专利名称：使用iridoptin在昆虫中诱导毒性的制作方法
技术领域：
本发明涉及改良的通过蛋白质工程在昆虫细胞中诱导毒性的方法。更具体来说， 本发明涉及使用iridoptin，一种从istk基因产物衍生而来的高活性剪切多肽，用于在昆 虫细胞中诱导高水平的凋亡和抑制宿主蛋白质合成，并在蚜虫中诱导死亡。
背景技术：
结合涉及通过蛋白质工程在昆虫细胞中诱导毒性的改进的方法，对背景进行了描 述，该描述不对本公开方法的范围构成限制。蚜虫、草盲蝽、银叶粉虱、棉籽象鼻虫和夜蛾造成的经济影响，对美国来说估计为 每年37亿美元，对德克萨斯州来说为每年4亿美元。这些昆虫造成了对水的需求增加，并 引起了数十亿美元的农业损失。消灭计划和化学防治具有局限性；例如，化学防治为了有效，需要剂量不断提高。 这些提高的剂量对于有益的昆虫和地下水具有不利的副作用。需要改进的生物防治方法。 因此，极为需要转基因抗害虫作物和能杀灭昆虫的微生物。鉴定和开发毒素基因对于实施 这样的方法是相当关键的。在2001年授予本发明人的美国专利No. 6，200，561 (‘ 561专利)中公开了使用病 毒蛋白防治棉籽象鼻虫和其他昆虫害虫。该题为“使用病毒蛋白防治棉籽象鼻虫和其他昆 虫害虫，，(Use of Viral Proteins forControlling the Cotton Boll Weevil and Other Insect Pests)的美国专利No. 6，200，561的全部公开内容，通过引用并入于此。‘561专 利涉及螟虫虹彩病毒(Chilo iridescent virus) (CIV ；新西兰株)衣壳蛋白提取物，它杀 死新生幼虫，抑制宿主表达并诱导凋亡。CIV在几个目的昆虫中引起感染。本发明公开了被 鉴定为iridoptin的组合物的使用，它能更加有效地在昆虫中诱导凋亡和抑制宿主蛋白质 合成，并且还在蚜虫中诱导死亡。发明概述因此，本发明提供了防治昆虫的改进的手段，包括使用iridoptin在目标昆虫中 诱导毒性的生物防治方法。它是针对非鳞翅目昆虫的第一种病毒毒素，与现有的细菌毒 素不同，例如对于蚜虫或大多数甲虫无效的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒 素，以及杆状病毒科(Baculoviridae)，该科是目前用作生物防治药剂的主要的病毒种类。 Iridoptin可具体用于对农业害虫的防治。Iridoptin可用于增加农业生产率，减少由介体 和住宅害虫引起的疾病传播。通过扩展，Iridoptin可用于癌症治疗和其他关键在于用凋 亡除去某些细胞的医学治疗中。总的来说，本发明公开了改良的通过蛋白质工程在昆虫细胞和蚜虫中诱导毒性的 方法。更具体来说，本公开的方法可用于在昆虫细胞中诱导高水平的凋亡并抑制宿主蛋白 质合成，以及在蚜虫群体中诱导死亡。附图简述为了更完全理解本发明的特点和优点，现在将参考本发明的详细描述以及随附的图，在这些图中
图IA描绘了根据本公开的实施方案，istk基因序列在CIV基因组中的位置。图IB描绘了编码完整istk基因的2-kbp区域的核苷酸序列(SEQID N0:1)；图IC描绘了 CIV基因组中istk基因的核苷酸序列，以及编码iridoptin的istk 基因的亚基因片段(下划线)；图2描绘了根据本公开的实施方案，从ISTK产物中切下的多肽；图3是根据本公开的实施方案的iridoptin产物的电泳分析；图4A描绘了根据本公开的实施方案暴露于iridoptin的芽虫细胞(CF)中的凋 亡；图4B描绘了根据本公开的实施方案暴露于放线菌素D的芽虫细胞(CF)中的凋 亡；图4C描绘了根据本公开的实施方案暴露于热失活iridoptin的芽虫细胞(CF)中 的凋亡；图4D描绘了根据本公开的实施方案暴露于对照缓冲液的芽虫细胞(CF)中的凋 亡；图5A描绘了根据本公开的实施方案暴露于iridoptin的棉籽象鼻虫细胞(AG)中 的凋亡；图5B描绘了根据本公开的实施方案暴露于热失活的iridoptin的棉籽象鼻虫细 胞(AG)中的凋亡；图5C描绘了根据本公开的实施方案暴露于放线菌素D的棉籽象鼻虫细胞(AG)中 的凋亡；图5D描绘了根据本公开的实施方案暴露于对照缓冲液的棉籽象鼻虫细胞(AG)中 的凋亡；图5E是根据本公开的实施方案对AG细胞中iridoptin诱导的(10 μ g/ml)凋亡 的TUNEL分析；图5F是根据本公开的实施方案对AG细胞中iridoptin诱导的(20 μ g/ml)凋亡 的TUNEL分析；图5G是根据本公开的实施方案对AG细胞中放线菌素D诱导的凋亡的TUNEL分 析；图5H是根据本公开的实施方案对AG细胞中对照缓冲液诱导的凋亡的TUNEL分 析；图5J是根据本公开的实施方案对AG细胞中iridoptin诱导的凋亡的剂量响应分 析；图6A描绘了根据本公开的实施方案在棉籽象鼻虫细胞中iridoptin诱导的蛋白 质合成的抑制；图6B描绘了根据本公开的实施方案在棉籽象鼻虫(AG)中量化的iridoptin诱导 的蛋白质合成的抑制；图6C描绘了根据本公开的实施方案在棉籽象鼻虫(AG)细胞中iridoptin诱导的蛋白质合成抑制的剂量响应分析；图7描绘了根据本公开的实施方案在芽虫(CF)细胞中iridoptin诱导的蛋白质合成的抑制；图8描绘了根据本公开的实施方案iridoptin诱导的蚜虫的死亡。优选实施方案的详细描述本文公开了改良的通过蛋白质工程在昆虫细胞中诱导毒性的方法，其中将昆虫细 胞暴露于iridoptin，然后在昆虫细胞中诱导凋亡，抑制宿主蛋白质合成，并在蚜虫群体中 导致死亡。现具体参考几个实施方案(是示例性的，而不是限制性的)，对本发明的大量创 新性内容进行描述。首先参考
图1A、1B和1C，对螟虫虹彩病毒(Chilo iridescent virus) (CIV ；新西 兰株)DNA中的istk基因区域进行定位和测序，并确定了丝氨酸/苏氨酸激酶的开放阅读 框。通过引物步移法(primer walking)确定了编码所推测的istk基因的开放阅读框，并 将其定位到CIV基因组中跨过将片段B和U分开的Eco RI位点(‘ ”)的一 2-kbp的区 域中(在图IA中用实心灰色块表示)。该基因显示出是有活性的，并被命名为istk(虹彩 病毒丝氨酸苏氨酸激酶)。图IB显示了所确定的编码完整的1236-bp istk基因(在图IB 中显示为下划线)的2-kbp区域的核苷酸序列。基因产物(ISTK)是49-kDa的多肽。该基 因的起始和终止位点在图IB中用粗体标出。现在参考图2，其中分析了衍生自ISTK的剪切后的37-kDa多肽的C-末端序列。 正如前面指出的，以前的美国专利No. 6，200, 561确定了能够杀死新生棉籽象鼻虫幼虫、抑 制宿主表达并诱导凋亡的螟虫虹彩病毒衣壳蛋白提取物。进一步的研究显示，CIV含有丝 氨酸-苏氨酸激酶。该基因现已被克隆并表达该酶，并已证明，其49-kDa的产物(ISTK)在 63%的处理过的昆虫细胞中诱导凋亡，在其余细胞中诱导坏死。凋亡通过DNA片段化、空泡 化以及通过TUNEL分析进行检测。本发明人现在做出了重要发现，即ISTK 49-kDa蛋白的 37-kDa剪切产物在群体的几乎所有细胞中诱导了凋亡效应。因此，对于完整的效应来说，不 需要其他因子或基因产物，并且49-kDa基因产物的翻译后加工对于该活性来说非常重要。 剪切后的新多肽对于完整的毒性效应来说是必要的和充分的。使用空泡形成分析在CF和 AG细胞中进行的剂量响应研究表明，为了在50%的细胞群体中诱导凋亡，分别需要IOOng/ ml 和 900ng/ml 的 37-kDa 多肽。在本发明中，鉴定了 ISTK上的剪切位点，该信息已被用于定制istk基因的亚基因 片段(在图IC中显示为下划线)。s/t激酶结构域和ATP结合位点的位置在图IC中突出 显示。istk基因序列的亚基因组片段(下划线)与毕赤酵母表达载体(pPICZ C)C-末端的 多聚组氨酸标签进行框内(in-frame)克隆，而表达载体中多聚组氨酸标签后的终止密码 子被用于终止。本发明还公开了现在命名为iridoptin的37-kDa多肽的修改过的编码基 因，该多肽能比来自原始基因的产物更有效地诱导凋亡和抑制宿主蛋白质合成。图2描绘了 37-kDa多肽在羧肽酶Y消化后的C-末端测序，由密歇根州立大学生物化学系大分子结构、测序与分析月艮务中心(Macromolecular Structure, Sequencing and Synthesis Facility,Department of Biochemistry at Michigan State University)进 行。C-末端氨基酸是天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly，或N-G)。图2显示了在从CIVistk基因 的相应区域得到的氨基酸序列中有两个位点处可检测到N-G(图2中下划线)。基于该序 列，剪切将发生在甘氨酸-天冬氨酸(Gly-Asp，G-D)位点处。在氨基末端的G-D残基处剪 切将导致形成只含有ATP结合位点的26-kDa的多肽。在羧基末端的G-D位点处剪切将产生同时具有ATP结合位点和s/t激酶基序这二者的预测的37-kDa多肽。在奥斯汀的德克萨斯大学细胞与分子生物学核心服务中心设施研究所 (Institute for Cellular and Molecular Biology Core Facility, University of Texas, Austin)进行的MALDI-TOF分析(基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱)，证实 了 37-kDa多肽的身份以及ATP结合和s/t激酶基序的存在。使用专门设计的引物和CIV 基因组DNA，扩增了编码37-kDa多肽的亚基因DNA序列，并在毕赤酵母系统(Invitrogen) 中表达，以产生带有6xHis标签的产物。现在参考图3，其中显示了来自毕赤酵母系统中表达的酵母裂解物含有带His标 签的37-kDa产物，其通过聚丙烯酰胺凝胶的银染和western印迹法检测。该材料通过结合 带6xHis标签多肽的镍柱(ProBond，Invitrogen, CA)进行纯化，得到纯的37-kDa多肽，即 iridoptin，其可用6xHis抗体探针和总蛋白的银染所检测。图3显示了在毕赤酵母系统 中表达并通过亲和层析纯化的iridoptin产物使用银染凝胶和western印迹(使用6xHis 抗体探针)进行的分析。如图3中所示，“U”下的列显示了未诱导的酵母裂解物不表达 iridoptin. “L”下的列显示了诱导的酵母裂解物显现出预计的iridoptin条带。“E”显示 了在结合His的镍亲和柱(ProBond)上纯化的iridoptin保留有6xHis标签，通过银染和 western印迹可以检测为纯的蛋白。“M”列显示了分子量标准品，其中数字表示分子量，单 位为千道尔顿。现在参考图4A、4B、4C和4D，其中显示了 iridoptin在云杉芽虫(CF 124T)细胞中 诱导凋亡。将细胞在Nunc 60孔盘(5. 6xl03个细胞每孔，在7 μ 1培养基中)中进行处理， 在28°C温育，在处理后24小时，通过相差显微镜检查凋亡性空泡的形成。Iridoptin产物 在超过90%的CF细胞中诱导凋亡性空泡形成，与此相比，在放线菌素D处理的阳性对照中 是98%。结果表现在图4A中，该图显示了 Iridoptin 从亚基因istk表达的37-kDa多肽 (毕赤酵母；10yg/ml) ；92%空泡形成，SD 4.7。图4B显示了放线菌素D(4y g/ml ；阳性对 照)；98%空泡形成，SD 1.1。图 4C 显示了 Δ Iridoptin (热失活的 iridoptin，10 μ g/ml， 65°C，30min)，5%空泡。图4D显示了用缓冲液(IX Rinaldini' s平衡盐溶液；RBSS)所做 的模拟处理，空泡形成。在图4A-4D中放大倍数为800x。现在参考图5A-5D，其中显示了 iridoptin在棉籽象鼻虫细胞(AG3A)中诱导凋亡， 其可通过细胞空泡形成来检测。将AG3A细胞接种在60-孔Terasaki板中，在28°C温育24 小时。在50%细胞群体中诱导空泡的最高稀释度是大约0.9 μ g/ml。在图5A中，空泡形成 分析显示20 μ g/ml的iridoptin在棉籽象鼻虫细胞系AG3A中诱导了 87%的空泡形成。图 5B显示了热失活的iridoptin (20 μ g/ml，65°C，30min)诱导了 7%的空泡形成。图5C显示 了放线菌素D(4y g/ml ；阳性对照)诱导了 99%的空泡形成。图5D显示了使用RBSS缓冲 液的模拟处理诱导了可被忽略的空泡形成(2. 7% )。现在参考图5E-5H，其中TUNEL分析证实了 iridoptin诱导的凋亡。图5E描绘了用10 μ g/ml Iridoptin处理的AG3A细胞在53%的细胞群体中显示出证实凋亡的核二氨 基联苯胺(DAB)信号。图5F描绘了用20 μ g/ml Iridoptin处理的AG3A细胞显示出84% 的核DAB。图5G描绘了用放线菌素D (ACT D)处理的AG3A细胞诱导了 96%的核DAB信号。 图5H描绘了用RBSS模拟处理的AG3A具有1 %的核DAB。现在参考图5J，其中显示了通过空泡形成检测的iridoptin诱导的针对棉籽象鼻虫细胞(AG3A)的凋亡的剂量响应分析。结果显示，0.5yg iridoptin足以在50%的AG 细胞群体中诱导凋亡。对于CF细胞获得了类似的结果。结果表现在图5J中，其中按照空 泡形成百分率显示了 iridoptin对棉籽象鼻虫细胞(AG3A)的剂量响应。将AG3A细胞以 4. 2xl03个细胞每孔接种在60-孔Terasaki板中，用iridoptin的连续10倍稀释液处理， 在28°C温育24小时。放线菌素D(4y g/ml)是阳性对照，热失活的iridoptin (20 μ g/ml, 65°C，30min)是阴性对照；模拟处理使用Rinadini ‘ s平衡盐溶液(RBSS)。数据点代表每 个视野大约200个细胞的空泡形成百分率。在50%的细胞群体中诱导空泡的最高稀释度 是大约0.5 μ g/ml。使用Microsoft Excel产生了线性回归线y = 17. 51og x+55，其中χ 是iridoptin的浓度，单位为μ g/ml, y是具有空泡的细胞群体的百分数；r = 0. 94。对照 显示出了预计的空泡形成(放线菌素D :99%，SD 1.5;热失活的iridoptin :7%，SD 1.7; RBSS 3%, SD 1. 9)。分析采用三份平行样。现在参考图6A，其中显示了 iridoptin在棉籽象鼻虫(AG3A)细胞中诱导蛋白合成 的抑制。将AG3A细胞接种在Costar 24孔板中，用所显示的浓度的iridoptin处理。对照包 括放线菌素 D (A，阳性，4 μ g/ml)，热失活的 iridoptin ( Δ，阴性，10 μ g/ml, 65°C，30min.) 和模拟处理(M，RBSS)。从处理后3小时开始，将细胞用35S-甲硫氨酸脉冲1小时，使用 SDS-PAGE 样品缓冲液(2% SDS，20% 甘油，20mM Tris-HClpH 8,2% β-巯基乙醇和 0. Img/ ml溴酚蓝)裂解，使用SDS-PAGE进行分级。蛋白合成的相对速度使用感光成像仪进行定 量。实验采用三份平行样。现在参考图6B，其中对iridoptin在棉籽象鼻虫(AG3A)细胞中诱导的蛋白质合成 的抑制进行了量化。26 μ g/ml的Iridoptin抑制了 90%以上的宿主蛋白质合成，而放线菌 素D抑制了 68%的蛋白质合成。将AG3A细胞接种在Costar 24孔板中，用图6B中显示浓 度(μ g/ml.)下的iridoptin处理。对照包括放线菌素D (ActDA,阳性对照，4 μ g/ml)，热失 活的iridoptin (加热的，阴性对照，10μ g/ml，65°C，30min.)和用Rinaldini' s平衡盐溶 液模拟处理的细胞(模拟)。在处理后3小时开始，将细胞用35S-甲硫氨酸脉冲1小时，使 用SDS-PAGE样品缓冲液裂解，使用SDS-PAGE进行分级。条带使用感光成像仪可视化。蛋 白合成的相对速度使用感光成像仪的功能进行量化。实验采用三份平行样。使用来自三次 独立实验的全部主要条带来确定抑制。26 μ g/ml的Iridoptin抑制了超过90%的宿主蛋 白质合成。现在参考图6C，其中显示了 iridoptin在棉籽象鼻虫(AG3A)细胞中诱导的蛋白 质合成的抑制的剂量响应分析。来自图6A的数据使用感光成像仪的功能进行了量化。抑 制90%宿主蛋白质合成的最高稀释度是大约23 μ g/ml。将iridoptin浓度的对数对蛋白 抑制百分率进行作图。使用Microsoft Excel 2003产生了具有下列方程的线性回归线y =98. 4x-44. 9，其中χ是单位为μ g/ml的iridoptin稀释度的对数，y是宿主蛋白质合成 的抑制百分率。拟合的线的r2值是0.99。现在参考图7，其中显示了 iridoptin在CF细胞中诱导的蛋白质合成的抑制。使用iridoptin的抑制(Iridoptin ；7 μ g/ml ；63% )是使用阳性对照放线菌素D观察到的 抑制(Act D ；4 μ g/ml ；68% )的 93% ；而使用加热过的 iridoptin 的抑制(Δ Iridoptin ； 7yg/ml,65°C,30min)是阳性对照的18%。来自SDS-PAGE凝胶中相关道的等同区域的光 密度，使用模拟道作为对照进行了计算，并转化成透光度百分数。从针对模拟道的透光率百分数确定了抑制值。现在参考表1，其中描述了 iridoptin的蛋白激酶活性。蛋白激酶的分析显示出 iridoptin的显著活性。Y32P-ATP用作标记物，鱼精蛋白用作底物。将样品点在磷酸纤维 素纸上，在洗掉过量标记物后对放射活性进行计数。激酶的比活力被表示成在使用的酶制 备物中每Pg总蛋白的cpm。Iridoptin的比活性略高于CIV毒粒蛋白提取物(CVPE)的。 在加热过的iridoptin (65°C，30min)和BSA对照中激酶活性低。 表 1现在参考图8，其中描绘了 iridoptin在蚜虫中诱导的死亡。生物分析显示 iridoptin在处理的蚜虫中诱导了 72%的死亡率，与此相比，对照中为14%死亡率。 iridoptin处理对棉花蚜虫的影响显示在图8中，其中将12只蚜虫放置在涂有下列制备 物的棉花叶片上1) Iridoptin 在毕赤酵母系统中表达iridoptin基因；酵母裂解物在 镍柱(ProBond)上纯化；将洗脱液脱盐，用RBSS交换，用含有终浓度为20 μ g/ml酪蛋白， 1 μ g/ml抑胃酶肽A和2 μ g/ml亮抑蛋白酶肽的RBSS稀释到50 μ g/ml ；2)模拟处理不含 iridoptin基因的毕赤酵母菌株(X33)按照上面的描述进行处理；将裂解物进行模拟纯化， 以制备iridoptin时使用的比例将上述溶剂稀释；以及3)未处理的将蚜虫在28°C温育 3天，使用解剖显微镜检查死亡率。结果显示为高于未处理叶片上的死亡蚜虫的数量。在 iridoptin、模拟处理和未处理叶片中蚜虫的死亡率分别为72%、14%和0%。实验采用三 份平行样。条表示标准偏差。下面，对本公开的方法和装置进行一般性描述，作为本发明的具体实施方案并为 了证明其实践和优点，引入了下面的实施例。应该理解，给出实施例仅仅是为了说明，而不 打算以任何方式限制本说明书或权利要求书。为了便于理解本发明，下面对几个术语进行定义。本文定义的术语具有本发明相 关技术领域的普通专业人员所通常理解的意义。不指明数量的实体不打算仅仅指称单数实 体，而是包括其具体例子可用于说明的通类。本文中的术语被用于描述本发明的具体实施 方案，但是，除了可能在权利要求书中有概述的之外，它们的使用不为本公开的方法划界。TUNEL 在凋亡细胞的核中检测片段化DNA的染色分析方法；阳性细胞被诊断为凋 亡细胞。凋亡程序化细胞死亡，其中细胞萎缩，经历核DNA片段化，并在表面产生空泡。 实施例通过对iridoptin的凋亡活性、在细胞培养物中抑制宿主蛋白质合成以及导致蚜 虫死亡进行试验，显示了来自CIV的修饰的istk基因的产物iridoptin，在90%以上的处理过的昆虫细胞中诱导了非常高水平的凋亡，抑制了宿主蛋白质合成，并杀死了超过对照 处理63%的蚜虫群体。这些数据强烈提示iridoptin对其他昆虫，包括棉籽象鼻虫、草盲 蝽、粉虱和夜蛾具有毒性或抑制性效应。此外，本发明的应用包括使用编码iridoptin的基因片段进行工程改造和生产 (i)抗蚜虫、棉籽象鼻虫、草盲蝽、粉虱、夜蛾和其他昆虫害虫的棉花和其他作物，(ii)用于 防治农业害虫以及植物、动物和人类疾病介体以及住宅害虫的微生物，以及(iii)大量的 iridoptin用于直接防治控制农业和住宅害虫以及疾病介体。通过扩展，发现Iridoptin可 用于癌症疗法和其他关键步骤在于用凋亡除去某些细胞的医学治疗中。应该理解，本文描述的具体实施方案仅仅是说明性的，不对本发明构成限制。本发 明的原则特点可用于各种不同实施方案中，而不背离本发明的范围。本技术领域的专业人 员将会认识到，或能够确定，仅使用常规的实验方法就可以产生本文描述的具体步骤的大 量等同体。这样的等同体被认为是在本发明的范围之内，并被权利要求书所覆盖。所有在说明书中提到的出版物和专利申请，说明了在本发明所属技术领域的专业 人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入于此，其程度与每个出版物或专利 申请被具体地、单独地通过引用合并于此相同。在权利要求书中，所有过渡性措辞例如“包含(comprising) ”、“包括 (including)”、“带有(carrying)，，、“具有(having)”、“含有(containing) ”、“涉及 (involving) ”等，被理解为是开放性的，即意味着包括但不限于。只有过渡性措辞“由……
构成(consistingof) ”和“基本上由......构成(consisting essentially of) ”分别将是封
闭性或半封闭性过渡性措辞。在本文中公开和要求权利的所有组合物和/或方法，可以根据本公开不需要过多 的实验就能做出或执行。尽管已经根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描 述，但对于本技术领域的专业人员来说，显然可以对组合物和/或方法以及在本文描述的 方法的步骤或一系列步骤中进行修改，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体来说，显然某些化学和生理学相关的因子可用于代替本文描述的因子，同 时仍能获得相同的或相似的结果。所有这些本技术领域的专业人员显而易见的类似替代和 修改，被视为处于随附的权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。参考文献Bernal, J. , Gonzalez, D, Ε. Τ. Natwick, J. G. Loya, R. Leon-Lopez, W. E. Bendixen. (1993).在加利福尼亚鉴定到的俄罗斯小麦蚜的天敌(Natural enemies of Russian wheat aphid identified in California), California Agric. 47 :24-28.Bernal, J. , Gonzalez, D. , Natwick, Ε. Τ. , Loya, J. G. , Leon-Lopez, R. , Bendixen, W. E. (1993) · California Agric. 47 :24_28.Burkness, E. C, Hutchison, W. D. ， Weinzierl， R. Α. ，ffedberg, J. L. ， Wold S. J.， Shaw J. T. (2002). Crop Protection,21 (2) :157_169.Cabrera, H. M.， Argandona;, V. H.， Zufiiga, G. E.，Corcuera L.J. (1995).
Phytochemistry 40(4) 1083-1088.Carter, R. S.，Stiebel，W. H.，Nalasco, P. J.，Pardieck, D. L. (1995).杀虫齐[J 工厂处地下水污染的调查与补救——案例研究(Investigationand Remediation ofGroundwater Contamination at a Pesticide Facility-aCase Study)， Water Quality Research Journal of Canada 30(3) 469-491.Chitnis，N. S.，D' Costa, S. M.，Paul，E. R.，and Bilimoria，S. L (2008)通过 胞吞作用、早期表达、JNK和启始胱天蛋白酶调节虹彩病毒诱导的凋亡(Modulation of iridovirus-induced apoptosis by endocytosis, earlyexpression, JNK, and apical caspase), )Virology 370 :333_342.D ' Costa, S. M.，H. J. Yao, et al. (2004).螟虫虹彩病毒感染的转录作图 (Transcriptional mapping in Chilo iridescent virus infections), OArch Virol 149(4) :723-42.D ' Costa, S. M. , Yao, H. , Bilimoria, S. L. (2001). Archives ofVirology 146(11) :2165-78.Funk, C. J.，Hunter, W. B.，Achor, D. S. (2001). J Invertebr Pathol. 77(2) 144-6.Grossi-de-Sa MF, Quezado de Magalhaes M, MS Silva, SM Silva, SCDias, EY Nakasu, PS Brunetta, GR Oliveira, OB Neto, Sampaio deOliveira R, LH Soares, MA Ayub, HA Siqueira, and EL Figueira(2007).棉铃象甲(棉籽象鼻虫)和草地夜蛾 (秋粘虫)对来自巴西苏云金杆菌菌株的crylia类型毒素的易感性(Susceptibility of Anthonomus grandis (cotton boll weevil)and Spodoptera frugiperda (fall army worm)to acrylia-type toxin from a Brazilian Bacillus thuringiensis strain)， Journal ofBiochemistry and Molecular Biology. 40 :773_782·Henderson, C. W. ，Johnson, C，Lodhi, S. A. ，and Bilimoria, S. L. (2001). _&虫工 彩病毒在棉籽象鼻虫——棉铃象甲中的复制，以及感染性分析方法的幵发(Replication of Chilo iridescent virus in the cottonboll weevil, Anthonomus grandis, and development of an infectivityassay), Archives of Virology. 146 :767_775.Henneberry, T. J. and R. M. Faust (2002).国家研究、行动与技术转化计划， 1997-2002 第二个5年计划的第5年度综述(National Research,Action,and Technology Transfer Plan, 1997-2002 :Fifth Annual Reviewof the Second 5-Year Plan),Kazmierczak，J. R.，F and B. C. Smith(1996).知识和观点在促进棉籽象鼻虫 (鞘翅目象虫科)消灭中的作用(Role of knowledge andopinion in promoting boll weevil(Coleoptera :Curculionidae)Eradication), Journal of Economic Entomology 89 :1166.Liang, G.，Liu, Τ. X. (2002).实验室中高岭土颗粒片包裹以及矿物 油——防晒油对甜瓜上的银叶粉虱(同翅目粉虱科)的驱除性(Itepellency of a Kaolin Particle Film， Surround， and a Mineral Oil， Sunspray Oil， to Silver leaf Whitefly(Homoptera :Aleyrodidae)on Melonin the Laboratory)，J.Econ. Entomol. 95(2) :317_324·Michels Jr.，G.J. (2002).德克萨斯高原的准确农业初步行动，2002年度综合报告，2002年度综合 艮告(Precision Agriculture Initiative ForTexas High Plains, 2002 Annual Comprehensive Report，2002 AnnualComprehensive Report)，
Norman Jr. , J. W. , Sparks Jr.，A. N. (2003).在下 Rio Grande 峡谷中管理棉 花昆虫，2003年德克萨斯农业扩展服务部出版号E-7(ManagingCotton Insects in the Lower Rio Grande Valley,2003 Texas AgriculturalExtension Service Publication No. E-7).Oerke, E. C, Dehne, H. W.，Schonbeck, F.，Weber, A. (1995).作物生产和作物保 护主要粮食和经济作物损失估计(Crop Production andCrop Protection Estimated Losses in Major Food and Cash Crops), Amsterdam, Elsevier Publishing Co.Paul, E. R. ， Chitnis, N. S. ， Henderson, C. W. ， Kaul, R. J. , D ' Costa, S. Μ.， and Bilimoria, S. L. (2007)通过虹彩病毒毒粒衣壳蛋白提取物诱导凋亡(Induction of apoptosis by iridovirus virion protein extrac.), Archives of Virology. 152 1353-1364.Pedigo, L. P. (2002).昆虫学与害虫管理(Entomology and PestManagement)， Prentice Hall.ffestbrook, J.，Suh, C, Jones, G.，Spurgeon, D.，Esequivel, J. (2002). 2002 年 年度报告，ARS 项目号6202-22000-007-00 (Annual Report 2002ARS Project Number 6202-22000-007-00).ffestbrook, J. , Suh, C, Jones, G. , Spurgeon, D. , Esequivel, J. (2002).发展 玉米铃虫、南瓜十二星叶甲和其他田间作物害虫的大面积管理，2002年年度报告，ARS项 目号6202-22000_007-00 (Development ofArea wide Management for Corn Earworm, Corn Rootworm & Other FieldCrop Pests, Annual Report 2002, ARS Project Number 6202-22000-007-00).Williams, M. R. (2000) · 1999 年棉花昆虫造成的损失(Cotton InsectLosses 1999), In Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences :887_913.Williams, M. R. (2003). In (online) Proceedings 2003 BeltwideCotton Production Conference.Williams, T. (I"8) ·无脊椎动物虹彩病毒(Invertebrate IridescentViruses)，The Insect Viruses, L.K. Miller and L. A. Ball. New York, Plenum Press :31_68.
权利要求
编码完整的istk基因的分离的核苷酸序列，如SEQ ID NO1中从46位核苷酸到1275位核苷酸所示，其中istk基因产物是丝氨酸-苏氨酸激酶49-kDa多肽(ISTK)。
2.权利要求1的ISTK多肽，其中多肽能够在昆虫细胞中诱导凋亡，或抑制昆虫细胞中 蛋白的合成。
3.权利要求1的istk基因的亚基因片段，其中所述亚基因片段具有如SEQID N0:3中 所示的核苷酸序列。
4.权利要求3的亚基因片段，其中所述亚基因片段编码如SEQIDN0 2中1-290位所 示的37-kDa多肽(iridoptin)，并且其中该多肽包含丝氨酸-苏氨酸激酶。
5.权利要求4的iridoptin多肽，其中所述多肽与ISTK相比，对昆虫显示出增强的毒性。
6.生产如SEQID NO 2中1-290位所示的37_kDa多肽(iridoptin)的方法，所述方 法包括下列步骤(a)提供如SEQID N0:1中从46位核苷酸到1275位核苷酸所示的编码完整istk基 因的分离的核苷酸序列，其中istk基因产物是丝氨酸-苏氨酸激酶49-kDa多肽(ISTK)；(b)鉴定ISTK多肽上的剪切位点；(c)鉴定C-末端氨基酸；(d)在从istk基因衍生的氨基酸序列中检测C-末端氨基酸；以及(e)剪切ISTK多肽，以产生同时含有ATP结合位点和丝氨酸-苏氨酸激酶的37_kDa多 肽(iridoptin)。
7.分离如SEQID NO :3所示的istk基因的亚基因片段的方法，其中亚基因片段编码 权利要求4的多肽，所述方法包括(a)对如SEQID NO 2中1-290位所示的37-kDa多肽(iridoptin)进行C-末端测序；(b)确定37-kDa多肽的分子量和并对其N-末端测序；(c)使用专门设计的引物和螟虫虹彩病毒基因组DNA，对编码37-kDa多肽的亚基因DNA 序列进行核酸扩增反应；以及(d)利用毕赤酵母系统表达产物。
8.载体，其含有编码如SEQID NO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所 述多肽与螟虫虹彩病毒衣壳蛋白提取物相比，对昆虫表现出增强的毒性。
9.宿主细胞，其含有编码如SEQID NO 2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其 中所述多肽与螟虫虹彩病毒衣壳蛋白提取物相比，对昆虫表现出增强的毒性。
10.权利要求9的宿主细胞，其中所述细胞是植物细胞或细菌细胞。
11.权利要求10的细胞，其中植物细胞是棉花细胞。
12.生产转化的细胞的方法，所述方法包括将编码具有SEQIDN0 2中1-290位的 37-kDa多肽(iridoptin)的istk基因的亚基因片段导入到细胞中，并且其中所述细胞是植 物细胞或微生物细胞。
13.权利要求12的方法，其中细胞是植物细胞。
14.权利要求13的方法，其中植物细胞是棉花细胞。
15.生产转化的细胞的方法，所述方法包括将如SEQID NO :3所示的核苷酸序列导入 到细胞中，并且其中所述细胞是植物细胞或微生物细胞。
16.生产抗昆虫植物的方法，所述方法包括下列步骤(a)将如SEQID NO :3所示的核苷酸序列导入到植物细胞中，用于表达杀昆虫蛋白；(b)筛选转化的植物细胞；以及(c)从转化的植物细胞再生植物，其中所述植物包含所述核苷酸序列。
17.来自按照权利要求16的方法生产的植物的种子或后代，其中所述种子或后代含有 所述核苷酸序列。
18.植物，其含有如SEQID NO :3所示的核苷酸序列。
19.来自权利要求18的植物的种子或后代，其中所述种子或后代含有所述核苷酸序列。
20.植物，其从权利要求19的种子长成。
21.在作物田间防治昆虫侵袭的方法，所述方法包括向昆虫提供该昆虫以之为食的 转基因植物，所述转基因植物表达如SEQ ID NO :2中的1-290位所示的多核苷酸序列编码 的杀昆虫蛋白。
22.防治昆虫侵袭植物的方法，所述方法包括向昆虫提供该昆虫以之为食的转基因 植物，所述转基因植物表达如SEQ ID NO :2中的1-290位所示的多核苷酸序列编码的杀昆 虫蛋白。
23.昆虫防治组合物，包含适合的载体和昆虫防治量的分离的杀昆虫的螟虫虹彩病毒 蛋白，所述蛋白包含编码如SEQ ID NO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所述 多肽与螟虫虹彩病毒衣壳蛋白提取物相比，对昆虫表现出增强的毒性。
24.防治在植物、人类或动物之间侵染或传播疾病的昆虫害虫或昆虫疾病介体的方法， 包括在有待防治昆虫的位置施加昆虫防治量的分离的杀昆虫的螟虫虹彩病毒蛋白，所述 蛋白包含编码如SEQ IDNO :2的1-290位所示的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽与螟虫 虹彩病毒衣壳蛋白提取物相比，对昆虫表现出增强的毒性。
25.权利要求24的方法，其中所述多肽被昆虫摄取或通过接触导入昆虫。
26.权利要求24的方法，其中昆虫被所述多肽喷洒。
27.权利要求24的方法，其中昆虫是蚜虫或同翅目(Homoptera)的其他成员。
28.权利要求24的方法，其中昆虫选自棉籽象鼻虫、草盲蝽、粉虱和夜蛾。
29.权利要求24的方法，其中所述位置是植物。
30.权利要求29的方法，其中植物选自棉花、玉米、苜蓿、油菜、豆、土豆和水稻植物。
全文摘要
用于防治昆虫的改进的方法和化合物，包括使用iridoptin在目标昆虫中诱导毒性的生物防治方法。本发明在昆虫细胞中诱导高水平的凋亡并抑制宿主蛋白的合成。它是针对非鳞翅目昆虫的第一种病毒毒素，与现有的细菌毒素不同，例如对于大多数甲虫，包括棉籽象鼻虫无效的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素，以及杆状病毒科(Baculoviridae)，该科是目前用作生物防治药剂的主要类型的病毒。Iridoptin将可用于农业害虫的防治。它将增加生产率，减少由介体和住宅害虫引起的疾病传播。通过扩展，它可用于癌症治疗和其他关键在于用凋亡除去某些细胞的医学治疗中。
文档编号C07H21/02GK101849004SQ200880114763
公开日2010年9月29日 申请日期2008年9月6日 优先权日2007年9月6日
发明者单·比利莫里亚 申请人:德克萨斯理工大学