专利名称：重组猪α型干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重组猪α型干扰素(interferon，IFN)的研制方法及过程。系将带有猪α型IFN基因重组质粒转化大肠杆菌，并使其高效表达猪α型IFN，经纯化后加入适量猪血浆白蛋白稳定剂冻干制成，用于治疗猪病毒性腹泻和流行性感冒等病毒性疾病。研制及检定的标准均采用国家SFDA认证的重组人α型IFN(中国生物制品规程中国生物制品标准化委员会编2000版)作为参比并实施。
背景技术：
猪病毒性疾病是当前严重制约猪养殖业健康发展的主要传染病。全年均有发生，如猪病毒性腹泻、流行性感冒等。这些动物一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，猪与人类密切接触，某些动物病毒性传染病还给人类健康带来潜在威胁。目前对猪病毒性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素。但由于养殖环境不完善，病毒变异以及机体抵抗力变化等原因，使传统的预防和治疗途径受到了巨大挑战，大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给人类健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒的不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。因此，积极治疗家禽、家畜病毒病将是人类最为关注的问题。
IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。猪IFN是一类能诱导猪细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子，主要用于猪流行性腹泻和猪流行性感冒等病毒性疾病的防治，特别是和猪用其它细胞因子协同使用时，效果更佳。因此，IFN是当今应用前景广阔的重要生物制剂之一。
目前，国内最早应用于兽医临床的是猪白细胞IFN，但采用血细胞分离的方法获得的白细胞IFN成本较高，血源易被污染，很难进行工业化生产。而采用基因工程技术生产重组猪α型IFN除可避免上述弊端外，尚有纯度高，成本低，可规模化生产等优势，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组猪α型干扰素的制备方法，是将猪α型IFN基因重组质粒转化大肠杆菌，使其高效表达猪α型IFN，经纯化后除菌、分装和冻干等工艺制成，是一种广谱抗病毒制剂，主治猪病毒性腹泻和流行性感冒等病毒性疾病。
本发明技术方案如下 重组猪α型干扰素的制备方法，其特征是进行以下步骤 (1)、构建克隆载体 目的基因为 TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特异性引物上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 克隆载体pMD18-T simple vector (2)、构建表达载体 表达载体pET-28a，或者pGEX-5X (3)、重组蛋白的表达 挑取载体构建成功的重组表达菌进行扩增、放大培养，并加入诱导剂低温诱导表达； (4)、鉴定重组蛋白 应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误； (5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于具体步骤为 (1)、构建克隆载体 目的基因 TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特异性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特异性引物PCR扩增猪α型干扰素的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序； (2)、构建表达载体 鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-28a或者pGEX-5X进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达菌； (3)、重组蛋白的表达 分别挑取与pET-28a或者pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌进行小量扩增、放大培养，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，低温诱导表达，收集细菌； (4)、鉴定重组蛋白 应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误； (5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于更为详细的步骤为 (1)、构建克隆载体 猪α型IFN的目的基因为 TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA 特异性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特异性引物PCR扩增猪α型IFN的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序； (2)、构建表达载体 鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-28a或者pGEX-5X进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别涂布于含卡那霉素的LB培养基平板或者含氨苄青的LB培养基平板培养过夜，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功； (3)、重组蛋白的表达 分别挑取与pET-28a或者pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培养基或者含氨苄青100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后分别在含卡那霉素100μg/ml的LB培养基或者含氨苄青100μg/ml的LB培养基中放大培养或发酵3h后，至细菌到达对数生长期，测细菌在600nm OD值在0.6-0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，32℃低温诱导表达，终浓度200μg/ml，收集细菌； (4)、鉴定重组蛋白 应用抗α型IFN参考血清做中和实验，证明型别无误； (5)、纯化重组蛋白，得到粗制品IFN。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于鉴定重组蛋白将目的基因的重组质粒pET-28a/IFN和pGEX-5X/IFN转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，大肠杆菌pET-28a/IFN菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在25KD左右有一条浓染的新增蛋白条带；大肠杆菌pGEX-5X/IFN菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在45KD左右有一条浓染的新增蛋白条带。经Western blotting鉴定，此两种菌体蛋白均能与抗α型IFN参考血清发生强阳性反应。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于纯化重组蛋白是指用超声破碎重组蛋白后，得到上清中的可溶性重组蛋白，再经AKTATMexplorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于纯化重组蛋白，得到粗制品IFN的具体步骤为收集菌液，4℃12000r/min离心5min，弃上清，留沉淀，-20℃与室温反复冻融沉淀3次后将沉淀混匀在9倍体积PBS液中，4℃孵育5min，超声裂解得到重组蛋白，功率400W，工作3秒，间隔3秒，超声6min，重复3-4次，可作革兰染色观察细菌裂解情况，12000r/min离心10min，收获上清。
所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于AKTATMexplorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白，测定IFN效价及比活性，比活性≥1×106国际单位/mg蛋白为合格；无菌分装，-70℃保存。
本发明制备的重组猪α型干扰素，经分离纯化后，制成冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为IFN含量≥2万单位/瓶，2～8℃可长期保存，室温(≤25℃)可保存两年。使用时要轻轻摇匀后方可进行肌肉注射，仔猪5000～1万单位/只/天；成年猪2万～4万单位/只/天，每日注射一次，一个疗程3～5次。
在治疗已发病猪的同时，应及时隔离未发病猪，并给予等量相应药物预防注射，使用本发明制备的重组猪α型IFN时，应注意环境的消毒等综合预防措施，防治再感染或疫病的复发。
具体实施例方式 重组猪α型IFN制备工艺流程 1.构建克隆载体 猪α型IFN目的基因为 TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA特异性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA 下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC 用特异性引物PCR扩增猪α型IFN目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序。
2.构建表达载体 选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与分别与表达载体pET-28a或pGEX-5X进行连接，并转化至BL-21大肠杆菌，分别涂布于含卡那霉素的LB培养基平板或含氨苄青的LB培养基平板培养过夜。取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。
3.重组蛋白的表达 分别挑取与pET-28a或pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培养基或含氨苄青100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后分别在两种LB培养基(含卡那霉素100μg/ml或含氨苄青100μg/ml)中放大培养或发酵3h后，测OD值在0.6-0.8时，加入IPTG，32℃低温诱导表达(终浓度200μg/ml)5h，收集细菌。
为了以后大规模的重组猪α型IFN，需在发酵罐中进行表达培养。本发明同时研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到50mg/L。
4.粗制品IFN的制备 收集细菌，-20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3-4次，离心12000r/min离心15min获得上清。
5.粗制品IFN纯化 5.1AKTATMexplorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白。
5.1.1亲和层析将粗制蛋白过滤处理后过GST亲和层析柱，用Elution buffer(50mMTris-Cl 40mM还原性谷胱甘肽pH 8.0)梯度洗脱，收集IFN峰。
5.1.2脱盐、缓冲液置换将第一步纯化的IFN过脱盐柱，用缓冲液(50mMTris-ClpH6.5)置换，准备下一步离子交换层析。
5.1.3离子交换层析分别用Loading buffer(50mMTris-Cl pH6.5)平衡好柱体，上样后用Elution buffer(50mMTris-Cl 1M NaCl pH6.5)梯度洗脱，收集IFN峰。
5.1.4分子筛层析离子交换层析收集到的IFN过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa2HPO4 0.15MNaCl Ph7.0)收集IFN峰。
5.1.5结果分析每一步纯化后用SDS-page及westen检测蛋白纯度，Lowry法蛋白定量，计算每一步纯化得率。
5.2测定IFN效价及比活性，比活性≥1×106国际单位/mg蛋白为合格； 5.3无菌分装，-70℃保存。
6.纯化后猪α型IFN的鉴定 6.1蛋白定量检测用Lowry法，以中国药品生物制品检定所的标准蛋白作标准测定。
6.2SDS-PAGE电泳检测，与空菌相比，两种重组菌分别在25KD和45KD左右有一条浓染的新增蛋白条带。
6.3高效液相色谱分析纯化后重组猪αIFN的纯度，纯化后猪αIFN＞95％。
6.4免疫印迹试验纯化后的样品能与抗α型IFN参考血清发生强阳性反应。
7.纯化后重组猪αIFN效价及比活性的测定 7.1IFN效价测定纯化后重组猪αIFN在WISH细胞上能够抑制100TCID50的VSV病毒的增殖。
7.1.1在96孔微量细胞培养板上用DMEM营养液培养WISH细胞，置5％CO2培养箱37℃条件下培养24小时。
7.1.2用不同剂量的猪αIFN进行处理。
7.1.3 24小时后吸弃，再分别接种100TCID50的VSV病毒。
7.1.4结果表明获得的重组猪α型IFN对VSV引起的细胞病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的两种重组猪αIFN处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察七天，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价＞107IU/ml。
7.2比活性测定方法将纯化后的重组猪α型IFN半成品蛋白定量检测后，以国际上通用的WISH/VZV系统测定比活＞1×107IU/mg。
8.取上清液用蔡氏滤器加压过滤，收集无菌滤液，取样进行无菌检验和安全检验。经检测合格后，加入终浓度含5％脱脂奶粉、5％GS(葡萄糖)和10％猪血浆白蛋白作为冻干保护剂混匀后，置于冻干机冻干。
9.重组猪α型IFN在猪肾细胞中抑制猪细小病毒中的应用 9.1在96孔微量细胞培养板上用DMEM营养液培养猪肾细胞(PK-15)，置5％CO2培养箱37℃条件下培养24小时。
9.2用不同剂量的重组猪α型IFN作用细胞。
9.3 24小时后吸弃，再分别接种100TCID50的猪细小病毒悬液。
9.4结果表明获得的重组猪α型IFN对猪细小病毒引起的细胞病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组猪α型IFN处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察七天，细胞形态正常，未出现任何病变。
10.重组猪α型IFN安全性实验 10.1豚鼠检验 用体重350～400g的健康豚鼠3只，各腹侧皮下注射重组猪α型IFN 2ml，观察10日，均健活。
10.2小白鼠检验 用体重18～20g的小白鼠5只，各尾静脉注射重组猪α型IFN 0.5ml，观察7日，均健活。
10.3乳鼠检验 用2日龄乳鼠1窝(至少5只，带母鼠饲养)，每只背部皮下注射0.1ml，同时设对照组，观察7日，均全部健活。
10.4猪检验 用经中和试验方法检测无猪瘟母源抗体的健康易感断奶仔猪4头(注射前观察5～7日，每日上、下午各测体温1次，挑选体温、精神、食欲正常者使用)。每头肌肉注射成品6ml，接种后每日上、下午各测体温观察1次，观察21日。体温、精神、食欲与注射本品前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日。检验结果，样品均合格。
11.重组猪α型IFN效力检验 用仔猪检验 按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定，选择的试验用仔猪为健康易感21日龄的断奶仔猪，每批IFN各注射8只。试验时，各肌肉注射IFN 2万U/只，连续3天(共约6万U/只)。在首次用药后24h，经口喂食猪细小病毒悬液(血凝效价≥1∶1280；TCID50≥1.0×10-9/ml)0.1ml(200TCID50)。同时同样设病毒对照组和正常对照组。攻毒后12h，IFN保护组和正常对照组试验仔猪一切行为正常，而病毒对照组仔猪则出现临床症状。观察96h后剖杀，IFN保护组和正常对照组肠道组织无明显病理改变，病毒分离阴性；而病毒对照组则出现明显肠道组织病理改变，病毒分离阳性。
12.临床试用效果 研制的IFN在安徽省合肥市、明光市以及五河县等多家养猪场(户)试用，结果证明，重组IFN对治疗猪病毒性腹泻有效率为86.5％，治愈率为67.9％；治疗猪细小病毒病有率为88.53％，治愈率为69.93％，质量优于市场现有产品。
<110>王明丽
<120>重组猪α型干扰素的制备方法
<160>1
<210>1
<211>501
<212>DNA
<213>猪(Sus scrofa)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(501)
<400>1
tcactccttc ttcctgagtc tgtcttgcag gtttgtggag gaagagaagg ctctcatgac 60
ttctgccctg acgatctccc aggcacaggg gctgtagctc ttctcttgca gatagagggt 120
gagtctgtgg aagtatttcc tcacagccag gatggagtcc tcctccagca ggggggtccc 180
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gagctggaag gtctgctgga gcatctcatg caccagagcc atggcttgag ccttctggac 360
ctggttgccc cccaaggcct cttgggggaa tccaaagtcc cttctgtggt ccaggcagga 420
gaagggggag attctcctca tttgtgccag gagcctcagg gccctggtgt gagccaggct 480
gtgggtctga ggcaggtcgc a 50权利要求
1、重组猪α型干扰素的制备方法，其特征是进行以下步骤
(1)、构建克隆载体
目的基因为
TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特异性引物上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
克隆载体pMD18-T simple vector
(2)、构建表达载体
表达载体pET-28a，或者pGEX-5X
(3)、重组蛋白的表达
挑取载体构建成功的重组表达菌进行扩增、放大培养，并加入诱导剂低温诱导表达；
(4)、鉴定重组蛋白
应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误；
(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。
2、根据权利要求1所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于具体步骤为
(1)、构建克隆载体
目的基因
TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特异性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
用特异性引物PCR扩增猪α型干扰素的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；
(2)、构建表达载体
鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-28a或者pGEX-5X进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别进行培养，鉴定出表达载体构建成功的重组表达菌；
(3)、重组蛋白的表达
分别挑取与pET-28a或者pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌进行小量扩增、放大培养，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，低温诱导表达，收集细菌；
(4)、鉴定重组蛋白
应用抗α型干扰素参考血清做中和实验，证明型别无误；
(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。
3、根据权利要求1所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于更为详细的步骤为
(1)、构建克隆载体
猪α型IFN的目的基因为
TCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGCAGGTTTGTGGAGGAAGAGAAGGCTCTCATGACTTCTGCCCTGACGATCTCCCAGGCACAGGGGCTGTAGCTCTTCTCTTGCAGATAGAGGGTGAGTCTGTGGAAGTATTTCCTCACAGCCAGGATGGAGTCCTCCTCCAGCAGGGGGGTCCCTTCCAGCCCGGCCTCCTGCATGACACAGGCTTCCAGGTCCCTGAGCTGCTGATCCAGTCCAGTGCAGAACTGGTGCAGGAGGCTCTCATCCCAGGCAGCAGCCGAGCCCTCTGTGCTGAAGAGCTGGAAGGTCTGCTGGAGCATCTCATGCACCAGAGCCATGGCTTGAGCCTTCTGGACCTGGTTGCCCCCCAAGGCCTCTTgGGGGAATCCAAAGTCCCTTCTGTGGTCCAGGCAGGAGAAGGGGGAGATTCTCCTCATTTGTGCCAGGAGCCTCAGGGCCCTGGTGTGAGCCAGGCTGTGGGTCTGAGGCAGGTCGCA
特异性引物序列上游GAATTC TGCGAC CTGCCT CAGACC CA
下游CTCGAG TCACTC CTTCTT CCTGAG TC
用特异性引物PCR扩增猪α型IFN的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；
(2)、构建表达载体
鉴定后选择与目的基因一致的克隆菌进行双酶切后，与表达载体pET-28a或者pGEX-5X进行连接，并相应转化至BL-21大肠杆菌，分别涂布于含卡那霉素的LB培养基平板或者含氨苄青的LB培养基平板培养过夜，取前述平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功；
(3)、重组蛋白的表达
分别挑取与pET-28a或者pGEX-5X表达载体连接的重组表达菌于含卡那霉素100μg/ml的LB培养基或者含氨苄青100μg/ml的LB培养基中少量扩增，后分别在含卡那霉素100μg/ml的LB培养基或者含氨苄青100μg/ml的LB培养基中放大培养或发酵3h后，至细菌到达对数生长期，测细菌在600nm OD值在0.6-0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG，32℃低温诱导表达，终浓度200μg/ml，收集细菌；
(4)、鉴定重组蛋白
应用抗α型IFN参考血清做中和实验，证明型别无误；
(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品IFN。
4、根据权利要求1-3之一所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于鉴定重组蛋白将目的基因的重组质粒pET-28a/IFN和pGEX-5X/IFN转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后，大肠杆菌pET-28a/IFN菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在25KD左右有一条浓染的新增蛋白条带；大肠杆菌pGEX-5X/IFN菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在45KD左右有一条浓染的新增蛋白条带。经Western blotting鉴定，此两种菌体蛋白均能与抗α型IFN参考血清发生强阳性反应。
5、根据权利要求1-3之一所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于纯化重组蛋白是指用超声破碎重组蛋白后，得到上清中的可溶性重组蛋白，再经AKTATMexplorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白。
6、根据权利要求1-3之一所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于纯化重组蛋白，得到粗制品IFN的具体步骤为收集菌液，4℃12000r/min离心5min，弃上清，留沉淀，-20℃与室温反复冻融沉淀3次后将沉淀混匀在9倍体积PBS液中，4℃孵育5min，超声裂解得到重组蛋白，功率400W，工作3秒，间隔3秒，超声6min，重复3-4次，可作革兰染色观察细菌裂解情况，12000r/min离心10min，收获上清。
7、根据权利要求6所述的重组猪α型干扰素的制备方法，其特征在于AKTATMexplorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白，测定IFN效价及比活性，比活性≥1×106国际单位/mg蛋白为合格；无菌分装，-70℃保存。
全文摘要
本发明公开了一种重组猪α型干扰素的制备方法，系将特异性引物PCR扩增猪α型IFN的目的基因，与表达载体pET-28a和与表达载体pGEX-5X进行连接，转化大肠杆菌，使其高效表达猪α型干扰素，经高度纯化后除菌、分装和冻干等工艺制成重组猪α型IFN冻干粉针剂。本发明经过安全性实验、IFN效力检验、临床试用，表明其对猪病毒性腹泻和流行性感冒等有明显的治疗效果，且在安全性和治愈率上优于同类产品。本发明制备工艺简单，易于工业化生产，经冻干后易运送和保藏。重组猪α型干扰素注射猪机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点可用于治疗猪病毒性腹泻和流行性感冒等疾病，是一种新型高效安全无残留的广谱抗病毒制剂。
文档编号C07K1/14GK101289666SQ200810020180
公开日2008年10月22日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者王明丽 申请人:王明丽