专利名称：一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法
技术领域：
本发明涉及一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，属于医药技术领域。
背景技术：
斑马鱼是一种用于生长发育和遗传研究的重要模式生物，在过去20年已经成为一种研究胚胎发育的重要模式生物。目前斑马鱼已经获得较为完整的基因组学、分子遗传学和胚胎学的资料，并被广泛应用于环境毒物的监测，已经被用于环境中许多化学物质如有害重金属、农药以及卤代芳香烃化合物等致癌物的累积效应和毒性研究。斑马鱼胚胎和幼鱼体积很小，可用微孔培养板培养，故其适合于高通量筛选。同时斑马鱼属于脊椎动物，是一种活体研究体系，可保留药物的代谢动力学过程，故其与其他的体外研究体系相比更加适合用于中药这种复杂化学体系的药效学和毒性筛选。斑马鱼的受精卵或者鱼苗能够便利地从培养介质中吸收亲水或亲脂的物质，使得其检测中药的活性变得非常方便。 当前，采用斑马鱼进行中药药效筛选模型有一些报道，但是进行毒性筛选的研究报道较少，即使有部分报道和相关研究性的模型，但是缺乏相关的研究数据评估该模型的适宜性和可靠性，并成为成熟和认可的毒性筛选模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种易操作、准确度高的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法。本发明可以通过下列步骤来实现(I)将中药药材粉碎或者提取或者直接已经成药的中药复方。(2)根据初步的预实验，将样品溶于水中，配制成不同的浓度供试液。(3)试验时挑选大小相近、健康活泼的斑马鱼，随机投入到干净的玻璃缸中(每缸中12条)，在试验期过程中不喂食，以避免饲料的影响，实验窜温度为(20±2)°C。试验开始后持续观察4h，同时在120h内不定时观察，至少每6h观察I次，发现死鱼及时捞出，(4)当鱼苗中毒停止呼吸以后,用小镊子夹鱼尾柄部，10分钟内鱼苗不出现反应，则判断为死亡，计算各组斑马鱼累计死亡率并作记录。以寇氏法计算LC50及95%可信限。(5)根据 LC50 进行毒性分级口 LC50 < I. Omg,剧毒；LC50 = I. O 100. Omg,高毒；LC50 = 100. O 1000. Omg,中等毒性；LC50 = 1000 10000. Omg,低毒；LC50 >10000. Omg,微毒(无毒)ο在步骤(I)中，所用的原料可以为药材粉末、中药提取物、中药浸膏、中药处方以及中药单体。在步骤⑵中，所用的溶剂可以为水，也可以为二甲亚砜。在步骤(3)中，所用的斑马鱼可以为斑马鱼，也可以为斑马鱼的受精卵或者胚胎；每个缸中的鱼的头数可以根据需要，调整为I 100条。在步骤⑷中，判断与死亡的方法可以为3 15min ;对于采用受精卵试验时，试验时观察陪她是否凝结、外包是否完成、有没有主动运动、水肿、色素、孵化是否延迟以及死亡等现象，以此判定药物对胚胎发育过程的影响以及毒性。与其他检测方法相比，本发明的有益效果如下(I)方法操作简便、实用性强；(2)初步判断出该中药的毒性，速度快，精确度高。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但本发明不仅限于所述实施例。
权利要求
1.一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)将中药药材粉碎或者提取或者直接已经成药的中药复方。
(2)根据初步的预实验，将样品溶于水中，配制成不同的浓度供试液。
(3)试验时挑选大小相近、健康活泼的斑马鱼，随机投入到干净的玻璃缸中(每缸中12条)，在试验期过程中不喂食，以避免饲料的影响，实验窜温度为(20±2)°C。试验开始后持续观察4h，同时在120h内不定时观察,至少每6h观察I次,发现死鱼及时捞出， (4)当鱼苗中毒停止呼吸以后，用小镊子夹鱼尾柄部，10分钟内鱼苗不出现反应，则判断为死亡，计算各组斑马鱼累计死亡率并作记录。以寇氏法计算LC50及95%可信限。(5)根据LC50 进行毒性分级口 =LC50 < I. Omg,剧毒；LC50 = I. O 100. Omg,高毒；LC50=100. O 1000. Omg,中等毒性；LC50 = 1000 10000. Omg，低毒；LC50 > 10000. Omg，微毒(无毒)。
2.根据权利要求I所述的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，其特征在于在步骤(I)中，所用的原料可以为药材粉末、中药提取物、中药浸膏、中药处方以及中药单体。。
3.根据权利要求I所述的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，其特征在于在步骤(2)中，用的溶剂可以为水，也可以为二甲亚砜。
4.根据权利要求I所述的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，其特征在于在步骤(3)中，所用的斑马鱼可以为斑马鱼，也可以为斑马鱼的受精卵或者胚胎；每个缸中的鱼的头数可以根据需要，调整为I 100条。
5.根据权利要求I所述的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法，其特征在于在步骤(4)中，判断与死亡的方法可以为3 15min ;对于采用受精卵试验时，试验时观察陪她是否凝结、外包是否完成、有没有主动运动、水肿、色素、孵化是否延迟以及死亡等现象，以此判定药物对胚胎发育过程的影响以及毒性。
全文摘要
本发明的目的是提供易操作、准确度高的一种用模式生物斑马鱼筛选中药毒性的方法。其特点在于将中药药材粉碎或者提取或者直接已经成药的中药复方溶于水中，配制成不同的浓度供试液，试验时挑选大小相近、健康活泼的斑马鱼，随机投入到干净的玻璃缸中实验窜温度为(20±2)℃。试验开始后持续观察4h，同时在120h内不定时观察，至少每6h观察1次，发现死鱼及时捞出，当鱼苗中毒停止呼吸以后，用小镊子夹鱼尾柄部，10分钟内鱼苗不出现反应，则判断死亡，计算各组斑马鱼累计死亡率并作记录。以寇氏法计算LC50及95％可信限。该方法的优点在于方法操作简便、实用性强；能初步判断出该中药的毒性，速度快，精确度高。
文档编号A61K49/00GK102716501SQ20111007802
公开日2012年10月10日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者杨双明, 王新亮, 谢天培, 邓春来, 钱勇, 魏国志 申请人:上海佰年诗丹德检测技术有限公司