哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的截短变体的制作方法

专利名称：哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的截短变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶标(mTOR)蛋白的截短变体。
背景技术：
哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)为丝氨酸/苏氨酸激酶，其属于PI3K相关激酶大 家族，该家族还包括DNA依赖性蛋白激酶ATM和ATR。生物化学和遗传学研究证明，mTOR将 生长因子刺激、能量和营养有效性结合在一起，以调节负责细胞生长、细胞大小和细胞周期 进程的生物合成过程。最近十年一直在广泛研究响应各种胞外信号的mTOR激酶活性调节 作用。大量具有各种酶活性、支架功能和连接功能(adaptor function)的细胞蛋白参与对 mTOR活性进行信号传导并调节mTOR活性，这些蛋白包括蛋白激酶PKB/Akt和AMPK、肿瘤抑 制剂PTEN和结节性硬化复合体TSC1/2、小GTP-结合蛋白Rheb、支架蛋白Raptor和Rictor。 mTOR处于活化状态时，通过使主要下游靶标例如S6K、4E-BP1和PKB/Akt磷酸化来转导信号 和代谢信息。不同实验室的研究指出，存在两种功能上不同的mTOR复合体，称为mTOR复合 体1 (mTORCl)和mT0RC2。mTORCl含有核心组分mT0R、raptor和mLST8/G L,并对雷帕霉素 敏感。mT0RC2被认为对雷帕霉素不敏感，并含有mTOR、Rictor和mLST8/G L。目前在大量 临床试验中评价雷帕霉素及其类似物为抗癌药物。另外，雷帕霉素被广泛用于涂覆支架，以 在冠状动脉成形术后减少装支架后再狭窄。与具有两个TOR基因的酵母菌相反，哺乳动物 只具有一个基因，已知其编码分子量大约280kDa的单一多肽。mTOR的一个重要的下游靶标为S6K。S6激酶(p70S6激酶(p70S6k))负责核糖体 S6蛋白的S6磷酸化，S6蛋白是真核核糖体(即负责mRNA翻译和蛋白质合成的细胞器) 的40S亚单位的组分。S6K还被认为是哺乳动物细胞中主要的生理学上的S6激酶(Proud， 1996 Trends Biochem. Sci. 21 181-185)。40S核糖体蛋白S6是真核核糖体的40S亚单位 的组分。S6蛋白因响应某些细胞信号传导事件而被磷酸化，这些事件例如有激素或生长因 子诱导的细胞增殖。S6激酶受到多种生长因子例如胰岛素和促细胞分裂原激活(Alessi等，1998 Curr. Biol. 8 :69_81)。业已确定出调节S6激酶活性的某些药物，其中包括雷帕霉素，雷帕 霉素是S6激酶的最有效的抑制剂(Pullen等，1997 FEBS Letters 410 :78_82)。美国专利 第6，830，909号公开了 S6激酶α和S6激酶β的结构和某些功能，该专利以其整体在此 引作参考。已显示S6激酶既被磷酸化也被乙酰化。研究发现S6激酶蛋白可通过ρ300和P/ CAF乙酰转移酶在体内和体外乙酰化。更准确地说，在S6K乙酰化作用提高(即存在HDAC 抑制剂/过量表达Ρ300)的条件下，S6激酶活性和412磷酸化作用降低。P-环赖氨酸突 变(由Ρ300在体外乙酰化)为谷氨酰胺(模拟乙酰化作用)，能导致S6K完全失活和412 磷酸化失败。还证明S6K2(S6Ki3)具有AT-hook DNA结合基序。因此，S6激酶2蛋白结合 DNA并藉此被活化，进而刺激其激酶活性。因此，S6K2被认为因响应促细胞分裂原和营养素 而转导促生长作用。当S6K2与DNA形成复合体并由该相互作用激活时，可涉及通过磷酸化
4作用调节转录因子和/或染色质重建蛋白。S6激酶蛋白活性的调节及相关方法公开于WO 2007/019421，该专利以其整体在此引作参考。发明简述本发明涉及最近发现的mTOR的剪接形式，称作mT0Ri3。具体而言，本发明提供使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化的分离的多肽，所述多肽选自(a)包含SEQ ID NO 2氨基酸序列的分离的多肽；(b)包含与SEQ ID NO :2氨基酸序列具有至少75%序列同一性的氨基酸序列的分 离的多肽；和(C)包含由SEQ ID NO 1编码的氨基酸序列的分离的多肽。本发明还提供-选自以下的分离的多核苷酸(a)编码本发明多肽的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO 1核苷酸序列或其互补体的多核苷酸；(c)包含与SEQ ID No 1的完整邻接序列具有至少80%序列同一性并且编码使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白的多核苷酸；和(d)与SEQ ID NO 1核苷酸序列或其互补体在68°C采用0. IXSSC条件下杂交的 分离的核酸分子，该核酸分子编码使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白。-包含本发明多核苷酸的载体。-包含本发明多肽、本发明多核苷酸或本发明载体的宿主细胞。-特异性结合本发明多肽的分离的抗体。-用于制备多肽的方法，该方法包括在表达本发明多肽或表达由本发明多核苷酸 编码的多肽的条件下培养本发明宿主细胞。-筛选调节rnTORii活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤(a)使本发明多肽与测试作用剂接触；和(b)检测所述多肽活性的任何变化，其中活性变化表明作用剂能够调节mT0Ri3活性。-筛选调节mT0Ri3表达和/或活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤(a)提供权利要求5的宿主细胞，该细胞包含或表达本发明多肽或由本发明多核 苷酸编码的多肽；(b)使所述宿主细胞与测试作用剂接触；和(c)检测所述多肽表达和/或活性的任何变化，其中表达和/或活性变化表明作用 剂能够调节mT0Ri3表达和/或活性。-治疗与本发明多肽异常表达有关的疾病的方法，该方法包括将有效量的作用剂 给予需要治疗的对象，其中所述作用剂改变所述多肽的活性和/或表达。_用于治疗所述多肽表达异常相关疾病的改变本发明多肽活性和/或表达的作用 剂。附图
简述fil显示用C-末端和Fll抗mTOR抗体在大鼠组织中进行的mTOR表达的蛋白印 迹分析。通过SDS-PAGE分离大鼠组织的蛋白提取物(30 μ g)，转移到PVDF膜上，并用来自多克隆抗体探测(上图)。然后剥洗(strip)该膜，用抗 肌动蛋白抗体重新探测(下图)。Ml显示在人组织中mTOR表达的RNA印迹分析。剥洗印迹，重新探测β肌动蛋 白的表达(下图)。Ml显示用C-末端抗mTOR抗体对来自H印2G、Hek293和MCF7细胞的mTOR β进 行的免疫沉淀。用C-末端抗mTOR抗体(CellSignaling)与H印2G、Hek293和MCF7细胞的 裂解液进行免疫沉淀，并用N-末端抗mTOR抗体(Santa Cruz)在蛋白印迹中探测免疫复合 体。Mi显示通过PCR对人细胞系中潜在的mTOR剪接变体进行的鉴定。图4A显示来 自H印2G、HEK293和MCF7的总RNA和mTOR β RNA的琼脂糖凝胶。纯化了来自H印2G、HEK293 和MCF7细胞系的总RNA，并将其转换为第一链DNA。将一组mTOR特异性引物用于PCR反应 中，以搜寻潜在的剪接变体。在2%琼脂糖凝胶中电泳分离所扩增的片段。从凝胶上切下最 显著的条带，进行序列分析。一组引物(m和C3)从三种细胞系中都一致地扩增得到IOObp 的片段。扩增了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)和β肌动蛋白特定片段，将其用作第一链 DNA的加样和质量对照。图4Β显示用附和C3mT0R特异性引物扩增的IOObp PCR片段的 序列比对。对所扩增得片段进行测序，由Clustal W程序进行比对。由箭头指出潜在剪接 融合的位置。图4C显示用附和C3mT0R特异性引物扩增的IOObp PCR产物的氨基酸序列。 箭头指出潜在剪接融合的位置。在对应于mTOR的N-末端区和FATN结构域的序列下面画 线。■显示全长mTORa和mT0Ri3剪接同等型(isoform)的结构域组织。指出了 各个结构域位置，包括其氨基酸位置。指出了对应于抗mTOR抗体的表位的地点。在介导 已知的mTOR结合配偶体相互作用的区域下画线。有20个37-43个氨基酸的HEAT基序 (Huntingtin、EF3、PP2A的A亚单位和Tor)，每一个都参与蛋白间的相互作用。HEAT18和 19足以将mTOR靶向内质网或高尔基体。mTOR经由这些HEAT区域二聚体化。FAT结构域= FRAP/ATM/TRAPP ；FATN = FAT结构域N-末端；FATC = FAT结构域的C-末端。发现FATC结 构域对于mTOR激酶活性和功能必不可少。FRB(FKBP12-雷帕霉素结合)结构域是保守的 IlkDa区域，是FKBP12-雷帕霉素结合的充分必要区域。KD =激酶结构域，认为其是PI3K 相关结构域。RD =调节结构域。_显示mTOR0因响应血清刺激而在与完整mTOR α氨基酸序列的Ser2448对应 的丝氨酸残基处被磷酸化，并在体外激酶测定中使S6K1和4E-BP1磷酸化。图6A显示用 pcDNA 3. ImTOR β转染后表达mTOR β的细胞的凝胶。用pcDNA3. 1或pcDNA 3. Im TOR β转 染ΗΕΚ293细胞。一天后，让细胞饥饿24小时，然后用10%胎牛血清刺激1小时。在刺激前 30分钟加入雷帕霉素(IOnM)。裂解细胞，通过SDS-PAGE分离，并用C-末端抗mTOR抗体和 抗pS2448mT0R抗体进行免疫印迹。图6B显示mTOR体外激酶测定的结果。用pcDNA3. 1、 pcDNA 3. l/FLAG-mT0R^ 或 pcDNA 3. l/FLAG-mTORa 转染 HEK293 细胞。两天后，裂解细胞， 用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。在mTOR体外激酶测定中使用免疫复合体，且用His-4E_BP1 和His-S6K1C作为底物。通过SDS-PAGE分离激酶反应物，用针对4E-BP1 p65和S6Klp389 的磷酸化特异性抗体(phosphospecific antibody)进行免疫印迹。通过用抗FLAG抗体进 行的蛋白印迹测量免疫沉淀的FLAG-mTORa和FLAG-mT0Ri3的水平。
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ΜΛ显示mTORP与Raptor、Rictor和G β L的特异性相互作用。用 pcDNA3. 1-mTOR β -FLAG 和 pRK-Raptor-HA 或 pcDNA3. l-mTOR β -FLAG 和 pRK-Rictor-Myc 或 pcDNA3. 1-mTOR β -FLAG和pcRK_G β L转染HEK293细胞。用抗FLAG抗体或对照非特异性抗 体对所裂解的细胞上清液进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分离免疫复合体或来自转染细胞 的总细胞裂解液(15 μ g)，并在蛋白印迹中用抗HA、抗Rictor或抗G β L抗体探测。Ml显示，与mTORa比较，mTOR0对雷帕霉素敏感性更低。用pcDNA3. 1、pcDNA 3. ImTOR^或pcDNA 3. ImTOR α转染HEK293细胞。一天后，让细胞饥饿24小时，然后用10% 血清刺激1小时。在刺激前30分钟加入各种浓度的雷帕霉素。裂解细胞，由SDS-PAGE分 离，并用C-末端mTOR抗体、抗肌动蛋白抗体和不同的磷酸化特异性抗体进行免疫印迹。Ml显示mTOR0的亚细胞定位。用ProteoExstract提取试剂盒(Calbiochem)分 级分离指数生长的HEK293细胞。用抗mTOR C-末端抗体从所有分离物中免疫沉淀mTOR α 和mTOR β，通过SDS-PAGE分离免疫复合体，并用抗mTOR N-末端抗体进行免疫印迹。将抗 4EBP1抗体、抗HSP60抗体和抗c-Jim抗体分别用作细胞质、细胞膜和细胞核分离物的对照。Mi^显示mT0Ri3而非HiTORa的过量表达诱导细胞增殖。将过量表达 mTOR β wt (野生型)、mTORa wt或EGFP的Hek293稳定细胞系以不同密度(每孔250、500、 1000和2000个细胞)接种到96孔板，在标准条件下培养7天。随后通过基于刃天青的测 定来测量各孔的细胞数目。用来自6个独立实验的数据计算各细胞系的标准化的生长曲线
(A)。用针对c-myc及其转录靶标的抗体进行稳定细胞系的总细胞裂解液的蛋白印迹分析
(B)。光密度测量蛋白水平，以肌动蛋白标准化，计算相对于表达EGFP的稳定细胞系的倍数
(C)。fill显示诱导增殖需要mTOR β激酶活性。将过量表达mTOR β wt、无激酶活性的 mTOR β或EGFP的Hek293稳定细胞系以不同密度(每孔1000、2000、4000和8000个细胞) 接种到96孔板，在标准条件下培养5天。随后通过基于刃天青的测定来测量各孔的细胞数 目。用来自6个独立实验的数据计算各细胞系的标准化生长曲线(A)。用针对c-myc及其 转录靶标的抗体进行稳定细胞系的总细胞裂解液的蛋白印迹分析。光密度测量蛋白水平， 以肌动蛋白标准化，并计算相对于表达EGFP的稳定细胞系的倍数(B)。fill显示mT0Ri3对细胞周期Gl的进展至关重要。用BrdU对稳定过量表达 mTOR β ,mTOR α或EGFP的HEK293细胞进行脉冲标记30分钟，在24小时内每2小时追踪一 次。通过FACS分析测量掺入的BrdU。图表表示对各个细胞系所观察到的细胞周期的G1、 S和G2期的持续时间(duration)。标准差，ρ = 0. 05。Sl^显示mT0Ri3的过量表达保护细胞免遭饥饿诱导的细胞死亡(A)。mTOR β 激酶活性为介导促存活作用(pro-survival effect)所需(B)。将过量表达mTOR β wt、 mTOR α wt、无激酶活性的mTOR β或EGFP的Hek293稳定细胞系血清饥饿60小时。通过锥 虫蓝染料排除测定法评估细胞存活率。数据为5个实验的平均值士SE。*P值<0.01。Sli显示mTOR β过量表达导致细胞致癌可能性增加。将稳定过量表达mTOR β、 mTOR α或EGFP的ΗΕΚ293细胞铺板在培养基中的薄层琼脂糖上。14天后，用MTT对染色 (A)。用Quantity One软件(Bio-Rad)计集落数，并用倍数作图(B)。数据为4个实验的平 均值 士SE。*P 值；^ 0.01。序列表简述
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SEQ ID NO :1为编码人mTOR β剪接变体的多核苷酸序列，而SEQ ID NO :2为人 mT0Ri3蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO :3为编码全长人mTOR α蛋白的多核苷酸序列，而SEQ ID NO :4为人 mTORa蛋白的氨基酸序列。SEQ ID No 5-8为用于实施例4的引物。SEQ ID NO 9为通过PCR从人MCF7、Keh293和HEP2G细胞系产生的扩增片段，而 SEQ ID NO 10为由SEQ ID NO 9编码的氨基酸序列。发明详述本发明基于对哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)蛋白的新型剪接形式的鉴定和表 征。这是首次显示mTOR新型剪接形式(下文称为mTOR β的存在。本发明基于对mT0Ri3 蛋白的测定及其活性的研究。业已确定mT0Ri3为当前已知的mTOR(下文中称为mTORa )的N-末端氨基酸1_23 和C-末端氨基酸1867-2549的剪接融合体(splicefusion)，这产生长706个氨基酸的融 合蛋白(SEQ ID NO :2)。在融合蛋白中，缺失了 HEAT和FAT调节结构域。还显示对应于 mTOR β的mRNA转录体在心脏和肝脏中高度表达，同时肾脏、肝脏、血液、小肠和大肠具有 最高的mT0Ri3蛋白水平。此外，与全长mTORa相似，剪接形式也能够与呈递底物的分子 Raptor、Rictor和GL缔合。mTOR0还能在体外使S6K1和4E-BP1磷酸化。另外，业已显示 mTOR β因响应血清刺激而在对应于完整mTOR α氨基酸序列Ser2448 (S2448)的丝氨酸残基 (mTOR β的Ser605)处被磷酸化。mTOR β在对应于完整mTOR α氨基酸序列Ser2448的丝 氨酸残基处的磷酸化作用对雷帕霉素敏感。此外，当与mTORa比较时，rnTORii显示出对雷 帕霉素较不敏感。本文所用术语“mTOR β ”指mTOR的剪接形式。例如，本发明人发现SEQ ID NO :2多 肽为天然存在的人mT0Ri3多肽。据认为，该蛋白长706个氨基酸，由长约2121个核苷酸的 SEQ ID NO :1核酸编码。本文所用术语“mTOR α ”指全长的哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) 蛋白。例如，人mTORa多肽被认为是大约2549个氨基酸长的蛋白(SEQID N0:4)，并被认 为由SEQ ID NO 3核苷酸编码。多肽本发明提供了 mT0Ri3多肽。本文所用“多肽”就其最广泛的意义而言是指两个或多个亚单位氨基酸(subimit amino acid)、氨基酸类似物或其它肽模拟物化合物。因此术语“多肽”包括短肽序列以及 较长的多肽和蛋白。本文所用术语“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘 氨酸和D或L两种旋光异构体及氨基酸类似物和肽模拟物。本发明多肽优选以分离的形式提供。当采用物理、机械或化学方法从通常与蛋白 缔合的细胞组成中移出蛋白时，认为本文所用蛋白得到分离。技术人员可采用标准纯化方 法容易地获得分离的蛋白。本发明包括mT0Ri3多肽。如本文所述，本发明mTOR β多肽可为天然存在的mTOR β 多肽，或可为其变体、衍生物或片段。在本发明一个实施方案中，mT0Ri3多肽由SEQ ID Ν0 2氨基酸序列组成、基本上由SEQ ID NO :2氨基酸序列组成，或包含SEQ ID NO :2氨基酸序 列。在本发明一个实施方案中，mTOR β多肽是mTORa的N-末端氨基酸1_23和C-末端氨基酸1867-2549之间的剪接融合体，这些氨基酸例如是在SEQ ID N0:4的mTORa多肽中的 那些氨基酸。在本发明另一个实施方案中，mT0Ri3多肽由、基本上由以下序列组成或包含 以下序列并且使S6K1和/或4E-BP1磷酸化与SEQ ID NO 2氨基酸序列具有至少75%或 至少95%序列同一性的序列。本发明多肽可由本文所述的本发明多核苷酸编码，例如由SEQ IDNO 1核苷酸序 列或由包含SEQ ID NO :1的多核苷酸编码。本发明多肽可由与SEQ ID NO :1完整邻接序 列具有至少80%或至少95%序列同一性的多核苷酸编码，或由在68°C采用0. Ix SSC的条 件下与SEQ IDNO :1多核苷酸杂交的多核苷酸编码。由所述多核苷酸编码的多肽将能够使 S6K1和/或4E-BP1磷酸化。rnTORii多肽可为天然存在的mT0Ri3多肽或其变体、衍生物或片段。天然存在的 mT0Ri3多肽可为在任何物种中天然表达的mT0Ri3多肽，优选在哺乳动物中表达。例如，合 适的天然存在的mT0Ri3多肽可为来自人、非人的灵长类、啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、兔、 马或家畜动物(例如山羊、绵羊、猪或牛)等的哺乳动物mT0Ri3多肽。mT0Ri3多肽可为兔、 小鼠、大鼠、猪、牛、绵羊、马、人或非人灵长类mT0Ri3多肽。优选mT0Ri3多肽为人mT0Ri3多 肽。例如，人mT0Ri3多肽氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。编码人mT0Ri3多肽的多核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明mT0Ri3多肽可为任何所述天然存在的mTORβ多肽， 例如人多肽，或可为其等位基因变体。等位基因变体尽管具有与上述的稍微不同的氨基酸 序列，但仍具有与所公开的蛋白有关的相同或相似的生物学功能。mTORii多肽可为变体多肽，例如天然存在的mT0Ri3肽的衍生物、类似物、多肽片 段或模拟物。所述变体多肽优选保留与天然存在的mT0Ri3肽相同的生物学功能或活性。活 性可为天然存在的mT0Ri3多肽所具有的任何活性。本文公开了 mT0Ri3的多种活性。合适 的变体多肽可具有这些活性中的任何一种或多种。例如，变体多肽可保留被乙酰化的能力 和/或使第二种蛋白磷酸化的能力和/或结合DNA的能力。例如，合适的变体多肽可诱导 cMyc表达(impression)。合适的变体多肽可在对应于SEQ ID NO :4完整mTORa氨基酸序 列的S2448的丝氨酸残基(SEQ ID N0:2的mTOR0多肽Ser605处被磷酸化。合适的变体 多肽可具有使S6K1磷酸化的能力。合适的变体多肽可具有使4E-BP1磷酸化的能力。合适 的变体多肽可具有使S6K1和4E-BP1磷酸化的能力。合适的变体多肽可与Raptor、RiCtor 和Gi3 L中的一个、两个或全部三个起作用。合适的变体多肽可诱导细胞增殖。合适的变体 多肽可保护细胞免遭饥饿诱导的细胞死亡。合适的变体多肽可增加细胞的致癌可能性。合 适的变体多肽可缩短细胞周期Gl期的长度。本文阐述了评估这些活性的方法，其将易于为 技术人员所理解。实施例显示如何评估所述活性，并用SEQ ID NO :2多肽作为实例。这些 方法可易于在本文所述其它多肽中使用。本发明mT0Ri3多肽可保留全长mTORa多肽的一种或多种功能。这些功能可包括 以下中的一种或多种激酶活性；通过在对应于SEQID NO :4的mTORa氨基酸序列的S2448 的丝氨酸残基(SEQ ID NO :2的mT0Ri3多肽的Ser605处的磷酸化来活化；使其它蛋白磷 酸化的能力，例如使S6K1磷酸化的能力和/或使4E-BP1磷酸化的能力；与Raptor、RiCtor 和Gi3 L中的一个、两个或所有三个相互作用或结合的能力。本发明mT0Ri3多肽可保留不同于全长mTORa多肽的天然存在的mTORβ的至少 一种活性。例如，如本文所述，表达mT0Ri3的细胞比表达mTORa的细胞增殖得更快；表达
9mTOR^而非mTORa导致诱导c_Myc蛋白表达；表达mTORβ的细胞具有比表达mTORα的 细胞更短的Gl期；表达mT0Ri3而非mTORa保护细胞抵抗血清饥饿作用；与表达mTORa的 细胞相比，mT0Ri3表达导致细胞致癌可能性增加。当与mTORa多肽比较时，本发明mTOR β 多肽可保留这些差异中的任何一种或多种。多肽变体包括但不限于天然存在的mT0Ri3多肽(例如SEQ ID NO 2多肽)的缺 失、添加或取代变体。例如，合适的变体可为所述序列的取代、缺失或添加变体，或可为任何 所述序列的片段。变体多肽可包含天然存在的mTOR β多肽序列(例如SEQ ID NO 2)的1、 2、3、4、5、至多10、至多20、至多30、至多40、至多50、至多75个或更多个氨基酸的取代和/
或缺失。“取代”变体优选涉及用相同数量的氨基酸置换一个或多个氨基酸并且进行保守 氨基酸取代。多肽可具有一个或多个其它氨基酸对一个或多个氨基酸的保守取代。本领域 技术人员知道不同氨基酸具有相似特性。多肽的一个或多个这样的氨基酸通常可被一个 或多个其它这样的氨基酸取代而不会消除该多肽期需的性质(例如乙酰转移酶活性)。例 如，氨基酸可被具有相似性质的备选氨基酸取代，后者例如为另一个碱性氨基酸、另一个酸 性氨基酸、另一个中性氨基酸、另一个带电荷的氨基酸、另一个亲水性氨基酸、另一个疏水 性氨基酸、另一个极性氨基酸、另一个芳香族氨基酸或另一个脂肪族氨基酸。可用于选择合 适取代的20种主要氨基酸的某些性质如下
权利要求
使S6K1和/或4E BP1磷酸化的分离的多肽，所述多肽选自(a)包含SEQ ID NO2氨基酸序列的分离的多肽；(b)包含与SEQ ID NO2氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的分离的多肽；和(c)包含由SEQ ID NO1编码的氨基酸序列的分离的多肽。
2.分离的多核苷酸，其选自(a)编码权利要求1的多肽的多核苷酸；(b)包含SEQID NO 1核苷酸序列或其互补体的多核苷酸；(c)包含与SEQID No 1的完整邻接序列具有至少80%序列同一性并且编码使S6K1 和/或4E-BP1磷酸化的蛋白的多核苷酸；和(d)与SEQID NO 1核苷酸序列或其互补体在68°C下采用0. IXSSC的条件下杂交的 分离的核酸分子，所述核酸分子编码使S6K1和/或4E-BP1磷酸化的蛋白。
3.权利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一个或多个表达调控元件可操作地连接。
4.包含权利要求2或3的多核苷酸的载体。
5.宿主细胞，其包含权利要求1的多肽、权利要求2或3的多核苷酸或权利要求4的载体。
6.特异性结合权利要求1的多肽的分离的抗体。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
8.权利要求6或7的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。
9.用于制备多肽的方法，所述方法包括在以下条件下培养宿主细胞表达权利要求1 的多肽或表达由权利要求2的多核苷酸编码的多肽的条件。
10.筛选调节mT0Ri3活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤(a)使权利要求1的多肽与测试作用剂接触；和(b)检测所述多肽活性的任何变化，其中活性变化表明作用剂能够调节mT0Ri3活性。
11.筛选调节mT0Ri3表达和/或活性的作用剂的方法，该方法包括以下步骤(a)提供权利要求5的宿主细胞，该细胞包含或表达权利要求1的多肽或由权利要求2 的多核苷酸编码的多肽；(b)使所述宿主细胞与测试作用剂接触；和(c)检测所述多肽表达和/或活性的任何变化，其中表达和/或活性变化表明作用剂能 够调节mT0Ri3表达和/或活性。
12.权利要求10或11的方法，其中通过测定S6K1和/或4E-BP-1的磷酸化情况来检 测所述活性。
13.权利要求10或11的方法，其中通过测定c-Myc蛋白的表达情况来检测所述活性。
14.权利要求11的方法，其中通过测定包含SEQID NO :1的核酸水平来检测所述表达。
15.治疗与权利要求1多肽的表达异常有关的疾病的方法，所述方法包括将有效量的 作用剂给予需要治疗的对象，其中所述作用剂改变所述多肽的活性和/或表达。
16.用于治疗与所述多肽异常表达有关的疾病的作用剂，所述作用剂改变权利要求1 的多肽的活性和/或表达。
17.权利要求15的方法或权利要求16的作用剂，其中所述作用剂是权利要求7-9中任 一项的抗体。
全文摘要
本发明涉及mTOR剪接形式mTORβ、编码mTORβ的核酸和针对mTORβ的抗体。本发明还涉及mTORβ制备方法和筛选调节mTORβ表达和/或活性的作用剂的方法。本发明进一步涉及通过给予改变mTOR活性和/或表达的作用剂来治疗与异常表达mTORβ有关的疾病的方法。
文档编号C07K14/47GK101939332SQ200880023258
公开日2011年1月5日 申请日期2008年5月1日 优先权日2007年5月1日
发明者A·兹海沃罗普, G·帕纳修克, I·内马扎尼, I·古特, M·沃特菲尔德 申请人:路德维格癌症研究所;Ucl商业有限公司