专利名称：：固相多肽合成海沙瑞林的方法
技术领域：
：本发明涉及海沙瑞林(包括醋酸盐、三氟乙酸盐)的制备方法，尤其涉及固相多肽合成海沙瑞林的制备方法。
背景技术：
：海沙瑞林，中文名海沙瑞林，英文名Hexarelin结构式His-D-2-Me-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2分子式及分子量C47H58N1206;887.0近几年研究发现，凋亡引起心肌细胞丢失是心力衰竭发生的重要机制之一，血管紧张素II(AngiotensionII)是心力衰竭发生时的一种重要神经内分泌因子,可诱导心肌细胞凋亡。大量资料表明,hexarelin对心血管系统有明显保护作用。通过研究表明Hexardin可明显抑制AngII诱导的心肌细胞凋亡。心肌细胞肥大是心力衰竭的重要发病过程之一，而hexarelin有明显抗AngII诱发的心肌细胞肥大以及对SHR心肌肥厚的作用。通常合成GHRH系列多肽如GHRH-2，GHRH-6等采用Boc法，每步脱Boc均需用TFA，使用MBHA或AMResin，用强刺激、巨毒的氟化氢切割，还有是通过液相法片断縮合，周期比较长。相对于以上二种，限制了海沙瑞林的大规模生产和使用。而随着Fmoc氨基酸的商品化程度越来越高，成本的下降，Fmoc固相法是比较快速，方便，可以大量规模化生产的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种相多肽合成海沙瑞林的方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长、在合成中使用剧毒物的技术问题。本发明的技术方案为一种相多肽合成海沙瑞林的方法，包括如下步骤以Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获的保护的六肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt其中的一种为縮合剂进行接肽反应，得保护的六肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得海沙瑞林粗品，并经C18色谱柱进行分离纯化，获得所说的海沙瑞林，然后可再经过冷冻干燥，获得海沙瑞林醋酸盐或三氟乙酸盐产品。按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护六肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团的方法包括如下步骤(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin选用Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin倒入接肽瓶，加入大约树脂2.5倍体积的DCM，浸泡10分钟(常温)后用真空泵抽干，加入脱帽试剂放入恒温振荡器反应5分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟(30°C~40°C),用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，加入Fmoc-Lys(BOC)-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Collidine反应40分钟(3(TC5(TC)，用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次,抽干,获得Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin;这里所说的脱帽试剂的组分和体积比为PIP:DMF(工业级)=1:4;下同；Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin的重量与脱帽试剂的加入量的比例为8-12ml/g;下同；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同；HOBt的摩尔数为树脂的2-3倍;下同；DIC的摩尔数为树脂的2-3倍;下同；Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin的重量与分析级的DMF的加入量的比例为8-10ml/g;下同；Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin的重量与用工业级的DMF、无水甲醇洗涤、重蒸过的DCM的加入量的比例为8-10ml/g;下同；(2)制备Fmoc-D-Phe隱Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(l)的Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin树脂中，加入脱帽试剂，3060°C反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂306(TC反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-Phe-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Collidine反应40分钟(30。C50。C),抽干，洗涤,抽干，获得Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-D-Phe-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同其余操纵以及工艺条件同上；(3)制备Fmoc-Trp(Boc)隱D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(2)的Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin,加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，，加入Fmoc-Trp(BOC)-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Collidine反应40分钟(30°C~50°C),抽干，洗涤，，抽干，获得Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-Trp(BOC)-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同其余操纵以及工艺条件同上；(4)制备Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(3)的Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-Ala-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Collidine反应40分钟(30。C50。C),抽干，洗涤,抽干，获得Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-Ala-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同其余操纵以及工艺条件同上(5)制备Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(4)的Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-2-Me-Trp-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Coilidine反应40分钟(30°C~50°C),抽干，洗涤,抽干，获得Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;Fmoc-D-2-Me-Trp-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同其余操纵以及工艺条件同上(6)制备Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(5)的Fmoc-D隱2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D隱Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-His(Trt)-OH、HOBt、分析级的DMF、DIC、Collidine反应40分钟(30°C~50°C)，抽干，洗涤,抽干,获得Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2-3倍;下同其余操纵以及工艺条件同上(7)在步骤(6)的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe陽Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次,用无水乙醚抽干(用真空泵一直抽约半小时),树脂成很干的颗粒；(8)把抽干的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin倒入玻璃的茄型瓶，加入预冷-5t:-10'C的切肽试剂中(TFA/EDT/p-Cresol/DCN^80/2.5/2.5/15,体积比),20。C4(rC切肽反应2~3小时，过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，用乙醚反复洗涤6次，在室温，置干燥器中减压抽干(一般为58小时)，获得海沙瑞林粗品。切肽试剂中，树脂的浓度为8~12ml/g;按照本发明，粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤将海沙瑞林粗品溶于25。/。ACN水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种A:0.1%TFA+99.9%ACN;B:0.1%TFA+99.9%H2O;梯度22%~30%;流速为110ml/min;检测波长为220nm;用液相色谱仪跟踪所需要的流出液，样品峰合并后浓縮去ACN，转醋酸盐，浓縮小体积冻干，获得成品(MW:887.0)，总收率为46.73%(以树脂的mmol计)。本发明的有益效果是本发明的海沙瑞林合成工艺路线有以下特点具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，收率高，质量稳定，生产成本低，极具市场竞争力，每步接肽收率可以达到98%以上，降低了成本。本工艺采用温和的Fmoc路线，每步脱Fmoc仅用20。/。的PIP，每步縮合反应只要40分钟，大大縮短了生产周期，切割采用TFA，避免使用氟化氢，大大减少了三废，有利于工业化生产。前述过程中所釆用的原料中英文列表如下序号英文名中文名1PIP六氢吡啶2DICN，N-二异丙基碳化二亚胺3HOBt1-羟基-苯并-三氮唑<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例1(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin称取Fmoc-Linker-AMResinlg(Loadding:0.6mmol/g)倒入30ml接肽瓶，加入大约树脂15mlDCM，浸泡10分钟(常温)后用真空泵抽千，加入脱帽试剂10ml放入恒温振荡器反应5分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂10ml反应15分钟(30。C40。C)，用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，加入Fmoc-Lys(BOC)-OH0.702g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Comdine0.3ml反应40分钟(30°C~50°C),用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，抽干,获得Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin;(2)制备Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(l)的Fmoc-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂，3060。C反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂306(TC反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-Phe-OH0.581g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(30。C50。C),抽干，洗涤,抽干,获得Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操纵以及工艺条件同上；(3)制备Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(2)的Fmoc-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，，加入Fmoc-Trp(BOC)-OH0.790g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟G0。C50。C)，抽干，洗涤，，抽干,获得Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操纵以及工艺条件同上；(4)制备Fmoc-Ala-Tip(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(3)的Fmoc-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤,加入Fmoc-AIa-OH0.467g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟G0。C50。C),抽干，洗涤,抽干,获得Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操纵以及工艺条件同上(5)制备Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala隱Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(4)的Fmoc-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-D-2-Me陽Trp-OH0.635g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟(3(TC5(TC)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin;其余操纵以及工艺条件同上。(6)制备Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin在步骤(5)的Fmoc-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入Fmoc-His(Trt)-OH0.929g、HOBt0.337g、分析级的DMF8ml、DlC0.2ml、Collidine0.3ml反应40分钟G(TC5(TC)，抽干，洗涤，抽干，获得Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin其余操纵以及工艺条件同上(7)在步骤(6)的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，用无水乙醚抽干(用真空泵一直抽约半小时)，树脂成很干的颗粒，所述的树脂为Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin(8)把抽干的Fmoc-His(Trt)-D-2-Me-Trp-Ala-Trp(BOC)-D-Phe-Lys(Boc)-LinkerAMResin倒入25ml玻璃的茄型瓶,加入8ml预冷-5'C~-10°C的切肽试剂(TFA/EDT/p-Cresol/DCM-80/2.5/2.5/15,体积比)，20。C40。C切肽反应2~3小时，过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，用乙醚反复洗涤6次，在室温，置干燥器中减压抽干(一般为58小时)，获得海沙瑞林粗品0.520g。按照本发明，粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤将海沙瑞林粗品溶于25y。ACN水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种A:0.1%TFA+99.9%ACN;B:0.1%TFA+99.9%H2O;梯度22%~30%;流速为U0ml/min;检测波长为220nm;用液相色谱仪跟踪所需要的流出液，样品峰合并后浓缩去ACN，转醋酸盐，浓縮小体积冻干，获得成品0.243g(MW:887.0)，总收率为46.73%(以树脂的mmol计)。实施例2采用与实施例l相同的方法和工艺条件，其中以Fmoc-Linker-MBHAResin作起始原料，加入脱帽试剂3050°C反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，洗涤，加入Fmoc-氨基酸、分析级的DMF、Collidine、DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或HUTC/HOAt或TBTU/HOBt，反应40分钟，同实施例l操作，直止六肽接完。再经切割等反应，得到0.540g白色粉末产品。实施例3称取Fmoc-Linker-AMResin或Fmoc-Linker-MBHAResin50g(Loadding:0.7mmol/g)倒入600ml接肽瓶，加入脱帽试剂3050。C反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，洗涤，加入Fmoc-氨基酸、分析级的DMF、Collidine、DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt或TBTU/HOBt，反应40分钟，同实施例1操作，直止六肽接完。再经切割等反应，得到33g白色粉末产品。用HBTU/HOBt反应粗品纯度会好点。权利要求1、一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是包括如下步骤以芴甲氧羰酰基-Linker-氨甲基树脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氢胺树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有芴甲氧羰酰基保护的氨基酸，获的保护的六肽树脂，其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，用N，N-二异丙基碳化二亚胺/1-羟基-苯并-三氮唑、N，N-二异丙基碳化二亚胺/N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑、7-氮杂苯并唑-1-基-氧-(三-(二甲胺基)膦)六氟磷酸盐/1-羟基-苯并-三氮唑/N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯/N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑或6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基-苯并-三氮唑其中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的六肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得海沙瑞林粗品，并经C18色谱柱进行分离纯化，获得所说的海沙瑞林。2、根据权利要求1所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是获得的海沙瑞林再经过冷冻干燥，获得海沙瑞林醋酸盐或三氟乙酸盐产品。3、根据权利要求1所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护六肽树脂，其间依次脱去芴甲氧羰酰基保护基团，当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤选用芴甲氧羰酰基-Linker-氨甲基树脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氢胺树脂倒入接肽瓶，加入树脂2.5倍体积的二氯甲烷，常温浸泡10分钟后用真空泵抽干，加入脱帽试剂放入恒温振荡器反应5分钟，用真空泵抽干，重新加入脱帽剂3(TC4(TC反应15分钟，用真空泵抽干，用工业级的二甲基甲酰胺洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的二氯甲烷洗涤3次，加入芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、1-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3,5-三甲基吡啶3(TC50'C反应40分钟，用真空泵抽干，用工业级的DMF洗涤3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的二甲基甲酰胺洗涤3次,抽干,获得芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂。4、根据权利要求3所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是荷甲氧羰酰基-Linker-氨甲基树脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氢胺树脂的重量与脱帽试剂的加入量的比例为8-12ml/g，芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍，l-羟基-苯并-三氮唑的摩尔数为树脂的2-3倍，N，N-二异丙基碳化二亚胺的摩尔数为树脂的2-3倍;下同，芴甲氧羰酰基-Linker-氨甲基树脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氢胺树脂的重量与分析级的二甲基甲酰胺的加入量的比例为8-10ml/g，芴甲氧羰酰基-Linker-氨甲基树脂或芴甲氧羰酰基-Linker-4-甲苯氢胺树脂的重量与用工业级的二甲基甲酰胺、无水甲醇洗涤、重蒸过的二氯甲烷的加入量的比例为8-10ml/g。5、根据权利要求4所述的一固种相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤在芴甲氧羰基-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂，306(TC反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂306(TC反应15分钟，抽干，洗涤，加入芴甲氧羰基-D-苯氨酸、1-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3,5-三甲基吡啶3(rC5(TC反应40分钟，抽干，洗涤,抽干,获得芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，其中芴甲氧羰基-D-苯氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍。6、根据权利要求5所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤在芴甲氧羰基-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸、1-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3,5-三甲基吡啶30'C5(TC反应40分钟，抽干，洗涤，抽干，获得芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，其中芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍。7、根据权利要求6所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树，包括如下步骤在芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧幾基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入芴甲氧羰基-L-丙氨酸、1-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3,5-三甲基吡啶30。C5(TC反应40分钟，抽干，洗涤，抽干，获得芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，其中芴甲氧羰基-L-丙氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍。8、根据权利要求7所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤在芴甲氧羰基-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸、1-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3，5-三甲基吡啶3(TC5(TC反应40分钟，抽干，洗涤，抽干，获得芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，芴甲氧羰基-D-2-甲基-色氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍。9、根据权利要求8所述的一固种相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-L-组氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤在获得芴甲氧羰基-0-2-甲基-色氨酸丄-丙氨酸-^^-叔丁氧羰基-1_-色氨酸-0-苯氨酸-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂反应5分钟，抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，洗涤，加入芴甲氧羰基-L-组氨酸、l-羟基-苯并-三氮唑、分析级的二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基碳化二亚胺、2,3,5-三甲基吡啶3(TC5(TC反应40分钟，抽干，洗涤，抽干，获得芴甲氧羰基丄-组氨酸-0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，芴甲氧羰基-L-组氨酸的摩尔数为树脂的2-3倍。10、根据权利要求9所述的一种固相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是当所述的六肽树脂为芴甲氧羰基-L-组氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂，包括如下步骤在芴甲氧羰基-L-组氨酸-D-2-甲基-色氨酸-L-丙氨酸-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂中，加入脱帽试剂反应5分钟,抽干，重新加入脱帽剂反应15分钟，抽干，用工业级的DMF洗漆3次，无水甲醇洗涤3次，重蒸过的DCM洗涤3次，用无水乙醚抽干树脂成很干的颗粒，所得到的树脂为L-组氨酸_0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸,-^-叔丁氧羰基丄-色氨酸-0-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂。11、根据权利要求3—10所述的一固种相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是所说的脱帽试剂的组分和体积比为六氢吡啶二甲基甲酰胺=1:4。12、根据权利要求10所述的一固种相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是把抽干的1_-组氨酸-0-2-甲基-色氨酸-1_-丙氨酸-1^0叔丁氧羰基丄-色氨酸-0-苯氨酸-N-印silon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸-Linker氨甲基树脂倒入玻璃的茄型瓶，加入预冷-5'C-l(TC的切肽试剂中，切肽试剂中，树脂的浓度为8~12ml/g，切肽试剂其组分的体积比三氟乙酸/乙二硫醇/对甲苯酚/二氯甲烷=80/2.5/2.5/15，20。C40。C切肽反应2~3小时，过滤除去树脂，加乙醚沉淀，离心，用乙醚反复洗涤6次，在室温，置干燥器中减压抽干，获得海沙瑞林粗品。13、根据权利要求1所述的一固种相多肽合成海沙瑞林的方法，其特征是粗品经C18柱分离纯化的方法包括如下步骤:将海沙瑞林粗品溶于浓度为25。/。的乙腈水溶液中，过滤，滤液经C18色谱柱纯化，流动相有两种A:0.1%三氟乙酸加99.9%乙腈；B:0.1%三氟乙酸加99.9%水；梯度22%到30%;流速为每分钟110ml，检测波长为220nm，用液相色谱仪跟踪所需要的流出液，样品峰合并后浓縮去乙腈，转醋酸盐，浓縮小体积冻干，获得成品。全文摘要本发明涉及海沙瑞林的制备方法，主要解决现有合成方法存在的合成周期长、在合成中使用剧毒物的技术问题。一种相多肽合成海沙瑞林的方法，包括如下步骤以Fmoc-Linker-AM-Resin或Fmoc-Linker-MBHA-Resin为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，获的保护的六肽树脂，其间依次脱去Fmoc保护基团，用DIC/HOBt或DIC/HOAt或BOP/HOBt或BOP/HOAt或HBTU/HOBt或HBTU/HOAt或HATU/HOBt或HATU/HOAt或HCTU/HOBt其中的一种为缩合剂进行接肽反应，得保护的六肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得海沙瑞林粗品，并经C18色谱柱进行分离纯化，获得所说的海沙瑞林，再经过冷冻干燥，获得海沙瑞林醋酸盐或三氟乙酸盐产品。本发明可规模化生产海沙瑞林。文档编号C07K1/04GK101314612SQ20081004334公开日2008年12月3日申请日期2008年5月8日优先权日2008年5月8日发明者姜培娟,徐红岩,金健林申请人:吉尔生化(上海)有限公司