专利名称：Smoothened多肽及使用方法
SMOOTHENED多肽及使用方法
相关申请的交叉参考00011 本专利申请要求于2006年10月31日提交的美国临时专利申请号 60/855,422的利益，其通过引用结合于此。
通过引用结合的以电子形式提交的材料 此外，例如，所述功能变体可以是SMOi2-8 (SEQ ID NO: 23)的功 能变体，其包括在位置1-7、 9、 11、和12处的氨基酸之一被Ala置换的 SMOi2-8氨基酸序列。
在这一点上，本发明还提供任意本发明多肽(包括功能片段和功 能变体)和肽模拟物的脂化衍生物。本发明的脂化衍生物包括含有脂质分 子的本文所述的任何多肽和肽模拟物。当用于本文时，术语"脂质分子" 是指任何包括这样的疏水部分的分子，所述疏水部分促进所述多肽(包括 功能片段和功能变体)或肽模拟物穿过细胞膜并且进入到细胞内。所述脂 质可以是本领域已知的任何脂质，诸如，例如，脂肪酸，法呢基基团(例如, 二磷酸法呢酯)，香叶基香叶基基团(例如，二磷酸香叶基香叶酯)，磷脂基 团，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱, 心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯，和胆固醇基团。0042优选地，所述脂化衍生物是脂肪酸衍生物，其中本文所述的多肽 或肽模拟物包括脂肪酸分子。所述脂肪酸分子可以是任何C8 - C加脂肪酸。 所述脂肪酸分子可以是，例如，月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油 酸、亚油酸、a-亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳 六烯酸(docosohexenoicacid)、芥酸、花生酸、或山嵛酸。所述脂肪酸可 以在任意碳原子上任选地包含其他官能团，例如， -个或多个氨基。在一 个优选的实施方案中，所述脂肪酸分子是Cs-dJ旨肪酸，例如，C,6脂肪 酸。在更优选的实施方案中，所述脂肪酸是棕榈酸。0043] 正如对于脂质分子是真实的，所述脂肪酸分子可以附着在本发明 多肽(包括功能片段和功能变体)或肽模拟物的任何适当的部分。在本发明 的一个优选实施方案中，本发明多肽(包括功能片段和功能变体)或肽模拟 物的脂肪酸衍生物在氨基(N-)端、在羧基(C-)端、或在N-和C-两端包括脂肪酸分子。10044] 脂肪酸分子可以直接或通过连接体附着到本发明多肽(包括功能 片段和功能变体)或肽模拟物上。在本发明的一个实施方案中，当所述脂肪 酸分子位于本发明多肽或肽模拟物的C端时，所述脂肪酸分子通过选自由 下列各项组成的组的氨基酸连接体附着Lys、 Cys、高半胱氨酸(高Cys)、 Orn、 (x,Y-二氨基丁酸、和a,P-二氨基丙酸。在本发明的一个优选实施方案 中，脂肪酸分子通过Lys附着。在本发明的一个更优选实施方案中，脂肪 酸分子通过Lys的s碳附着。10045在另一个优选的实施方案中，当脂肪酸分子位于本发明多肽或肽 模拟物的C-端时，所述脂肪酸分子被修饰，例如，以在诸如式I或式II 的修饰的分子中包括氨基，其中式I是NH2(CH2)nCOOH,式II是 CH3(CH2)mCH(NH2)COOH，其中每个n和m为1-24。在这一点上，所述 脂肪酸分子附着在所述多肽或肽模拟物C端氨基酸的羧基上。优选地，n 或m是8-16。更优选地，n或m是16。00461 备选地，本文所述的本发明多肽(包括功能片段和功能变体)或肽 模拟物可以包括细胞-穿透肽(CPP)。所述CPP促进本发明多肽或肽模拟 物穿过细胞膜并且进入细胞内。CPPs在本领域中是已知的。参见，例如， Deshayes等，细胞分子生命科学(CW/. M /. <SW.) 62:1839-1849(2005); El-Andaloussi等，现代药物设计(O^r,尸/w附，Z)ewg") 11: 3597-3611 (2005);以及M纽和Langel,现代药学观点(Cwat. 尸/zar附aco/.) 6:509-514 (2006))。所述CPP可以是本领域已知的那些中的任--种，例如， Transportan, VP22， Pepl，等。优选地，所述CPP包括SEQ ID NO: 78或79 的氨基酸序列，其分别对应penetratin和Tat (48-60)的氨基酸序列。00471 本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)和肽模拟物，包括其脂 肪酸衍生物，可以是单体肽，或可以是二聚体或多聚体肽。例如，所述多 肽可以是下述通用结构的二聚体序列x-连接体l 一NH-(CH2、序列x-连接体2-NH -(CH2),其中序列X选自由下列各项组成的组Ac-LAKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 85); Ac-AKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 86);和 Ac-KFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 87);其中连接体1和连接体2 每一个是任选地存在，并且每一个独立地是Gly、 P-Ala、氨基丙酸、？氨 基丁酸、氨基己酸(aminocaproic acid)、或氨基己酸(aminohexanoic acid); 其中n和m为0-6;其中Y是K、 C、高Cys、 Om、 二氨基丙酸(DPA)、 二氨基丁酸(DBA);并且其中所述脂肪酸是硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、 月桂酸、癸酸或辛酸。在一个优选的实施方案中，序列X是SEQIDNO: 87， n是4， m是0，连接体1和连接体2的每一个是P-Ala，并且所述脂肪酸是 棕榈酸。制备二聚体和多聚体多肽的方法在本领域中是已知的。参见，例 如，Wrighton等，自然生物技术(A^we历ofecA"o/ogy) 15: 1261-1265 (1997)。制备二聚体多肽的一种优选方法也记述在本文的实施例1中。0048
当本发明的多肽(包括功能片段和功能变体)和肽模拟物，包括其 脂肪酸衍生物，是以盐的形式存在时，优选地，所述多肽或肽模拟物以药 用盐的形式存在。合适的药用酸加成盐包括衍生自矿物酸如盐酸、氢溴酸、 磷酸、偏磷酸、硝酸、和硫酸的那些，和衍生自有机酸如酒石酸、乙酸、 柠檬酸、苹果酸、乳酸、延胡索酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、 和芳基磺酸例如对-甲苯磺酸的那些。0049
本发明还提供编码本文所述的任一种本发明多肽，包括功能片段 和功能变体的核酸。当用于本文时，术语"核酸"包括"多核苷酸"、"寡 核苷酸"和"核酸分子"，并且通常是指.DNA或RNA的聚合物，其可以 是单链的或双链的，合成的或从天然来源获得(例如，分离和/或纯化)， 其可以包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以包含天然的、 非天然的或改变的核苷酸之间键，诸如氨基磷酸酯(phosphoroamidate) 键或硫代磷酸酯键，代替在未修饰寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二 酯。通常优选所述核酸不包括任何插入、删除、倒位、和/或置换。然而， 在一些情形中，如本文所讨论的，核酸包括一个或多个插入、删除、倒位、 和/或置换可以是适当的。00501 优选地，本发明的核酸是重组的。当用于本文时，术语"重组"是 指(i)通过使天然或合成的核酸片段与能够在活细胞内复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)由以上(i)中所述的那些的复制形成 的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。00511 核酸可以基于化学合成/或酶连接反应使用本领域已知的方法构 建。参见，例如，Sambrook等，^i:屏述，和Aus.ubd等，厨J:屏述。例如， 核酸可以使用天然存在的核苷酸或不同修饰的核苷酸化学合成，所述不同 修饰的核苷酸设计成增加分子的生物学稳定性或增加在杂交时形成的双 链体的物理稳定性(例如，硫代磷酸衍生物和吖啶置换的核苷酸)。可以用 来生成所述核酸的修饰的核苷酸的实例包括，但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、 5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿 嘧啶、二氢尿嘧啶、卩-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、 1-甲基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟 嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N、置换的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、 5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、 P-D-mannosylqueosine、 5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基 硫代-N、异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、 wybutoxosine、假尿嘧 啶、queosine、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、 5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧 啶、和2，6-二氨基嘌呤。备选地，本发明的一种或多种核酸可以购自公司， 如大分子资源(Macromolecular Resources) (Fort Collins, CO)和Synthegen (休斯顿(Houston) ,TX)。00521 所述核酸可以包括编码任一种本发明多肽，包括功能片段和功能 变体的任意核苷酸序列。例如，所述核酸可以包括编码SEQ ID NOs: 2 - 29， 32， 33， 38 - 48， 53 - 56， 59 - 66， 70 - 72, 76,和80中任--种的核苷酸序列。 所述核酸备选地可以包括与这些序列中的任一种简并的核苷酸序列或简 并序列的组合。本发明还提供包括这样的核苷酸序列的分离的或纯化的核酸，所述核苷酸序列与本文所述的任- -种核酸的核苷酸序列互补或在严格 条件下与本文所述的任--种核酸的核苷酸序列杂交。00531 本发明的核酸可以结合到重组表达载体中。在这一点上，本发明 提供包括任一种本发明核酸的重组表达载体。为了本文的目的，术语"重组表达载体"意指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，其在该构建体包括编码mRNA、蛋白、多肽、或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使所 述mRNA、蛋白、多肽或肽在宿主细胞内表达的条件下与所述细胞接触时， 允许宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽、或肽。本发明的载体作为一个整 体不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组 表达载体可以包括任意类型的核苷酸，包括但不限于，DNA和RNA,其 可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源，并且其可以包括天 然的、非天然的或改变的核苷酸。所述重组表达载体可以包括天然存在的、 非天然存在的核苷酸间键，或两种类型的键。优选地，所述非天然存在的 或改变的核苷酸或核苷酸间键不阻碍该载体的转录或复制。 100541本发明的重组表达载体可以是任何适当的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何适当的宿主。适当的载体包括设计用于繁殖和扩增 或用于表达或用于二者的那些，诸如质粒或病毒。所述载体可以选自由下 列各项组成的组pUC系列(Fermentas生命科学(Fermentas Life Sciences))、 pBluescript系歹lJ(Stmtagene, LaJolla， CA)、pET系歹(J(Novagen, Madison， WI)、 pGEX系列(法玛西亚生物技术(Pharmacia Biotech), Uppsala, Sweden)、 和pEX系列(Clontech, Palo Alto, CA)。还可以使用噬菌体载体，诸如 入GTIO、人GTll、 IZapII (Stratagene)、入EMBL4、和ANM1149。植物表达 载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19 (Ckmtech)。 动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、 pMAM和pMAMneo (Clontech)。优选地，所述重组表达载体是病毒载体，例如，反转录病毒载体。00551可以使用记述在例如，Sambrook等，展Z:^f述，和Ausubel等， J:历:述中的标准重组DNA技术制备本发明的重组表达载体。可以制备环 形的或线性的表达载体构建体，以包含在原核或真核宿主细胞中起作用的 复制系统。例如，复制系统可以源自，例如，ColEl、 2p质粒、X、 SV40、 牛乳头状瘤病毒等。00561 理想地，所述重组表达载体包括调控序列，诸如转录和翻译起始 与终止密码子，当合适并且考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的时候， 所述调控序列对于所述载体所引入的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物、 或动物)是特异性的。0057
所述重组表达载体可以包括一种或多种标记基因，其允许选择转 化的或转染的宿主。标记基因包括杀生物剂抗性，例如，对抗生素、重金 属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，等等。对于本发明 表达载体合适的标记基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性 基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因、和氨节青霉素抗性基因。00581 所述重组表达载体可以包括天然的或非天然的启动子，所述启动 子同编码修饰的TCR、多肽、或蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核 苷酸可操作性连接，或同与编码修饰的TCR、多肽、或蛋白的核苷酸序列 互补或与之杂交的核苷酸序列可操作性连接。启动子的选择，例如，强、 弱、诱导型、组织特异型和发育特异型的，在技术人员的普通技能之内。 相似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能之内。启动子可 以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40 启动子、RSV启动子、以及在鼠干细胞病毒长末端重复中存在的启动子。
本发明还提供包括至少--种本文所述的宿主细胞的细胞群体。所 述细胞群体可以是异种群体，包括包含任一种所述重组表达载体的宿主细 胞，以及至少一种其它细胞，例如，不包含任何所述重组表达载体的宿主细 胞(例如,T细胞)，或除T细胞之外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜 中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞，等。 备选地，所述细胞群体可以是基本同种群体，其中所述群体主要包括包含 所述重组表达载体的宿主细胞(例如，主要由包含所述重组表达载体的宿 主细胞组成)。所述群体还可以是细胞的克隆群体，其中所述群体的所有细 胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，以致该群体的所有细胞包 含所述重组表达载体。在本发明的--个实施方案中，所述细胞群体是包括 包含本文所述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。0063
在本发明范围内包括缀合物，例如，生物缀合物，其包括本发明多 肽(包括任一种功能片段或功能变体)或肽模拟物、核酸、重组表达载体、 或宿主细胞中的任一种。缀合物，以及通常合成缀合物的方法在本领域内 也是已知的(参见，例如，Hudecz，F.，分子生物学方法(Afe决oA Afo/.历o/.) 298: 209-223 (2005)和Kirin等，无机化学(/"org CTze附.)44(15): 5405-5415 (2005))。00641 本发明多肽(包括功能片段和功能变体)、肽模拟物、脂肪酸衍生 物、核酸、重组表达载体、以及宿主细胞(包括其群体)可以是分离的、纯 化的、合成的、和/或重组的。当用于本文吋，术语"分离的"意指已经从其 天然环境脱离的。当用于本文时，术语"纯化的"意指已经在纯度上提高的，其中"纯度"是相对术语，并不必要地解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50%，可以是大于60%、 70°/。、 80%、或卯％、或可以是100%。0065本发明多肽(包括功能片段和功能变体)、肽模拟物、脂肪酸衍生 物、缀合物.、核酸、重组表达载体、和宿主细胞(包括其群体)，以下全部 笼统称为"本发明物质"，可以配制成组合物，诸如药物组合物。在这一点 上，本发明提供包括任意所述多肽(包括功能片段和功能变体)、肽模拟物、 脂肪酸衍生物、缀合物、核酸、重组表达载体、和宿主细胞(包括其群体)， 以及药用载体的药物组合物。包含任意本发明物质的本发明药物组合物可 以包括多于一种本发明物质，例如，多肽和核酸，或两种或更多不同的多 肽。备选地，所述药物组合物可以包括与另一种药物活性试剂或药物组合 的发明物质，所述另一种药物活性试剂或药物诸如化疗剂，例如，天冬酰 胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨， 羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，长春新碱，等等。00661 在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合物包括与脂质组 合的本发明物质。所述脂质可以是任何脂质，包括，例如，脂肪酸、磷脂、 固醇、鞘脂、萜、甘油脂、甘油磷酸酯、异戊烯醇脂、糖脂、聚酮化合物。 所述脂在本领域内是已知的。参见，例如,Fahy等，脂质硏究杂志( /h;pW46:839-861 (2005)。优选地，所述脂质是胆固醇。0067关于药物组合物，药用载体可以是任意常规所用的那些，并且仅 通过化学-物理考虑因素，诸如溶解性和缺乏与活性化合物的反应性，以及 通过施用的途径限定。本文所述的药用载体，例如,媒介物(vehicles)、 佐剂、赋形剂、和稀释剂，是本领域技术人员公知的，并且容易为公众获 得。优选地，所述药用载体对活性试剂是化学惰性的和在使用条件下不具 有有害副作用或毒性。100681 载体的选择应该部分由特定的本发明物质、以及由用于施用本发 明物质的特定方法决定。因此，存在本发明药物组合物的多种适当制剂。 下述用于口服、气雾剂、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、 腹膜内、直肠、和阴道施用的制剂是示例性的，并且不以任何方式限制。 可以使用多于一种途径施用本发明物质，并且在特定情形中，特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的响应。在本发明的一个优选实施 方案中，所述药物组合物是局部制剂、静脉内制剂、或皮下制剂。0069在本发明的一个优选实施方案中，所述药物组合是局部制剂。局 部制剂是本领域技术人员公知的。在本发明施用到皮肤的情形中，所述制 剂特别适合。本发明的局部制剂可以是，例如，膏剂、洗液、油膏、贴片、 油、糊剂、喷雾剂例如气雾剂喷雾剂、凝胶、慕思(mousse)、滚抹式的 液体、固体棒等。优选地，本发明的局部制剂是膏剂、洗液、油膏、或贴 片。当所述局部制剂是洗液时，优选地，所述洗液还包括紫外(UV)光阻 隔剂，诸如生育酚(toc叩heiyl)、氨基苯甲酸、阿伏苯宗、西诺沙酯、二 羟苯宗、胡莫柳酯、邻氨基苯甲酸甲酯、奥克立林、辛基甲氧基肉桂酸酯、 辛水杨酯、羟苯甲酮、帕地马酯O、苯基苯并咪唑、磺酸、舒利苯酮、二 氧化钛、三乙醇胺水杨酸酯(trolaminesalicylate)、和氧化锌。0070适于口服施用的制剂可以由下列各项组成.，(a)液体溶液，诸如溶 解在稀释剂如水、盐水、或橙汁中的有效量的本发明物质;(b)胶囊、香囊 (sachet)、片剂、锭剂(lozenge)、和锭剂(troch),每一种包含预先 确定量的作为固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)在适当液体中的混悬 液；和(e)适当的乳剂。液体制剂可以包括稀释剂，诸如水和醇，例如，乙 醇、苯甲醇、和聚乙二醇，添加或不添加药用表面活性剂。胶囊形式可以 是普通的硬-或软-壳明胶型，其包含，例如，表面活性剂、润滑剂、和惰 性填充剂诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙、和玉米淀粉。片剂形式可以包括下列 各项中的一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐 藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜耳胶、胶状二氧化硅、 croscarmellose sodium、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸、 和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调 味剂、和其它药物相容的赋形剂。锭剂(lozenge)形式可以包括处在调味 剂通常是在蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶中的本发明物质，以及包括处在惰 性基质诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中的本发明物质的软锭剂， 另外包含本领域己知的赋形剂的乳剂、凝胶等。0071本发明物质，单独的或与其它适宜的成分组合，可以制成通过吸 入施用的气雾剂制剂。这些气雾剂制剂可以放置在加压可用的推进物中，诸如二氯二氟甲烷、丙垸、氮等。它们还可以配制成非加压的制剂，如在 喷雾器或雾化器中。所述喷雾制剂还可以用于向粘膜喷雾。0072适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射液，其 可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使得所,述制剂与预期接收者的血 液等渗的溶质，以及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括混悬剂、增溶 剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。本发明物质可以处在药用载体中的生理 用稀释剂中施用，诸如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性葡萄 糖和相关的糖溶液、醇如乙醇或十六醇、二醇如丙二醇或聚乙二醇、二甲 亚砜、甘油、縮酮如2，2-二甲基-l，3-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、 油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化的脂肪酸甘油酯，添加或不添 加药用表面活性剂诸如皂或去污剂，混悬剂如果胶、carbomers、甲基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、或羧甲基纤维素，或乳化剂和其它药用佐剂。
。
实施例01051 本实施例论述按照本发明实施方案的多肽能够抑制患病细胞的增 殖。
0106
如实施例1所述，构建与具有N端棕榈酰基残基的SMO的所有 三个胞内环(SMOil-l,SMOi2-l，SMOi3-l)全长相对应的多肽。然后，如实 施例2所述，使用MCF-7乳腺癌细胞和胃腺癌细胞检测所述多肽毒性(生 长抑制)。比较SMOi2-l和SMOi3-l的活性和环杷明(5 pM)的活性，环 杷明是从玉米百合(corn lily)加州藜芦(Veratrum califonicum)中分离的 致畸剂。
01071 如在
图1中所示，所有三种肽均抑制MCF-7细胞的生长。SMOi3-l 多肽对细胞生长具有最显著的作用，其次是SMOi2-l，而SMOil-l表现 出最小量的抑制活性。如在图2中所示，SMOi3-l和SMOi2-l多肽能够如 环杷明- -样或者比环杷明更好地抑制胃腺癌细胞生长。
实施例4
I0108J 本实施例论述按照本发明的--个实施方案具有基于SMO蛋白的 第二个和第三个胞内环的氨基酸序列的功能片段和功能变体能够抑制患 病细胞的增殖。
01091 如在实施例1中所述，合成基于SMO的第二个或第三个胞内环 的多肽(SMOi2或i3多肽)(如在表1中所示)，并且如在实施例2中所述， 使用MCF-7乳腺癌细胞或SK-Mel2黑素瘤细胞进行检测。在暴露于所述肽48小时后在SK-Md2黑素瘤细胞中通过MTT测定法确定的每种肽的 ICw显示在表4和5中。
表4
化合物 结构 IC幼，nM
SMOi2-l Pal-LTYAWHTSFKALG1TYQPLSGKYSY 0.45±0.05
SMOi2-2 Pal-LTYAWTSFKALGTTYQPLSGKTSY 0:45±0:05
SMOi2-3 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQPLSG !掘4 SMOi2~4 Ac-1/rYAWHTSFKALGTTYQPLSGKTSYK- e-Pal !.0^^ SMOi2-5Ac-YAWHTSFKALGTIYQPLSGKTSYK- ePal
SMOi2-6 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQP 0:3±0:05
SMOi2-7 AoGTTYQPLSGKTSYK-ePal 2.7±0.4
SMO i2-8 Pal-LTYAWHTSFKAL 0.08±0.02
SMO i2-9 Ac-LTYAWHTSFKAL >10
SMOi2-10 Pal隱TYAWHTSFKAL 0.7±0.
SMOi2-11 Pal-LTYAWHTSFKA 0.09±0.007
SMO i2-12 Pal-LTYAWHTSFK 0.06±0.007
SMO i2-13 Ac-TYAWHTSFKA 2.8±0.3
SMOi2-I4 VWFWLTYAWHTSFKAL >5
SMOi2-15 WFWLTYAWHTSFKAL >5
SMOi2-16 Ac-LAKFS"raWATYLK-8-Pal(allD-) 0.006±0.0005
SMOi2-17 AoAKFSTHWATYLK-sPal (all D-) 0.0004±0.0001
SMO i2-18 Pal-LTYABpaHTSFKAL 0.1±0.05
SMO i2-20 Ac-KFSTHWATYLK- ePal (all D-) 0.0003±0.0001
SMOi2-21 Pal-LTYABpaHTSFKAL"Hcy-生物素 >15
SMOi2-23 Pal-LTYAWHTSFKALGTTYQPLSGKTSYK- E-Pal 0 05±0 02
SM012-24 PalLTYAWHTSFKAL(AUD) 0.039±0 004
SMOi2-25 AcLTYAWHTSFKAL(MD) >10
SMOi2-26 Myr-LTYA丽SFKAL 0謂5
SMO i2-29 Ac-LTYAWHTSFKAL-P咖fratin >15
SMOi2-30 P節咖tin-LTYAWHTSFKAL "5
SMOi2-56 4.0 nm
\K-K-s-Pal AKFSTHWAYTL-P-Ala"7-NfiT""
Pal,棕榈酸翻Ac,乙酸豳<A11 D),所述多肽的每一个氨基酸均是D异构体；
Myr,肉豆楚酸；e-Pal,在Lys的e碳上添加的棕榈酸酯；(Bpa), 4-苯甲酰苯丙氨酸.化合物
结构
SMO i3-l PaIRGVMTLFSDCSNHPGLLSEKAASKINErML 0.64±0.1
SMOi3-2 PalRGVMTLFSKSNHPGLLSEKA 0.50±0.1
SMOi34 PalLFSnCSNHPGLLSEKAASKINETMLR 1.5±0.2
SMOi3-5 A汰GVMTLFSIKSNHPGLLSEKAAS]KINETMLRK-8-Pal 0.9±0.2
SMOi3-6 ' AoLLSEKAASKINETMLRKr8-Pal 0.8±0.1
SMO i3-7 Ao^LFSIKSNHPGLLSEKAAISKINETMLRK;- e -Pal 0.95±0.2
SMOi3-8 PalRGVMTLFSKSNHPGLLS 0.5劲..1
SMOi3-10 PalRGVMTLFSKSNH ' 0.95±0.2
SMO i3-12 AoLLSEKAASKINETMLR : e -Pal 1.33±0.0110〗 如在表5和图3中所示，基于SMO第三个胞内环的多肽表现出 抑制MCF-7细胞生长的能力。此外，与第三胞内环片段相对应的肽具有 与全长环(SMOi3-l)相当的或低于其的活性。 本实施例论述按照本发明的一个实施方案抑制细胞内Hedgehog 信号传导途径蛋白的基因表达的方法。-丙基氨基)-2，10b-二氮杂-醋 蒽烯-6-酮)(Tarasov等，光化学和光生物学(i^otoc/z柳.尸/zotoWo/.) 78: 313-322(2003))。化合物，如WMC-77在进入生物大分子如DNA的两亲 性环境(Tarasova等，2003,厨J:厥述)或典型胶束的疏水性核心(Tarasov 等，光化学和光生物学(尸/^oc/2柳.尸/7oto6/o/J 70: 568-578 (1999))时，倾 向于显著提高它们固有的荧光性。由于咪唑并吖啶酮由水性溶液中吸附到 石英上，所以将来自西格玛-奥得里奇(Sigma-Aldrich) (St. Louis, MO)的 塑料聚甲基丙烯酸酯10x 10mm单元用于大部分检测。发现大气氧猝灭是 不重要的，原因在于在氮气净化之前和之后从BIAs获得相似的荧光强度 值。在去离子水中制备溶液。在25°C在单光子计数分光荧光计 FLUOROMAX(S^2 (Horiba Jobin Yvon， Edison， NJ)上获得未校正的荧光发 射光谱。分别将激发和发射单色仪裂缝调整为1.5和3.5 nm带宽。使用 430 nm激发单色仪设置，在450-700 nm范围内收集发射光谱(增量1 nm, 整合吋间0.2秒)。对于预先混合的肽和咪唑并吖啶酮溶液等分试样进行荧 光光度测量。在所有探测中发荧光剂WMC-77的浓度是0.4 nM。
本实施例论述本发明的肽针对不同细胞系表现出不同敏感性。 [01291 在包含浓度为0.001、 0.01、 0.1、 1.0、或5 的SMOi2-12或 SMOi2-20的培养基中，培养乳腺癌(T47D)、黑素瘤(SK-MEL-2)、肝细胞 瘤(H印G2， PLC, JM-1)、胰腺癌(Panc10.05, HS766T)、结肠癌(Cok)205， HCT15)、和肺癌(A549)的癌细胞。细胞按照实施例2中所述进行测定。如 在图9中所示，SMOi2-12和SMOi2-20根据受到处理的细胞表现出不同敏 感性。表现出GI50>5的细胞系包括PLC、JM-l、HS766T、Colo205、HCT15、 和A549。
实施例9
f0130j 本实施例论述本发明的肽具有二级结构。
10131
通过圆二色性(CD)光谱法测量所述肽。通过将化合物溶解在含有 50 mM十二烷基胆碱磷酸(Avanti极性脂质(Avanti Polar Lipids), Alabaster, AL)的PBS中而制备肽溶液(l pM)。通过AVIV mod. 202 CD-光谱仪(Aviv 仪器，Lakewood， NJ)，使用0.1 cm径长石英杯在22-24°C记录CD光谱。 扫描范围为180-260 nm，并且从化合物的光谱中减去缓冲液的光谱。 [01321 SMOi2-8和SMOi2-16的CD光谱(图IO)表明，所述肽主要釆取卩-链构象。逆反(retro-inverso)肽似乎比亲本全是-L负体更加结构化和刚 性。
实施例IO
01331 本实施例论述本发明多肽的丙氨酸扫描硏究。0134
通过创建SMOi2-8肽的突变体集合，探测SMOi2-8序列 (PalLTYAWHTSFKAL)中不同残基的重要性，其中所述集合的每个突变体 具有被Ala置换的氨基酸残基，并且SMOi2-8的每个残基被该集合中的至 少一个突变体靶向突变。
10135在SMOi2-8第10位置处的Lys残基对于SMOi2-8肽的活性是关 键的。当在SMOi2-8位置8的Ser被置换时，也观察到活性的显著损失。 当在位置l的Leu被Ala替代时，活性增加。可以在不显著改变活性的条 件下，用Ala置换位置9的Phe，位置3的Tyr，和位置5的Trp。其余置 换(2、 4、 6、 7、 11、和12)导致GIso的略微(40-60%)增加。
01361 本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请、和专利，通 过引用以如同每篇参考文献单独且特别指明通过引用结合相同的程度结 合于此，并且完全结合于此。
[0137
术语"a (—个)"和"an (—个)"以及"the (这个)"以及在描述本 发明的上下文中(特别是在下述权利要求的上下文中)的相似引用语，应 该解释为涵盖单数和复数，除非另外在本文中指明或明显同上下文相抵 触。术语"comprising (包括)，""having (具有)，""including (包括)，"以 及"containing(包含)"应该解释为开放术语(即，意指"包括但不限于")， 除非另外指明。本文数值范围的引用仅意欲作为独立引用落入该范围内的 每个单独的数值的简略表述方法，除非在本文中另外指明，并且每个独立 的数值如同其单独在本文中引用--样结合在本说明书中。本文所述的所有 方法可以以任何适当的顺序实施，除非在本文中另外指明或另外明显与上 下文相抵触。本文提供的任何以及所有实施例，或示例性语言(例如，" 诸如")的应用仅意欲更好地阐述本发明，并不形成对本发明范围的限制， 除非另外要求。本说明书中的任何语言不应该解释为指示任何不要求的要 素是对实施本发明重要的。
0138
在本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知实施本 发明的最佳模式。在阅读了前述描述时，这些优选实施方案的变化对本领 域普通技术人员可以变得清楚。本发明人预计熟练的技术人员适当地利用 所述变化，并且本发明人意欲以与本文具体描述不同的方式实施本发明。
44因此，如适用法律所允许地，本发明包括在所附权利要求中引用的主题的^ 所有修改和等价物。此外，本发明包括在其所有可能的变化中的上述要素 任何组合中，除非本文另外指明，或另外明显与上下文相抵触。
权利要求
1.分离的或纯化的多肽或肽模拟物，或其脂肪酸衍生物，所述多肽或肽模拟物包括Smoothened(SMO)蛋白(SEQ ID NO1)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能变体的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs2-4中的任一氨基酸序列，其中所述功能变体包括与SEQ ID NO2、3、或4具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽或肽模拟物长度小于或等于50个氨基酸，其中所述功能片段包括SEQ ID NO2、3、或4的至少7个连续氨基酸，并且其中所述功能片段或功能变体抑制患病细胞的增殖。
2. 权利要求1的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物，其 中所述肽模拟物是拟肽。
3. 权利要求1或2的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能片段包括SEQIDNOs: 5-8中的任一氨基酸序列。
4. 权利要求l-3任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍 生物，其中所述功能片段包括选自由SEQ ID NOs: 9 — 33组成的组中的一 个氨基酸序列。
5. 权利要求1或2的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能变体包括SEQIDNO:23的氨基酸序列，其中在SEQID NO: 23位置1-7、 9、 11、和12中的任一位置具有一个氨基酸置换，其中 在所述位置的氨基酸被Ala置换。
6. 权利要求1或2的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能变体包括SEQIDNO:23、 26、或33的逆反类似物。
7. 权利要求6的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物，其 中所述逆反类似物包括SEQIDNOs:34- 37、 84、和92-94中的任一氨基 酸序列。
8. 权利要求6的分离的或纯化的多肽或肽模拟物，其包括下述通用结构序列X-连接体1 -NH-(CH2)n^^^^CH-C0-Y-脂肪酸 序列X画连接体2國NH -(CH2)m其中序列X选自由下列各项组成的组Ac-LAKFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 85); Ac画AKFSTHWAYTL (全是画D) (SEQ ID NO: 86);和 Ac-KFSTHWAYTL (全是-D) (SEQ ID NO: 87);其中连接体1和连接体2每 —个是任选地存在，并且每一个独立地是Gly、卩-Ala、氨基丙酸、？氨基 丁酸、氨基己酸(咖inocaproic acid)、或氮基己酸(aminohexanoic acid); 其中n和m为0-6;其中Y是K、 C、高Cys、 Om、 二氨基丙酸(DPA)、 二氨基丁酸(DBA);并且其中所述脂肪酸是硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、 月桂酸、癸酸或辛酸。
9. 权利要求1或2的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生 物，其中所述功能变体包括SEQ ID NOs: 38-59中的任--氨基酸序列。
10. 权利要求1-9任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸 衍生物，其中所述脂肪酸衍生物在氨基(N-)端，羧基(C-)端，或N-和C-端 两端包括脂肪酸分子，所述脂肪酸分子任选地包含至少--个氨基基团。
11. 权利要求10的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物， 其中，当脂肪酸分子位于C端时，所述脂肪酸分子通过选自由下列各项组 成的组的--个氨基酸附着到所述多肽或肽模拟物上Lys、 Cys、高半胱氨 酸、Orn、 aj-二氨基丁酸、禾卩a,P-二氨基丙酸。
12. 权利要求ll的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物， 其中所述教基酸是Lys。
13. 权利要求10-12任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸分子是C8-C20脂肪酸。
14. 权利要求13的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸分子是C,6脂肪酸。
15. 权利要求10的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物，其中，当脂肪酸分子位于c端时，所述脂肪酸分子是式i或式n的分子，其中式I是NH2(CH2)。COOH，并且式II是CH3(CH2)mCH(NH2)COOH，其 中每一个n和m是1-24。
16. 权利要求15的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物， 其中n或m是16。
17. 权利要求1-9任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸 衍生物，其还包括细胞-穿透肽(CPP)。
18. 权利要求17的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物， 其中所述CPP包括SEQ ID NO: 78或79的氨基酸序列。
19. 权利要求l-18任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸 衍生物，其中所述肽模拟物包括具有下述结构的甲基化肽主链..■ NCH3-Ca—CO-NCH3，a-CO...侧链 侧链。
20. 权利要求l-19任一项的分离的或纯化的多肽或肽模拟物或脂肪酸 衍生物，其包括约10-约12个氨基酸。
21. —种缀合物，其包括(i)多肽或肽模拟物，或其脂肪酸衍生物，所 述多肽或肽模拟物包括Smoothened(SMO)蛋白(SEQ ID NO: 1)的一部分、 其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能变体的氨基酸序列，其 中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4中的任一氨基酸序列，其中所述功能片 段包括SEQIDNO:2、 3、或4的至少7个连续氨基酸，并且其中所述功能片段或功能变体抑制患病细胞的增殖，和(ii)靶向部分。
22. 编码多肽的分离的或纯化的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQIDNO: l)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述 功能片段的功能变体的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4 中的任一氨基酸序列，其中所述功能片段包括SEQ ID NO: 2、 3、或4的 至少7个连续氨基酸，并且其中所述功能片段或功能变体抑制患病细胞的 增殖。
23. 重组表达载体，其包括编码多肽的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQIDNO: l)的一部分、其功能片段、或者所述部分或所述 功能片段的功能变体的氨基酸序列，其中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4 中的任一氨基酸序列，其中所述功能片段包括SEQIDNO:2、 3、或4的 至少7个连续氨基酸，并且其中所述功能片段或功能变体抑制患病细胞的增殖。
24. 包括重组表达载体的宿主细胞，所述重组表达载体包括编码多肽 的核酸，所述多肽包括Smoothened (SMO)蛋白(SEQ ID NO: l)的一部分、 其功能片段、或者所述部分或所述功能片段的功能变体的氨基酸序列，其 中所述部分包括SEQ ID NOs: 2 - 4中的任一氨基酸序列，其中所述功能片 段包括SEQ ID NO: 2、 3、或4的至少7个连续氨基酸，并且其中所述功 能片段或功能变体抑制患病细胞的增殖。
25. 药物组合物，其包括权利要求l-20任一项的多肽或肽模拟物或脂 肪酸衍生物，任选地，脂质、和药用载体。
26. 药物组合物，其包括权利要求21的缀合物，任选地，脂质、和药 用载体。
27. 药物组合物，其包括权利要求22的核酸，任选地，脂质、和药用 载体。
28. 药物组合物，其包括权利要求23的重组表达载体，任选地，脂质、 和药用载体。
29. 权利要求25-28任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是局 部制剂。
30. 权利要求29的药物组合物，其中所述局部制剂是膏剂、洗液、油 膏、或贴片。
31. 权利要求30的药物组合物，其中所述洗液还包括紫外(UV)光 线阻隔剂。
32. 权利要求25-28任一项的药物组合物，其中所述药物组合物是静 脉内制剂或皮下制剂。
33. 抑制患病细胞增殖的方法，其包括使所述患病细胞与有效抑制所 述患病细胞增殖的量的权利要求25-32任一项的药物组合物接触。
34. 权利要求33的方法，其中所述患病细胞存在于宿主中。
35. 权利要求34的方法，其中所述宿主是哺乳动物。
36. 权利要求35的方法，其中所述哺乳动物是人。
37. 权利要求33-36任一项的方法，其中所述方法治疗或预防宿主的 癌症。
38. 权利要求37的方法，其中所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、 胃癌、结肠癌、肝癌、黑素瘤、基细胞癌、横纹肌肉瘤、成神经管细胞瘤、 胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、骨髓瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、或肉瘤。
39. 权利要求38的方法，其中所述胃癌是胃腺癌。
40. 权利要求33-36任一项的方法，其中所述方法治疗或预防宿主的 肿瘤。
41. 权利要求33-40任一项的方法，其中所述药物组合物局部施用给 宿主。
42. 权利要求33-37任一项的方法，其中所述药物组合物肿瘤内施用 给宿主。
43. 治疗或预防宿主中的癌症的方法，其包括给所述宿主施用有效治 疗或预防所述癌症的量的权利要求25-32任一项的药物组合物。
44. 治疗宿主中的银屑病的方法，其包括给所述宿主施用有效治疗银 屑病的量的权利要求25-32任一项的药物组合物。
45. 治疗宿主中的肿瘤的方法，其包括给所述宿主施用有效治疗所述 肿瘤的量的权利耍求25-32任一项的药物组合物。
46. 抑制患病细胞中选自由下列各项组成的组的基因的表达的方法 G7!W、 G7/-2、 G7!'-3、尸fc/j、幼/ 、 Swo、 A^S*、以及它们的组合，所述方法 包括使所述患病细胞与有效抑制所述基因表达的量的权利要求25-32任一 项的药物组合物接触。
47. 抑制患病细胞中Hedgehog信号转导途径的方法，所述方法包括使 所述患病细胞与有效抑制Hedgehog信号转导途径的量的权利要求25-32 任--项的药物 组合物接触。
48. 分离的或纯化的多肽或肽模拟物，包括Smoothened (SMO)蛋白 (SEQIDNO: l)的一部分、其功能变体的氨基酸序列，其中所述部分包括 SEQ ID NOs: 5 - 8中的任一氨基酸序列，其中所述多肽或肽模拟物长度小 于约50个氨基酸，其中所述功能变体包括SEQ ID NO: 80的氨基酸序列。
49. 权利要求1-20和48任--项的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物在 制备药物中的应用，所述药物用于在宿主中治疗或预防癌症、治疗银屑病、 或治疗肿瘤。
50.权利要求1-20和48任一项的多肽或肽模拟物或脂肪酸衍生物， 用于在宿主中治疗或预防癌症、治疗银屑病、或治疗肿瘤。
全文摘要
本发明公开一种分离的或纯化的多肽或肽模拟物，或其脂肪酸衍生物，所述多肽或肽模拟物包括Smoothened(SMO)蛋白一部分、其功能片段、或所述部分或所述功能片段的功能变体的氨基酸序列，其中所述部分包括SMO蛋白任一胞内环的氨基酸序列，其中所述功能片段包括所述胞内环的至少7个连续氨基酸，并且其中所述功能片段或功能变体抑制患病细胞的增殖。还提供了相关缀合物、核酸、重组表达载体、宿主细胞、和药物组合物。本发明还提供抑制患病细胞增殖、治疗或预防癌症、治疗肿瘤或银屑病、和抑制参与Hedgehog信号传导途径的基因表达由此抑制Hedgehog信号传导途径的方法。
文档编号C07K14/705GK101616931SQ200780046085
公开日2009年12月30日 申请日期2007年10月30日 优先权日2006年10月31日
发明者娜佳·塔拉索瓦, 宏 楼, 迈克尔·迪安 申请人:美国政府卫生与公共服务部