专利名称：一种提高烟草病毒抗性的方法
技术领域：
本发明属于植物抗病毒育种领域，具体而言，本发明涉及一种提高烟草 病毒抗性的方法。
技术背景美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein, PAP)属于类型I 单链核糖体灭活蛋白(ribosome-inactiviting protein, RIP) ， RIP蛋白 是位点特异的RNA N-糖苷酶，裂解真核生物核糖体28S rRNA和原核生物核 糖体23S rRNA Sarcin/ricin区域特殊腺嘌呤的N-糖苷键，使核糖体不能与 eEF-2-GTP复合体结合，导致mRNA不能翻译成蛋白质，抑制病毒在细胞内的 繁殖。Irvin (1975， 1980)首先从美洲商陆(尸/ yz^7acca叶片 中提取得到PAP，并研究报道了该蛋白广谱抗病毒特性，Lin等(1991 ) 、 Poyet 等(1994) 、 Poyet等(1997)和Park等(2002)分别从美洲商陆春叶、夏 叶、种子和根中克隆了 PAP、 PAP II、 PAP-S和PAP-H四种c腿。PAP原蛋 白由的N端结构域(22个氨基酸)、中心结构域(262个氨基酸)和C端 结构域(29个氨基酸)组成，其他类型的PAP结构类似，但各结构域氨基酸 数目和种类有较大差异。N端结构域主要起信号肽作用，将PAP定位在细胞 壁基质中；中心结构域含有4个在RIP中高度保守的活性催化残基，是PAP 活性的关键区域,而C端结构域，起着辅助N端信号肽细胞定位的作用，Ready 等(1986)研究指出，PAP抗病毒作用机理属于"局部自杀"模型，即PAP 与PAPII定位于美洲商陆细胞壁基质中，病毒感染时，PAP随病原体进入细 胞，将宿主细胞的核糖体灭活，导致感病细胞死亡，从而抑制病毒繁殖，使 相邻细胞不受感染。这个模型得到Bonness等(1994)研究的支持，并且Park 等(2002)也证实PAPH定位在根尖细胞壁基质。研究表明PAP具有与RIP 相似的抗病毒功能，能抑制动植物病毒和噬菌体活性，是广谱的抗病毒蛋白(Peumans等，2001)。例如，PAP抑制脊髓灰白质炎病毒(/Wio 、 流感病毒(i> /7ye"z<3 pa>iAs0 、单纯疱疹病毒(Zfei7 es 5^顺Je义WriAS加e/)、人类免役缺陷病毒(HIV-1)和噬菌体MS2活性，以及多种植物RNA
病毒和DNA病毒诸如黄瓜花叶病毒(0/c〃/z^er/mosaic kj'27as， CMV)、烟草 花叶病毒(7b力sccopa'/7/s, TMV)、马铃薯X病毒(尸"Wo kjV〃"， PVX)、马铃薯Y病毒(尸""o ^'ri/s r, PVY)、花椰菜花叶病毒(Ca^i/7ow^r /mosaic kj.r〃s， CaMV)、非洲木薯花叶病毒(爿/!rj'ca/7 cassara/mosaic h'ttas1， ACMV)、苜蓿花叶病毒(^/a7/a)msaic Wrys， AIMV)、烟草坏死病毒(7b/ acco"ecrOSJ.S rJ'27AS1， TNV)、 南方菜豆花口十病毒(5bwt/ e/v3 6ea/ /ff09<3_Z'C !^Z'27AS",SBMV)和芫箐花叶病毒(ri/27H》历M&'c Wr"s， TuMV)等。因此，PAP在医 药领域、植物抗病毒基因工程中具有很大的应用前景。迄今为止，己经获得烟草、马铃薯、匍茎翦股颖"Vros"^Wo7o7^/eT^)、 水稻和百合转/^權因的植株(Lodge等，1993; Tumer等，1997; Wang等，1998; 张海燕等，1998; Dai等，2003; Tabares等，2004;王燕萍等，2006;万多 荣等，2007)。但是，转基因植株程度不同地出现PAP细胞毒性症状和病毒抗 性不理想的结果，例如Lodge等(1993)和T匿r等(1997)报道，/^凍化频 率很低(0.7%)或不能得到转基因植株；即使得到转M權因的植株，该植株则表现出不育、矮化和枯斑等PAP产生的细胞毒性症状；接种病毒10天，转基因烟草对烟草花叶病毒的感染率从33% 100%不等，转基因马铃薯对马铃薯Y 病毒的感染率从14% 86%，但接种后随着生长时期延长，感染率增加。针对 降低PAP细胞毒性和提高转基因植株病毒抗性，在植物抗病毒研究中利用", 基因的技术特点为(1) 选择弱毒性的美洲商陆抗病毒蛋白基因如/^尸//。 Wang等(1998) 用W尸i7基因转化普通烟草，其转化率为5%，转基因植株表达PAP II蛋白量 至少比PAP蛋白高10倍，而且细胞毒性减弱。PAP H蛋白含量达到150ng/mg 蛋白才使转基因烟草叶片出现失绿中毒症状，含量低于100ng/mg蛋白以下转 基因烟草生长正常。但是，Dai等(2003)报道，在田间种植条件下，表达"尸 /顺转基因匍茎翦股颖(/^rOS"s "o7o/n'/era)植株死亡率很高，18株转 基因植株死亡ll株，发生较强的PAP II细胞毒性。(2) 诱导PAP序列突变。Tumer等(1997)诱导编码PAP成熟蛋白N端、C 端和活性中心的DNA序列碱基突变，结果表明C末端W237无义突变的PAP序列 导入烟草细胞，转化率提高到11%，转基因植株生长正常，具有一定的抗PVX
病毒能力，但随着感染后时间增加，抗病程度降低；N端突变仍然表现中毒症 状，虽然活性中心碱基突变的序列导入烟草细胞，转基因植株不表现PAP细胞 毒性，但其病毒抗性丧失。万多荣等(2007)诱导PAP信号肽氨基酸突变，将 信号肽修饰的M尸导入烟草细胞，虽然转基因植株抗病毒能力有所提高，但仍 然表现PAP细胞毒性症状。(3)利用损伤诱导型启动子，使转基因植株在受到机械或昆虫损伤时表 达PAP活性，避免正常生长条件下发生PAP细胞毒性。张海燕等(1998)将蛋 白酶抑制子II启动子驱动的/^尸cDNA导入甘蓝型油菜，转基因植株接种TuMV 病毒后表现出不同程度的抗性，但有的转基因植株发生叶片枯斑等PAP细胞毒 性症状。由此可见，现有利用/^/^因的技术并没有达到既消除PAP细胞毒性又提 高转基因植株病毒抗性的目的，限制了/^ 因在植物抗病毒基因工程中的应 用。发明内容本发明所要解决的技术问题在于克服现有利用美洲商陆抗病毒蛋白基因 技术中的不足，而提出一种利用"尸融合基因提高转基因烟草病毒抗性的方 法，即利用烟草病程蛋白-la信号肽将PAP成熟蛋白定位到细胞壁基质中的 功能，将编码烟草病程蛋白-la信号肽的DNA序列与编码PAP成熟蛋白的DNA 序列融合，人工合成W尸融合基因。将这种融合基因导入烟草细胞并获得转 基因植株，从转基因植株中筛选出病毒抗性强、很少或不表现PAP细胞毒性 的烟草植株。本发明有利于培育广谱抗病毒的烟草品种。本发明提供的技术方案是利用编码烟草病程相关蛋白-la信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒 蛋白成熟肽的DNA序列人工合成PAP融合基因，该融合基因的序列特征表示在 序列表所示的DNA序列中。其中，1 90bp为PR-la信号肽的DNA序列(GenBank 登录号D90196) ， 91 876 bp为PAP成熟蛋白的DNA序列(GenBank登录号 X55383);一种提高烟草病毒抗性的方法，包括以下步骤(1)通过反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增方法，克隆编码烟草 病程蛋白la基因(/W-h)和编码美洲商陆抗病毒蛋白基因(W尸)的cDNA 序列；(2) 利用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension)，用聚合酶链式反应(PCR)扩增的编码烟草病程蛋白la信号肽 的DNA序列和编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列，合成ZM尸融合基 因，并克隆W尸融合基因；(3) 将/^户融合基因的DNA片段连接到双元载体质粒pBI121，构建携 带"尸融合基因的植物表达载体；(4) 利用农杆菌介导的方法，将W尸融合基因导入烟草细胞，通过抗生 素筛选培养，诱导再生植株，遗传鉴定转基因植株；(5) 机械法将烟草花叶病毒(TMV)等病毒接种转基因植株叶片，选择 病毒抗性强、不表现细胞毒性的转基因植株。
具体实施方式
实施例一1.高保真PCR扩增/^辨Q/^-7a的cDNA序列(1) 合成第一链cDNA 用TMV感染10 15cm高的盆栽烟草品种K326叶片，4 6周后感病植物叶片表现明显症状，取感病幼叶提取mRNA;用美洲商陆完全伸展的夏季幼叶提取 mRNA。具体做法是，各取幼叶O. l克，在液氮中研磨成粉，使用Pharmacia公 司Quick Pr印Micro mRNA Purification Kit,按照试剂盒使用指南，提取 和纯化mRNA。然后，用第一链cDNA合成试剂盒(上海申能博彩公司)，按照 试剂盒使用指南，合成第一链cDNA。(2) PCR扩增/^堪因片段根据Lin等(1991)报道的/M堪因序列(GenBank登录号X55383. 1)设 计扩增PAP cDNA编码区序列且携带^a^ I和7朋 I酶切位点的正义引物和反义 引 物 ， 艮P 5， —GGATCCATGAAGTCGATGCTTGTGGT-3， 和5， -CCCGGGTCAGAATCCTTCAAATAGAT-3'。高保真PCR扩增在50 (xl体系中进行， 其中含/ /w聚合酶2 U，美洲商陆第一链cDNA约20 ng ， dNTP 200 pmol/L ， 引物浓度各为20 pmol/L和10Xp/"扩增缓冲液5 pl。扩增条件为94'C预变 性4分钟，然后94。C变性1分钟，55'C退火1分钟，72'C延伸2分钟，共30次循 环，最后在72'C下保温10分钟。(3) PCR扩增尸y -7a基因片段根据Cornelissen(1986)报道的/W-7a基因序列(GenBank登录号D90196) 设计扩增/^-cDNA编码区序列且携带万a/^ I和Jam I酶切位点的正义引物和 反 义 引 物， 艮卩 5， -GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3' 和 5， -CCCGGGTTAGTATGGACTTTCGCCTC-3，。以烟草第一链cDNA为模板，PCR扩增 /^-h基因片段，扩增反应体系和条件同本实例步骤l (2)。 2. /^權因和/^-7a基因的克隆扩增产物在含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶板中电泳，TAE电泳缓冲液，电压 4 V/cm。电泳后，在长波紫外光照下，快速切取只含DNA片段的凝胶。用3S 核酸纯化试剂盒(申能博彩公司)纯化PCR扩增片段。使用pGEM-T Easy试剂 盒(Promega公司)，按照试剂盒使用指南，将扩增的DNA片段连接到pGEM-T 载体，转化感受态大肠杆菌菌株JM109,在含有X-gal 80mg/L、 IPTG 100 mg/L 和氨苄青霉素IOO mg/L的LB培养基上培养。挑选白色菌落，以碱裂解法(金 冬雁，黎孟枫等译分子克隆实验指南，科学出版社，1992， P26)提取质粒。 在20ial反应体系中，加入质粒DNA 0. 1 fig， 10XfcoR I酶缓冲液2 nl与&oR I IOU， 37T:恒温水浴中酶切反应4小时。电泳酶切产物，鉴定携带含有插入 目的DNA片段的pGEM-T载体的JM109细胞克隆。将克隆的基因进行DNA序列测序(上海生工生物技术有限公司)后，分别与NCBI基因库中/M/^因和/W-7a基 因的序列比对，选择携带含有目的基因碱基序列正确的pGEM-T质粒的JM109 细胞克隆。 实施例二利用重叠区扩增基因拼接法合成编码/^-h信号肽的DNA序列与编码PAP 成熟肽的DNA序列合成融合基因。 (1) PCR扩增编码戶y -h信号肽的DNA片段正义引物和反义引物分别为5' -GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3'和 5， -CCCGGGAACATTGTAGATGATTGTGGCACGGCAAGAGTGG-3，，以携带尸y -h的质 粒为摸板，在50 nl体系中进行高保真PCR扩增。其中，含10Xp/^扩增缓冲
液5 pl， 质粒DNA 20 ng， dNTP 200 ,1/L ，引物20 ;rool/L和; /"i/聚合酶 2U。扩增条件为94。C预变性4分钟，然后94。C变性1分钟，55'C退火1分钟， 72t:延伸2分钟，共进行30次循环，最后在72'C下保温10分钟。PCR扩增产物 的电泳与纯化同实例一步骤2。(2) PCR扩增编码PAP成熟蛋白的DNA序列正 义 引 物和反义 引 物分 别 为 5， -TCCCACTCTTGCCGTGCCACAATCATCTACAATGTT-3, 和 5' -CCCGGGTCAAGTTGTCTGACAGCTCCC，以携带/^户的质粒为摸板，在50 jul体 系中进行高保真PCR扩增。其他步骤同本实例步骤(1)。(3) PCR扩增"/^合基因正义引物和反义引物分别为5， -GGATCCATGGGATTTGTTCTCTTT-3，和 5' -CCCGGGTCAAGTTGTCTGACAGCTCCC，以纯化的编码PR-la信号肽的DNA片段和 编码PAP成熟蛋白的DNA片段为摸板，在50 pl体系中进行高保真PCR扩增。其 他步骤同本实例步骤(1)。(4) "/f虫合基因克隆 W/14合基因克隆与酶切鉴定方法与实例一步骤2相同。将测序后的/^°融合基因序列，与NCBI基因库中/^-h信号肽相应序列和/^尸成熟肽相应序列 比对，选择携带含有目的基因片段碱基序列正确的pGEM-T质粒的JM109细胞克 隆。实施例三1.构建W/1虫合基因的植物表达载体 (1) "/I虫合基因DNA片段和线型双元载体质粒pBI121片段的纯化用Sa/sH I和&历I酶分别双酶切含有W顺合基因的pGEM-T载体质粒和双 元载体质粒pBI121。做法是，在20 pl反应体系中加入质粒DNA 0.5 ^g， 10 X5a/nH I反应缓冲液2 pl与^a/sH I 10 U， 37汇恒温水浴中酶切反应4小时。 然后，在反应液中加入无水乙醇40 pl，混匀，-20'C下放置30分钟，每分钟 12000转离心10分钟，弃溶液，17 Kil无菌水溶解DNA沉淀。在该DNA溶液中， 加入10XJ柳I反应缓冲液2 ial与J柳I 10 U (10U/ji1) ， 37。C水浴中酶切 反应4小时。电泳酶切产物，用手术刀切取琼脂糖凝胶中的W/f虫合基因条带 和线型双元载体质粒pBI121条带，用3S核酸纯化试剂盒(申能博彩公司)分 别纯化这两种DNA条带。(2) Z^/ii合基因与双元载体pBI121质粒连接与克隆在10 iLil连接反应体系中，加入2XT4DNA连接酶缓冲液5 pl ， /Wf虫合 基因片段3 pl，质粒pBI121 1 pl和T4 DNA连接酶1 pl ， 4'C下连接过夜。用 连接转化产物3 pl与大肠杆菌菌株JM109感受态细胞50 pl混合，将转化处理 的大肠杆菌菌株JM109细胞涂布在含有卡那霉素100 mg/L的LB培养基上，培养 过夜。选取单菌落，碱裂解法提取质粒，按照本实例步骤l (1)方法，用"sW I和Xa历I酶双酶切，然后进行电泳，观察电泳后琼脂糖凝胶中双酶切产物出 现的/^/l虫合基因的DNA片段，以此确定携带含有/^/^合基因的pBI121质粒的 JM109细胞克隆。(3) 农杆菌LBA4404的遗传转化 用携带/^/f虫合基因的pBI121质粒0. 1 ng与农杆菌LBA4404感受态细胞混合，冻融法转化农杆菌。转化处理后的农杆菌在含有利福平80 mg/L与卡那霉 素100mg/L的YEB培养基上培养24 48小时，选取单菌落，碱裂解法微量提取 质粒，用Sa/nHI和^fe/z/I酶双酶切(方法同本实例步骤l (1))，电泳酶切产 物，观察琼脂糖凝胶中酶切产物的/^ 合基因片段，鉴定携带含有/M/f虫合 基因的pBI121质粒的农杆菌菌落。 2.烟草叶片的遗传转化(1) 农杆菌的培养YEB培养基中过夜培养农杆菌，取菌液2ml，加入到20 ml同一培养基 中，在28X:、每分钟180转的条件下震荡培养6小时左右，用分光光度计检 测菌液浓度为0D6Q()=0. 2 0. 5时，用于烟草叶片细胞的遗传转化。(2) 烟草叶片外植体表面消毒取烟草K326品种3月龄植株上完全伸展的幼叶，用自来水洗净晾干。在 超净工作台上，将叶片放入无菌烧杯中，用70%酒精浸泡叶片30秒，然后 用0. 1%氯化汞对叶片表面消毒6分钟，无菌水清洗5次，每次在无菌水中 停留5分钟。在表面消毒与清洗过程中，需要间歇地摇动烧杯，使叶片表面 消毒与清洗彻底。然后，将无菌叶片剪切成0.5 1.0 cm2大小，用于感染农 杆菌。(3) 农杆菌感染烟草叶片外植体将烟草叶外植体放入0D6。。=0. 2 0. 5的菌液中，在每分钟80转的摇床上 震荡感染10分钟。然后，在超净工作台内，用无菌滤纸上吸除叶外植体上多 余的菌液后，将叶片接种在MS共培养基(MS基本培养基+萘乙酸0.02 mg /L + 6-苄氨基腺嘌啉0.2 mg/L + 3%蔗糖+ 0.6%琼脂，pH二5.8)上，在 26土rC、黑暗条件下共培养3天。(4) 筛选抗性愈伤组织与诱导植株再生 将共培养后的叶片转移到MS筛选培养基(MS基本培养基+萘乙酸0. 02mg / L + 6-苄氨基腺嘌啉0. 2 mg / L +羧苄青霉素100 mg/L +卡那霉素80 mg/L + 3%蔗糖+ 0.6%琼脂，pH=5.8)上。每隔3 4天将培养叶外植体转 移到同一新配制的培养基上。培养条件为，光照2000 lx，温度25。C。经过 3 4周的培养后，从叶外植体边缘个别部位形成小愈伤组织，再经过1 2 周培养，从愈伤组织上分化出不定芽。卡那霉素抗性的无菌苗生长到2 cm 左右长时，将无菌苗从茎基部切离，转移到MS生根培养基U/2大量元素浓 度的MS基本培养基+萘乙酸O.Ol mg/L +羧苄青霉素100 mg/L +卡那霉 素80 mg/L + 1%蔗糖+ 0.6%琼脂，pH=5.8)中诱导生根，培养条件同上。 IO天后，从无菌苗茎基部产生多条幼根。根长达到l 2cm长后，取出生根 苗，小心清除抗性苗根系的琼脂，移栽到土壤中。移栽初期，用塑料薄膜遮 盖，保持相对湿度90%以上，温度20 25'C。移栽苗恢复生长后，逐步降低 相对湿度，直到与自然环境的相对湿度一致。 3.转基因植株的鉴定与^ 合基因的表达分析 (1) PCR扩增鉴定转基因植株。取抗生素抗性的植株幼叶O. lg，在液氮中快速研磨成粉，迅速转入预冷 的1.5 ml离心管中，立即加入65。C预热的2X十六烷基三甲基溴化氨(CTAB) 提取缓冲液O. 5ml，在65T:水浴中提取30分钟。然后，加入等量的氯仿/异 戊醇(24:1)，来回颠倒抽提。每分钟12000转离心10分钟。取上清液0.4ml， 加入-20'C预冷的异丙醇0.8 ml，来回颠倒混匀，溶液中出现丝状DNA物质。 挑出丝状DNA物质，用76%乙醇(含IO mmol/L乙酸铵)漂洗20分钟后，稍 微干燥，用O. 5 ml TE缓冲液溶解。进一步纯化DNA的步骤与Williams等 (1990)描述的相同(Nucleic Acids Res. 18: 6531 - 6535， 1990)。 用两种DNA序列的PCR扩增片段鉴定转基因植株， 一种是II基因的 DNA片段，其正义和反义引物分别是5， -CCGACCTGTCCGGTGCCC-3'和 5， -CCGCCACACCCAGCCGGCC-3'，扩增产物大小为495 bp;另一种是35S启 动子片段，其正义和反义引物分别是5， -CACAGATGGTTAGAGAGGCT-3，和 5' -TTACGGCGAGTTCTGTTAGG-3'，扩增产物大小为315 bp。在50 |iil PCR扩 增体系中，各加入叶片总DNA lOOng， TagDNA聚合酶3U, dNTP 200 |umol/L， 正义和反义引物浓度各为20 pmol/L， lOXTag DNA酶缓冲液5 pl，超纯水 补足到50 pl。扩增条件为94'C预变性4分钟，然后94'C变性1分钟，55°C 退火1分钟，72'C延伸2分钟，共进行35个循环，最后72'C保温IO分钟。 同时，用携带"P融合基因的植物表达载体质粒和非转基因植株叶片总DNA 为模板，分别作为阳性和阴性对照，在同样条件下进行PCR扩增。扩增产物 在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，TAE电泳缓冲液，电压4V/cm。通 过凝胶成像仪观察电泳结果，阳性对照和转基因植株的PCR产物出现495 bp 和315 bp大小的DNA条带，而阴性对照无这些DNA条带。 (2) RT-PCR半定量分析/W^融合基因的表达取转基因植株上完全展开的幼叶0.1 g,于液氮中充分研磨成粉，使用 植物RNA提取试剂盒(普利莱公司，按说明书进行实验操作)提取转基因植 株叶肉细胞总RNA。在含有总RNA的100 pl体系中加入DNase 2 U， 37。C温 浴10分钟，消除RNA中的微量DNA。利用第一链cDNA合成试剂盒(上海申 能博彩生物技术公司，按试剂盒说明书操作)合成第一链cDNA。以烟草延长因子-la (EF-1a) (GenBank登录号D63396)转录产物为 内参，其 PCR 扩增的正义和反义引物分别是 5， -TCACATCAACATTGTGGTCATTGGC-3， 和 5， -TTGATCTGGTCAAGAGCCTCAAG-3，。从第一链cDNA得到的PCR扩增产物大 小为654bp。 PCR扩增W尸融合基因编码成熟蛋白序列，所设计的正义引物和 反 义 引 物 分 别 是 5， -GGTTATTCTGATCCCTTTGA-3' 和 5， -TCTTACCCCATGTCTCTTGC-3'，从第一链cDNA得到的PCR扩增产物大小为 409 bp。在50 |ul PCR扩增体系中，加入模板cDNA 100 ng, Tag DNA聚合 酶3U， dNTP 200 |nmol/L，正义和反义引物浓度各为20 pmol/L, lOXTagDNA 酶缓冲液5 pl，超纯水补足到50 )il。扩增条件是，94'C预变性4分钟，然 后94。C变性30秒、55。C退火30秒、72。C延伸45秒，共30个循环；最后在 72'C延伸7分钟。在各样品^F-7a的PCR扩增产物水平基本一致的条件下， 根据不同样品中PCR扩增/^尸融合基因片段的电泳观察结果，确定转基因植 株的W尸融合基因是否表达，以及/^尸融合基因表达的强弱。将PAP融合基 因表达的转基因植株按本实例步骤4的方法检测病毒抗性。 4.转基因植株的病毒抗性取4'C下干燥保存、携带TMV的烟草叶片20mg，置于玻璃研钵中，加入 0. 1 mol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0) 2 ml，研磨成匀浆，制备TMV病毒溶液。 加入少许400目的石英砂与病毒液混匀。以盆栽中新生长5 7叶的烟草转基 因和非转基因植株为材料，用玻璃棒蘸取病毒液，轻轻摩擦叶片表面，接种 病毒。同时接种其他病毒的方法同上。接种病毒后20天，定期观察记录植株 系统感病症状，选择没有或轻度表现TMV等病毒系统感染症状，且生长发育 正常，没有PAP细胞毒性表现的转基因植株，将其作为病毒抗性的育种材料， 用于培育广谱抗病毒的烟草。实施例中使用的培养基与缓冲液(1) TAE电极缓冲液(100 ml的50倍贮存液)Tris， 24.2 g;冰乙酸，5.7 ml; EDTA， 10 ml 0.5 mol/L (pH8.0);(2) LB培养基胰蛋白，5 g/L;酵母提取物，10 g/L; NaCl， 10 g/L; pH， 7.0;(3) YEB液体培养基蛋白胨，5 g/L;酵母提取物，10 g/L;牛肉膏，5 g/L;蔗糖，5 g/L;MgS04， 0.495 g/L; pH, 7.0;(4) MS基本培养基 大量元素成分KNO" 1900 mg/L; NH4N03， 1650 mg/L; CaCl2* 2H20， 440 mg/L; MgS04 7H20， 370 mg/L; KH2P04， 170 mg/L;
微量元素成分FeS04'7H20， 27. 8 mg/L; KI， 0. 83 mg/L; H3B03， 6. 2 mg/L; MnS04 4H20， 22. 3 mg/L; ZnS04'7H20， 8. 6 mg/L; Na2Mo04 2H20， 0. 25 mg/L; CuS04 5H20， 0. 025 mg/L; CoCl2 6H20， 0. 025 mg/L;有机营养成分肌醇，100 mg/L;烟酸，0.5 mg/L;盐酸吡哆醇，0.5 mg/L;盐酸硫胺 素，0. 1 mg/L;甘氨酸，2.0 mg/L;(5) 2X十六院基三甲基溴化氨(CTAB)提取缓冲液Tris-HCl， lOOmmol/L (pH8. 0) ; CTAB, 2% (w/v) ; NaCl， 1.4mol/L; (3-巯基乙醇，40 mmol/L; EDTA， 20 mmol/L;(6) TE缓冲液:Tris-HCl， 10画1/L (pH， 7.4) ; EDTA， 1 mmol/L;
序列表〈110〉北京师范大学<120> —种提高烟草病毒抗性的方法〈130> 1234〈160〉 2〈170〉 Patentln version 3.3〈210〉 1〈211〉 876〈212〉 薩<213〉 美洲l商陆(Phytolacca americana) 〈220〉〈221〉 CDS<222〉 (1)..(876) 〈220〉〈221〉 sig—peptide<222> (1)..(90) 〈220〉〈221〉 mat一p印tide〈222〉 (91亍..(876)〈400〉 1atg gga ttt gtt etc ttt tea caa ttg cct tea ttt ctt ctt gtc tct 48 Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser -30 -25 -20 -15aca ctt etc tta ttc eta gta ata tec cac tct tgc cgt gcc gtg aat 96 Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val lie Ser His Ser Cys Arg Ala Val Asn-10 -5 -l 1aca ate ate tac aat gtt gga agt acc acc att age aaa tac gcc act 144 Thr lie lie Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr lie Ser Lys Tyr Ala Thr 5 10 15ttt ctg aat gat ctt cgt aat gaa gcg aaa gat cca agt tta aaa tgc 192 Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys 20 25 30tat gga ata cca atg ctg ccc aat aca aat aca aat cca aag tac gtg 240
Tyr Gly lie Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Tyr Val 35 40 45 50ttg gtt gag etc caa ggt tea aat a犯aaa acc ate aca eta atg ctg 288 Leu Val Glu Leu Gin Gly Ser Asn Lys Lys Thr lie Thr Leu Met Leu55 60 65aga cga aac aat ttg tat gtg atg ggt tat tct gat ccc ttt gaa acc 336 Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Glu Thr 70 75 80aat aaa tgt cgt tac cat ate ttt aat gat ate tea ggt act gaa cgc 384 Asn Lys Cys Arg Tyr His lie Phe Asn Asp lie Ser Gly Thr Glu Arg 85 90 95caa gat gta gag act act ctt tgc cca aat gcc aat tct cgt gtt agt 432 Gin Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn Ser Arg Val Ser 100 105 110aaa aac ata aac ttt gat agt cga tat cca aca ttg gaa tea aaa gcg 480 Lys Asn lie Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu Glu Ser Lys Ala 115 120 125 130gga gta aaa tea aga agt caa gtc caa ctg gga att caa ata etc gac 528 Gly Val Lys Ser Arg Ser Gin Val Gin Leu Gly lie Gin lie Leu Asp135 140 145agt aat att gga aag att tct gga gtg atg tea ttc act gag aaa acc 576 Ser Asn lie Gly Lys lie Ser Gly Val Met Ser Phe Thr Glu Lys Thr 150 155 160gaa gcc gaa ttc eta ttg gta gcc ata caa atg gta tea gag gca gca 624 Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala lie Gin Met Val Ser Glu Ala Ala 165 170 175aga ttc aag' tac ata gag aat cag gtg aaa act aat ttt aac aga gca 672 Arg Phe Lys Tyr lie Glu Asn Gin Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala 180 185 190 ttc aac cct aat ccc asia gta ctt giat ttg caa gag aca tgg ggt aag 720 Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gin Glu Thr Trp Gly Lys 195 200 205 210att tea aca gca att cat gat gcc aag aat gga gtt tta ccc aaa cct 768 lie Ser Thr Ala lie His Asp Ala Lys Asn Gly Val Leu Pro Lys Pro215 220 225etc gag eta gtg gat gcc agt ggt gcc aag tgg ata gtg ttg柳gtg 816 Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp lie Val Leu Arg Val 230 235 240gat gaa ate aag cct gat gta gca etc tta aac tac gtt ggt ggg age 864 Asp Glu lie Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr Val Gly Gly Ser 245 250 255Tgt cag aca act 876 Cys Gin Thr Thr 260〈210〉 2 <211> 292 〈212〉 PRT<213> 美洲l商陆(Phytolacca americana) 〈400〉 2Met Gly Phe Val Leu -30Thr Leu Leu Leu Phe-10Thr lie lie Tyr Asn 5Phe Leu Asn Asp Leu 20Tyr Gly lie Pro Met16Phe Ser Gin Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser -25 -20 -15Leu Val lie Ser His Ser Cys Arg Ala Val Asn-5 -l 1Val Gly Ser Thr Thr lie Ser Lys Tyr Ala Thr 10 15Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys 25 30Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Tyr Val35404550Leu Val Glu Leu Gin Gly Ser Asn Lys Lys Thr lie Thr Leu Met Leu55 60 65Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Glu Thr 70 75 80Asn Lys Cys Arg Tyr His lie Phe Asn Asp lie Ser Gly Thr Glu Arg 85 90 95Gin Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn Ser Arg Val Ser 100 105 110Lys Asn lie Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu Glu Ser Lys Ala 115 120 125 130Gly Val Lys Ser Arg Ser Gin Val Gin Leu Gly lie Gin lie Leu Asp135 140 145Ser Asn lie Gly Lys lie Ser Gly Val Met Ser Phe Thr Glu Lys Thr 150 155 160Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala lie Gin Met Val Ser Glu Ala Ala 165 170 175Arg Phe Lys Tyr lie Glu Asn Gin Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala 180 185 190Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gin Glu Thr Trp Gly Lys 195 200 205 210lie Ser Thr Ala lie His Asp Ala Lys Asn Gly Val Leu Pro Lys Pro215 220 225Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp lie Val Leu Arg Val 230 235 240Asp Glu lie Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr Val Gly Gly Ser245250255Cys Gin Thr Thr 260
权利要求
1、一种由编码烟草病程蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列组成的PAP融合基因，它编码序列表SEQ NO2所示的氨基酸序列。
2、 根据权利要求1所述的融合基因编码的多肽，它是由序列表SEQNO: 1 所示的DNA序列编码的。
3、 含有权利要求2所述的融合基因的植物表达载体。
4、 根据权利要求3所述的植物表达载体，它含有编码烟草病程蛋白-la信 号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽的DNA序列组成的融合 基因。
5、 含有权利要求2所述的融合基因的转基因植物。
6、 根据权利要求5所述的植物是普通烟草dco"'a朋z^力ac"/z )。
全文摘要
本发明公开了一种提高烟草病毒抗性的方法。提高烟草病毒抗性的方法包括人工合成由编码烟草病程蛋白-1a信号肽的DNA序列与编码美洲商陆抗病毒蛋白成熟肽(PAP)的DNA序列组成的PAP融合基因，用这种融合基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导将PAP融合基因导入烟草细胞，在筛选培养基上筛选抗性愈伤组织和诱导再生植株，利用分子生物学方法鉴定转基因植株，通过病毒攻毒试验，可筛选病毒抗性强、生长发育正常的转基因植株。本发明能克服利用野生型美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化烟草后，转基因烟草出现PAP细胞毒性与病毒抗性提高不大的缺陷，有助于培育广谱抗病毒的烟草品种。
文档编号C07K19/00GK101397569SQ20081018061
公开日2009年4月1日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者肖尊安 申请人:北京师范大学