位含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72禾nLT-G192。参考文献72-82中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。优选根据参考文献83中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考。F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[84]等)[85]、干扰素(如干扰素-力、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。G.生物粘着剂和粘膜粘着剂生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[86]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯垸酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[87]。H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即一定直径的颗粒)由无毒材料(例如聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-乙交酯共聚物)形成，并任选经处理而具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。I.脂质体(参考文献35的第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献88-90所述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[91]。这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[92]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[93]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(516(^"11^)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂参见例如，参考文献94和95。L.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(l，-2，-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。M.咪唑并喹诺酮化合物。适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，见参考文献96和97所述。本发明也可包括以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以17下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[98];(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[99];(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[100〗；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[101];(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80頂、5。/。普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)RibFM佐剂系统(RAS)(RibiImmunochem)，含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM);和(8)—种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献35的第7章。特别优选使用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选佐剂。本发明组合物的pH优选为6-8，优选约为7。可使用缓冲液来维持稳定的pH。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[102]。该组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明组合物与人体等张。组合物可装在药瓶中，或者可装在填充好的注射器中。注射器可装有或未装有针头。注射器可包含一个组合物剂量，而药瓶可包含一个剂量或多个剂量。可注射组合物通常是溶液或悬浮液。或者，它们可制备成固体形式(如冻干)，注射前用液体载体形成溶液或悬液。本发明组合物可以包装成单位剂型或多剂量剂型。就多剂量剂型而言，与预填充注射器相比更优选药瓶。可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用注射剂量一般为0.5ml体积。临用前制备本发明组合物(例如，以冻干形式提供组分时)和以药盒形式提供时，该药盒可包括两个药瓶，或者可包括一个填充好的注射器和一个药瓶，注射器内容物用于在临用前再次激活药瓶内容物。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。'免疫有效量'指以一次剂量或一系列剂量的一部分，将某剂量给予个体能有效治疗或预防。此量取决于所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计，用量将落入可通过常规试验测定的相对较宽的范围，，每剂量中各脑膜炎球菌糖抗原的含量一般为每种抗原lfig-10mg。药学应用本发明也提供一种治疗患者的方法，所述方法包括给予该患者治疗有效量的本发明组合物。该患者可能是自身处于发生该疾病的风险中，或者可能是怀孕妇女('母体免疫')。本发明提供用作药物(如免疫原性组合物或疫苗)或诊断试剂的本发明的核酸、多肽或抗体。也提供了本发明的核酸、多肽或抗体在制备以下产品中的应用(i)治疗或预防脑膜炎球菌引起的疾病和/或感染的药物；(ii)检测是否存在脑膜炎球菌或脑膜炎球菌产生的抗体的诊断试剂；和/或(iii)可产生脑膜炎球菌抗体的试剂。所述脑膜炎球菌可以是任何血清组或毒株，但优选为血清组B。例如，所述疾病可以是细菌性脑膜炎(具体是脑膜炎球菌性脑膜炎)或败血症。患者优选为人。当疫苗用于预防应用时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年，如年龄为0-18岁的人；当疫苗用于治疗应用时，人优选为成年人，年龄为18-55岁的人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，以评估(例如)其安全性、剂量、免疫原性等。检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌感染。监测预防性治疗的功效的一种方式包括监测给药后对所给多肽产生的免疫应答。本发明组合物的免疫原性可通过以下方法测定给予受试对象(如12-16个月大的儿童，或动物模型)，然后测定标准参数，包括IgG的ELISA效价(GMT)。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。给予一个以上剂量的组合物时，可进行一次以上的给药后测定。评估对脑膜炎球菌的预防性功效的标准方法是血清杀菌测定(SBA)。用人补体测定时，给药优选导致对相关血清组的SBA效价升高至少4倍，优选至少8倍[103]。如果用兔补体测定SBA效价，那么效价优选提高至少128倍。给予多肽抗原是优选的诱导免疫的治疗方法。给予本发明抗体是另一种优选的治疗方法。这种被动免疫方法对新生儿童或怀孕妇女特别有用。这种方法一般使用单克隆抗体，该抗体是人源化抗体或完全的人抗体。本发明组合物通常直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳内、经肺或其它粘膜给药途径进行直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可通过针头(如皮下针头)进行，但也可采用无针注射。肌肉内剂量一般为0.5ml。用本发明引发全身和/或粘膜免疫。可以通过单剂量方案或多剂量方案进行剂量治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可进行加强给药方案。可通过常规方法确定初免给药之间的适当时机(如4-16周)以及初免和加强给药之间的适当时机。细菌感染会影响多个身体区域，因此可制备各种形式的组合物。例如，可将该组合物制备成液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式(如冻干组合物)。该组合物可制备成外用制剂，如油膏剂、乳膏剂或粉末剂。该组合物可制备成口服给药制剂，如片剂或胶囊，或糖浆(任选调味)。该组合物可制备成使用细粉或喷雾的肺部给药制剂，如吸入剂。该组合物可制备成栓剂或子宫托。该组合物可制备成用于鼻腔、耳内或眼部给药的制剂，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献104和105]。本发明组合物的其它抗原性组分本发明也提供含有本发明多肽和一种或多种以下额外抗原的组合物-脑膜炎奈瑟球菌(W.mem'"g/"Vfc)血清组A、C、W135和/或Y(优选所有四种)的糖抗原，如参考文献106所述的血清组C的寡糖[也参见参考文献107]或参考文献108所述的寡糖。-肺炎链球菌的糖抗原[如109、110、lll]。-甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[如112，113]。-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如113，114]。-白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献115的第3章]，如CRM^突变体[如116]。-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献115的第4章]。-百日咳博德特菌(50^^&/&peWMw'"的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合使用[例如，参考文献117和118]。-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如107]。-脊髓灰质炎病毒抗原[如119，120]如IPV。-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献115的第9、IO和11章]。-流感抗原[如参考文献115的第19章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。—粘膜炎莫拉菌(Mora;ce〃aca^n^afe)抗原[如121]。-无乳链球菌(&";^ococcwagfl/ac"ae)(B型链球菌)的蛋白抗原[如122，123〗。-无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。-酿脓链球菌CS^e^ococc^j^oge"es)(A型链球菌)的抗原[如123、124、125]。—金黄色葡萄球菌(iSto;/^/ococczwawrew力抗原[如126]。该组合物可包含一种或多种这些额外抗原。必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[118])。当组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合o糖抗原优选为偶联物形式。偶联物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[127]、合成肽[128、129]、热激蛋白[130、131]、百日咳蛋白[132、133]、流感嗜血杆菌的蛋白D[134]、细胞因子[135]、淋巴因子[135]、链球菌蛋白、激素[135]、生长因子[135]、艰难梭菌(^^骄"76)的毒素A或B[136]、摄铁蛋白[137]等。优选的载体蛋白是CRM197白喉类毒素[138]。组合物中各抗原的浓度一般是至少1pg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。作为在本发明免疫原性组合物中使用蛋白质抗原的替代方式，也可使用编码该抗原的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)。抗原优选吸附于铝盐。筛选方法
技术领域：
：本发明提供测定受试化合物是否结合本发明多肽的方法。如果受试化合物结合于本发明多肽，且这种结合能抑制脑膜炎球菌的生活周期，那么可将该受试化合物用作抗生素或设计抗生素的先导化合物。该方法一般包括以下步骤使受试化合物接触本发明多肽，测定受试化合物能否结合所述多肽。优选用于这些方法的本发明多肽是酶(如tRNA合成酶)、膜转运蛋白和核糖体多肽。合适的受试化合物包括多肽、多肽、糖、脂质、核酸(如DNA、RNA和其修饰形式)，以及小分子有机物(如MW为200-2000Da)。可单独提供受试化合物，但受试化合物通常是文库(如组合文库)的一部分。检测结合相互作用的方法包括NMR、滤膜结合实验、凝胶阻滞实验、顶替(displacement)实验、表面等离振子共振、反向双杂交等。可通过将该化合物与脑膜炎球菌相接触、然后监测生长抑制，以检测结合本发明多肽的化合物的抗生活性。本发明也提供用这些方法鉴定的化合物。该方法优选包括以下步骤(a)使本发明多肽与一种或多种候选化合物相接触，形成混合物；(b)培育所述混合物，以使该多肽和候选化合物相互作用；和(c)评估候选化合物是否结合该多肽或调节其活性。一旦候选化合物在体外被鉴定为结合本发明多肽的化合物，则需要对它进行进一步实验，以验证该化合物在体内抑制细菌生长和/或存活的功能。因此，该方法还包括使该化合物接触脑膜炎球菌并评估其作用的步骤。用于该筛选方法的多肽可以是在溶液中游离的、固定于固体支持物、位于细胞表面或位于细胞内。优选地，通过与候选化合物直接或间接相结合的标记方式检测候选化合物与该多肽的结合。标记可以是荧光团、放射性同位素或其它可检测标记。概述本发明提供包含序列表中一个或多个序列的计算机可读介质(如软盘、硬盘、CD-ROM、DVD等)和/或计算机存储器和/或计算机数据库。术语"含有"包括"包含"以及"由…组成"，例如"含有"X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。与数值x相关的术语"约"表示，例如x土100/0。术语"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语"基本上"。优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(OxfordMolecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。序列之间的相同性优选通过Smith-Waterman同源性搜索算法确定。序列表中氨基酸序列的N末端残基表示对应核苷酸序列中第一个密码子编码的氨基酸。应理解，当第一个密码子不是ATG时，当该密码子是启动密码子时它应被翻译为甲硫氨酸，但如果该序列位于融合伙伴的C末端，则该密码子被翻译成所示的非-Met氨基酸。本发明特别公开和包括序列表中用N-末端甲硫氨酸残基(如甲酰基-甲硫氨酸残基)替代任何所示非-Met残基的各氨基酸序列。可使用生物学领域的其它启动密码子。序列表中的氨基酸序列是基于特定的启动密码子，但也可使用下游启动密码子。因此，本发明特别公开和包括从序列表所示N-末端残基下游序列的任何甲硫氨酸残基开始(转录)的序列表的各氨基酸序列(如SEQIDNO:5和10)。如上文所述，本发明核酸和多肽可包含以下序列(a)与序列表所示序列相同(即100%相同)的序列；(b)与序列表所示序列有序列相同性的序列；(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个单核苷酸或氨基酸改变(缺失、插入、取代)的序列，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和(d)用逐对比对算法与序列表中的特定序列比对时，移动的;c单体(氨基酸或核苷酸)窗口从起点(N-末端或5')向终点(C-末端或3')移动，以便在p(p〉X)个单体上比对p-;c+7个这种窗口，各窗口具有至少个相同比对单体，其中x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、卯、100、150、200;y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99;如果；c';;不是整数，则四舍五入至整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[139]，使用默认参数(如缺口开放罚分=10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的weed/e工具能方便地实施这种算法[140]。本发明核酸和多肽还可在序列(a)-(d)的N-末端/5'—侧和/或C-末端/3'一侧包含其它序列。除非另有说明，本发明的实施将采用常规的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法，这些方法是所述领域技术人员已知的。文献中充分解释了这些技术。参见例如，参考文献141-148等。实施本发明的方式在脑膜炎奈瑟球菌(iV.we"/"g/^fc)血清组B的菌株M04-240196的基因组中鉴定到各种编码的氨基酸序列。根据各种标准选择其中39种用作抗原，在序列表中给出其基因和氨基酸序列。预测的生物学功能见表I，但抗原在脑膜炎球菌中的准确生物学作用并不像它们用作免疫原的能力那样重要。表I也指出参考文献6和8中已公开血清组A和B基因组中的最接近匹配，以及血清组C菌株FAM18的未公开基因组中的最接近匹配。当某序列与已知序列的相同性大于95%(特别是相同性为100%)时，与鉴定该蛋白本身相比，本发明更关注鉴定该蛋白的有用抗原特性。除注释和比较外，其它感兴趣特征包括B269J7含有内含肽结构域；B269—34的C末端含有连接序列；B269—05、B269—10、B269_18、B269—24中存在跨膜结构域；B269_15和B269—29中存在五个跨膜结构域。使用本文的序列信息，不难用本领域已知技术在重组宿主中表达蛋白质并用于产生免疫应答。例如，用C-末端聚组氨酸标签将编码B269—蛋白的序列11、13、14、15、17、24、25、26、29、31、32、34、36、37、51、52、53、54、55、56、57、58和59插入表达载体。B269—蛋白14、29、31、34、37也以结构域截短形式表达。还制备的37、54、55和57的GST融合物。从大肠杆菌纯化表达的蛋白质。表达没有任何优化，观察到各种程度的纯度，例如从B269一14和B269—32的20%纯度到最高达B269一51的95%纯度。观察到B269—蛋白13、24、25、31结构域、32、51、53和56有可溶性表达。将抗体和弗氏完全佐剂或氢氧化铝佐剂一起注入小鼠可引起针对表达蛋白的反应。然后将抗血清用于针对脑膜炎球菌的western印迹或FACS结合试验。通过western印迹能检测到以下B269—蛋白13;24;29结构域；31;34结构域；51;52;和53。此外，在特定MW的印迹中可检测到以下蛋白质11(40kDa);24(20kDa);和26(28kDa)。FACS显示以下蛋白质17;24;25;26;29结构域；34结构域；禾口53。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>参考文献(其内容通过引用纳入本文)W099/24578。[2〗W099/36544。[3]WO99/57280。[4]WO00/22430。[5]WO00脂91。Tettelin等(2000)Sc/e"ce287:1809-16。[7]Pizza等(2000)5We"ce287:1-1816-20。[8]Parkhill等(2000)淑脏404:502-8。[9〗Geysen等(1984)尸7V/U81:3998-4002。[10]Carter(1994)TWe^ocfeMo/5/o/36:207-23。Jameson,BA等1988，C4膨S4(1):181-186。Raddrizzani和Hammer(2000)5We/所o/"/orml(2):179-89。DeLalla等(1999)//附mw"o/.163:1725-29。Brusic等(1998)历o,w/wma""14(2):121-30。Meister等(1995)Fhcc/"e13(6):581-91。Roberts等(1996)」/057^/^附^"^^>7"12(7):593-610。Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Co/npW^p/5fosd9(3):291-7。Feller和delaCruz(1991)淑we349(6311):720隱1。Welling等(1985)尸五5S丄e".188:215-218。Davenport等(1995)/mm""ogewWos42:392-297。Fields等(1997)《酶学方法》(MeA五w2^mo/)289:固相肽合成0So/W-尸/zaseS;;W/zeW力.ISBN:0121821900。Kullmann(1987)《酶促肽合成》(五"2^ma"c尸ep"c/e^"Ae^).ISBN:0849368413。[26〗Ibba(1996)Ge"W五"g及ev13:197-216。Breedveld(2000)Zgwc"355(9205):735-740。Gorman和Clark(1990)&w/"./mmw"o/.2:457-466。Sambrook等(1989)《分子克隆实验室手册》(Mo/ec"/arC/o"/"g,^《简明分子生物学实验指南》(幼oW;^Woco/s/"mo/ecw/arWo/ogy)(第4版，1999)Ausubel等编，ISBN0-47l-32938-X。[31]美国专利5,707,829。《新编分子生物学实验指南》(0#reW尸ratocoAyz'"Mo/ecw/ar(F.M.Ausubel等编，1987)增刊30。[33]EP-B-0509612。[34]EP-B-0505012。WO00/23105。[37]WO90/14837。[38]美国专利5,057,540。[39]W096/33739。[40]EP-A-0109942。[41]W096/11711。[42]WO00/07621。Barr等(1998)J<ivfl"cedi>wgDe//ve^yiev/ews32:247-271。Sjolanderet等(1998)」dva"cec/Z>wgi>//veo;7ev/eiw32:321-338。Niikura等(2002)PWogy293:273-280。Lenz等(2001)//mmw"o/166:5346-5355。Pinto等(2003)188:327-338。Gerber等(2001)P7ra/75:4752-4760。WO03/024480。WO03/024481。[51[52Scharton-Kersten等(2000)/"/ec〃mmw"68:5306-5313。Ryan等(1999)/"/ec〃wmw"67:6270-6280。Partidos等(1999)/wmw"o/丄e"67:209-216。Peppoloni等(2003)五x;eW7evJ^c"."es2:285-293。Pine等(2002)/Co咖/肠ase85:263-270。Domenighini等(1995)Mo/Afzcro6/o/15:1165-1167。W099簡36。W099/44636。Singh等(2001)JCo"fie/efl;ye70:267-276。WO99/27960。美国专利6，0卯,406。美国专利5,916,588。网EP-A-0626169。W099/52549。WO01/21207。WOO1/21152。Andrianov等(1998)19:109-115。Payne等(1998)^c/vDe"veo;iev〖ew31:185-196。Stanley(2002)C//"~De画to/27:571-577。Jones(2003)O/^rQp/"/"veWgDrags4:214-218。W099/11241。W094細153。W098/57659。欧洲专利申请0835318、0735898和0761231。[102]WO03/009869。『丑arec/z.594:51,1976。Almeida和Alpar(1996)/ZVwgr^ge""g3:455-467。[105]Agarwal和Mishra(1999)/"(i/朋J五x;5/o/37:6-16。[106]Costantino等(1992)F"acd"e10:691-698。[107]Costantino等(1999)f^cc/"e17:1251-1263。[108]WO03/007985。Watson(2000)尸eof/a^/w/e"￡fe/19:331-332。[110]Rubin(2000)尸e^.a^7VoW/z47:269-285,v。[111]Jedrzejas(2001)Mc油WMo/編iev65:187-207。[112]Bell(2000)iW/欣￡fe/19:1187-1188。[113]Iwarson(1995)^尸M/S103:321-326。[114]Gerlich等(1990)Facc/"e8Suppl:S63-68和79-80。[115]《疫苗》(7acc/"es)(1988)，Plo汰in和Mortimer编.ISBN0-7216-1946-0。DelGuidice等(1998)Mo/ecw/wJ^ecGo/A/eWc/"e19:1-70。Gustafsson等(1996)M/Meof.334:349-355。Rappuoli等(1991)9:232-238。Sutter等(2000)尸e^V^C//"MW/z爿m47:287-308。Zimmerman和Spann(1999)爿mFam尸/;w'c/a"59:113-118,125-126。McMichael(2000)19增刊l:S101-107。Schuchat(1999)丄a"c"353(9146):51-6。U23]WO02/34771。Dale(1999)/"/e"加C""爿m13:227-43,viii。[125]Ferretti等(2001)iWAS98:4658-4663。Kuroda等(2001)丄fl"cW357(9264):1225-1240;也参见第1218-1219页。EP-A-0372501。[128]EP-A-0378881。[129]EP-A-0427347。[130]W093/17712。[131]WO94/03208。[132]W098/58668。[133]EP-A-0471177。[134]WO00/56360。[135]WO91/01146。[136]WO00/61761。[137]WO01/72337。《研究公开》(iewan^D&c/owre),453077(Jan2002)。[139]Needleman和Wunsch(1970)Mo/.48,443-453。[140]Rice等(2000)r腦cfeG匿f16:276-277。Gennaro(2000)《雷明顿药物科学和实践》(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy).第20版，ISBN:0683306472。《酶学方法》(MwAoA/"￡"2jwo/ogy)(S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社(AcademicPress,Inc.))。《实验免疫学手册》(/7朋必00&0/￡^^/附6"^//附附""0/0^),第I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(BlackwellScientificPublications))。Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Mo/ecw/wC7o"/"g.'爿丄a60rato7Ma肌a/X第2版，1989)。《表面和胶体化学手册》(//fl"WooA:o/Swr/ace朋dCo//oWa/aem&^y)(Birdi,K.S.编，CRC出版社(CRCPress),1997)。《简明分子生物学实验指南》(幼oWpratoco/s/"mo/ecw/wWo/ogy)，第4版(Ausubel等编，1999,约翰韦利出版社(JohnWiley&Sons))。《分子生物学技术详细实验室教程》(Mo/ecw/arrecAm々ww爿w/"tow/ve丄a6ora^^7CowAse)(Ream等编，1998，学术出版社(AcademicPress))。PCR(生物技术导论丛书(/"&o^c"o"to5/ofec/zm々w&s&Wm))，第2版(Newton和Graham编，1997，施普林格出版社(SpringerVerlag))。权利要求1.一种多肽，其包含与SEQIDNO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78中一个或多个序列的序列相同性为至少75％的氨基酸序列。2.如权利要求l所述的多肽，其包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78中的一个或多个氨基酸序列。3.—种多肽，其包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78中一个或多个序列的至少7个连续氨基酸的片段。4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述片段包含SEQIDNO:氨基酸序列的T细胞或B细胞表位。5.—种结合前述任一权利要求所述多肽的抗体。6.如权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。7.—种核酸，其包含与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77中一个或多个序列的序列相同性为至少75%的核苷酸序列。8.如权利要求7所述的核酸，其包含选自SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77的核苷酸序列。9.一种核酸，其在高度严谨条件下可与权利要求8所述核酸杂交。10.—种核酸，其包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、(53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77中一个或多个序列的10个或更多个连续核苷酸构成的片段。11.编码权利要求1-4中任一项所述多肽的核酸。12.—种组合物，其包含(a)前述任一权利要求所述的多肽、抗体和/或核酸；和(b)药学上可接受的载体。13.如权利要求12所述的组合物，还包含疫苗佐剂。14.如权利要求1-11中任一项所述的核酸、多肽或抗体，其特征在于，它们用作药物。15.—种治疗患者的方法，所述方法包括给予该患者治疗有效量的权利要求12所述的组合物。16.权利要求1-11中任一项所述的核酸、多肽或抗体在制备治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病和/或感染的药物中的应用。17.如权利要求15所述的方法，或权利要求16所述的应用，其特征在于，用于预防脑膜炎球菌性脑膜炎。全文摘要本发明公开了各种具体脑膜炎球菌蛋白质。本发明提供相关的多肽、核酸、抗体和方法。它们均可用于医疗目的，治疗或预防脑膜炎球菌引起的疾病和/或感染，如细菌性脑膜炎。文档编号C07K14/22GK101479293SQ200780024335公开日2009年7月8日申请日期2007年6月29日优先权日2006年6月29日发明者C·弗雷泽,D·塞鲁托,H·特特林,M·斯卡塞利,M·皮扎,R·拉普奥里申请人:诺华有限公司;J·克莱格凡特研究所有限公司