喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途。本发明用从海南儋州白马井近海的海泥样品中分离得到的蜡样芽胞杆菌(Bacillus Cereus)041381生产出结构新颖的 上述类型化合物，并通过化学合成方法制备了此类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗 白色念珠菌的活性，其最小抑制浓度MIC为1. 3-10. 2 μ M，可作为白色念珠菌的抑制剂。
背景技术：
白色念珠菌隶属酵母菌目、酵母菌科、假丝酵母属，广泛地存在于人体的皮肤表 面、小肠、空腔以及湿润部位。白色念珠菌是一种条件致病菌，当人体的抵抗力降低时， 可以诱发多种感染疾病，如鹅口疮等，危害着人类的生命安全，是真菌感染的首要病原 菌(Edwards JE Jr.Management of severe candidal infections !integration and review of current guidelines for treatment and prevention. Curr. Clin.Top. Infect.Dis. 2001，21 :135_147 ；Klepser ME，Lewis RE, Pfaller MA. Therapy of Candida infections :susceptibility testing， resistance， and therapeutic options.Ann. Pharmacother. 1998，32 :1353_1361 ；Reyes G.，Ghannoum MA. Antifungalsusceptibility testing of yeasts :uses and limitations. Drug Resist. Updates，2000，3 :14_19)。随 着广谱抗生素的普遍应用，器官移植中免疫抑制治疗的广泛开展，以及艾滋病等免疫缺陷 患者的增多，白色念珠菌感染率在近几年迅速增加，深部念珠菌感染已经成为重症患者死 亡的重要原因(White TC, Marr ΚΑ. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 1998,11 382-402 ； Law D, Moore CB, Wardle HM, Ganguli LA, Keaney MG, Denning Dff. High prevalence of antifungalresistance in Candida spp. from patients with AIDS. J Antimicrob chemother, 1994, 34 (5) 659-668) 0目前针对白色念珠菌感染的药物主要有酮康唑、克 霉唑或氟康唑等(Kowalsky SF, Dixon DM. Fluconazole -.a newantifungal agent. Clin Pharm. 1991,10:179-94 ；Palacin C,Tarrago C,Agut J,Guglietta,A. In vitro activity ofsertaconazole, fluconazole, ketoconazole, fenticonazole, clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginalyeast isolates. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2001, 23 61-64)。但是随着药物的滥用，白色念珠菌对这些药物产生了抗药性 和耐药性，成为临床治疗的一大难题，急需寻找结构新颖、作用高效的抗白色念珠菌感染药 物。本发明人从广西山口、防城、北海红树林样品分离的498株海洋细菌中，发现了一株能 够产生抗白色念珠菌活性物质的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381，且活性物质为 生物碱类化合物。从其液体发酵物中，分离并鉴定了这类生物碱为结构新颖的喹唑啉酮类 生物碱。活性测试表明，此类喹唑啉酮类生物碱具有较强的白色念珠菌抑制活性，最小抑制 浓度MIC为1. 3-10. 2 μ Μ,可作为白色念珠菌抑制剂用于由白色念珠菌感染所导致的疾病 的治疗，还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命科学研究。目前尚未见对该 化合物的化学结构及抗白色念珠菌活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容
本发明旨在提供一类结构独特的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮类生物碱。本发明的目的还在于提供这类新化合物的制备方法及其在制备白色念珠菌抑制 剂中的用途。本发明首次从蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381发酵物中发现了一类抗白 色念珠菌活性的喹唑啉酮类生物碱，如式I、II所示 其结构特征是化合物的基本骨架为在2-位上带有3-庚基取代片段的喹唑啉酮 生物碱，其中礼、r2、R3、R4、R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氨基或芳 香基团，1，2-位为单键或双键。优选的本发明化合物之一是所述的式I化合物(R2、R3、R4、R5和R6均为 氢):R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)> S-(-)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4(3H) -one (3)及其外消旋(士)_2_ (h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5) 优选的本发明化合物之二是所述的式II化合物(札、R2、R3、R4、R5和R6均为氢):(2R， 3 ‘ R) + (2S. 3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2), (2R, 3' S) + (2S，3' S) -2-(heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)及其消旋物 (+ )-2- (heptan-3-yl)~2, 3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。上述发明中最优选的化合物是由海南儋州白马井的近海海泥来源的细菌-蜡样 芽胞杆菌(Bacilluscereus)041381的液体发酵物经大孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯 度洗脱，乙醇-水70 30洗脱物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再经反相硅胶柱层析， 甲醇、水为溶剂进行梯度洗脱，其中甲醇-水80 20洗脱物为活性组分，再经S印hadex LH-20柱层析，所得氯仿-甲醇1 1洗脱产物，最后经HPLC分离纯化(甲醇-水75 25) 洗脱得式 I 化合物 R-(+)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (1)和式 II 的一对非对 映体混合物(2R，3' R) + (2S，3' R) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -on e(2)。上述发明中最优选的化合物还可以由合成方法获得，由R-(-)-2-乙基己酸为原 料，经草酰氯制为酰氯后，与邻氨基苯甲酰胺反应，所得到的反应物在碳酸氢钠饱和溶液中 回流或与六甲基二硅胺(HMDS)和I2反应，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水75 25 洗脱)得式 I 化合物 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)。化合物 1 经 NaBH4还原，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水70 30洗脱)得式II的一对非对映 体混合物(2R，3' R) + (2S，3' R)-2-(heptan-3-yl)-2, 3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e(2)。同样条件，由S-(+)-2-乙基己酸为原料，制得式I化合物3-(-)-2-0!印切11-311) quinazolin-4 (3H)-one (3)和式 II 的一对非对映体混合物(2R, 3 ‘ S) + (2S,3' S) -2-(heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)；由(士)-2-乙基己酸为 原料，可得式 I 化合物(士)-2_(h印tan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和式 II 化合物 (+ )-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。本发明采用纸片法测试了式I、II的化合物对白色念珠菌(Candida albicans)的抑菌活性。实验证实，此类化合物对白色念珠菌有生长抑制作用，R-(+)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)、非对映体混合物(2R，3R) + (2S, 3 ‘ R) -2- (heptan-3-yl) -2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)、 S-(-)~2~(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)、 混合物(2R，3 ‘ S)+(2S，3 ‘ S)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e(4)、 (士)一2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5)禾口 (士)一2-(heptan-3-yl)-2， 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (6)对白色念球菌的最小抑制浓度为 1. 3-10. 2 μ M0因此本发明的式I、II化合物可用作白色念珠菌的抑制剂。式I、II化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗白色念珠 菌药物，用于白色念珠菌感染的治疗。式I、II化合物还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命科学研究， 作为探针应用时，式I化合物可溶于氯仿、甲醇、或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含 水溶液中加以应用。本发明的式I、II化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得 到；也可以由简单原料通过化学合成而获得。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I、II化合物的方法可采用其它 任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为式I、II化合 物的生产菌。本发明的实施例中列举了利用蜡样芽胞杆菌041381株制备优选的本发明式I、式 II化合物的实例。该细菌041381株从采自海南儋州白马井的近海海泥中分离，并经分类学研究和 分子生物学研究鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，并由中国典型培养物保藏中心 保藏(编号CCTCC M 203030,日期2003年4月25日，地点中国武汉、武汉大学)。该蜡样芽胞杆菌041381 (Bacillus cereus 041381)株具有如下微生物菌学特 征菌落在培养基(酵母粉0.4%、麦芽膏1%、葡萄糖0.4%、陈海水75%、pH7. 4)、 28°C培养24小时的直径2mm;菌落隆起，呈淡黄色，边缘齐整，不透明，较湿，稍有光泽；个体 形态为杆状，有芽孢，端部圆形。可在0-15%盐度生长，最佳生长盐度为6%。该蜡样芽胞杆菌041381能利用糊精、糖原、吐温40、吐温80、N-乙酰-D-葡萄糖 胺、D-纤维二糖、D-果糖、α -D-葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-核 糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、α-酮戊二酸、α-酮颉草酸、L-苹果酸、丙酮酸甲酯、丙酮 酸、琥珀酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、谷氨酰-L-谷氨酸、 L-丝氨酸、2，3- 丁二醇、甘油、腺苷、2-脱氧-酰苷、肌苷、胸苷、尿苷、腺苷_5 ‘-磷酸、胸 苷-5'-磷酸、尿苷-5' _磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-L-α-甘油磷酸。该蜡样芽胞杆菌041381不能利用α-环糊精、β _环糊精、菊粉、甘露聚糖、N-乙 酰-β -D-甘露糖胺、杏苷、阿拉伯糖、L-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、m-肌糖、α -D-乳糖、D-甘露醇、D-松三糖、α -甲基-D-半乳糖苷、β -甲基-D-半乳糖苷、α -甲基-D-葡萄糖 苷、α -甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖、L-鼠李糖、水杨苷、水苏糖、D-山梨醇、D-塔格糖、 木糖醇、乙酸、α -羟基丁酸、ρ-羟基苯乙酸、D-乳酸甲酯、D-苹果酸、丙酸、D-果糖-6-磷酸。
该赌样芽胞杆菌(Bacillus cereus 041381,CCTCC M 203030)菌株具有如下分子 生物学特征16S rRNA 序列信息(GenBank 登陆号AY973027)GCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACA
具体实施例方式在如下的实施实例中所指的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物碱的化学结 构是(式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)式I、II化合物，其中Ri、R2、R3、R4、 R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氨基或芳香基团。实施例1化合物1、2的发酵生产及分离精制1发酵生产按培养微生物的常规方法，取蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)041381适量，接种到斜面培养基上，在28°C培养箱中培养3天。取斜面培养3天的B.cereus 041381适量，接种到装有150mL培养液(培养基组成为可溶性淀粉4%、酵母粉0. 1%、海水素2. 5%、pH =7.0)的 500mL 锥型瓶中，在 28°C、120rps/min 摇床培养 18 小时，获得 B. cereus 041381 的种子培养液。将该种子培养液按接种量分别接种于装有300mL生产培养液(培养基 组成同上)的IOOOmL锥型瓶中，装载于28°C环境下静置发酵96小时，获得发酵培养液。2浸膏的获得所取得的发酵培养液用等体积的正丁醇萃取3次，萃取液合并，减压浓缩获得正 丁醇提取浸膏共25. 5g。3化合物的分离精制浸膏(25. 5g)加水超声悬浮后，用大孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯度洗脱， 乙醇-水70 30洗脱物Fr-2 (8. 6g)，再经反相硅胶柱层析，甲醇、水为溶剂进行梯度洗 脱，分为3个组分。Fr-2-l (153. 5mg,甲醇-水8 2洗脱物)经S印hadex LH-20柱层析， 氯仿-甲醇1 1洗脱产物再经HPLC分离纯化，以甲醇-水75 25洗脱得式I化合物 R-(+) -2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1) (8mg)和一对非对映体的混合物(2R， 3' R)+(2S,3' R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)(IOmg)。R- (+) -2- (Heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)白色晶体，熔点为 123-125 "C,分子式为=C15H2tlN2O，[a ]D20+2. 1 (c 0. 1, acetone) ； UV λ maxMe0H (log C )202 (4. 17) ,224(4. 23) , 265 (3. 73) ,304(3. 44) ,316 (3. 35) nm ； lRvmaxKBr3177, 3034, 2959,2906,1674, 1609,1494,1465,1241,1196,890,768cm_1 ；Positive HRESIMS m/ z245. 1655 [M+H]+。其NMR数据如表1所示。(2R，3 ‘ R) + (2S，3 ‘ R) -2- (Heptan-3-yl) -2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (2)白色晶体，熔点为 86_87°C，分子式为C15H22N20，[a]D20+3. 9(c 0· 1，acetone)； UVAmaxMe0H(log € ) :221(4. 17)，252(3. 42)，349(3. 18) nm ;IRvmaxKBr3290，3063，2955，2928， 2867, 1646, 1517, 1489,1460,1395,1312,1262,1151,750cm_1, Positive HRESIMSm/z 247. 1819 [M+H]+。其NMR数据如表1所示。表1.化合物 1 和 2 的 1H 和 13C NMR 数据(600and 125MHz, in CDCl3)a a本表信号归属基于DEPIVH-1HCOSY, HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重 性利用DEPT方法确定并分别用s (单重峰)、(！(二重峰)、t (三重峰)和q(四重峰)表示。
b此栏中的数字和代号别代表以合成方法所制备的化合物1的1H和13C谱信息。。分别为化合物2的一对非对映异构体NMR数据。实施例2抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物碱的化学制备上述发明中式I的化合物还可以由合成方法获得，以最优选的化合 *R-(+)-2-0u5ptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l)、非对映体混合物(2R， 3 ‘ R)+(2S,3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2 )> S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3),非对映体混合物(2R， 3 ‘ S) + (2S,3 ‘ S) -2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one (4), (±)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (5)、 ( ± )-2-(heptan-3-y 1) -2, 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)为例，其化学制备路线见下图 1 R-㈠-2-乙基己酸和S-(+)-2-乙基己酸的制备将4.8mL(0.03mol) (士)_2_乙基己酸置于三颈瓶中，在搅拌条件下缓慢滴加 4mL(0. 03mol) (R) - (+) - α -苯乙胺，白色铵盐立即析出，约10分钟后铵盐完全析出。粗产物 加入30mL石油醚重结晶(反复重结晶)。所得晶体溶于IOmL水中，后用6mol/L盐酸酸化 至弱酸性。酸化后的水溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次20mL)，合并乙酸乙酯，无水硫酸钠 干燥后真空蒸干，得到1.8g S-(+)_2-乙基己酸(收率38%)，[a]D2°+10.2(c 2, acetone), 91% ee。将结晶后的石油醚母液减压蒸干，残留物加IOmL水溶解，酸化后乙酸乙酯萃取 3次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，真空蒸干，得到500mg R-( —)-2_乙基己酸，[α] d20-4. 4(c 2, acetone) ,42% ee。2 R- (-) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide (7)的制备将制得的R-(-)_2-乙基己酸 80mg(0. 56mmol)置于 25mL 两口瓶中，用 IOmL CH2Cl2 溶解、N2保护下滴加草酰氯142mg(l. 12mmol)，室温反应5h，真空蒸去CH2Cl2和草酰氯，用 IOmL CH2Cl2重新溶解，滴加到5mL CH2Cl2溶解的邻氨基苯甲酰胺76mg(0. 56mmol)和三乙 胺62mg(0.62mmol)中，室温反应1小时，反应完全，真空蒸干溶剂，乙酸乙酯重新溶解，分 别用水、5% NaHCO3溶液洗，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸干。硅胶柱层析分离纯化(乙酸 乙酯石油醚4 1)得125mg白色结晶粉末，产率85%。[a]D2°-1.3(c 1, acetone) ；mp 152-153°C, ESI-MS m/z 263. 2[M+H]+,285. 1[M+Na]+ ；1H NMR (500MHz, CDCl3) δ :11.2(lH，s， H-2)，8· 68 (1H, d, J = 8. 4Hz, H_7)，7. 54 (1H, d, J = 8. OHz, H_4)，7. 49 (1H, t, J = 8. OHz, H-5), 7. 06 (1H, t，J = 7. 7Hz，H_6)，6. 31 (1H，brs, -NH2B), 5. 75 (1H, brs, _NH2b)，2. 18 (1H,m, H-3' )，1. 71(2H，m，H-2' )，1. 55 1. 59 (4H，m，H_4' , H-5' ), 1. 32 (2H, m, H-6')， 0. 94 (3H, t, J = 7. 5Hz, H-I' ) ,0. 85 (3H, t, J = 6. 8Hz, H-7')。3 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)的制备法一取 R-(-)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg (0. 34mmol)置于 25mL两口瓶中用ImL甲醇溶解，加入15mL饱和的碳酸氢钠水溶液，回流2小时，冷却至室温，加水 10mL。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，经无水硫酸钠干燥后减 压除去乙酸乙酯。硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯石油醚6 1)得到SOmg白色结晶， 收率 96%。[a]D20+0. 4(c 1，acetone)。法 二 IX R- (-) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide 60mg(0. 23mmol)禾口 I2 175mg(0. 69mmol)置于 25mL 两口瓶中，用 IOmL CH2Cl2 溶解，N2 保护下滴加 HMDS 148mg(0. 92mmol)，室温反应12小时，用IOmL 二氯甲烷稀释，分别用5% Na2S2O3溶液、盐、水 洗后，有机层用无水硫酸钠干燥、蒸干。硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯石油醚6 1) 得 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (l)48mg，产率 86%。[α ]D2CI+0. 4(c 1， acetone) ； ESI-MS m/z 245.2[M+H] +。4 ( 2 R , 3 ' R ) + ( 2 S , 3 ' R)-2-(heptan_3-yl)-2， 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (2)的制备取 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H )-one(l) 15mg(0. 06mmol)和 NaBH4 23mg(0. 60mmol)置于 25mL 单口瓶中，-10°C下搅拌加 入4mL乙酸，缓慢升温至50°C，反应48小时，饱和碳酸氢钠溶液终止反应，等体积乙酸乙 酯萃取，经无水硫酸钠干燥后减压除去乙酸乙酯，得到白色固体，经HPLC分离纯化(以甲 醇-水75 25洗脱)得到白色结晶粉末7. 4mg，收率50%。[a]D20+1.3(c 1,acetone) ,mp 86-87°C ；ESI-MS m/z247. 2 [M+H]+ ；1H NMR(600MHz, CDCl3) δ :7· 88 (2Η，d，J = 7· 7Hz，Η_5)， 7. 30 (2Η, t, J = 7. 3Ηζ, Η_7)，6· 84 (2Η, t, J = 7. 3Ηζ, Η_6)，6· 66 (2Η, d, J = 7. 7Ηζ, Η_8)， 5. 71 (2Η, brs, Η_3)，4. 96 (2Η，‘t，like, J = 3. 7Ηζ, Η_2)，4. 06 (2Η，brs, Η_1)，1· 58 (2Η， m, Η-2 ' a),l. 55 (2Η, m, Η-4 ' a), 1. 50 (2Η, m, Η-3 ' ), 1. 40 (2Η, m, Η-2 ' b), 1. 34 (6Η, m, Η-4 ' b/H-5 ' ), 1. 33 (4Η, m, Η-6 ' )，0· 98 (3Η，t，J = 7· 8Ηζ，Η_Γ )/0. 96 (3Η, t, J =7. 8Hz, H-I' )，0· 92(3Η，t，J = 6· 9Ηζ，Η-7' )/0. 90 (3Η, t, J = 6. 9Ηζ, Η-7 ' ) ； 13C 匪R(125MHz，CDCl3) δ :165· 70/165. 66 (C-4)，147. 9 (2C, C_8a)，133. 9 (2C, C_7)，128. 6 (2C, C-5), 119. 2 (2C, C-6), 115. 8 (2C, C_4a), 114. 7 (2C, C_8)，67. 4 (2C, C_2)，44. 2 (2C, C_3')， 29. 8/29. 7(C-5 ' )，28. 6 (2C，C_4 ' )，23. 1 (2C，C_6 ' )，22. 0 (2C，C_2 ' )，14. 1 (2C， C-T ), 12. 0/11. 9 (C-I')。5 S-(_)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (3)的制备制备方法同化合物1 以拆分得到的S-⑴-2-乙基己酸80mg (0. 56mmol)和 草酰氯 142mg(l. 12mmol)反应得 S- (+) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide 115mg,产 率 80%，[a]D2°+1.6(c 1，acetone)，mp 148-149 °C ；波谱数据同化合物 7。法一由 S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg 与饱和 NaHCO3 可得白色结晶 381mg，收 97%。 [a]D20_0.9(c 1, acetone)S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 60mg (0. 23mmol)和 I2175mg(0. 69mmol)及 HMDS 148mg (0. 92mmol)反应得化合物 347mg，产 率 84%。[α ] D20-L l(c 1, acetone)，mp 93-94 °C ；波谱数据同化合物 1。6 ( 2 R , 3 ‘ R ) + ( 2 S , 3 ‘ R)-2-(heptan_3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)的制备制备方法同化合物2 由 S-(-)-2-0u5ptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one 20mg(0. 082mmol)和 NaBH4 32mg (0. 82mmol)反应，得化合物 2 10. 4mg，产率 52 %。[α] D20+l. 3(c 1，acetone)。mp 89-90 °C, ESI-MS m /z 247. 2[M+H]+ ；1H NMR (600MHz，CDCl3) δ 7. 87 (2H, d, J = 7. 7Hz, H_5)，7. 28 (2H, t, J = 7. 7Hz, H_7)，6. 82 (2H, t, J = 7. 7Hz, H_6)， 6. 67 (2H, d, J = 7. 7Hz, H_8)，6. 39 (2H, brs, H_3)，4. 94 (2H, dd, J = 3. 3，6. 6Hz，H_2)， 4. 19(2H，brs，H-l)，1. 62(2H，m，H-2 ' a), 1. 56 (2H, m, H-4 ' a), 1. 52 (2H, m, H-2 ' b)， 1. 45 (2H, m, H-3 ' ), 1. 39 (2H, m, H-4 ' b), 1. 32 (4H, m, H-5 ' ), 1. 30 (4H, m, H-6 ')， 0. 97 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-I' )/0. 95 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-I' ) ,0. 89 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-7' )/0. 88(3H，t，J = 6. 6Hz，H-7' ) ；13C NMR(125MHz, CDCl3) δ : 165. 73/165. 70 (C_4)， 147. 9 (2C, C-8a)，133. 8 (2C, C_7)，128. 6 (2C, C_5) ,119. 1 (2C, C_6) ,115. 8 (2C, C_4a)， 114. 7 (2C, C-8), 67. 4 (2C, C~2), 44. 2 (2C, C-3' ), 29. 8/29. 7(C-5' ) ,28. 6(2C, C-4')， 23. 13/23. 09(C-6' ) ,22. 0(2C, C-2' )，14. 1 (2C，C_7' ), 12. 0/11. 9 (C-I')。7 (±) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (5)的制备制备方法同化合物1 以(士)-2-乙基己酸108mg(0. 75mmol)和草酰 氯 190mg(l. 5mmol)反应得(士)_2_(2-ethylhexanamido)benzamide 169mg, 产 率 86 %。 由(士)一2-(2-ethylhexanamido) benzamide 120mg(0. 46mmol)禾口 I2 350mg(l. 38mmol)及 HMDS 296mg(l. 84mmol)反应得化合物(士)_2_(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(5)95mg，产率 85%。[α ]D20(C 1，acetone)，mp 115_116°C。8 (±) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (6)的帝[J备制备方法同化合物2 由(士)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5) 20m g(0. 082mmol)和 NaBH432mg(0. 82mmol)反应，得化合物 69. 6mg，产率 48 %。[α ]D20(C 1， acetone) ；mp 76-80 °C。实施例3抗白色念珠菌活性的测试1实验样品及实验方法被测样品及阳性对照药溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离 精制的纯品化合物 R-(+)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (1)和(2R， 3 ‘ R)+(2S，3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)及其 化学合成的 S-(-)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (3)和(2R, 3 ‘ S) + (2S, 3 ‘ S)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(4)、(士)(heptan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(5)禾口(士)-2-(heptan-3-yl)_2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e (6)，以及阳性对照药酮康唑纯品(日本东京化成)。准确称取适量样品，用甲醇按二倍稀 释法配制成所需浓度的溶液，即 10 μ g/mL、5 μ g/mL、2. 5 μ g/mLU. 25 μ g/mL、0. 625 μ g/mL、 0. 3125 μ g/mL、0. 15625 μ g/mL、0. 078125 μ g/mL 供活性测试。致病菌白色念球菌培养活性测试采用致病菌白色念球菌。取冻存保藏的白色念 珠菌适量，接种到YPD培养基的斜面上活化(培养基组成为酵母膏1%、葡萄糖2%、蛋白 胨2%、琼脂2%、pH = 7. 0)。取斜面培养3天的白色念球菌适量，接种到装有150mL培养 液(培养基组成为酵母膏1 %、葡萄糖2 %、蛋白胨2 %、pH = 7. 0)的500mL锥型瓶中，在 28°CU20rps/min的条件下摇床培养24小时，获得白色念球菌的种子培养液。用涂布棒将该种子培养液均勻的涂抹在YPD培养菌的平板上，供活性测试。纸片法测定实验样品的抑菌活性实验将上述配制好的各个浓度的样品，吸取 10 μ L滴加在直径为6mm的灭菌滤纸片上。无菌操作将加有样品的滤纸片贴在上述制备好 的带有菌的平板上。28°C培养12小时，观察抑菌圈直径大小，以看不到抑菌圈的最大浓度 为该样品的最小抑制浓度(MIC)。2实验结果
it ^ ^ R-( + )-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l) > (2R, 3 ‘ R) + (2S,3 ‘ R)-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one ( 2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)禾口 (2R，3 ' S) + (2S， 3 ‘ S)-2 - (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (4) > (士)一2- (heptan-3-yl) quinazolin—4 (3H) -one (5)禾口 (士)一2-(heptan-3-y 1) -2， 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)对白色念球菌具有强的抑制活性，其MIC分别为2. 5、 2. 5、1. 3、5. 0、10. 2、10. 1 μ M，阳性对照药酮康唑的MIC为0. 2 μ Μ。其中，S-构型的喹唑啉 酮生物碱(3)的活性最强，表明S-构型和2，3_双键可能是活性基团，而外消旋的产物则降 低其抑菌活性。3 结论it ^ ^ R-( + )-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l) > (2R, 3 ‘ R) + (2S,3 ‘ R)-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one ( 2) , S-(-)-2-(heptan-3-yDquinazolin-4 (3H)-one (3)禾口 (2R，3 ' S) + (2S， 3 ‘ S)-2 - (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH) - one(4) > (士)一2- (heptan-3-yl) quinazolin—4 (3H) -one (5)禾口 (士)_2_ (heptan-3-y 1) -2， 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)对白色念珠菌的生长具有较强抑制作用。因此，本发 明的式I、II化合物、特别是具有S-构型的喹唑啉酮生物碱可作为白色念珠菌抑制剂用于 治疗白色念珠菌感染所导致的疾病，还可作为抑制白色念珠菌的低分子生物探针用于生命 科学研究。
权利要求
式I、或式II化合物其中R1、R2、R3、R4、R5、R6为氢、烃基、氨基、烷氧基、羟基、酰基、酰氧基、酰氮基或芳香基团。F2010100045625C00011.tif
2.权利要求1所述的式I的1个天然产物R-⑴-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(l)，其中 R2、R3> R4> R5 和 R6 均为氢；式 II 的 1 个天然产物(2R， 3' R) + (2S，3' 10-2-01印{&11-311)-2，3-(1让7(11~(^1^11&201士11-4(1!1)-0116(2)，其中 R”R2、 R3、R4、R5和R6均为氢。
3.权利要求1所述的式I的2个合成产物(式I，&、民、1 4、1 5和1 6均为氢) S-(-)-2"(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3),外消旋体(士)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H) -one (5)及其 2 个还原产物(式 II，R1、R2、R3、R4、R5 和 R6 均为氢)非 对映体混合物(2R，3S) + (2S, 3 ‘ S) -2- (heptan-3-yl) -2，3-dihydroquinazolin-4 (IH) -on e (4)、(士)-2_ (heptan-3-yl) quinazol in-4 (3H) -one (6)。
4.权利要求2所述的式I、II化合物的制备方法，其特征是液体发酵培养蜡样芽胞杆 菌(Bacillus cereus) 041381，获取含有上述式I、II化合物的发酵物，然后从发酵物中分 离纯化出式 I 化合物 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazol in-4 (3H) -one (1)和式 II 的-对非 对映体混合物(2R，3' R) + (2S，3' R) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (2) ο
5.权利要求4所述的制备方法，将所述发酵物经火孔树脂柱层析，以乙醇、水为溶剂梯 度洗脱，乙醇-水70 30洗脱物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再经反相硅胶柱层析， 甲醇、水为溶剂进行梯度洗脱，其中甲醇-水80 20洗脱物，再经S印hadex LH-20柱层 析，所得氯仿-甲醇1 1洗脱产物，最后经HPLC分离纯化(甲醇-水75 25)洗脱得式 I 化合物 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazol in-4 (3H)-one (1)和式 II 的一对非对映体混合 物(2R，3' R)+(2S，3' R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)
6.权利要求5所述的式I、II化合物的微生物制备方法，其生产菌是蜡样芽胞杆菌 (Bacillus cereus)041381，保藏编号为=CCTCC M 203030。
7.权利要求2所述的式I化合物的化学制备方法，由R-(-)_2-乙基己酸为原料，经草 酰氯制为酰氯后，与邻氨基苯甲酰胺反应，所得到的反应物在碳酸氢钠饱和溶液中回流或 与六甲基二硅胺(HMDS)和I2反应，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水75 25洗脱) 得式 I 化合物 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazol in-4 (3H)-one (1)。化合物 1 经 NaBH4 还 原，所得产物经HPLC分离纯化(甲醇-水70 30洗脱)得式II的一对非对映体混合物 (2R, 3' R) + (2S,3‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)。
8.权利要求3所述的式I、II化合物的化学制备方法，由S-(+)-2-乙基己酸为原料， 以权力要求 7 所述的方法制得 S-(-)-2-(hi5ptan-3-yl)quinaZ0lin-4(3H)-0ne(3)和混合 物(2R，3' S) + (2S，3' S) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)；由(士)-2-乙基己酸为原料，同样方法可得(士)-2-(h印ten-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5) 禾口(士)-2-(heptan-3-yl)_2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。
9.权利要求1所述的式I、II化合物在制备白色念珠菌抑制剂的用途。
10.权利要求1所述的式I、II化合物在制备抗白色念珠菌药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及喹唑啉酮类生物碱及其制备方法和用途。本发明用从海南儋州白马井近海的海泥样品中分离得到的细菌——蜡样芽胞杆菌041381(Bacillus cereus 041381，菌种保藏编号CCTCC M 203030)生产出结构新颖的上述类型的化合物，并通过化学合成方法制备了此类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗白色念珠菌的活性，其最小抑制浓度MIC为1.3-10.2μM，可作为白色念珠菌的抑制剂。
文档编号C07D239/90GK101845021SQ20101000456
公开日2010年9月29日 申请日期2010年1月10日 优先权日2010年1月10日
发明者付海超, 刘培培, 张亚鹏, 徐志红, 朱伟明, 林海鹏, 洪葵, 王又, 肖春 申请人:中国海洋大学;中国热带农业科学院热带生物技术研究所