抗epha2抗体的制作方法

专利名称：抗epha2抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抑制细胞恶性转化和/或肿瘤细胞生长的活性的抗体。更具体地 说，本发明涉及针对EPHA2的抗体以及包含所述抗体的药物组合物。
背景技术：
EPHA2是一种受体酪氨酸激酶，其分子量为130kDa并且具有单个跨膜结构域 (Molecular and Cellular Biology，1990，第 10 卷，第 6316-6324 页)。EPHA2 在其 N 端胞 外区存在一个配体结合域和两个纤连蛋白III型结构域，而在其C端胞内区存在一个酪氨 酸激酶结构域和一个sterile-α -Hiotif(SAM)结构域。GPI锚定的质膜蛋白印hrin-Al至印hrin_A5已知为EPHA2配体(Annual Review of彻皿08(^61 ^，1998，第21卷，第309-345页)。所述配体与EPHA2结合激活酪氨酸 激酶结构域并使存在于EPHA2胞内区的酪氨酸残基磷酸化，从而引起细胞内的信号转导。 还有文献报道与所述配体结合的EPHA2通过内吞作用进入细胞并最终被蛋白酶体降解 (Molecular Cancer Research，2002，第 1 卷，第 79-87 页)。已在临床上报道EPHA2在许多癌症中高表达，特别是以下癌症乳腺癌、食道癌、 前列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤(Cancer Research，2001，第 61 卷，第 2301-2306 页；International Journal of Cancer, 2003，第 103 卷，第 657-663 M ；The Prostate，1999，第 41 卷，第 275—280 页；AmericanJournal of Pathology, 2003, 第 163 卷，第 2271-2276 页；CancerScience, 2005，第 96 卷，第 42-47 页；Clinical Cancer Research，2003，第 9 卷，第 613-618 页；Oncology R印orts，2004，第 11 卷，第 605-611 页 和Molecular Cancer Research, 2005，第3卷，第541-551页)。还有文献报道对于食道 癌而言，EPHA2表达阳性的患者容易表现高频率的局部淋巴结转移、大量的淋巴结转移、低 程度的肿瘤分化和五年存活率低(International Journal of Cancer，2003，第103卷，第 657-663页)；对于非小细胞肺癌而言，高度表达EPHA2的患者倾向于无病存活率低和复发， 特别是脑转移(Clinical Cancer Research，2003，第9卷，第613-618页)；而对于结肠癌 而言，EPHA2表达阳性的患者容易发生肝转移、淋巴管侵袭和淋巴结转移，并且许多临床后 期患者为EPHA2表达阳性的患者(Oncology R印orts，2004，第11卷，第605-611页)。此外，有文献报道将EPHA2基因引入细胞后，非癌细胞获得了癌细胞的表型(例 如不依赖贴壁生长的能力、胞外基质上形成管状形态的能力以及体内肿瘤生长的能力 (Cancer Research，2001，第61卷，第2301-2306页))，并且癌细胞通过细胞外基质的侵 袭性增强(Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004,第 320 卷， 第1096-1102页和Oncogene，2004，第23卷，第1448-1456页)。此外，有文献报道通过 用siRNA敲低(knockdown)EPHA2的表达来抑制肿瘤细胞的侵袭性、不依赖贴壁的生长和 体内肿瘤的生长(Oncogene，2004，第 23 卷，第 1448-1456 页和 Cancer Research，2002，第 62卷，第2840-2847页)；以及通过使用EPHA2的配体印hrin-Al和人IgG Fc区的融合蛋 白激活EPHA2并经由内吞作用诱导EPHA2降解，来抑制肿瘤细胞的侵袭性、不依赖贴壁的生长和形成管状形态的能力(Cancer Research，2001，第61卷，第2301-2306页；Molecular Cancer Research, 2005,第 3 卷，第 541-551 页禾口 Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，第 32O 卷，第 IO96-IlO2 页)。另一方面，据报道，EPHA2不仅在癌细胞中表达，也在肿瘤及其周围的血管中表 达(Oncogene，2000，第19卷，第6043-6052页)。据报道，在小鼠中，EPHA2信号涉及由 ephrin-Al诱导的血管生成，并且特别地，血管内皮细胞中表达的EPHA2对血管生成或血管 内皮细胞的存活是必需的(Journal of Cell Science，2004，第117卷，第2037-2049页)。 还有文献报道，EPHA2胞外区与人IgGFc区的融合蛋白在体内抑制血管生成并表现出抗肿 瘤作用(Oncogene，2002，第 21 卷，第 7011-7026 页)。 单克隆抗体不仅可用作诊断药物也可用作治疗药物。特别地，单克隆抗体被广 泛地用于癌症治疗领域，而且针对受体酪氨酸激酶(例如HER2和EGFR)或针对CD20胞 外区的单克隆抗体被用于癌症治疗并表现出极佳的效果(The New England Journal of Medicine, 2007,第 357 卷，第 39-51 页；Oncogene, 2007,第 26 卷，第 3661-3678 页和 Oncogene，2007，第26卷，第3603-3613页)。单克隆抗体在用于癌症治疗中的作用机制包 括诱导凋亡和生长信号的抑制。此外，其免疫应答介导的作用(例如ADCC或CDC)也被认 为起非常重要的作用。实际上，已有文献报道，当向Fc γ R(Fe γ R对于诱导ADCC是必需的) 缺陷的裸鼠和非FcyR缺陷的裸鼠给予抗HER2抗体(曲妥珠单抗(trastuzumab))或抗 CD20抗体(利妥昔单抗(rituximab))时，这两种抗体在前一种小鼠的异种移植物中比在后 一种小鼠中表现出的抗肿瘤效果弱得多(Nature Medicine, 2000，第6卷，第443-446页)。 还有文献报道，当向补体缺失的小鼠(通过给予眼镜蛇毒(cobra venom))和非补体缺失的 小鼠给予抗CD20抗体利妥昔单抗时，所述抗体在前一种小鼠比后一种中表现出更弱的抗 肿瘤效果(Blood, 2004，第 103 卷，第 2738-2743 页)。据报道，对于EPHA2，拮抗性抗EPHA2单克隆抗体具有诱导EPHA2酪氨酸残基磷 酸化活性和诱导EPHA2降解活性，对于其配体而言，所述抗体抑制了乳腺癌细胞系的不依 赖贴壁的生长及其在胞外基质上管状形态的形成(Cancer Research，2002，第62卷，第 2840-2847页)。还有文献报道，拮抗性抗EPHA2单克隆抗体在体内表现出抗肿瘤效果，所述 单克隆抗体识别癌细胞而不是非癌细胞上展示的EPHA2上的表位并且具有诱导EPHA2酪氨 酸残基磷酸化活性和诱导EPHA2降解活性(Cancer Research, 2003，第63卷，第7907-7912 页和WO 03/094859扉页)。另一方面，Kiewlich等报道其抗EPHA2单克隆抗体具有诱 导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性和诱导EPHA2降解活性，但并不表现出体内抗肿瘤效果 (Neoplasia, 2006，第 8 卷，第 18-30 页)。此外，WO 2006/084226扉页公开了通过用癌细胞免疫接种小鼠得到的抗EPHA2单 克隆抗体LUCA19、SG5、LUCA40和SPL1，并公开在用毒素(皂草毒蛋白)标记的抗小鼠抗体 存在下，在上述这些抗体，LUCA19和SG5不影响EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；LUCA40抑制 癌细胞体外生长；而LUCA19、SG5和LUCA40被内化到癌细胞内。该文件还报道LUCA40和 SPLl在体内表现出抗肿瘤效果。然而，这些抗体的拮抗活性是否存在仍待阐明。尽管有以上研究，但对应于在体内表现出抗肿瘤效果的抗EPHA2抗体的表位仍未 知。现有文件无一报道EPHA2胞外区中的特定氨基酸序列可用作适用于癌症治疗的单克隆 抗体所针对的表位。
即使针对相同抗原的抗体在其性质上也会有所不同，视表位或其序列的差异而 定。此外，由于它们性质上的所述差异，所述抗体当给予人时根据以下方面以不同的方式诱 导临床反应药物有效性、治疗反应的频率、副作用和耐药性的出现频率等。因此，在临床上具有最佳性质的药物也可能因患者而不同。在很多情况下，所述性 质在实际给药前是未知的。因此，强烈需要开发具有新型作用机制的药物。还强烈需要开 发与常规抗体性质不同的针对EPHA2的抗体。发明公开 待本发明解决的问题本发明的目标是提供针对EPHA2的抗体。本发明的另外目标是提供包含对癌症有治疗作用的抗EPHA2抗体的药物组合物寸。本发明的另外目标是提供用于制备所述抗体的方法。本发明的另外目标是提供利用所述抗体用于抑制肿瘤生长的方法等等。解决问题的手段本发明进行努力研究以达到所述目标，由此成功地获得新型抗EPHA2单克隆抗 体，所述抗体无诱导EPHA2酪氨酸残基磷酸化活性，但具有针对表达EPHA2的癌细胞的ADCC 活性和CDC活性。此外，本发明人分析了上述抗体所针对的表位，从而首次发现了一种抗体 具有体内良好抗肿瘤活性，所述抗体结合包含EPHA2中存在的两个纤连蛋白III型结构域 的C端结构域的区域。本发明基于这些结果得以完成。具体而言，本发明包括(1) 一种抗体，所述抗体识别产生自杂交瘤SH348-1 (FERMBP-10836)的抗体所识 别的表位；(2)第⑴项的抗体，其中所述抗体具有以下a)_d)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和d)具有体内抗肿瘤活性；(3)第(1)项的抗体，其中所述抗体具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；
c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；d)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和e)具有体内抗肿瘤活性；(4) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨 基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽；(5) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨 基酸所表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)_d)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；
c)具有针对表达epha2的细胞的⑶c活性；和d)具有体内抗肿瘤活性；(6) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中seq id no 8的第426-534位氨 基酸表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化epha2酪氨酸残基的能力； b)表现出降低epha2蛋白水平的作用；c)具有针对表达epha2的细胞的adcc活性；d)具有针对表达epha2的细胞的⑶c活性；和e)具有体内抗肿瘤活性；(7)第(1)-(6)项中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中seq id no 8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽；(8)第(1)_(7)项中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由epha2配体诱导的epha2
酪氨酸残基的磷酸化；(9)第(1)_(7)项中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制epha2配体结合epha2但 抑制由所述配体诱导的epha2酪氨酸残基的磷酸化；(10) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中seq id no :8所表示的氨基酸序 列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列由 序列表中seq id no :59、61和63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多 个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的 以下氨基酸序列由序列表中seq id no :65、67和69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序 列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；(11) 一种特异性结合由序列表中seq id no :8所表示的氨基酸序列组成的多肽 的抗体，所述抗体表征在于以下1)和2)1)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι)其中，frh1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶rh1表示由序列表中 seq id no :59表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取 代或添加的氨基酸序列；frh2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；cdrh2表示由序 列表中seq id no :61表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的 缺失、取代或添加的氨基酸序列；frh3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；cdrh3表 示由序列表中seq id no :63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨 基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而frh4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序 列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和2)具有包含由通式(ii)表示的氨基酸序列的轻链多肽-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ιι)其中，frl1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶rl1表示由序列表中seq id no 65表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代 或添加的氨基酸序列；frl2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；cdrl2表示由序列 表中seq id no :67表示的氨基酸序列；frl3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；〇0扎3表示由序列表中SEQ ID NO :69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或 多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基 酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；(12) 一种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH357-1 (FERMBP-10837)的抗体识 别的表位；(13)第(12)项的抗体，其中所述抗体具有以下a)_d)的性质
a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和d)具有体内抗肿瘤活性；(14) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨 基酸所表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)不表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；d)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和e)具有体内抗肿瘤活性；(15)第(12)-(14)项中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽；(16)第(12)-(15)项中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的 EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；(17)第(12)-(15)项中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合 EPHA2但抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化；(18) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8所表示的氨基酸序 列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的以下氨基酸序列由 序列表中SEQ ID NO :71、73和75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多 个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的 以下氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO :77、79和81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序 列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；(19) 一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8所表示的氨基酸序 列组成的多肽，所述抗体特征在于以下1)和2)1)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι)其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中 SEQ ID NO :71表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取 代或添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序 列表中SEQ ID NO :73表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的 缺失、取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表 示由序列表中SEQ ID NO :75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL1表示由序列表中SEQ ID NO :77表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或 添加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表 中SEQ ID NO :79表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、 取代或添加的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由 序列表中SEQ ID NO :81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸 的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其 中这些氨基酸彼此通过肽键连接。(20)第(1)_(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人源化抗体；(21)第(1)_(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人抗体；(22)第(1)_(19)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为IgG抗体；(23)第(1)_(9)和(12)_(17)项中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为选自以 下的任何抗体Fab、F(ab' ) 2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体；(24) 一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH348-1 (FERMBP-10836)；(25) 一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH357-1 (FERMBP-10837)；(26) 一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 35的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链 多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO :39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 37的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽，或包含由SEQ ID NO 41的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；(27) 一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 35的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链 多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽；或2)包含由序列表中SEQ ID NO 39的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链 多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽；(28) 一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO :35表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列 表中SEQ ID NO 39表示的氨基酸序列的重链多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO :37表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列 表中SEQ ID NO 41表示的氨基酸序列的轻链多肽；(29) 一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 35表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中SEQ ID NO 37表示的氨基酸序列的轻链多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 39表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表 中SEQ ID NO 41表示的氨基酸序列的轻链多肽；(30) 一种抗体，所述抗体通过人源化第(24)-(29)项中任一项的抗体得到；(31) 一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO :115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链 多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻 链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO 99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；(32) 一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO 99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；(33) 一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，或包含由序列表中SEQ ID NO :147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链 多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻 链多肽或包含由序列表中SEQ ID NO :131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；(34) 一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQ ID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；和2)包含由序列表中SEQ ID NO 147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重 链多肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链 多肽；(35)衍生自第(24)-(34)项中任一项的抗体的Fab、F(ab' ) 2、Fv、scFv、双抗体、 线性抗体或多特异性抗体；(36)选自以下1)-20)中任一种的多肽1)包含由序列表中SEQ ID NO 35的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；2)包含由序列表中SEQ ID NO 39的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；
3)包含由序列表中SEQ ID NO 37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；4)包含由序列表中SEQ ID NO 41的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；5)包含由序列表中SEQ ID NO 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；6)包含由序列表中SEQ ID NO 115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽； 7)包含由序列表中SEQ ID NO 107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；8)包含由序列表中SEQ ID NO 115的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；9)包含由序列表中SEQ ID NO 91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；10)包含由序列表中SEQ ID NO 99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；11)包含由序列表中SEQ ID NO 91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；12)包含由序列表中SEQ ID NO 99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多 肽；13)包含由序列表中SEQ ID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；14)包含由序列表中SEQ ID NO 147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；15)包含由序列表中SEQ ID NO 139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；16)包含由序列表中SEQ ID NO 147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；17)包含由序列表中SEQ ID NO 123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；18)包含由序列表中SEQ ID NO 131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；19)包含由序列表中SEQ ID NO 123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；和20)包含由序列表中SEQ ID NO 131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的 多肽；(37)小鼠杂交瘤 SH348-1(FERM BP-10836)；(38)小鼠杂交瘤 SH357-1 (FERM BP-10837)；(39) 一种药物组合物，其特征在于包含选自第(1)_(35)项的抗体中的至少一种抗体；(40) 一种用于癌症治疗的药物组合物，其特征在于包含选自第(1)_(35)项的抗 体中的至少一种抗体；(41) 一种用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予选自第 (1)_(35)、(39)和(40)项的抗体中的任何抗体；(42)第(41)项的用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法特征在于所述肿瘤为表达 EPHA2的肿瘤 ；(43) 一种多核苷酸，所述多核苷酸编码(1)_(36)中任一项的抗体或多肽；(44) 一种宿主细胞，所述宿主细胞转化了第(43)项的多核苷酸；和(45) 一种使用第(44)项的宿主细胞制备抗体的方法。本发明的优点本发明已成功得到新型抗EPHA2的单克隆抗体，所述抗体不具有诱导EPHA2酪氨 酸残基磷酸化的活性但具有针对表达EPHA2的癌细胞的ADCC活性和CDC活性。此外，业已 发现所述抗体在体内具有良好的抗肿瘤活性。此外，本发明提供了包含所述抗体的用于癌症治疗的药物组合物。附图简述

图1为显示蛋白印迹的结果的图，该结果显示存在或不存在抗EPHA2抗体诱导 EPHA2酪氨酸残基磷酸化的活性。图1A)为显示在没有交联抗体的情况下得到的结果的图， 其中上面的条带显示关于4G10抗体的结果，下面的条带显示关于抗EPHA2抗体(D7)的结 果。图1B)是显示在存在交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示4G10抗 体的结果，下面的条带显示抗EPHA2抗体(D7)的结果；图2为显示蛋白印迹的结果的图，该结果显示存在或不存在抗EPHA2抗体诱导降 低EPHA2蛋白水平的活性。图2A)为显示在没有交联抗体的情况下得到的结果的图，其中 上面的条带显示关于抗EPHA2抗体(D7)的结果，下面的条带显示关于抗β肌动蛋白抗体 的结果。图2Β)为显示在存在交联抗体的情况下得到的结果的图，其中上面的条带显示关 于抗ΕΡΗΑ2抗体(D7)的结果，而下面的条带显示关于抗β肌动蛋白抗体的结果；图3为显示存在或不存在抗ΕΡΗΑ2抗体对各种细胞系的ADCC活性的图。图中“ ’ 表示P < 0. 01，“***”表示P < 0. OOlo图3Α)为显示对MDA-MB-231细胞的ADCC活性的图。 图3Β)为显示对Α549细胞的ADCC活性的图。图3C)为显示对PC-3细胞的ADCC活性的 图；图4为显示存在或不存在抗ΕΡΗΑ2抗体对各种细胞的⑶C活性的图。图中“_”表 示P < 0. 001。图4Α)为显示SH348-1对MDA-MB-231细胞的CDC活性的图。图4Β)为显示 SH348-1对Α549细胞的⑶C活性的图。图4C)为显示SH348-1对PC-3细胞的⑶C活性的 图。图4D)为显示SH357-1对MDA-MB-231细胞的CDC活性的图。图4Ε)为显示SH357-1 对Α549细胞的⑶C活性的图。图4F)为显示SH357-1对PC-3细胞的⑶C活性的图；图5Α)显示ΕΡΗΑ2结构域的结构预测，和在ΕΡΗΑ2中作为表位确定肽的 EPHA2-ECD、FNIII-NC、FNIII-N和FNIII-C的位置。在该图中，配体-BD表示配体结合域， FN3表示纤连蛋白III型结构域，TM表示跨膜区，Trk激酶表示酪氨酸激酶结构域，SAM表 示SAM结构域；
图5B)为显示存在或不存在抗EPHA2抗体对EPHA2-ECD、FNI11-NC, FNIII-N和 FNIII-C的结合活性的图；图6A)为显示SH348-1对移植了 MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性的图；图6B)为显示SH357-1对移植了 MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性的图。在 图中，误差线表示标准误差(η = 9)；图7Α)为显示SH348-1对ΕΡΗΑ2胞外区多肽的结合活性的图；图7Β)为显示SH357-1对ΕΡΗΑ2胞外区多肽的结合活性的图；图7C)为显示Ab96_l对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；图8为显示SH348-1、SH357-1和Ab96_l的配体结合抑制活性的图；图9为显示SH348-1和SH357-1具有抑制EPHA2酪氨酸残基的^hrin-Al依赖性 磷酸化的活性的图；图10为显示用于表位鉴定的EPHA2缺失突变体的概况的图；图11A)为显示SH348-1对EPHA2缺失突变体的反应性的图；图11B)为显示图11A)中的EPHA2缺失突变体在PVDF膜上的检测情况的图；图11C)为显示SH357-1对EPHA2缺失突变体的反应性的图；图11D)为显示图11C)中的EPHA2缺失突变体在PVDF膜上的检测情况的图；图12A)为显示hSH348-l_Tl对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；图12B)为显示hSH348-l-T3对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；图12C)为显示hSH357-l_Tl对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；图12D)为显示hSH357-l_T3对EPHA2胞外区多肽的结合活性的图；图13A)为显示hSH348-l-Tl和hSH348_l_T3对SH348-1的抗原结合的竞争性抑 制活性的图；图13B)为显示hSH348-l-Tl和hSH348_l_T3对SH357-1的抗原结合的竞争性抑 制活性的图；图 14A)为显示 hSH348-l-Tl 或 hSH348_l_T3 对 EPHA2 酪氨酸残基的印hrin-Al 依赖性磷酸化的抑制活性的图；和图 14B)为显示 hSH357-l-Tl 或 hSH357_l_T3 对 EPHA2 酪氨酸残基的印hrin-Al 依赖性磷酸化的抑制活性的图。本发明最佳实施方式1.定义在本说明书中，所用术语“癌症”和“肿瘤”含义相同。在本说明书中，术语“基因”意指不仅涵盖DNA，还涵盖其RNA、其cDNA和其cRNA。 因此,术语“EPHA2基因”在本发明中涵盖EPHA2的DNA、mRNA、cDNA和cRNA。在本说明书中，所用术语“多核苷酸”与核酸含义相同并且还涵盖DNA、RNA、探针、 寡核苷酸和引物。在本说明书中，所用术语“多肽”和“蛋白，，彼此之间没有差别。在本说明书中，术语“细胞”还涵盖单个动物的细胞和培养的细胞。在本说明书中，术语“细胞恶性转化”意指表现出异常生长(例如失去对接触抑 制的敏感性)或表现出不依赖贴壁生长的细胞。表现出此类异常生长的细胞被称作“癌细胞”。在本说明书中，具有与EPHA2的细胞恶性转化活性和/或细胞生长活性等功能相 当的蛋白也被称作EPHA2。在本说明书中，术语“酪氨酸残基的磷酸化”意指肽的氨基酸序列中所含的酪氨酸 残基被磷酸化。酪氨酸残基是否被磷酸化可基于例如所述肽与抗磷酸酪氨酸的抗体(例如 抗磷酸酪氨酸的重组4G10HRP缀合物(购自Millipore(Upstate), #16-184) )的亲和力来 检测。当所述肽与抗体结合时，可确定酪氨酸残基被磷酸化。在本说明书中，术语“磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力”是指磷酸化EPHA2的氨基 酸序列中酪氨酸残基的能力。抗体是否具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力可通过例如以 下方法检测将抗体与EPHA2温育并随后检测是否存在EPHA2对抗磷酸酪氨酸抗体的亲和 力。在本说明书中，短语“降低EPHA2蛋白表达水平，，意指EPHA2的蛋白水平降低了。 抗体是否具有降低EPHA2蛋白水平的作用可通过例如以下方法检测将抗体与EPHA2温育 并随后对EPHA2水平定量。在本说明书中，术语“EPHA2配体”意指能作为EPHA2配体的物质。其具体实例可包 括 GPI ,苗定的质膜蛋白 ephrin-Al 至 ephrin-A5 (Annual Review of Neuroscience, 1998, 第21卷，第309-345页)。在本说明书中，术语“细胞毒性”是指细胞的任何病理改变，并且不仅指对细胞的 直接损伤也指对细胞的任何结构损伤或功能损伤，例如DNA裂解、碱基二聚化作用、染色体 断裂、有丝分裂器的损伤及各种酶活性降低。在本说明书中，术语“细胞毒活性”是指引起细胞毒性的活性。在本说明书中，ADCC与抗体依赖性细胞毒作用同义，并且是指以下反应荷有 Fcy受体的细胞经由所述反应借助Fc γ受体附着到与靶细胞表面抗原结合的抗体的Fc 部分并杀死靶细胞。ADCC活性也被称作抗体依赖性细胞毒活性并指引起所述反应的活性。 ADCC活性可通过本领域的技术人员通常进行的方法来检测，也可根据例如本说明书中实施 例3的第3)-2节中所述方法检测。在本说明书中，术语“CDC”与补体依赖性细胞毒作用同义。CDC活性是指导致补体 依赖性细胞毒作用的活性。CDC活性可通过本领域的技术人员通常进行的方法来检测，也可 根据例如本说明书中实施例3的第3)-3节中所述方法检测。在本说明书中，短语“具有体内抗肿瘤活性”意指具有抑制或减轻荷瘤动物个体 中肿瘤生长的活性。抗EPHA2抗体是否“具有体内抗肿瘤活性”可通过本领域的技术人 员通常进行的方法来检测，也可例如依照以下方法检测向皮下移植了肿瘤细胞(例如 MDA-MB-231细胞)的裸鼠(例如ALB/cAJcl_nu/nu ；购自CLEAJapan，Inc.)皮下给予作为 试验物质的合适剂量的抗EPHA2抗体，并比较所述裸鼠与未给予抗EPHA2抗体的对照之间 肿瘤体积的时间依赖性变化。当所述小鼠的肿瘤体积明显小于对照的肿瘤体积时，作为试 验物质的抗EPHA2抗体可被确定为“具有体内抗肿瘤活性”。业已了解抗体分子的每条重链和轻链具有三个互补决定区(⑶R)。在本说明书中， 抗体的互补决定区由以下表示重链的互补决定区由CDRHp CDRH2和CDRH3表示；而轻链的 互补决定区由CDRL^ CDRL2和CDRL3表示。
在本说明书中，术语“表位”意指在动物(优选哺乳动物、更优选小鼠或人)体内 具有抗原性和/或免疫原性的EPHA2的部分肽。具有抗原性的EPHA2部分肽的表位可通过 本领域的技术人员已知的方法(例如通过免疫检测)来确定，还可例如根据以下制备各种 EPHA2的部分结构的方法来确定。对于所述部分结构的制备，可使用本领域已知的寡肽合成 技术。例如，利用本领域技术人员熟知的基因重组技术制备从EPHA2的C-或N-端开始的 一系列连续缩短的合适长度的多肽。随后研究抗体对这些多肽的反应性。大致确定识别位 点后合成更短的肽。可研究对这些肽的反应性，从而确定表位。1.关于 EPHA2 (1)EPHA2 基因EPHA2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在GenBank中记录为EPH受体A2 (登记 号分别为NM_004431和NP_004422)。此外，EPHA2基因的开放阅读框(ORF)的核苷酸序列 参见序列表中的SEQ ID NO :1。其氨基酸序列参见序列表中的SEQ ID NO :2。在本文中，EPHA2还涵盖以下蛋白所述蛋白由有一个或多个氨基酸的取代、缺失 或添加的EPHA2氨基酸序列所衍生的氨基酸序列组成，并且具有与此酶的生物学活性相当 的生物学活性。(2)EPHA2基因的癌位点特异性表达据报道，EPHA2基因在许多癌症中高度表达，特别是以下癌症乳腺癌、食道癌、前 列腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤。特别地，可检测EPHA2在每种细胞和/或每种组织中的表达水平，从而确定受治疗 者中可由EPHA2的过量表达引起的恶性转化和/或肿瘤细胞生长的情况。此外，抑制EPHA2表达水平和/或活性的物质具有抑制由EPHA2引起的恶性转化 和/或癌细胞生长的活性。因此，将试验物质与表达EPHA2的细胞接触并选定抑制EPHA2的表达水平和/或 活性的物质，藉此筛选抗肿瘤物质。在本文中，针对EPHA2的siRNA抑制EPHA2表达并且可用作抗肿瘤药物。针对 EPHA2的siRNA可通过以下方法制备基于EPHA2mRNA的核苷酸序列设计由EPHA2mRNA的部 分序列组成的RNA (正义RNA)和由与所述RNA核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的RNA (反 义RNA)；通过本领域本身已知的化学合成方法合成上述RNA并杂交所得的两条RNA。优选 的是，称为突出端序列(overhang sequence)的一个或多个核苷酸的序列应与构成siRNA 的正义和反义RNA各自的3'-端连接。所述突出端序列不具体受到限制，只要其保护RNA 免受核酸酶降解即可。可使用优选1-10个核苷酸、更优选1-4个核苷酸、更优选2个核苷 酸的任何序列。2.针对EPHA2的抗体(1)抗原的制备用于获得本发明针对EPHA2的抗体的抗原的实例可包括EPHA2的全长多肽及其部 分多肽，并且更具体地可包括EPHA2的全长多肽并优选EPHA2的胞外区多肽(由序列表中 SEQ ID NO 8的第1-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成)、更优选EPHA2胞外区多肽中的 部分多肽(包含序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸序列)、甚 至更优选EPHA2胞外区多肽中的部分多肽(包含序列表中SEQ ID NO :8的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列)、以及通过向这些序列中添加任意氨基酸序列或载体所得的衍生多肽。其另外的实例可包括由至少6个氨基酸的连续部分氨基酸序列组成的多肽和通过 向这些序列中添加任意氨基酸序列或载体所得的衍生多肽。在本文中，用作抗原的EPHA2的全长多肽或其部分多肽可通过基因工程改造致使 EPHA2基因或其部分多肽的基因在宿主细胞中表达而得到。EPHA2可直接从人的肿瘤组织或肿瘤细胞中纯化以供使用。此外，可在体外合成， 或通过基因工程改造致使宿主细胞产生多肽来得到EPHA2的全长多肽或其部分多肽。在基因工程中，具体而言，将编码EPHA2或其部分多肽的基因引入能表达EPHA2或 其部分多肽的载体中，然后可在含有转录和翻译所需的酶、底物和能量物质的溶液中合成 EPHA2或其部分多肽。或者，可用所述基因转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞并使其 表达EPHA2或其部分多肽以得到所需蛋白。可通过例如所谓的聚合酶链式反应(在下文称作“PCR” )的方法得到EPHA2的部 分多肽的cDNA，其中用表达EPHA2的cDNA文库作模板和特异性扩增EPHA2cDNA或编码部分 多肽的 DNA 的引物进行 PCR(参见 Saiki，R. K.等· Science (1988) 239，第 487-489 页)。体外多肽合成的实例包括但不限于快速翻译系统(RTS，RapidTranslation System)(购自 Roche Diagnostics Corp)。原核细胞宿主的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)。为了用目标基因转化这些宿主细胞，用包含复制子(即复制起点) 和来源于与所述宿主相容的物种的调控序列的质粒载体转化所述宿主细胞。此外，优选所 述载体应具有可赋予经转化的细胞表型性状(表型)选择性的序列。宿主真核细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等细胞。例如以下细胞通常用作所述脊椎 动物细胞猴 COS 细胞(Gluzman, Y. Cell (1981) 23，第 175-182 页，ATCC CRL-1650)、小鼠 成纤维细胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷品系 (CH0 细胞，ATCC CCL-61) (Urlaub,G. ^P Chasin, L. Α. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 第4126-4220页)，但脊椎动物细胞并不限于以上所述。可按照标准方法培养由此得到的转化子并且所述转化子在培养期间能在胞内或 胞外产生目标多肽。用于培养的培养基可依照所采用的宿主细胞从常规使用的各种培养基中适当地 选定。对于大肠杆菌而言，例如可使用任选补充了抗生素(例如氨苄青霉素)或IPTG的LB
培养基。在培养中由所述转化子在胞内或胞外产生的重组蛋白可通过本领域已知的各种 分离方法利用重组蛋白的物理性质、化学性质等分离并纯化。所述方法可具体地例述为用常用的蛋白沉淀剂处理、超滤、各种液相色谱技术 (例如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析和高效液相色谱)和透 析以及它们的组合。此外，待表达的重组蛋白可与6个组氨酸残基连接，藉此在镍层析柱上有效地纯 化所得蛋白。通过将这些方法组合，可容易地以高产率和高纯度大量制备目标多肽。本发明抗体可由以下方法得到依照标准方法用抗原免疫接种动物并收集体内产生的抗体，随后进行纯化。此外，按照本领域已知的方法(例如Kohler和Milstein，Nature (1975) 256，第 495-497 页；禾口 Kennet，R.编辑，MonoclonalAntibodies,第 365—367 页，Plenum Press, N. Y. (1980))，将产生针对EPHA2的抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合并藉此建立杂交瘤，从中 也可得到单克隆抗体。
(2)抗EPHA2单克隆抗体的制备特异性结合EPHA2的抗体的实例可包括特异性结合EPHA2的单克隆抗体。用于获 得所述抗体的方法如下所述。对于单克隆抗体的制备，通常需要以下程序(a)纯化用作抗原的生物聚合体的步骤；(b)通过注射用所述抗原免疫接种动物后，从所述动物中收集血液，检测其抗体效 价以确定脾切除的时间，随后制备产生抗体的细胞的步骤，(C)制备骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的步骤，(d)将所述产生抗体的细胞与骨髓瘤进行细胞融合的步骤，(e)选择产生目标抗体的杂交瘤群体的步骤；(f)分成单细胞克隆(克隆化(cloning))的步骤，(g)根据情况培养用于制备大量单克隆抗体的杂交瘤或饲养移植了所述杂交瘤的 动物的步骤，(h)研究由此产生的单克隆抗体的生物活性和结合特异性或检测其作为标记试剂 的性质的步骤等等。在下文中，将按照这些步骤详述用于制备单克隆抗体的方法，但用于制备抗体的 方法并不仅限于此。例如，也可使用除脾细胞和骨髓瘤之外的产生抗体的细胞。(a)抗原的纯化通过上述方法制备的EPHA2或其部分多肽可用作抗原。此外，依照本领域技术人员熟知的方法，用表达EPHA2的重组体细胞制得的膜分 离物或EPHA2的重组体细胞自身化学合成的本发明中蛋白的部分肽也可用作抗原。(b)产生抗体的细胞的制备将步骤(a)中所得抗原与本领域技术人员已知的佐剂(例如弗氏完全佐剂或弗氏 不完全佐剂)或其它辅剂(例如硫酸铝钾)混合，并用这些免疫原免疫接种实验动物。毫 无疑问本领域已知的杂交瘤制备方法中所用的动物可用作所述实验动物。具体而言，可使 用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和马。但从与所提取产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞的 易获得性而言，优选使用小鼠和大鼠作为免疫接种动物。此外，实际所用小鼠和大鼠的品系不具体受到限制。例如可使用以下的小鼠品系 例如 A、AKR、BALB/c、BDP、ΒΑ、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L, DBA、FL、HTH、HTU LP, NZB, NZW、 RF、R III、SJL, SffR, WB 或 129 ；以及以下的大鼠品系例如 Low、Lewis、Sprague-Dawley, ACI、BN 或 Fischer。这些小鼠和大鼠可获自例如实验动物饲养机构/销售机构例如CLEA Japan, Inc. 禾口 Charles River Laboratories Japan，Inc0在这些谱系中，考虑到下述与骨髓瘤细胞的融合相容性，特别优选BALB/c谱系的小鼠和Low谱系的大鼠作为免疫接种的小鼠。 此外，考虑到人鼠之间的抗原同源性，还特别优选使用生物机能减少以去除了自 身抗体的小鼠(即自身免疫病的小鼠)。在免疫接种时这些小鼠或大鼠优选为5-12周龄、更优选6-8周龄。对于用EPHA2或其重组抗原对动物免疫接种，可使用以下文献详述的本领域已知 方法，例如 Weir，D. M.的实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)第 I、II 和 III 卷，BlackwellScientific Publications, Oxford (1987)以及 Kabat，E. Α.和 Mayer， Μ. Μ.的免疫化学实验(Experimental Immunochemistry), Charles C ThomasPublisher Springfield,Illinois(1964)。在这些免疫接种的方法中，本发明的优选方法将在下文具体阐述。具体而言，首先向动物皮内或腹膜内给予用作抗原的膜蛋白分离物或表达抗原的 细胞。然而，优选联合使用所述两种给药途径以提高免疫效率。免疫效率尤其可通过以 下方法提高在早期免疫时进行皮内给予抗原而在后期免疫或仅最后一次免疫时进行腹膜 内给予。抗原的给药方案可视被免疫动物的类型及其个体差异等而不同。所述抗原通常优 选按2-6周的间隔给予3-6个剂量、更优选按2-4周的间隔给予3-4个剂量。此外，所述抗原的剂量可视动物类型及其个体差异等而不同，并且通常为约 0. 05-5mg、优选约 0. 1-0. 5mg。在给予所述抗原后1-6周、优选2-4周、更优选2_3周进行加强免疫。在本文中，在加强免疫中所述抗原的剂量因动物类型及其体型等而异，例如对于 小鼠而言，所述剂量通常为约0. 05-5mg、优选约0. 1-0. 5mg、更优选约0. 1-0. 2mg。在加强免疫1-10天后、优选2-5天后、更优选2-3天后，在无菌条件下从被免疫接 种的动物中提取含有产生抗体的细胞的脾细胞或淋巴细胞。在该方法中测量其抗体效价，抗体效价足够大的动物可用作产生抗体的细胞的来 源，从而提高后续方法的效率。本文所用的测量抗体效价的方法的实例可包括但不限于RIA和ELISA。本发明抗体效价的测量可通过下述方法(例如按照ELISA)进行。首先，将纯化或部分纯化的抗原吸附在固相(例如用于ELISA的96孔板)的表面 上。此外，用与抗原无关的蛋白(例如牛血清白蛋白(下文称作“BSA”))覆盖未吸附抗原 的固相表面。洗涤表面并随后与作为第一抗体的系列稀释的样品(例如小鼠血清)接触， 以使所述样品中的抗体与抗原结合。此外，向其加入作为第二抗体的针对小鼠抗体的酶标记的抗体，从而使第二抗体 与鼠抗结合。洗涤后，向其加入所述酶的底物，并且例如通过检测基于底物降解的显色所致 的吸光度变化，藉此计算出抗体效价。可按照本领域已知的方法(例如Kohler等，Nature (1975) 256，第495页；Kohler 等，Eur. J. Immunol. (1977)6，第 511 页；Milstein 等，Nature (1977)，266，第 550 页禾口 Walsh, Nature, (1977) 266，第495页)从这些脾细胞或淋巴细胞中分离出产生抗体的细胞。例如，对于脾细胞，可采用常规方法，所述方法包括将所述细胞切成条状，将其通过不锈钢滤网过滤，随后通过漂浮于Eagle极限必需培养基(MEM)中从中分离出产生抗体 的细胞。(c)骨髓瘤细胞(下文称作“骨髓瘤”)的制备细胞融合中所用的骨髓瘤细胞不具体受到限制并且可从本领域已知的细胞株中 适当地选择以供使用。但考虑到方便从融合细胞中选出杂交瘤，优选使用已建立其选择方 法的HGPRT (次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)缺陷株。
其具体实例包括小鼠来源的X63-Ag8 (X63)、NSl-ANS/1 (NSl)、P3X63_Ag8. Ul (P3U1)、X63-Ag8. 653 (X63. 653)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、MPCl 1-45. 6TG1. 7 (45. 6TG)、F0、 S149/5XX0 和 BU. 1 ；大鼠来源的 210. RSY3. Ag. 1. 2. 3 (Y3)和人来源的 U266AR(SK0_007)、 GM1500. GTG-A12 (GM1500)、UC729-6、LICR-L0N-HMy2 (HMy2)和 8226AR/NIP4-1 (NP41)。这些HGPRT缺陷株可获自例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection (ATCC))。这些细胞株继代培养于合适的培养基中，例如8-氮鸟嘌呤培养基[补充了谷氨酰 胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(下文称作“FBS”)并另外补充了 8-氮杂鸟嘌呤的 培养基]、Iscove 改良的 Dulbecco 培养基(Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium,下 文称作“IMDM，，)或 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基(Dulbecco' s ModifiedEagle Medium, 下文称作“DMEM”)，并且在细胞融合前3-4天继代培养于普通培养基[例如含10 % FBS的 ASF104培养基(购自Ajinomoto Co.，Inc.)]中。在融合当天，确保细胞在2 X IO7个以上。(d)细胞融合产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞之间的融合可依照本领域已知的方法(例如 Weir, D. Μ.的实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)第 I、II 和 III 卷，Blackwell ScientificPublications, Oxford(1987)禾口 Kabat，Ε. Α.禾口 Mayer， Μ. Μ. , Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas PublisherSpringfield, Illinois (1964))在不过度减少细胞存活率的条件下适当进行。例如，化学方法(其包括将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞在高浓度的聚合物(例 如聚乙二醇)溶液中混合)和物理方法(使用电刺激)可用作所述方法。在这些方法中，下文具体例述了化学方法。具体而言，当将聚乙二醇用作高浓度聚合物溶液中的聚合物时，在30-40°C、优选 35-38°C的温度下，在分子量为1500-6000、优选2000-4000的聚乙二醇溶液中混合产生抗 体的细胞和骨髓瘤细胞，持续1-10分钟、优选5-8分钟。(e)杂交瘤群体的选择用于选择通过细胞融合得到的杂交瘤的方法不具体受到限制，并且通常使用 HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)选择法(Kohler等，Nature (1975) 256，第495页和 Milstein 等，Nature (1977) 266，第 550 页)。通过使用不可在氨基蝶呤中存活的HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞株，该方法能有效得 到杂交瘤。具体而言，可在HAT培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，由此仅使抗氨基蝶呤 的杂交瘤存活并生长。(f)分成单细胞克隆(克隆化)
例如，诸如甲基纤维素、软琼脂糖和有限稀释法等本领域已知的方法可用作 克隆杂交瘤的方法(参见例如Barbara，B.M.和Stanley，Μ. S.的细胞免疫学的选择 方 法(Selected Methods in Cellularlmmunology), W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980))。在这些方法中，特别优选有限稀释法。在该方法中，将饲养细胞(feeder)(例如胎鼠来源的成纤维细胞株或普通小鼠的 脾细胞、胸腺细胞或腹水细胞)接种在微量培养板上。另一方面，预先在培养基中将杂交瘤稀释至0. 2-0. 5个个体/0. 2ml。按0. Iml/孔 的浓度加入含有悬浮于其中的经稀释的杂交瘤的该液体，并可对杂交瘤连续培养约2周并 按固定间隔(例如3天的间隔)用新的培养基更换约1/3的培养基，由此使杂交瘤克隆生 长。对于可观测到抗体效价的孔，例如对通过有限稀释法进行的克隆化重复2-4次， 可选出稳定观测到其抗体效价的克隆作为产生抗EPHA2单克隆抗体的杂交瘤株。由此克隆的杂交瘤株的实例可包括杂交瘤SH348-1和杂交瘤SH357-1。杂交瘤 SH348-1和杂交瘤SH357-1已于2007年6月8日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所 特许生物寄托中心(地址Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan) 中。杂交瘤SH348-1命名为SH348-1，保藏号为FERM BP-10836 ；杂交瘤SH357-1命名为 SH357-1，保藏号为 FERM BP-10837。在本说明书中，产生自杂交瘤SH348-1的抗体称作“ SH348-1 ”，产生自杂交瘤 SH357-1 的抗体称作 “SH357-1”。(g)通过杂交瘤培养制备单克隆抗体可培养由此选定的杂交瘤从而有效得到单克隆抗体。在培养前，优选应筛选产生 目标单克隆抗体的杂交瘤。为了进行该筛选，可采用本领域本身已知的方法。可例如通过(b)节所述的ELISA进行本发明抗体效价测定。通过上述方法得到的杂交瘤可在液氮或-80°C以下的冰箱中冻存。此外，完全克隆的杂交瘤可在HT培养基(无氨基蝶呤的HAT培养基)中传代数次， 随后从所述培养基换至普通培养基中培养。通过使用大培养瓶的旋转培养(rotational culture)或旋动培养(spinner culture)进行大规模培养。所述大规模培养中得到的上清液可按照本领域技术人员已知的方法(例如凝胶 过滤)纯化，以得到特异性结合本发明蛋白的单克隆抗体。此外，可向与杂交瘤谱系相同的小鼠(例如BALB/c)或Nu/Nu小鼠腹膜内注射杂 交瘤，并使其生长以获得含大量本发明的单克隆抗体的腹水。对于腹膜内给药，预先(给药前3-7天)给予矿物油(例如2，6，10，14-四甲基 十五烷(降植烷))以得到更大量的腹水。例如，提前向与杂交瘤谱系相同的小鼠经腹膜内注射免疫抑制剂以使T细胞失活。20天后，使IO6-IO7个杂交瘤克隆细胞悬浮于无血清的培养基(0.5ml)中，并向所述小 鼠经腹膜内给予所述液体。通常当腹水累积导致腹胀时，从所述小鼠中收集腹水。通过此方法，所得的单克隆抗体的浓度约比培养液的浓度高约100倍。
通过以上方法得到的单克隆抗体可通过例如下述方法纯化Weir，D. Μ.实 验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology),第 I、II、III 卷，Blackwell Scientific Publications, Oxford(1978)。所述纯化方法的具体实例包括硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析。对于纯化，也可用市售的单克隆抗体纯化试剂盒(例如MAbTrap GII Kit;购自 Pharmacia Inc.)等作为便利的方法。由此得到的单克隆抗体具有针对EPHA2的高抗原特异性。(h)单克隆抗体的试验 可如下所述测定由此得到的单克隆抗体的同种型和亚类。首先，鉴定方法的实例包括奥脱洛尼法(Ouchterlony method)、ELISA和RIA。奥脱洛尼法很方便但对于低浓度的单克隆抗体而言需要浓缩步骤。另一方面，当使用ELISA或RIA时，培养上清液直接与吸附了抗原的固相反应，并 且另外，与各种免疫球蛋白同种型和亚类相容的抗体可用作第二抗体，由此鉴定出单克隆 抗体的同种型或亚类。此外，用于鉴定的市售试剂盒(例如Mouse Typer Kit ；购自Bio-Rad Laboratories, Inc.)等也可用作更便利的方法。 此外，依照福林酚(Fo 1 in-Lowry)法并利用280nm处的吸光度的计算方法 [1.4(0D280) = lmg/ml免疫球蛋白]可对蛋白定量。(3)其它抗体本发明抗体涵盖针对EPHA2的单克隆抗体以及为了某些目的(例如减少对人的异 种抗原性)而人工修饰的遗传重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。这些抗体可 依照已知方法制备。嵌合抗体的实例包括具有来源于彼此不同的物种的可变区和恒定区的抗体，并且 特别包括含有相连的鼠源可变区与人源恒定区的嵌合抗体(参见Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，81，6851-6855，(1984))。人源化抗体的实例可包括含有互补决定区(OTR)被另一物种的⑶R置换的人 源抗体的抗体(参见Nature (1986) 321，第522-525页)；以及含有CDR序列和某些构架 氨基酸残基通过CDR移植被另一物种的相应CDR序列和残基置换的人抗体的抗体(参见 W090/07861和 US6972323)。本发明抗体的另外的实例可包括抗人抗体。所述抗EPHA2人抗体意指仅具有人 染色体来源的抗体的基因序列的人抗体。所述抗EPHA2人抗体可通过以下方法得到利用 具有含人抗体H链和L链基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠(参见例如Tomizuka， K.等，Nature Genetics (1997) 16，第 133-143 页；Kuroiwa，Y.等，Nucl. Acids Res. (1998) 26，第 3447-3448 页；Yoshida，H.等，AnimalCell Technology =Basic and Applied Aspects 第 10 卷，第 69-73 页(Kitagawa，Y.，Matsuda, Τ.和 Iijima，S.编辑)，Kluwer AcademicPublishers, 1999 和 Tomizuka，K.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97,第 722-727 页)。对于这样的转基因动物，具体而言，可通过制备敲除动物和转基因动物并使这些 动物杂交得到遗传重组动物，所述遗传重组动物中非人类哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链的基因座被破坏，取而代之，经由酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋 白重链和轻链的基因座。此外，通过基因重组技术，用编码这样的人抗体重链和轻链各自的cDNA(优选含 所述cDNA的载体)转化真核生物细胞，也可培养产生遗传重组的人单克隆抗体的转化细胞 并由此从培养上清液中得到这些抗体。在本文中，可使用例如真核细胞、优选哺乳动物细胞(例如CHO细胞、淋巴细胞和 骨髓瘤)作为宿主。
此外，用于获得从人抗体文库中选择的噬菌体展示的人抗体的方法也是 己知的(参见例如 Wormstone， I. M.等，InvestigativeOphthalmology & Visual Science. (2002)43(7)，第 2301-2308 页；Carmen，S.等，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，第 189—203 页禾口 Siriwardena， D.等， Ophthalmology (2002) 109 (3)，第 427-431 页)。例如，可使用噬菌体展示方法，所述方法包括使人抗体可变区以单链抗体 (scFv)表达在噬菌体的表面并选定与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology (2005), 23，(9)，第 1105-1116 页)。同样地，还可使用另一种噬菌体展示方法，所述方法包括使人抗体Fab(抗原结 合片段)表达在噬菌体的表面并选定与抗原结合的噬菌体(W0 97/08320和WO 01/05950)。可分析基于抗原结合而选定的噬菌体基因，从而确定编码与抗原结合的人抗体可 变区的DNA序列。当清楚与所述抗原结合的scFv或Fab的DNA序列时，从所述DNA序列中析取 出CDR序列，可制备具有所述序列的表达载体并引入合适的宿主中，随后通过基因表达 获得人抗体(W0 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、 W095/01438, WO 95/15388、Annu. Rev. Immunol (1994) 12，第 433-455 页和 Nature Biotechnology (2005) 23 (9)，第 1105-1116 页)。可暂时分离所述抗体的基因并随后引入合适的宿主中以制备抗体。在这样的情况 下，可结合合适的宿主和表达载体以供使用。当真核细胞用作宿主时，可使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。动物细胞的实例可包括(1)哺乳动物细胞，例如猴COS细胞(Gluzman， Y. Cell (1981) 23，第 175-182 页，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株 (Urlaub, G.和 Chasin，L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1980) 77，第 4126-4220 页)。此外，还可修饰这些宿主以表达具有修饰的糖链结构和ADCC活性(抗体依赖的细 胞毒活性)或CDC活性增强的抗体以供使用。此类宿主的实例可包括CHO细胞，所述细胞 包含其中引入了编码能产生抗体组合物的抗体分子的基因，在所述抗体组合物中，在其还 原端具有未结合岩藻糖的N-乙酰葡糖胺的糖链占与抗体Fc区连接的混合型N-糖苷连接 的糖链的20%以上(参见TO 02/31140)。当使用原核细胞时，其实例可包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。通过转化将目标抗体基因引入这些细胞中，并在体外培养经转化的细胞以得到抗 体。
本发明抗体的同种型不受限制，其实例包括IgG(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、 IgAdgAl或IgA2)、IgD和IgE,并且可优选包括IgG和IgM。此外，本发明抗体可为具有所述抗体的抗体结合位点的抗体片段或其修饰形式。所述抗体片段的实例包括Fab、F (ab' ) 2、Fv、含经由合适的接头连接的重链Fv 和轻链Fv的单链Fv(SCFV)、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，本发明抗体可为对至少两种不同的抗原具有特异性的多特异性抗体。这样的分子通常结合两种抗原(即双特异性抗体)。本发明的“多特异性抗体”涵盖对多种(例如三种)抗原具有特异性的抗体。用作本发明抗体的多特异性抗体可为全长抗体或此类抗体的片段(例如 F(ab' ) 2双特异性抗体)。所述双特异性抗体可通过使两种抗体的重链和轻链(HL对)结 合来制备，或者也可通过使产生彼此不同的单克隆抗体的杂交瘤融合以制备产生双特异性 抗体的融合细胞(Millstein 等，Nature (1983) 305，第 537-539 页)。本发明抗体可为单链抗体(也称作scFv)。单链抗体通过将抗体的重链和轻链的 V 区经由多月太接头连接得至Ij (Pluckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 和 Moore 编辑，Springer Verlag, New York,第 269-315 页(1994))禾口 NatureBiotechnology (2005)，23，第 1126-1136 页)。用于制备单链抗体的方法为本领域所已知(参见例如美国专利第4，946，778号、 第5，260，203号、第5，091，513号和第5，455，030号)。在所述scFv中，重链和轻链的V 区经由并不形成缀合物的接头(优选多肽接头)连接(Huston，J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. (1988)，85，第5879-5883页)。scFv中重链和轻链的V区可来源于相同或不同 的抗体。例如，12-19个残基的任意单链肽用作连接所述V区的肽接头。如下得到编码scFv的DNA 将编码抗体重链或重链V区的DNA以及编码其轻链或 轻链V区的DNA的全长序列或部分序列(编码所需的氨基酸序列)作为模板，用设计用于 其两端的引物对通过PCR法扩增；随后结合设计用于分别使接头序列两端连接至重链和轻 链序列的引物对来进一步扩增编码肽接头部分的DNA。此外，一旦制得编码scFv的DNA，依照标准方法可得到包含所述DNA的表达载体和 转化了所述表达载体的宿主。此外，通过利用所述宿主，依照标准方法可得到所述scFv。对于这些抗体片段，按以上相同的方法得到并表达其基因，并可使宿主产生所述 抗体片段。本发明抗体可为多克隆抗体，其是氨基酸序列不同的多种抗EPHA2抗体的混 合物。多克隆抗体的一个实例可包括CDR不同的多种抗体的混合物。培养产生彼此不 同的抗体的细胞混合物，并且从培养物中纯化的抗体可用作这样的多克隆抗体(参见 W02004/061104)。通过将本发明抗体与各种分子(例如聚乙二醇(PEG))结合得到的抗体也可用作 所述抗体的修饰形式。此外，本发明抗体可为这些抗体与其它药物形成的缀合物(免疫缀合物)。此类抗 体的实例可包括通过将这些抗体与放射性物质或具有药理作用的化合物结合得到的缀合 物(Nature Biotechnology (2005) 23，第 1137-1146 页)。
可纯化所得到的抗体直至均质。在抗体的分离和纯化中，可使用用于普通蛋白的任何分离/纯化方法。可通过合适地选择和联合以下方法来分离和纯化抗体例如使用层析柱、过滤、超 滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦(蛋白纯化和表征的策略实验路
(Strategies forProtein Purification and Characterization :A Laboratory CourseManual), Daniel R. Marshak 等编缉，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1996) 禾口抗体实验室手册(Antibodies :A Laboratory Manual. ) Harlow 禾Π David Lane 编辑， Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但分离/纯化方法但不限于以上所述。层析的实例包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附 层析。这些层析技术可利用液相色谱(例如hplc或fplc)进行。亲和层析中所用柱的实例包括蛋白a柱和蛋白g柱。 基于蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、P0R0S和S印haroseF. F. (Pharmacia Inc.) 。此外，抗体还可通过其对抗原的亲和力，使用抗原固定化载体进行纯化。3.本发明抗体的性质通过上述方法得到的本发明抗EPHA2抗体具有以下性质(1)本发明的一种抗体具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；d)具有体内抗肿瘤活性；和e)特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸 序列组成的多肽。具有这样的性质的抗体的实例可包括选自以下1)_8)中任一种抗体1)SH348-1,2)识别由产生自杂交瘤SH348-1 (FERM BP-10836)的抗体识别的表位的抗体，3) 一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO 59,61和63表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO :65、67和69表示的氨基酸序列，4)特征在于以下i)和ii)的抗体i)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι)其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中 SEQ ID NO :59表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH2 表示由序列表中SEQ ID NO 61表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨 基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO :63表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨 基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽
-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)
其中，frl1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶rl1表示由序列表中seq id no 65表示的氨基酸序列；frl2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；cdrl2表示 由序列表中seqid no 67表示的氨基酸序列；frl3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸 序列；cdrl3表示由序列表中seq id no :69表示的氨基酸序列；而frl4表示由10个氨基酸 组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。5)sh357-1,6)识别由产生自杂交瘤sh357_1(ferm bp-10837)的抗体识别的表位的抗体，7) 一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中seq id no 71、73和75表示的氨基酸序列，并具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中seq id no 77、79和81表示的氨基酸序列，8)第(5)-(7)项中任一项的抗体，所述抗体特征在于以下i)和ii)i)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι)其中，frh1表示由18-30个氨基酸的序列组成的任意氨基酸序列；⑶rh1表示由序 列表中seq id no :71表示的氨基酸序列；frh2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列； ⑶rh2表示由序列表中seq id no 73表示的氨基酸序列；frh3表示由32个氨基酸组成的 任意氨基酸序列；cdrh3表示由序列表中seq id no :75表示的氨基酸序列；而frh4表示由 11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，frl1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶rl1表示由序列表中seq id no 77表示的氨基酸序列；frl2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；cdrl2表示 由序列表中seqid no 79表示的氨基酸序列；frl3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸 序列；cdrl3表示由序列表中seq id no 81表示的氨基酸序列；而frl4表示由10个氨基酸 组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。(2)本发明的另一种抗体具有以下a)_f)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有针对表达epha2的细胞的adcc活性；d)具有针对表达epha2的细胞的⑶c活性；e)具有体内抗肿瘤活性；和f)特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸 序列组成的多肽。具有此类性质的抗体的实例可包括选自以下1)_4)中任一种抗体1)sh348-1, 2)识别由产生自杂交瘤sh348-1 (ferm bp-10836)的抗体识别的表位的抗体，
3) 一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中seq id no 59,61和63表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中seq idNO :65、67和69表示的氨基酸序列，4)特征在于以下i)和ii)的抗体i)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι) 其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中 SEQ ID NO :59表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH2 表示由序列表中SEQ ID NO 61表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨 基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO :63表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨 基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL1表示由序列表中SEQ ID NO 65表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示 由序列表中SEQID NO 67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸 序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO :69表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸 组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。(3)本发明的另一种抗体具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有 adcc 活性；d)具有cdc活性；e)具有体内抗肿瘤活性；和f)特异性结合由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸所表示的氨基酸 序列组成的多肽。具有所述性质的抗体的实例可包括选自以下1)-4)中任一种抗体1)SH357-1,2)识别由产生自杂交瘤SH357_1(FERM BP-10836)的抗体识别的表位的抗体，3) 一种抗体，所述抗体具有作为重链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO 71、73和75表示的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区的互补决定区的序列表中SEQ ID NO :77、79和81表示的氨基酸序列，4)具有以下i)和ii)的性质的抗体i)具有包含由通式⑴表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4- (ι)其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中 SEQ ID NO 71表示的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH2 表示由序列表中SEQ ID NO 73表示的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨 基酸序列；CDRH3表示由序列表中SEQ ID NO :75表示的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨 基酸组成的任意氨基酸序列，其中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和ii)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽
-Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL1表示由序列表中SEQ ID NO 77表示的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示 由序列表中SEQID NO 79表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序列表中SEQ ID NO 81表示的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸 组成的任意氨基酸序列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。4.包含抗ΕΡΗΑ2抗体的药物本发明的抗ΕΡΗΑ2抗体可用作药物，特别地，可用作预期治疗癌症的药物组合物 或用作免疫诊断此类疾病的抗体。癌症类型的优选实例可包括但不限于乳腺癌、食道癌、前列腺癌、胃癌、非小细胞 肺癌、结肠癌和多形性成胶质细胞瘤。本发明还提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的抗ΕΡΗΑ2抗体和可药用稀 释齐 、载体、增溶齐 、乳化剂、防腐剂和/或辅料。优选的是，对接受所述药物组合物的个体而言，本发明的药物组合物中的可药用 物质在所用的剂量或给药浓度下应是无毒的。本发明的药物组合物可含有用于改变、保持或维持以下性质的药用物质ρΗ、渗透 压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌、稳定性、溶解速率、持续释放速率、吸收性或渗透性。药用物质的实例可包括但不限于以下氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、 天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠)； 缓冲液(例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液)、碳酸氢盐溶液和Tris-HCl 溶液；填充剂(例如甘露醇和甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例 如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精)；补充剂(例如葡萄糖、甘露 糖和糊精)；单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和其它烃类(例如糊精)；着色剂；矫味剂；稀释剂； 乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷)；低分子量多肽；成盐反荷离子；消毒剂(例如洁 尔灭、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、双氯苯双胍己烷、山梨酸和过 氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇和山梨醇)；助悬剂；表 面活性剂(例如PEG、脱水山梨糖醇酯、吐温类(例如吐温20和吐温80)、曲通、氨丁三醇、 卵磷脂和胆固醇)；促稳定剂(例如蔗糖和山梨醇)；强性增强剂(elasticity enhancer) (例如氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂；和/或药用辅料。这些药用物质的加入量优选比抗EPHA2抗体的重量高0. 01-100倍，特别优选高 0. 01-10 倍。在本文中，本发明还涵盖一种含免疫脂质体的药物组合物，所述免疫脂质体包含 脂质体中的抗EPHA2抗体或与脂质体结合的抗EPHA2抗体(美国专利第6214388号)。制剂中药物组合物的优选的组成可通过本领域的技术人员根据适应症、适用的给 药途径等适当地确定。药物组合物中的赋形剂或载体可为液体或固体。合适的赋形剂或载体可为注射用 水、盐水、脑脊液或常规用于胃肠外给药的其它物质。中性盐水和含血清白蛋白的盐水也可用作载体。所述药物组合物还可含有Tris 缓冲液(PH 7. 0-8. 5)或醋酸盐缓冲液(pH 4. 0-5. 5)以及山梨醇或其它化合物。本发明的药物组合物可配制成冻干形式或液态形式作为具有所选组合物和必要纯度的合适的药物。
还可使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将含抗EPHA2抗体的药物组合物配制成冻干 形式。 本发明的药物组合物可经配制用于肠胃外给药或还可经配制用于胃肠吸收。所述制剂的组成和浓度可视给药方法而定。当本发明的药物组合物中所含抗 EPHA2抗体对EPHA2具有较高的亲和力(即就解离常数(Kd值)而言，对EPHA2具有较高亲 和力(较低Kd值))时，包含所述抗体的药物在人体中在较低的剂量下可为有效的。基于 该结果，还可确定本发明的药物组合物在人体中的剂量。抗EPHA2抗体在人体中的剂量通常可为约0. Ι-lOOmg/kg，每1-180天给药一次。本发明的药物组合物的剂型的实例包括注射剂(包括滴注剂)、栓剂、滴鼻剂、舌 下剂和透皮吸收剂。给予本发明的药物组合物可抑制表达EPHA2的肿瘤的生长。 实施例 下面，根据实施例对本发明作更具体的描述。然而，并不意味着本发明限于以下实 施例。在以下的实施例中，除非另外说明，否则涉及基因工程的方法按照"分子克隆 (Molecular Cloning)“ (Sambrook, J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis, Τ.,由 Cold Spring Harbor Laboratory Press出版，1989)中所述方法、或者本领域的技术人员所用其它的实 验手册中所述方法或依照所用市售的试剂或试剂盒中所含说明书中所述方法进行。(实施例1)质粒的制备1)-1表达人EPHA2的载体的制备1)-1-1表达全长的人EPHA2的载体的制备编码人EPHA2的cDNA通过以下PCR反应扩增利用合成自SK-0V-3细胞来源的总 RNA作模板和以下引物组进行PCR 引物 1 5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggggat cggaccgagagcgagaag-3 ‘ ( ΨΜ^. SEQ ID No. 3)；禾口引物 2 :5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctagatggggatccccacagtgttcacc tggtcctt-3'(序列表 SEQ ID No. 4)。用BP Clonase(购自Invitrogen公司)将所述PCR产物引入pD0NR221(购自 Invitrogen 公司)中以制备中间载体(entry vector) 利用 GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System(购自Invitrogen公司)和以下引物组从中间载体的EPHA2基因中去 除终止密码子弓丨物 3:5' -ctgtggggatccccatcgacccagctttc-3'(序列表 SEQ ID No. 5)；禾口弓丨物 4:5' -gatggggatccccacagtgttcacctggtc-3'(序列表 SEQ ID No. 6)。用LR Clonase (购自Invitrogen公司)进行得到的中间载体和 pcDNA-DEST40Gateway载体(购自Invitrogen公司)之间的重组反应，以制备 pcDNA-DEST40-EPHA2 (本载体具有在attBl和attB2序列之间的由序列表中SEQ ID NO 7 表示的核苷酸序列)。此外，克隆至本载体中的EPHA2基因的ORF部分的序列由序列表中 SEQID NO :7的第33-2960位核苷酸表示。此外，EPHA2的氨基酸序列由序列表中SEQ IDNO 8表示。1)-1-2EPHA2胞外区的表达载体的制备通过PCR反应使用以下引物组扩增编码人EPHA2胞外区多肽(由序列表中SEQ ID NO 8的第1-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成；在下文简称为“EPHA2-ECD”)的cDNA 弓I物 5:5' -aaaaagcttatggagctccaggcagcccgc-3'(序列表 SEQ ID No. 9)；和弓丨物 6:5' -aaagggccctcagttgccagatccctccgg-3'(序歹Ij表 SEQ ID No. 10)。用HindIII和ApaI切割所述所得的PCR产物并克隆至pcDNA3. 1的HindIII/ ApaI位点中(所得载体在下文简称为“pcDNA3. 1-EPHA2-E⑶”；在以下的描述和附图中，由 "pcDNA3. 1-EPHA2-ECD，，表达的重组蛋白称作 “rEPHA2-ECD，，)。1)-1-3截短的EPHA2蛋白的表达载体的制备为构建表达以下区域的载体由EPHA2的序列表中SEQ IDNO 8的第315-540位氨 基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"FnIII-NC")、由所述SEQ ID NO :8的第 315-430位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"FnIII-N")或由所述SEQ ID NO :8的第426-540位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"FnIII-C")， 以pcDNA-DEST40-EPHA2作为模板并用以下各引物组进行PCR反应用于扩增FnIII-NC的引物组弓L 7:5' -gcaggcttcatcgaaggtcgtgggcgggcacctcaggacccag-3‘ (SEQ ID No. 11)；和弓L-gtacaagaaagctgggtgctagccgccaatcaccgccaag-3‘ (SEQ ID No. 12)；用于扩增FnIII-N的引物组引物7和弓L 9:5' -gtacaagaaagctgggtgctaggcagtacggaagctgcgg-3‘ ( ΨΜ^. SEQ ID No. 13)；用于扩增FnIII-C的引物组弓丨物 10:5' -gcaggcttcatcgaaggtcgtgggagcttccgtactgccagtg-3 ‘(序列表 SEQ ID No. 14)；和引物 8。为了在所得PCR产物的两端添加attBl和attB2位点，以所述各PCR产物作为模 板并使用以下引物组进行PCR反应弓 L 11:5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatcgaaggtcgtggg-3 ‘ (Ιψβ]^. SEQ ID No. 15)；和弓丨物 12:5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3'(序列表 SEQ IDNo. 16)。用BP Clonase将以上方法中得到的PCR产物引入pD0NR221中以制备中间载 体。以上各中间载体和目的载体之间的重组反应通过以下步骤制得用限制性内切酶切割 pET15b (购自Novagen)的NdeI和BamHI位点，补平所述切割位点，并随后用LR Clonase将 Gateway Vector Conversion System(购自 Invitrogen 公司)的 ReadingFrame Cassette C. 1连接至所述补平的位点中以制备表达载体(由引入了 FnIII-NC、FnIII-N和FnIII-C的 表达载体表达的重组蛋白在下文分别称作rFnIII-NC、rFnIII-N和rFnIII_C)。1)-2人EPHB2胞外区的表达载体的制备
编码人EPHB2的cDNA如下制得使用由HCC70细胞来源的总RNA合成的cDNA作 为模板和以下引物组进行PCR反应弓 L 13:5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgccccgggaagcgcacc-3 ‘ (序列 表 SEQ ID No. 17)；和弓I物 14 :5' -ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaaacctccacagactgaatctggtt catctg-3'(序列表 SEQ ID No. 18)。人EPHB2cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 19表示。其氨基酸序列由序 列表中SEQ ID N0:20表示。使用用于扩增编码人EPHB2胞外区(该区由序列表中SEQ ID NO :20的第1-542位氨基酸表示的氨基酸序列组成)(在下文简称为"EPHB2-E⑶")的 cDNA的引物组进行PCR反应弓丨物 15:5' -aaaaagcttatggctctgcggaggctgggg-3'(序歹Ij表 SEQ IDNo. 21)；禾口弓丨物 16:5' -aaagatatctcatggcaacttctcctggat-3'(序列表 SEQ ID No. 22)。用HindIII和EcoRV切割所得的PCR产物并克隆至pcDNA3. 1的Hindlll/EcoRV 位点中(所得载体在下文简称为"pcDNA3. 1-EPHB2-E⑶"；在以下的描述和附图中， 由"pcDNA3. 1-EPHB2-ECD"表达的重组蛋白称作 rEPHB2_ECD)。1) -3人ERBB2的表达载体的制备用Human clone collection(购自 STRATAGENE，#C33830)作为模板，使用以下引 物组进行PCR反应引物 I7:5' -caccatggagctggcggccttg-3 ‘(序列表 SEQ ID No. 23)；知引物 18:5' -tcccactggcacgtccagacc-3‘(序列表 SEQ ID No. 24)。用pENTR Directional Τ0Ρ0克隆试剂盒(购自Invitrogen公司)将所得 PCR产物掺入至pENTR/D-TOPO(购自Invitrogen公司)中以制备中间载体。为了修复 由氨基酸的取代引起的突变，用EcoRI消化所述的中间载体，并且将在所得的片段中的 含pENTR/D-TOPO来源的序列的片段与在用EcoRI消化的Human clone collection(购 自STRATAGENE，#C14640)所得片段中的第二大的片段(约1. 6kbp)连接。所得中 间载体与pcDNA_DEST40Gateway载体之间的重组反应用LR Clonase进行，以制得 pcDNA-DEST40-ERBB2(所述载体具有在attB 1和attB2序列之间的由序列表中SEQ ID N0: 25表示的核苷酸序列)。(实施例2)单克隆抗体的制备2)-1抗原的制备为了表达 EPHA2-ECD，用 293fectin(购自 Invitrogen 公司)用 pcDNA3. 1-EPHA2-ECD 转染 FreeStyle 293-F 细胞(购自 Invitrogen 公司)中，并在 37°C 下8% CO2中培养5天。培养后，通过离心收集培养上清液并用作纯化rEPHA2-E⑶的来 源。所得培养上清液在分子截留为15000的透析管中用pH 7. 5的20mM Tris-HCl透析， 随后通过滤器(0. 45 μ m，PES)过滤，之后进样至用pH 7. 5的20mMTris-HCl平衡的HiPr印 16/10Q XL(购自 GE HealthcareBio-Sciences 公司)中。用线性浓度梯度的 NaCl (20mM Tris-HCl, ρΗ7.5，0-1Μ NaCl)进行洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(在以下简称 为"SDS-PAGE")分离洗脱部分的等分试样。然后，用考马斯亮蓝染色(在下文简称 为〃 CBB染色〃)凝胶以确定含rEPHA2-E⑶的部分。接下来，合并含rEPHA2_E⑶的部分并上样至用 PBS平衡的HiLoad 26/60Superdex 200pg(购自 GE Healthcare Bio-Sciences 公司)中。经PBS洗脱后，通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。随后用CBB染色凝胶 以确定含rEPHA2-ECD的部分。合并含rEPHA2_ECD的部分并用作免疫接种和表位确定的抗 原。用 BCAProtein Assay Reagent (购自 PIERCE)检测蛋白浓度。2)-2免疫接种使用4-6 周龄的 BALB/cAnNCrlCrlj 小鼠(Charles RiverLaboratories Japan, Inc.)。在第O天，向小鼠的背部皮下给予50 μ grEPHA2-E⑶和弗氏完全佐剂H37Rv (购自 Wako Pure Chemicallndustries，Ltd.)(体积比=1 1)的混合物。同样地，向另一小 鼠的背部皮下给予 50 μ g rEPHA2-ECD 和 TiterMax Gold Adjuvant (购自 Sigma-Aldrich， Inc.)(体积比=1 1)的混合物。在第22和第36天，向每只小鼠的背部皮下给予50 μ g rEPHA2-ECD 和弗氏不完全佐剂(购自 Wako Pure Chemicallndustries, Ltd.)(体积比= 1 1)的混合物。在第53天，向每只小鼠腹膜内给予50 μ g rEPHA2-E⑶。在第56天，收 集小鼠的脾并将其用于杂交瘤的制备。2)-3杂交瘤的制备用PEG4000 (购自 IBL (Immuno-Biological Laboratories, Co.，Ltd.))进行脾细 胞和小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U. 1细胞之间的细胞融合以制备杂交瘤。所得杂交瘤的培养上清 液用于筛选产生抗EPHA2抗体的杂交瘤。2) _4抗体筛选2)-4-1表达编码抗原的基因的细胞的制备将293T细胞按5X104细胞/cm2接种于包被了 I型胶原的培养瓶(购自IWAKI)上 并在37 °C下，5 % CO2中在含10 % FBS的DMEM中培养过夜。次日，用Lipofectamine 2000 (购 自 Invitrogen 公司)将 pcDNA-DEST40_EPHA2 或作为对照的 pcDNA_DEST40_ERBB2 转染至 293T细胞中并在37°C下，5% CO2中再次培养过夜。次日，用胰蛋白酶处理经转染的293T细 胞，接着用含10% FBS的DMEM洗涤并随后悬浮于含5% FBS的PBS中。所得的细胞悬液将 用于细胞ELISA和流式细胞术分析。2)-4-2 细胞 ELISA将第2)-4_1节中制得的细胞悬液离心并除去上清液。随后，通过加入杂交瘤培养上清液分别使表达EPHA2的293T细胞和表达ERBB2的293T细胞悬浮，并在4°C下孵育 1小时。用含5% FBS的PBS洗涤各孔内细胞两次。然后，通过加入用含5% FBS的PBS稀 释500倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG(购自Millipore(Chemicon)，#AP181P)使所述 细胞悬浮，并在4°C下孵育1小时。用含5% FBS的PBS洗涤孔内细胞两次。然后，将OPD 显色液(OPDColor Developing Solution)(将邻苯二胺盐酸盐(购自 Wako PureChemical Industries,Ltd.)和 H2O2 分别以 0. 4mg/ml 和 0. 6% (ν/ν)的浓度溶解于 OPD 溶液(0. 05Μ 柠檬酸三钠、0. IM十二水合磷酸氢二钠，ρΗ 4. 5)中)以ΙΟΟμ 1/孔加入。通过搅拌进行显 色反应并通过以ΙΟΟμ 1/孔加入IM HCl终止反应。通过离心沉淀细胞，接着将上清液转移 至新的96孔板平底微量培养板中。用酶标仪(ARV0，PerkinElmer)检测490nm处的吸光 度。为了选出产生能特异性结合细胞膜表面上表达的EPHA2的抗体的杂交瘤，选定如下杂 交瘤为产抗EPHA2抗体呈阳性所述杂交瘤产生的培养上清液在表达EPHA2的293T细胞中 比在表达ERBB2的293T细胞(对照)中表现出更高的吸光度。
2) -4-3流式细胞术分析为了消除细胞ELISA中的假阳性，通过流式细胞术，针对在细胞ELISA中测定为阳 性的杂交瘤所产生的抗体对EPHA2结合的特异性，进一步地对它们进行检测。将第2)-4-1 节中制得的细胞悬液离心并除去上清液。然后通过加入杂交瘤培养上清液分别使表达 EPHA2的293T细胞和表达ERBB2的293T细胞悬浮，并在4°C下孵育1小时。用含5% FBS的 PBS洗涤孔内细胞两次。然后，通过加入用含5%FBS的PBS稀释了 1000倍的“荧光素缀合 的抗鼠 IgG 的羊 IgG 片段”(Whole Molecule)(购自 ICN Pharmaceuticals, Inc.，#55493)， 并在4°C下孵育1小时 。用含5% FBS的PBS洗涤所述细胞两次并随后重悬浮于含5% FBS 并另外含有2yg/ml 7-氨基放线菌素D(购自Invitrogen公司(Molecular Probes))的 PBS 中，随后用流式细胞仪(FC500，Beckman Coulter, Inc.)分析。用 Flowjo (TreeStar， Inc.)分析数据。用门排除7-氨基放线菌素D阳性的死细胞。然后作出活细胞的FITC荧 光强度的直方图。若得到的杂交瘤在表达EPHA2的293T细胞的荧光强度直方图中比在作 为对照的表达ERBB2的293T细胞的荧光强度强直方图中所提供的荧光强度更强，则所述杂 交瘤作为产生抗EPHA2抗体的杂交瘤。2) -5杂交瘤分离成单克隆用ClonaCell-HY 选择培养基 D (购自 StemCell Technologies，#03804)稀释产 生抗EPHA2抗体的杂交瘤并培养，收集所形成的集落作为单克隆。按第2)-4-3节的相同方 法用培养上清液分别培养收集的克隆并检测其对EPHA2的结合活性，以建立产生抗EPHA2 单克隆抗体(SH348-1、SH357-1、Ab57_l、Ab65_l、Ab96_l、AblOO-U Abl05_l、Abl06_13、 Abl36-l、Abl48-l、Abl51-4、Ab230-l、Ab373-l 和 Ab382_l)的杂交瘤。2)-6单克隆抗体对癌细胞系的结合活性的确证第2) -5节中所得单克隆抗体是否结合高度表达EPHA2的癌细胞通过第2) -4-3节 中方法相同的流式细胞术来研究。用人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(A549) 和人前列腺癌细胞系(PC-3)代替所述已转染的293T细胞。结果，确证所有已建立的单克 隆抗体与这些癌细胞系结合。2)-7单克隆抗体同种型的确定用鼠单克隆同种型试剂盒(Mouse monoclonal isotyping kit)(购自AbD Serotec)检测单克隆抗体的同种型。结果显示，所述同种型为IgGl (Ab57_l和Ab230_l)、 IgG2a(SH348-l、SH357-1、Ab65_l、Ab96_l、AblOO-U Abl36_l、Ab 148-1 和 Abl51_4)和 IgG2b(Abl05-l、Abl06-13、Ab373-l和 Ab382_l)。2)-8单克隆抗体的制备从移植了杂交瘤的小鼠的腹水或杂交瘤培养上清液(下文称作“用于抗体纯化的 来源”)中纯化单克隆抗体。小鼠腹水制备如下首先，用降植烷(pristane)(购自Sigma-Aldrich, Inc.)处 理 7-8 周龄的 BALB/cAJcl-nu/nu 小鼠(CLEAJapan，Inc.)。约 3 周后，以 1 X IO7 细胞 / 每 只小鼠的量向腹膜内移植用盐水洗涤的杂交瘤。1-2周后，收集腹膜腔中累积的腹水，将其 通过0. 22-μ m的滤器除菌并用作抗体纯化的来源。用CELLine (购自BD Biosciences)制备杂交瘤的培养上清液。依照生产商的说 明书培养杂交瘤，除了将 ClonaCell-HY GrowthMedium E(购自 StemCell Technologies,#03805)用作培养基之外。将收集的培养上清液通过0. 45-μ m滤器过滤并用作抗体纯化的 来源。 用含固定在Formyl-Cellulofine (购自Seikagaku公司)上的重组蛋 白 A rPA50 (Recombinant Protein A rPA50)(购自 R印IiGen 公司)(在下文简称 为〃 Formyl-Cellulofine Protein A")或 HiTrap MabSelectSuRe (购自 GE Healthcare Bio-Sciences公司)的亲和柱纯化抗体。对于Formyl-Cellulofine Protein A，用结合缓 冲液(Binding Buffer) (3MNaCl，1. 5M甘氨酸，pH 8.9)将用于抗体纯化的来源稀释三倍并 上柱，然后用结合缓冲液洗涤，接着用PH 4. O的0. IM柠檬酸洗脱。另一方面，对于HiTrap MabSelect SuRe，将用于抗体纯化的来源上柱，随后用PBS洗涤，接着用pH 4. O的2M精氨 酸-HCl洗脱。中和含抗体的洗脱液，并随后用PBS代替缓冲液。通过将与POROS G 20μπι Column, PEEK, 4. 6mmX 100mm, 1. 7ml (Applied Biosystems)结合的抗体洗脱并检测洗脱液吸光度(0. D. 280nm)来确定抗体浓度。具体而 言，将用PBS稀释的抗体样品上样至用平衡缓冲液(Equilibrating Buffer) (30. 6mM十二 水合磷酸二氢钠，19. 5mM磷酸二氢钾，0. 15M NaCl,pH 7.0)平衡的P0R0S G20ym中。用平 衡缓冲液洗柱，接着将与柱结合的抗体用洗脱液(0. 1% (v/v)HCl,0. 15Μ NaCl)洗脱。检测 洗脱液的吸光度(0.D.280nm)的峰面积并依照以下等式计算浓度抗体样品的浓度(mg/ml)=(抗体样品的峰面积)/(标准品(人IgGl)的峰面 积)X标准品的浓度(mg/ml) X稀释倍数。此外，所得抗体中所含内毒素的浓度用Endospecy ES-50M Set (Seikagaku公司， #020150)和 Endotoxin Standard CSE-L Set (Seikagaku 公司，#020055)检测并且确保在 lEU/mg以下。所得抗体用于后续实验。(实施例 3) SH348-1 和 SH357-1 的性质3)-1针对抗EPHA2抗体诱导EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的活性和其诱导降低 EPHA2蛋白水平的活性的研究3)-1-1抗体刺激的细胞裂解液的制备将悬浮于含10% FBS,50个单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的RPMI1640 (在下 文简称为“含10% FBS的RPMI1640 (含抗生素)”)中的MDA-MB-231细胞按6 X IO5细胞/孔 接种于6孔板上并在37°C下，5% CO2中培养过夜。次日，弃去培养基并向其加入RPMI1640。 将细胞于37°C下，5% CO2下再培养过夜。次日，将SH348-1、SH357-1、作为同种型对照抗 体的鼠IgG2A同种型对照(在下文的描述和附图中，简称为“mIgG2a”；购自R&D Systems, Inc.，#MAB003)、作为可溶性EPHA2配体的重组小鼠Ephrin_Al/Fc嵌合体(在下文的描述 和附图中，简称为〃 Ephrin-Al/Fc"；购自 R&D Systems, Inc.，#602-Α1-200)和作为可溶 性配体的对照蛋白的重组人IgG1Fd在下文的描述和附图中，简称为"IiG1Fc"；购自R&D Systems, Inc.，#110-HG_100)分别用 RPMI1640 按图 1 或 2 中所示浓度(SH348-1、SH357-1 禾口 mIgG2a 在图 IA 中按 10 μ g/ml 或 50 μ g/ml，而在图 2A 中按 50 μ g/ml，Ephrin_Al/Fc 禾口 I1G1Fc 图1和图2中按1 μ g/ml)稀释。在弃去培养基后将所得溶液加入MDA-MB-231细胞 中并37°C下，5%0)2中温育预定时间。此外，在交联抗体存在下的实验中，sH348-l、SH357-l 或 mIgG2a 和羊抗鼠的 IgG5Fcy 片段特异性(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot)(购自 Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc.，#115-005-071)作为交联抗体按浓度各为 10 μ g/ml或50 y g/ml (图IB)和50 u g/ml (图2B)混合于RPMI1640中。弃去培养基后将所得溶液加 入MDA-MB-231细胞中，并在37°C下，5 % C02中培养预定时间。在预定时间之后，除去上清 液，通过加入含ImM PMSF(购自Sigma-Aldrich, Inc.)的IX细胞裂解缓冲液(购自Cell Signaling Technology, Inc.)使细胞裂解并在15000rpm离心5分钟。将细胞裂解物的上 清液用作免疫沉淀和蛋白印迹的样品。用BCA Protein Assay Reagent (购自PIERCE)测 量样品的蛋白浓度。3)-1-2鉴定诱导EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的活性为了使EPHA2免疫沉淀，首先将8 y g抗Eck/EphA2的clone D7 (在下面的描述和 附图中简称为"抗EPHA2抗体(D7)"；购自Mi 11 ipore (Upstate)，#05-480)按每个样品加 入25 ill含Protein G磁珠(购自NEW ENGLAND BioLabs, Inc.)的混悬液中，并在4°C下 将混合物颠倒混合2小时。接着，向其加入终浓度10%的FBS并在4°C下再将混合物颠倒混合30分钟。用含 ImM PMSF的IX细胞裂解缓冲液洗涤珠粒三次。然后向其加入200 yg第3)-1-1节中制备 的细胞裂解液上清液，并在4°C下将混合物颠倒混合过夜。次日，用含ImM PMSF的1 X细胞 裂解缓冲液洗涤珠粒三次。随后将SDS-样品缓冲液(56. 3mM Tris_HCl，pH 6.8,1.8% (w/ v)SDS，9%甘油，0. 72M 2-巯基乙醇，0. 045mg/ml溴酚蓝)加入珠粒中，并将混合物在98°C 下加热5分钟。从珠粒中解离的蛋白通过SDS-PAGE分离。为进行蛋白印迹，将蛋白从凝胶上转移至聚偏二氟乙烯膜(在下文简称为“PVDF 膜”；孔径为0. 45 ii m ；购自Millipore)上。转膜后，将PVDF膜在封闭液(Blocking Solution)(将一袋 Block Ace 粉末(购自 Dainippon Sumitomo Pharma Co. , Ltd. (Snow Brand MilkProducts Co.，Ltd.)溶解于100ml超纯水中，向其加入终浓度分别为0. 1% (v/ v)和0.02% (w/v)的吐温20和叠氮钠)中振荡来封闭。首先，为了检测免疫沉淀的EPHA2， 将如上封闭的PVDF膜浸入用封闭液稀释至0. 25 u g/ml的抗EPHA2抗体(D7)溶液中，并在 室温下振荡 1 小时。用 TBST(50mM Tris-HCl, pH 8. 0，138mM NaCl，2. 7mMKCl,0. 1% (v/v) 吐温20)洗涤PVDF膜10分钟三次。接着，将PVDF膜浸入用TBST稀释了 3000倍的抗鼠 Ig，HRP-Linked Whole AbShe印(购自 GE Healthcare Bio-Sciences 公司)的溶液中并在 室温下振荡30分钟。再用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10分钟。然后用ECL Plus (购自 GE Healthcare Bio-Sciences公司)检测胶片上化学发光的信号。接下来，为了去除这些PVDF膜上的抗体，将PVDF膜浸入剥离液(Stripping Solution) (50mM Tris-HCl, pH 6. 8,2% (w/v) SDS, lOOmM 2-巯基乙醇)中并在 55°C下振 荡30分钟。随后将PVDF膜浸入猝灭液(Quenching Solution)(含(v/v)H202和0. (w/v) NaN3的TBST)中，然后在室温下振荡20分钟，再用TBST洗涤三次，每次10分钟。为 了检测EPHA2酪氨酸残基的磷酸化情况，通过在无叠氮钠的封闭液(将一袋Block Ace粉末 溶解于100ml超纯水中，向其加入终浓度为0. 1% (v/v)的吐温20)中振荡来封闭PVDF膜。 然后将PVDF膜浸入用无叠氮钠的封闭液稀释了 10000倍的抗磷酸酪氨酸重组4G10 HRP缀 合物(Anti-Phosphotyrosine，recombinant 4G10HRP_conjugate)(在附图中简称为“4G10 抗体”；购自Millipore (Upstate)，#16-184)的溶液中，并在室温下振荡1小时。用TBST洗 涤PVDF膜三次，每次10分钟，并随后再用水洗涤三次，每次5分钟。用ECL Plus检测胶片 上化学发光的信号。
结果显示，通过加入可溶性配体Ephrin-Al/Fc，EPHA2酪氨酸残基在10分钟内被 磷酸化。相比之下，当加入10 u g/ml或50 ii g/ml浓度的抗体SH348-1和SH357-1时，在预 定时间(10分钟、30分钟和60分钟)内完全观察不到配体对EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的 诱导作用(图1A)。同样地，即使在交联抗体存在的情况下，在SH348-1和SH357-1存在下 观察不到配体对EPHA2酪氨酸残基的磷酸化的诱导作用(图1B)。3)-1-3诱导降低EPHA2蛋白水平的活性的鉴定将第3)-1_1节中制备的lOyg细胞裂解物的上清液通过SDS-PAGE分离。然后将 凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上并用抗EPHA2抗体(D7)和作为样品蛋白水平的对照的单 克隆抗3肌动蛋白克隆AC-15(在下面的描述和附图中，简称为“抗3肌动蛋白抗体”；购 自Sigma-Aldrich，Inc.，#A_5441)进行蛋白印迹。具体而言，转膜后，通过在封闭液中振 荡来封闭PVDF膜并随后以分子量70kDa附近为中心用刀片将膜切成两段。将含70kDa以 上蛋白的PVDF膜浸于用封闭液稀释至0. 25 u g/ml的抗EPHA2抗体(D7)溶液中，而将含 70kDa以下蛋白的PVDF膜浸于用封闭液稀释1000倍的抗0肌动蛋白抗体的溶液中。每 张PVDF膜在室温下振荡1小时。每张PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。接着，将每 张PVDF膜浸于用TBST稀释了 3000倍的抗鼠Ig，HRP-Linked Whole AbSheep的溶液中，并 在室温下振荡30分钟。各张PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后用ECL Plus和 NightOWL LB983(Berthold Technologies GmBH & Co. KG)检测信号。用针对 Windows 的 Gel-Pro Analyzer 4. 5版(注册商标；Media Cybernetics，Inc.)对条带的信号强度定量。结果显示，通过加入可溶性配体Ephrin-Al/Fc，观察到EPHA2蛋白水平显著减少 (图2A和2B)。在存在和不存在交联抗体的情况下观察到通过加入抗体SH348-1使EPHA2 蛋白水平减少，尽管比配体的活性弱(图2A和2B)。另一方面，在抗体SH357-1中，无论存 在或不存在交联抗体下，都观察到EPHA2的蛋白水平几乎没有变化(图2A和2B)。为了分析在加入SH348-124小时后EPHA2的蛋白水平，计算三次实验结果中的平 均值(EPHA2带的信号强度肌动蛋白带的信号强度)并用未补充配体/抗体的样品校 正所述平均值。结果显示，当将加入mIgG2a 24小时后的值定义为100%时，在交联抗体不 存在下SH348-1加入24小时后的值为70%，而在交联抗体存在下所述值为69%。3)_2ADCC 活性3)-2-1效应细胞的制备在无菌条件下从 CAnN. Cg-Foxnlnu/CrlCrlj 裸鼠(Charles RiverLaboratories Japan, Inc.)中收集脾。用两个载玻片将收集的脾磨勻并用BD Pharm Lyse (购自BD Biosciences, #555899)使血细胞溶解。将所得脾细胞悬浮于含10%胎牛血清和Ultra-low IgG (购自Invitrogen公司)的无红酚RPMI1640 (购自Invitrogen公司)(在下文简称为 “针对ADCC的培养基”)中并通过细胞过滤网(孔径40iim;购自BD Biosciences).然后 通过锥虫蓝排斥试验对活细胞计数。将脾细胞悬液离心，然后去除培养基。将细胞以活细 胞密度为1. 5X107个细胞/ml重悬浮于针对ADCC的培养基中并用作效应细胞。3)-2-2靶细胞的制备用胰蛋白酶处理MDA-MB-231、A549 或 PC-3 细胞。用含 10 % FBS 的 RPMI1640 洗涤细胞并随后重悬浮于含10% FBS的RPMI1640中。用通过0. 22-y m滤器除菌的 铬-51 (5550kBq)混合每种细胞(4X 106个细胞)，并在对以上细胞标记后在37°C下，5% C02中放置1小时。用针对ADCC的培养基洗涤已标记的细胞三次，并以2X105个细胞/ml的 浓度重悬浮于针对ADCC的培养基中以制备靶细胞。3)-2_351Cr 释放试验将靶细胞(2X105细胞/ml)按50 yl/孔分配至96孔U形底微量培养板中。向 其中加入50 u 1用针对ADCC的培养基稀释至2. 5 u g/ml (按加入效应细胞后的终浓度)的 SH348-USH357-1或同种型对照抗体(mIgG2a)并在4°C下孵育1小时。向其中加入100 yl 效应细胞(1.5X107细胞/ml)并在37°C下，5%C02中温育过夜。次日，将上清液收集至 LumaPlate (购自PerkinElmer)中。用Y计数器测量所释放、射线的剂量。由ADCC活性 导致的细胞裂解率依照以下等式计算细胞裂解率(%) = (A-B)/(C-B) X100A:样品孔中的计数B 自发释放计数(未补充抗体/效应细胞的孔)的平均值(n = 3)。分别加入50 ill和100 u 1针对ADCC的培养基代替抗体和效应细胞。其它过程按 样品孔的相同方法进行。C 最大释放计数(含溶解于去污剂的靶细胞的孔)的平均值(n = 3)。加入50 yl 针对ADCC的培养基代替抗体，并加入100 ill含2% (v/v)Triton-X100的针对ADCC的培养 基代替效应细胞。其它过程按样品孔的相同方法进行。图3显示了三次实验的平均值，其中误差线表示标准差，P值由学生t检验 (Student' s t-test)计算。结果显示，抗体 SH348-1 对 MDA-MB-231 细胞(图 3A)、A549 细胞(图3B)和PC-3细胞(图3C)表现出的细胞溶解活性分别为8. 2%,9. 和4. 7%. 抗体SH357-1对MDA-MB-231细胞(图3A)、A549细胞(图3B)和PC-3细胞(图3C)表 现出的细胞溶解活性分别为8. 8%、13. 0%和9. 0%。这些结果证明所述两种抗体具有对 MDA-MB-231细胞、A549细胞和PC-3细胞的ADCC活性。3) -3CDC 活性将悬浮于含10% FBS的RPMI1640 (含抗生素)中的MDA_MB_231、A549或PC-3细 胞按5000个细胞/孔接种于96孔微量培养板中并在37°C下，5% C02中培养过夜。次日， 向其加入用含10% FBS的RPMI1640(含抗生素)稀释至25 u g/ml (按加入补体后的终浓 度)的SH348-1、SH357-1或同种型对照抗体(mIgG2a)并在4°C下温育1小时。向其加入 用RPMI 1640稀释至30%、终浓度为5%的兔的补体(购自CEDARLANE，#CL3051)，然后在 37°C下，5% C02中温育1小时，在室温下再静置30分钟。为了检测细胞存活率，加入与培 养液相同量的 CellTiter-Glo Luminescent Cell ViabilityAssay (购自 Promega 公司)， 并在室温下搅拌混合物10分钟。然后用酶标仪检测发出光的量。依照以下等式计算细胞 存活率细胞存活率(%) = (a-b)/(c-b) X100a 样品孔发出光的量b 作为本底(未添加细胞/抗体的孔)发出光的量的平均值(n = 8)。加入与细 胞悬液等量的含10% FBS的RPMI1640(含抗生素)代替接种的细胞，并加入与抗体稀释液 等量的含10%FBS的RPMI1640(含抗生素)来代替抗体。其它过程按样品孔的相同方式进 行。
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c 未补充抗体的孔中发出光的量的平均值(n = 3)。加入与抗体稀释液等量的含 10%FBS的RPMI1640(含抗生素)代替抗体。其它过程按样品孔的相同方式进行。图4显示了三次实验的平均值，其中误差线表示标准差，P值由学生t检验计算。结 果显示，在补体存在的情况下，抗体SH348-1引起MDA-MB-231细胞(图4A)、A549细胞(图 4B)和PC-3细胞(图4C)的细胞存活率分别减少44%、31%和41%。在补体存在的情况下， 抗体SH357-1也引起MDA-MB-231细胞(图4D)、A549细胞(图4E)和PC-3细胞(图4F) 的细胞存活率分别减少65%、60%和65%。这些结果证明所述两种抗体具有对10^-1 -231 细胞、A549细胞和PC-3细胞的⑶C活性。3)-4表位的确定3)-4-1 截短的 EPHA2 多肽(rFnlll-NC、rFnlll-N 和 rFnlll-C)的制备用第1)-1-3节制备的表达质粒分别转化大肠杆菌BL21和大肠杆菌Origami (DE3) (购自Novagen)，并培养在补充有50 u g/ml氨苄青霉素(购自Sigma-Aldrich，Inc.)的 LB培养基中。对于BL21，使用Autoinduction System(购自Novagen)诱导截短的EPHA2 多肽的表达，而对于Origami (DE3)，则加入0.5mM IPTG。通过在6000rpm离心20分钟收 集细菌细胞，然后悬浮于均质缓冲液(50mM TrisHCl, pH 7. 5,150mM NaCl,0. 1% (v/v) Triton-X100,10% (v/v)甘油)中，接着在冰上超声。上清液通过在14000rpm离心15分钟 收集并上样至0.5ml Ni-NTA(购自Invitrogen公司)中。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl， pH 7. 5,150mM NaCl，50mM咪唑，10% (v/v)甘油)洗涤Ni-NTA，随后用洗脱缓冲液(50mM Tris HC1，pH 7. 5，150mMNaCl，400mM咪唑，10% (v/v)甘油)洗脱。将洗脱下来的样品进 一步地通过用PBS作为溶剂的凝胶过滤柱层析(Superdex 75 10/300;购自GE Healthcare Bio-Sciences ^W] ) @ft>。 M Protein AssayBio-Rad Laboratories, Inc) Iljfilj'f 得重组蛋白的蛋白浓度。3)-4-2EPHB2 胞外区多肽(rEPHB2_ECD)的制备为表达EPHB2-ECD，用 293fectin 将 pcDNA3. l_EphA2_ECD 转染至 FreeStyle 293-F细胞中并在37°C下，8% C02中培养72小时。培养后，通过离心收集培养液并用作 纯化rEPHB2-E⑶的来源。所得培养上清液用具有分子截留15000的透析管对pH 7. 5的 20mM Tris-HCl进行透析，然后通过滤器(0. 45 y m，PES)过滤，接着上样至用pH 7. 5的20mM Tris-HCl平衡的HiPr印16/10Q XL中。洗脱用线性浓度梯度的NaCl (20mM Tris-HCl、0_1M NaCl)进行。通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。然后，凝胶用CBB染色以确证存在含 rEPHB2-ECD的部分。接着，合并含rEPHB2_ECD的部分并上样至用PBS平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200pg中。在用PBS洗脱后，通过SDS-PAGE分离洗脱部分的等分试样。然后，凝 胶用CBB染色以确证存在含rEPHB2-E⑶的部分。合并含rEPHB2_E⑶的部分并用作用于确 定表位的抗原。用BCA ProteinAssay Reagent测定蛋白浓度。3) -4-3通过ELISA确定抗原的结合位点将rEPHA2-ECD、rFnIII-NC、rFnIII-N、rFnIII-C 或对照蛋白 rEPHB2_ECD 用 PBS 稀 释至1 U g/ml，然后按100 u 1/孔分配至免疫微量板(immunoplate)(购自Nunc, #442404) 上，并在4°C下孵育过夜从而使蛋白吸附在板上。次日，去除孔内溶液，并将用PBS稀释4 倍的Block Ace溶液(一袋Block Ace粉末溶于100ml的超纯水中)按200 ii 1/孔分配至 各孔中并在室温下孵育1小时。去除孔内溶液，按50 yl/孔加入用稀释缓冲液(DilutingBuffer) (PBS,0. 05% (v/v) Tween 20)稀释至 5 μ g/ml 的 SH348-1、SH357-1 或同种型对照 抗体(mIgG2a)。在室温下孵育板1小时。然后，去除孔内溶液并用稀释缓冲液洗涤各孔两 次。按50 μ 1/孔加入用稀释缓冲液稀释了 3000倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG并在室 温下孵育1小时。去除孔内溶液并用稀释缓冲液洗涤各孔两次。接着，通过以100 μ 1/孔 加入OPD显色液并搅拌进行显色反应。显色后，通过加入100 μ 1/孔的IM HCl终止显色反 应。用酶标仪测量490nm处的吸光度。图 5A 显示了 EPHA2 域的结构预测(NCBI CDD 2. 11 版、CBSTMHMM Server 2. 0 版) 以及EPHA2-ECD、FnIII-NC、FnIII-N和FnIII-C在EPHA2中的位置。配体-BD表示配体结 合域，FN3表示纤连蛋白III型结构域，TM表示跨膜区，Trk激酶 表示酪氨酸激酶结构域， SAM表示SAM域。制备了 EPHA2胞外区(EPHA2-E⑶)的重组蛋白、含两个纤连蛋白III型结构域区 (FnIII-NC)的重组蛋白、含N端纤连蛋白III型结构域区(FnIII-N)的重组蛋白和含C端纤 连蛋白III型结构域区(FnIII-C)的重组蛋白并研究它们对SH348-1和SH357-1的结合活 性。结果显示，所述抗体SH348-1和SH357-1表示出对rEPHA2-ECD、rFnIII-NC和rFnIII_C 的结合活性(图5B)。因此，抗体SH348-1和SH357-1显示与含有C端纤连蛋白III型结构 域的第426-534位氨基酸区域(由序列表中SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸序列表示 的氨基酸序列)结合。(实施例4)体内抗肿瘤效果通过胰蛋白酶处理使MDA-MB-231细胞从培养瓶剥离并接着悬浮于含10% FBS的 RPMI1640 (含抗生素)中。离心后去除上清液。细胞用与如上相同的培养基洗涤两次，然 后悬浮于 BD MatrigelBasement Membrane Matrix(购自 BD Biosciences)中并按 5X106 个细胞/每只小鼠的浓度皮下移植至6周龄的BALB/cAJc 1-nu/nu((CLEAJapan，Inc.)的 背部。当将移植当天定为第0天时，在第9、16、23和30天腹膜内给予剂量为500 μ g/只小 鼠的SH348-1或SH357-1。腹膜内给予与所述抗体的体积相等的PBS(500y 1)作对照。在 第9、13、16、20、23、28、30、34和37天测量肿瘤体积，研究给予抗体所致的抗肿瘤效果。结 果显示，与PBS给药组相比，SH348-1和SH357-1给药组中肿瘤的生长明显受到抑制(与在 第37天的PBS给药组的肿瘤体积相比，SH348-1-和SH357-1的P值均为P < 0. 001 ；P值 由学生t检验计算)。此外，在第37天的肿瘤生长抑制率(=100-(给予抗体组中肿瘤体 积的平均值)/ (给予PBS组中肿瘤体积的平均值)X 100)方面，对于SH348-1为89. 5%，而 对于SH357-1为84. 1%.在体内观察到它们很强的抗肿瘤效果(图6A和6B)。在研究其对移植了 MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤效果的14种抗EPHA2的单克 隆抗体中，仅抗体SH348-1和SH357-1与FnIII-C的结合显示为有效(表1)。这些结果证明SH348-1和SH357-1为识别以往未报道的表位(由序列表中SEQ ID NO :8的第426-534位氨基酸表示的氨基酸序列)并表现出抗肿瘤效果的抗体。此外， SH348-1或SH357-1所结合的区域显示为作为靶向EPHA2的抗肿瘤单克隆抗体的有前景的 靶标。[表 1]表 1 (实施例5)SH348-1和SH357-1抗体基因的鉴定为确定小鼠的抗人EPHA2抗体SH348-1和SH357-1的N端氨基酸序列的重链和轻 链，通过SDS-PAGE分离含有第2) -8节中纯化的SH348-1或SH357-1的溶液的等分试样。将 由此分离到的凝胶中的蛋白从凝胶转移至PVDF膜(孔径0. 45 μ m ；购自Invitrogen公司) 上。用洗涤缓冲液(25mM NaCUpH 8. 0的IOmM硼酸钠缓冲液)洗涤PVDF膜，接着通过浸入 染色液(50%甲醇、20%乙酸、0. 05%考马斯亮蓝)中染色5分钟，随后用90%甲醇脱色。将 在PVDF膜上看到的重链和轻链相应的条带部分(重链流动性较小的条带；轻链流动性 较大的条带)切出，尝试用自动化的Edman法(参见Edman，P.等· (1967)Eur. J. Biochem. 1， 80)并用 Procise (注册商标)cLC Protein Sequencer Model 492cLC(Applied Biosystems)鉴定其各自的N端氨基酸序列。对于SH348-1的重链，所述方法不能鉴定其 氨基酸序列。因此，用Pfu焦谷氨酰氨肽酶(Pfu PyroglutamateAminopeptidase)(购自 TAKARA BIO INC.)去除N端的焦谷氨酸，随后进行上述相同的方法以鉴定从N端第二个氨 基酸开始的氨基酸序列。结果显示，SH348-1重链相应条带的氨基酸序列(开始自N端的第二个氨基酸) 为I-Q-L-V-Q-S-G-P (序列表中 SEQ ID NO 26)。SH348-1轻链相应条带的N端氨基酸序列为D-V-L-M-T-Q-S-P-L-S-L (序列表中 SEQ ID NO 27)。SH357-1重链相应条带的N端氨基酸序列为Q-I-Q-L-V-Q-S-G-P (序列表中 SEQ ID NO 28)。SH357-1轻链相应条带的N端氨基酸序列为D-V-L-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-S-L-G-D-Q-A (序列表中 SEQ IDNO 29)。将这些氨基酸序列与Kabat等制作的抗体氨基酸序列数据库(参见Kabat， Ε. Α.等，(1991)在 Sequences of Proteins oflmmunologicallnterest 第 I 禾口 II 卷中，U. S. Department of Health andHuman Services)比较。结果显示，SH348-1 重链的亚型 (Y 2a链)是混杂型，轻链的亚型是κ轻链II。此外，SH357-1重链的亚型(Y 2a链)确 定为混杂型，轻链的亚型确定为κ轻链II。 因此，合成以下寡核苷酸引物，其分别与属于这些小鼠亚型的抗体基因编码区的 5，-端区及其3，-端区(含终止密码子)杂交(参见Kabat等，ibid ；Matti Kartinen 等· (1988)25,859-865 和 Heinrich，G.等· (1984) J. Exp. Med. 159，p. 417-435)5' -cagatccagttggtgcagtctggacct-3‘ (DB3F1 序列表 SEQ ID No. 30)5 ‘ -aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3 ‘ (MIG2AEVR1 序列表 SEQ ID No. 31)5' -aagaattcatgaagttgcctgttagg-3‘ (MK19EIF1 序列表 SEQ ID No. 32)5' -aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3' (KEVR1 序歹丨J表 SEQ IDNo. 33)为了克隆编码SH348-1和SH357-1重链和轻链的cDNA，用Quick Prep mRNA 纯化试剂盒(购自 GE Healthcare Bio-Sciences 公司，#27-9254-01)从产生 SH348-1 或SH357-1的杂交瘤中制得mRNA。用TaKaRa—步RNA PCR试剂盒(TaKaRa One Step RNAPCR Kit(AMV)(购自 TAKARA BIO INC.，#RR024A))并使用针对重链的引物组(DB3F1 和MIG2AEVR1的组合)或针对轻链的引物组(MK19EIF1和KEVRl的组合)由所得到的各 mRNA扩增编码各抗体的重链或轻链的cDNA。通过PCR扩增的这些cDNA用Zero BluntTOPO PCR Cloning Kit (购自Invitrogen公司)克隆。使用基因序列分析仪(〃 ABI PRISM 3700DNA Analyzer ；Applied Biosystems“或"Applied Biosystems 3730x1 Analyzer ； Applied Biosystems“)测定克隆的重链和轻链各自的核苷酸序列。在测序反应中，使用 GeneAmp9700(Applied Biosystems)。已测定的编码SH348-1重链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO :34表 示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 35表示。编码SH348-1轻链的cDNA的核苷酸序列由序列 表中SEQ ID NO 36表示，其氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO 37表示。编码SH357-1重 链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 38表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :39表 示。编码SH357-1轻链的cDNA的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO :40表示，其氨基酸序 列由SEQ IDNO 41表示。以下序列是来源于引物的序列由SEQ ID NO 34的第1_27位和 第1327-1350位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO 36的第637-660位核苷酸表示的序列、 由SEQ ID NO 38的第1-27位和第1327-1350位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO 40的 第637-660位核苷酸表示的序列。此外，这些重链和轻链的氨基酸序列通过与Kabat等制作的氨基酸序列数据 库(参见Kabat，Ε. Α.等· (1991)在〃免疫相关蛋白的序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)第 I 禾口 II 卷"中；U. S. Department of Health and Human Services)比较来分析。结果显示，SH348-1重链具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO 35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的SEQID NO 35的第 120-449位氨基酸表示的氨基酸序列。此外，SH348-1轻链显示出具有作为可变区的由序 列表中SEQ ID N0:37的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的SEQ IDNO 37的第113-219位氨基酸表示的氨基酸序列。SH357-1重链显示出具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO 39的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的由SEQ ID NO :39的第120-449位氨基酸 表示的氨基酸序列。此外，SH357-1轻链显示出具有作为可变区的由序列表中SEQ ID NO 41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列，并且具有作为恒定区的由SEQ ID NO :41的第 113-219位氨基酸表示的氨基酸序列。编码SH348-1重链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 42表示，其氨基酸 序列由SEQ ID NO 43表示。编码SH348-1重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO 44表 示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:45表示。编码SH348-1轻链可变区的核苷酸序列由序列 表中SEQ ID NO :46表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :47表示。编码SH348-1轻链恒定区 的核苷酸序列由SEQ ID NO :48表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:49表示。以下序列为来 源于引物的序列由SEQ ID NO 42的第1_27位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO 44的第 970-993位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO 48的第301-324位核苷酸表示的序列。此外，编码SH357-1重链可变区的核苷酸序列由序列表中SEQID N0:50表示，其氨 基酸序列由SEQ ID N0:51表示。编码SH357-1重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO 52 表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:53表示。编码SH357-1轻链可变区的核苷酸序列由序列 表中SEQ ID NO 54表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 55表示。编码SH357-1轻链恒定区 的核苷酸序列由SEQ ID NO 56表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :57表示。以下序列为来 源于引物的序列由SEQ ID NO 50的第1_27位核苷酸表示的序列、由SEQ ID NO 52的第 970-993位核苷酸表示的序列和由SEQ ID NO 56的第301-324位核苷酸表示的序列。此外，上述重链和轻链可变区的各氨基酸序列中⑶R的位置和序列通过与Kabat 等制作的抗体氨基酸序列数据库(参见Kabat，E.A.等.(1991)ibid)同源性比较来分析并 确定。依照该文献，若不同的抗体为相同的亚类，则这些抗体具有彼此氨基酸长度几乎相等 的构架区并且观察到可变区的氨基酸序列具有共同性。另一方面，CDR是位于这些构架区侧 翼的特定序列。因此，重链和轻链的氨基酸序列通过与其相同亚类的序列比较来进行分析。 结果显示，确定SH348-1重链的⑶R具有由序列表中SEQ ID NO 35的第26-35位氨基酸表 示的氨基酸序列(⑶RH1)、由SEQ ID NO 35的第50-66位氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RH2) 和由SEQ ID NO :35的第99-108位氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RH3)。确定SH348-1轻链 的⑶R具有由序列表中SEQ ID NO :37的第24-39位氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RL1)、由 SEQ ID NO :37的第55-61位氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RL2)和由SEQ ID NO :37的第 94-102位氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RL3)。确定SH357-1重链的⑶R具有由序列表中SEQ ID NO 39的第26-35位氨基酸表示的氨基酸序列(CDRH1)、由SEQ ID NO 39的第50-66位 氨基酸表示的氨基酸序列(⑶RH2)和由SEQ ID NO :39的第99-108位氨基酸表示的氨基酸 序列(⑶RH3)。确定SH357-1轻链的⑶R具有由序列表中SEQ ID NO 41的第24-39位氨基 酸表示的氨基酸序列(CDRL1)、其第55-61位氨基酸序列(CDRL2)和其第94-102位氨基酸 序列(CDRL3)。编码SH348-1CDR&的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO :58表示，其氨基酸序列由 SEQ ID NO :59表示。编码SH348-1CDRH2&核苷酸序列由SEQ ID NO :60表示，其氨基酸序列 由SEQ ID N0:61表示。编码SH348-1⑶RH3的核苷酸序列由SEQ ID NO :62表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:63表示。编码SH348-1⑶RL1的核苷酸序列由SEQ ID N0:64表示，其氨 基酸序列由SEQ ID NO 65表示。编码SH348-1⑶RL2的核苷酸序列由SEQ ID NO 66表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 67表示。编码SH348_1CDRL3的核苷酸序列SEQ ID NO 68表 示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :69表示。此外，编码SH357-1⑶RH1的核苷酸序列由SEQ ID NO 70表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 71表示。编码SH357-1⑶RH2的核苷酸序列由SEQ ID NO 72表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :73表示。编码SH357-1⑶RH3的核苷酸序列由序 列表中SEQ IDNO 74表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :75表示。编码SHSST-ICDRL1的核苷 酸序列由SEQ ID NO 76表示，其氨基酸序列由SEQID NO 77表示。编码SH357-1⑶RL2的核 苷酸序列由SEQ ID NO :78表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:79表示。编码SH357_1CDRL3 的核苷酸序列由SEQ ID NO 80表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 81表示。

(实施例6)抗EPHA2抗体与EPHA2胞外区的结合活性将用PBS溶液稀释至1 μ g/ml的EPHA2胞外区多肽(购自R&DSystems，Inc.， #3035-A2-100)或作为对照的牛血清白蛋白(在下文的描述和附图中简称为"BSA")的 溶液按100 μ 1/孔分配至免疫微量板(购自Nunc，#442404)上，并在4°C下孵育过夜，以使 蛋白吸附在平板上。次日，去除孔内溶液，将Block Ace溶液(将一袋Block Ace粉末(购自Dainippon Sumitomo Pharma Co. ,Ltd. (Show Brand MilkProducts Co. ,Ltd.))IOOml
中)用PBS稀释4倍后以200 μ 1/孔分配，并在室温下温育1小时。各孔用稀释缓冲液(PBS， 0. 05% (v/v) Tween 20)洗涤两次。接着，用 PBS 分别稀释 SH348-1、SH357_1 和 Ab96_l 至浓 度为 1. 25Χ1(Γ4μ g/ml、l. 25X 1(Γ3 μ g/ml、1· 25X 1(Γ2 μ g/ml、1· 25X ICT1 μ g/ml、1· 25 μ g/ ml、12. 5 μ g/ml或125 μ g/ml，并将所得溶液以100 μ 1/孔(含0. 05% (ν/ν)(终浓度)的 吐温20)加入。在室温下温育平板1小时。然后，去除孔内溶液，各孔用稀释缓冲液洗涤两次。 以100 μ 1/孔加入用稀释缓冲液稀释了 1000倍的过氧化物酶缀合的羊抗鼠IgG(购自 Millipore(Chemicon)，#ΑΡ181Ρ)，并在室温下温育1小时。去除各孔内液体，用稀释缓冲液 洗涤各孔两次。然后按100 μ 1/孔加入OPD显色液并搅拌进行显色反应。显色后，按100 μ 1/ 孔加入IM HCl终止显色反应。用酶标仪测量490nm处的吸光度(图7)。图7A)显示了 SH348-1的结果，图7B)显示了 SH357-1的结果，图7C)显示了 A96-1 的结果。在各图中，吸光度表示为平均值士标准差(η = 3)。较强的吸光度表示结合活性 更强。如图所示，所有抗体SH348-1、SH357-1和Ab96_l均没有表现出对BSA的亲和力，证 明它们特异性结合EPHA2胞外区。(实施例7)抗EPHA2抗体对配体结合的影响依照实施例6中所述方法制备固定了 EPHA2胞外区多肽(购自R&D Systems, Inc.，#3035-A2-100)的免疫微量板。免疫微量板各孔用稀释缓冲液洗涤两次。然后按 100 μ 1/孔加入用稀释缓冲液稀释至10 μ g/ml或50 μ g/ml的SH348-l、SH357-l、Ab96_l或 作为同种型对照抗体的鼠IgG2A同种型对照(在下面的描述和附图中，简称为"mIgG2a"； 购自R&D Systems, Inc.，#MAB003)。在室温下温育板1小时。然后，按1 μ g/ml的终浓 度加入作为可溶性配体的重组鼠Ephrin-Al/Fc嵌合体(在下面的描述和附图中，简称 为"Ephrin-Al/Fc “；购自R&D Systems, Inc. , #602-Α1-200)或作为可溶性配体的阴性对 照蛋白的重组人IgG1 Fc(在下面的描述和附图中，简称为"h^Fc"；购自R&D Systems, Inc.，#110-HG-100)，并在室温下温育1小时。
接下来，依照实施例6中所述方法，去除孔内溶液，并且用稀释缓冲液洗涤各孔。向其中加入Fc γ片段特异性过氧化物酶AffiniPure羊抗人IgG (Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgGFc y Fragment Specific)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ,#109-035-098) 0用OPD显色液进行显色反应。用酶标仪测量490nm处的吸光度(图 8)。在图8中，吸光度表示为平均值士标准差(η = 3)。抗体Ab96_l甚至在10 μ g/ ml的浓度也强烈抑制EPHA2配体印hrin_Al与EPHA2的结合。相比之下，抗体SH348-1和 SH357-1即使在50 μ g/ml的浓度(Ab96_l浓度的五倍)下也不抑制Ephrin_Al/Fc与EPHA2 的结合。这些结果证明抗体SH348-1和SH357-1不抑制Ephrin_Al/Fc与EPHA2的结合。(实施例8)验证抗EPHA2抗体对印hrin-Al依赖的EPHA2酪氨酸残基磷酸化的抑 制活性8)-1细胞裂解液的制备将悬浮于含10% FBS,50单位/ml青霉素和50 μ g/ml链霉素的RPMI1640 (在下文 简称为"含10% FBS的RPMI1640 (含抗生素)“)的MDA-MB-231细胞按2. 5 X IO5个细胞 /孔铺于12孔板中，并在37°C下，5% CO2中培养过夜。随后弃去各孔内培养基，并向其重新 加入RPMI1640。将细胞在37°C下，5% CO2中再培养过夜。接着，去除各孔内培养基，向各 孔中加入单独的RPMI1640或含浓度为10 μ g/ml或50 μ g/ml的抗体(mIgG2a、SH348-1或 SH357-1)的RPMI1640，并在37°C下，5% CO2中预孵育1小时。向由此预孵育的仅补充了 RPMI1640的孔中加入含1/50体积的Ephrin_Al/Fc或 IiG1Fc (终浓度1 μ g/ml)或与此体积相同的RPMI1640 (在图9中由㈠表示)。此外，向补 充了 mIgG2a、SH348-l 或 SH357-1 的各孔中加入 1/50 体积的 Ephrin_Al/Fc 或 IiG1Fc (终浓 度 1 μ g/ml)。将所述板在37 °C下，5% CO2中另外孵育15分钟。弃上清液后，向其中加入含 ImM PMSF(购自 Sigma-Aldrich, Inc.)和蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)(购自 Sigma-Aldrich, Inc.，#P8340)的 IX 细胞裂解缓冲液(IXCell Lysis Buffer)(购自 CellSignaling Technology, Inc.)(以下简称为 PPCLB)以裂解细胞。将裂 解液在15000rpm下离心15分钟，并将所得上清液用作免疫沉淀的样品。用BCA Protein Assay Reagent (购自PIERCE)测量样品的蛋白浓度。8) -2通过免疫沉淀检测EPHA2的磷酸化情况将25 μ 1 蛋白 G 磁粒(购自 NEW ENGLAND BioLabs, Inc.)禾口 4 μ g 的抗 EphA2 抗 体(购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.，#sc_924)的悬浮液加入各孔中，并在4°C下将 混合液颠倒混合2小时。接着，向其加入终浓度为10%的FBS，并在4°C下将混合物再颠倒 混合30分钟。随后，用PPCLB洗涤珠粒。接着，向其加入200yg第8)-1节中制备的细胞 裂解液上清液，并在4°C下将混合物颠倒混合过夜。次日，用PPCLB洗涤珠粒三次。然后向珠粒中加入SDS-样品缓冲液(56. 3mM Tris-HCl,pH 6. 8，1.8% (w/v) SDS，9%甘油，0. 72M2-巯基乙醇，0. 045mg/ml 溴酚蓝)并将 混合液在98°C加热5分钟。从珠粒中解离的蛋白通过SDS-PAGE分离。将蛋白从凝胶上转移至PVDF膜(孔径0. 45 μ m ；购自Millipore)上。通过在无 叠氮钠的封闭液(将一袋Block Ace粉末溶解于100ml超纯水中，然后向其加入终浓度为0. 1% (ν/ν)的 Tween 20)振荡来封闭 PVDF 膜。为检测ΕΡΗΑ2酪氨酸残基的磷酸化情况，将PVDF膜浸入用无叠氮钠的封闭液稀释 了 10000倍的抗磷酸酪氨酸重组4G10HRP缀合物(购自Upstate，#16-184)溶液中，并在室 温下反应 1 小时。用 TBST(50mM Tris-HCl, pH 8. 0 的，138mM NaCl, 2. 7mM KC1,0. 1% (ν/ ν) Tween 20)洗涤PVDF膜三次，每次10分钟并接着用水洗三次，每次5分钟。然后用ECL Plus(购自GE Healthcare Bio-Sciences公司)检测胶片上化学发光的信号。接着，为检测存在于PVDF膜上免疫沉淀的EPHA2，将已检测EPHA2酪氨酸残基的磷 酸化情况后的PVDF膜浸入剥离液(50mM Tris-HCl, pH 6. 8的，2% (w/v) SDS，IOOmM 2-巯 基乙醇))中并在55°C下振荡30分钟。接着，将PVDF膜浸入猝灭溶液(含(v/v)H2O2 和0. (w/v)NaN3的TBST)中并在室温下振荡20分钟以去除PVDF膜上的抗体。用TBST 洗涤PVDF膜三次，每次10分钟，并在封闭液(将一袋Block Ace粉末溶解于IOOml超纯 水中，然后向其加入终浓度分别为0. (ν/ν)和0.02% (w/v)的Tween 20和叠氮钠) 中封闭。然后将PVDF膜浸入用封闭液稀释了 4000倍的抗EphA2抗体(购自Santa Cruz Biotechnology, Inc.，#sc_924)的溶液中并在室温下反应1小时。PVDF膜用TBST洗涤 三次，每次10分钟。然后将PVDF膜浸入用TBST稀释10000倍的抗兔IgG，HRP连接的抗 体(Anti-rabbit IgG, HRP-Iinked Antibody)(购自 Cell SignalingTechnology, Inc., #7074)的溶液中，并在室温下反应30分钟。然后用TBST洗涤该PVDF膜三次，每次10分 钟。然后用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。可溶性配体Ephrin-Al/Fc诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化不被同种型对照抗 体mIgG2a抑制，但通过加入抗体SH348-1和SH357-1则呈剂量依赖性形式被抑制(图9)。这些结果证明抗体SH348-1和SH357-1不抑制配体Ephrin-Al与EPHA2的结合， 并抑制了由所述配体诱导的EPHA2酪氮酸残基的磷酸化。(实施例9)抗EPHA2抗体的表位鉴定制备由图10所示的区域组成的EPHA2缺失突变体，并确定与SH348-1或SH357-1 结合的区域。9)-1EPHA2缺失突变体的制备为使EPHA2的缺失突变体表达成N端添加有GST标签和His标签并且C端添加有S 标签的蛋白，合成以下引物，并且将通过以下所示方法扩增的基因片段克隆至pET-49b(+) (购自 Novagen)中5' -attaggatccgagcttccgtactgccagtgtc-3'(弓丨物 Nl :SEQ ID No. 82)5' -attaggatccgccccccaaggtgaggct-3'(弓丨物 N2 :SEQ ID No. 83)5' -attaggatccggtcacttaccgcaagaagggaga-3'(弓 L N3 :SEQ ID No. 84)5' -attaggatccggtccaggtgcaggcactgacg-3'(弓丨物 N4 :SEQ ID No. 85)5' -aattaagcttgccgccaatcaccgccaagtt-3'(弓丨物 C 1 :SEQ ID No. 86)5' -aattaagcttgttgccagatccctccggggac-3'(弓丨物 C2 :SEQ ID No. 87)5' -aattaagcttcaggtaggtggtgtctggg-3'(弓丨物 C3 :SEQ ID No. 88)5' -aattaagcttctcgtacttccacactcggc-3'(弓丨物 C4 :SEQ ID No. 89)用作为模板的pcDNA-DEST40-EPHA2和以下引物组通过PCR反应扩增以下各区弓丨 物m和Cl用于由序列表中SEQ ID NO 8的第426-540位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作〃 ml")；引物N2和C2用于由SEQ ID NO 8的第426-534位氨基酸表 示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"m2〃)；引物m和C3用于由SEQ ID NO :8的第 426-504位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"m3〃)；引物m和C4用于由 SEQ ID NO :8的第426-470位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"m4")； 引物N2和C2用于由SEQ ID NO 8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域 (下文称作〃 m5〃)；引物N3和C2用于由SEQID NO :8的第471-534位氨基酸表示的氨基 酸序列组成的区域(下文称作〃 m6〃)；引物N4和C2用于由SEQ ID NO :8的第505-534 位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"m7")；引物N2和C3用于由SEQ ID NO :8的第439-504位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文称作"m8 “)，而引物 N2和C4用于由SEQ ID NO 8的第439-470位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区域(下文 称作“m9 “)。所得PCR产物用BamHI和HindIII切割并亚克隆至pET_49b (+)的BamHI/ HindIII位点中。
9) -2EPHA2缺失突变体的表达用第9) -1节构建的质粒DNA或作为阴性对照的pET_49b⑴转化大肠肝菌 BL21 (DE3)。将所得转化子培养于补充了 30 μ g/ml卡那霉素(购自Invitrogen公司)的 LB培养基中。用AutoinductionSystem(购自Novagen)诱导EPHA2缺失突变体的表达。通 过离心收集细菌细胞并用PBS洗涤。然后，用含ImM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(购自 Sigma-Aldrich, Inc.，#P8340)的2% SDS溶液裂解细菌细胞。通过离心收集上清液并用于 表位的鉴定。通过下述方法估计转化了 pET_49b(+)的大肠杆菌的细菌细胞裂解液中表达的蛋 白(由pET-49b(+)来源的GST标签、His标签和S标签和用于连接它们的接头部分组成， 在以下说明及附图中，称作"Vec")的表达水平。将表达Vec的细菌细胞裂解液的系列稀 释液和6x His Protein Ladder (购自QIAGEN)的系列稀释液分别溶解于SDS样品缓冲液 中并在98°C下加热5分钟。然后通过SDS-PAGE分离蛋白，并将凝胶中的蛋白转移至PVDF 膜上。PVDF膜用含5% BSA的TBST封闭。然后将PVDF膜浸入用含5% BSA的TBST稀释了 1000倍的五His HRP Conjugate (购自QIAGEN)溶液中并在室温下反应1小时。用TBST洗 涤该PVDF膜三次，每次10分钟。然后用ECL Plus检测信号。比较表达Vec的细菌细胞裂 解液的系列稀释液和6x His Protein Ladder的系列稀释液之间的信号强度，并从6x His Protein Ladder所含每条带的蛋白水平估计表达Vec的细菌细胞裂解液中所含Vec蛋白的 浓度。将以下量的EPHA2缺失突变体用于后续的表位鉴定实验所述量表现出的反应性与 20ngVeC在用S标签单克隆抗体(Novagen)的蛋白印迹中的反应性相当。9)-3)表位鉴定将含第9)-2节中制得的EPHA2缺失突变体的细胞裂解物溶解于SDS样品缓冲液 中并在98°C下加热5分钟。所得样品通过SDS-PAGE分离，并将凝胶中的蛋白转移至PVDF 膜上。转膜后，通过在封闭液(一袋Block Ace粉末溶解于IOOml超纯水中，然后向其加 入终浓度分别为0. 1% (ν/ν)和0. 02% (w/v)的Tween 20和叠氮钠)振荡封闭PVDF膜。 随后，在4°C下将这些PVDF膜在含2 μ g/ml SH348-1或SH357-1的封闭液中反应过夜。用 TBST洗涤这些PVDF膜三次，每次10分钟，并在室温下用TBST稀释了 5000倍的Anti-Mouse Ig, HRP-Linked Whole Ab Sheep溶液中另外反应30分钟。随后，PVDF膜用TBST洗涤三次，每次10分钟。接着用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。接下来，将PVDF 膜浸入剥离液(50mM Tris-HCl, pH 6. 8,2 % (w/v) SDS，IOOmM 2-巯基乙醇)中并在55°C下振荡30分钟，随后用TBST洗涤三次，每次10分钟。将这些PVDF 膜在封闭液中封闭并用TBST洗涤三次，每次10分钟。然后将PVDF膜浸入用TBST稀释了 10000倍的S标签单克隆抗体溶液中并在室温下反应30分钟。用TBST洗涤PVDF膜三次， 每次10分钟。随后将PVDF膜浸入用TBST稀释了 5000倍的Anti-Mouse Ig, HRP-Linked WholeAb She印溶液中并在室温下反应30分钟。接着，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次10 分钟。接着用ECL Plus检测胶片上化学发光的信号。结果显示，抗体SH348-1(图11A)和SH3 57-1 (图11C)两者仅对ml、m2和m5表 现出结合活性。此外，在该方法中，EPHA2的缺失突变体在每张PVDF膜上存在量基本恒定 (SH348-1 图 11B，SH357-1 图 11D)。这些结果证明抗体 SH348-1 和 SH357-1 结合 EPHA2 氨 基酸序列中的由序列表中SEQ ID NO :8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的区 域。(实施例10)人源化抗体的设计10)-1SH348_1人源化抗体的设计10)-1-1SH348_1可变区的分子模型SH348-1可变区的分子模型根据同源建模(Methods inEnzymology, 203， 121-153，(1991))进行。将登记在蛋白数据库(Protein Data Bank) (Nuc. Acid Res. 35， D301-D303(2007))中人免疫球蛋白可变区的一级序列(可用来源于X射线晶体结构的三 维结构)与实施例5中确定的SH348-1可变区对比。结果显示，2JEL和1A4J分别被选为 与SH348-1轻链或重链的可变区同源性最高的序列。构架区的三维结构基于“构架模型” 制作，所述“构架模型”通过结合对应于SH348-1轻链和重链的2JEL和1A4J的坐标而得 至丨J。按照 Thornton 等的分类法(J. Mol. Biol.，263，800-815，(1996))，SH348-1 的 CDRL1、 CDRLyCDRLpCDRH1 和 CDRH2 分别指定为以下簇16A、7A、9A、10A 和 10A。按照 H3-规则(FEBS letters 399，1-8 (1996)) CDRH3归类为e (9) D。由此，每个CDR的典型构象都被引入构架模 型中。最后，从能量方面考虑，为了得到SH348-1可变区可能的分子模型，进行排除不 利的原子间接触的能量计算。用市售的三维蛋白结构预测程序Prime和坐标搜索程序 MacroModel (Schrodinger, LLC)进行这些方法。10)-1-2人源化SH348-1的氨基酸序列的设计依照CDR 移植(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033 (1989))构建人源化 SH348-1的抗体。基于构架区内氨基酸的同源性选择受体抗体。将SH348-1构架区的序列 与Kabat Database (Nuc. Acid Res. 29，205-206 (2001))中登记的涉及抗体氨基酸序列的所 有人构架区的序列比较。选定GSD2B5B10' CL抗体作为受体，因为他们的构架区之间的序 列同源性最高(72% )。将GSD2B5B10' CL构架区的氨基酸残基与SH348-1中相应的氨基 酸残基比对，以确定在两者间使用不同氨基酸的位置。使用由此构建的SH348-1的三维模 型分析这些残基的位置。然后，按照Queen等提供的标准(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86， 10029-10033 (1989))选定向受体移植的供体残基。通过将某些选定的供体残基转移至受体 抗体GSD2B5B10' CL中来确定人源化的SH348-1序列。结果显示，如下所示得到两类轻链和两类重链的人源化序列。在下文中，基于Kabat等制作的抗体氨基酸序列数据库对可变
区、恒定区和CDR分类。 10-1-3) SH348-1 轻链的人源化 10-1-3-1) hSH348-TlL 型轻链如下设计人源化SH348-1的轻链并将其命名为“hSH348_TlL型轻链”将序列表 中SEQ ID N0:37所示SH348-1的轻链可变区中第2(缬氨酸)、3(亮氨酸)、14(丝氨酸)、 15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、79(精氨酸)、88(亮氨酸)、 105 (甘氨酸)、109 (亮氨酸)和114 (丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代异亮氨酸、 缬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏 氨酸。编码hSH348_TlL型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 90表示，其氨基酸 序列由SEQ ID NO 91表示。由SEQ ID NO 90的第1_60位核苷酸表示的核苷酸序列为分 泌信号序列。由SEQ IDNO :90的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQID NO 90的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 90的第130-177 位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RL115由SEQ ID NO 90的第223-243位核苷酸表示的核苷 酸序列为⑶RL2。由SEQ ID NO 90的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RL3。由序列表中SEQ ID NO 91的第1_20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO :91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO: 91的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 91的第44-59位氨 基酸表示的氨基酸序列为CDRL115由SEQ ID NO :91的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列 为CDRL20由SEQ ID NO 91的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL30此外，编码hSH-348-TlL型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 92表 示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :93表示；⑶RL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID N0:94表 示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 95表示；⑶RL3的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 96表 示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:97表示。10-1-3-2) hSH348_T3L 型轻链如下设计人源化SH348-1的轻链并将其命名为“hSH348_l_T3L型轻链”将序列 表中SEQ ID NO :37所示SH348-1轻链可变区中第14 (丝氨酸)、15 (亮氨酸)、17 (天冬氨 酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、79(精氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨 酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷 氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。编码hSH348-l_T3L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO :98表示，其氨基酸 序列由SEQ ID N0:99表示。由SEQ ID NO :98的第1_60位核苷酸表示的核苷酸序列为分泌 信号序列。由SEQID NO 98的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO 98的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 98的第130-177 位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RL115由SEQ ID NO 98的第223-243位核苷酸表示的核苷 酸序列为⑶RL2。由SEQ ID NO 98的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RL3。由序列表中SEQ ID NO 99的第1-20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO :99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO:99的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 99的第44-59位氨 基酸表示的氨基酸序列为CDRL115由SEQ ID NO :99的第75-81位氨基酸表示的氨基酸序列 为⑶RL2。由SEQ ID NO 99的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RL3。此外，编码hSH348-l-T3L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 100 表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 101表示；⑶RL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 102表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 103表示；⑶RL3的核苷酸序列由序列表中SEQID NO: 104表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 105表示。10-1-4) SH348-1 重链的人源化
10-1-4-1) hSH348-l_TlH 型重链如下设计人源化SH348-1的重链并将其命名为“hSH348-l_TlH型重链”将序列 表中SEQ ID N0:43所示的SH348-1重链可变区中第2(异亮氨酸)、9(脯氨酸)、11(亮氨 酸)、16(谷氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、46(赖氨酸)、 68(苯丙氨酸)、69(丙氨酸)、70(苯丙氨酸)、71(丝氨酸)、72(亮氨酸)、73(谷氨酸)、 76 (丙氨酸)、80 (苯丙氨酸)、82 (谷氨酰胺)、83 (异亮氨酸)、84 (天冬酰胺)、85 (天冬酰 胺)、87(赖氨酸)、88(天冬酰胺)、93(苏氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115 (亮氨 酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精 氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。编码hSH348_TlH型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 106表示，其氨基酸 序列由SEQ ID NO 107表示。由SEQ ID NO 106的第1_57位核苷酸表示的核苷酸序列为 分泌信号序列。由SEQID NO :106的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由 SEQ ID NO :106的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 106 的第148-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH115由SEQ ID NO 106的第205-255位核 苷酸表示的核苷酸序列为⑶RH2。由SEQ ID NO: 106的第352-381位核苷酸表示的核苷酸 序列为CDRL3。由序列表中SEQ ID NO 107的第1_19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO 107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO 107的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 107的第50-54位 氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RHp由SEQ ID NO 107的第69-85位氨基酸表示的氨基酸 序列为⑶RH2。由SEQ ID NO 107的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RH3。此外，编码hSH348-l_TlH型重链⑶RH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 108 表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 109表示；⑶RH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID N0: 110表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 111表示；⑶RH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 112表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:113表示。10-1-4-2) hSH348-l_T3H 型重链如下设计人源化SH348-1的重链并将其命名为“hSH348-l_T3H型重链”将序列表 中SEQ ID N0:43所示的SH348-1重链可变结构域中第9(脯氨酸)、11(亮氨酸)、16(谷氨 酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨酸)、 80 (苯丙氨酸)、82 (谷氨酰胺)、83 (异亮氨酸)、84 (天冬酰胺)、85 (天冬酰胺)、87 (赖氨酸)、88 (天冬酰胺)、93 (苏氨酸)、95 (苯丙氨酸)、114 (苏氨酸)和115 (亮氨酸)位氨基 酸分别用以下氨基酸取代丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天 冬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、 亮氨酸和缬氨酸。编码hSH348-l_T3H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 114表示，其氨基 酸序列由SEQ ID NO 115表示。由SEQ ID NO 114的第1_57位核苷酸表示的核苷酸序列 为分泌信号序列。由SEQID NO :114的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由 SEQ ID NO :114的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 114 的第148-162位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RH115由SEQ ID NO 114的第205-255位核 苷酸表示的核苷酸序列为⑶冊2。由SEQ ID NO 114的第352-381位核苷酸表示的核苷酸 序列为CDRL3。
由序列表中SEQ ID NO 115的第1_19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO 115的其第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO 115的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 115的第50-54位 氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RHp由SEQ ID NO 115的第69-85位氨基酸表示的氨基酸 序列为⑶RH2。由SEQ ID NO 115的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RH3。此外，编码hSH348-l-T3H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 116 表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 117表示；⑶RH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 118表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 119表示；⑶RH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 120表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO :121表示。10)-2SH357-1的人源化抗体的设计10)-2_1SH357-1可变区的分子模型以如第10)-1-1节的相同方法选择2JEL和1A4J分别作为与SH357-1轻链和重链 可变区同源性最高的序列。CDRLpCDRLyCDRLyCDRH1和CDRH2分别指定为以下簇16A、7A、 9A、10A 禾口 10A, CDRH3 归类为 e(9)D。10) -2-2人源化SH357-1的氨基酸序列的设计以与第10)-1_2节相同的方法，选择6502858 10' CL抗体作为受体并确定人源化 SH357-1的序列。结果得到如下所示的两类轻链和两类重链的人源化序列。10-2-3) SH357-1 轻链的人源化10-2-3-1) hSH357_TlL 型轻链如下设计人源化SH357-1轻链并命名为“hSH357_l_TlL型轻链”将序列表中SEQ ID NO 41所示的SH357-1轻链中第2 (缬氨酸)、3 (亮氨酸)、7 (苏氨酸)、14 (丝氨酸)、 15(亮氨酸)、17(天冬氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、 109 (亮氨酸)和114(丙氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代异亮氨酸、缬氨酸、丝氨 酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨 酸。编码hSH357-l-TlL型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 122表示，其氨基 酸序列由SEQ ID NO 123表示。由SEQ ID NO 122的第1_60位核苷酸表示的核苷酸序列 为分泌信号序列。由SEQID NO :122的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由SEQ ID NO 122的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 122的 第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL115由其第223-243位核苷酸表示的核苷酸 序列为⑶RL2。由SEQ ID NO 122的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序列为⑶RL3。由序列表中SEQ ID NO 123的第1_20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO :123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO: 123的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 123的第44-59位 氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RL115由SEQ ID NO: 123的第75-81位氨基酸表示的氨基酸 序列为CDRL20由SEQ ID NO 123的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL30此外，编码hSH357-l-TlL型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 124 表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 125表示；⑶RL2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 126表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 127表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表中SEQID N0: 128表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:129表示。
10-2-3-2) hSH357_l_T3L 型轻链如下设计人源化SH357-1的轻链并将其命名为“hSH357_l_T3L型轻链”将序列表 中SEQ ID而41所示的5!1357-1轻链中第7(苏氨酸)、14(丝氨酸)、15(亮氨酸)、17(天冬 氨酸)、18(谷氨酰胺)、50(赖氨酸)、88(亮氨酸)、105(甘氨酸)、109(亮氨酸)和114 (丙 氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰 胺、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和苏氨酸。编码hSH357-l-T3L型轻链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 130表示，其氨基 酸序列由SEQ ID NO 131表示。由SEQ ID NO 130的第1_60位核苷酸表示的核苷酸序列 为分泌信号序列。由SEQID NO :130的第61-402位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由 SEQ ID NO 130的第403-717位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 130的 第130-177位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRL115由SEQ ID NO 130的第223-243位核苷 酸表示的核苷酸序列为⑶RL2。由SEQ ID NO 130的第340-363位核苷酸表示的核苷酸序 列为CDRL3。由序列表中SEQ ID NO 131的第1_20位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO :131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID N0: 131的第135-239位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 131的第44-59位 氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RL115由SEQ ID N0:131的第75-81位氨基酸表示的氨基酸 序列为CDRL20由SEQ ID NO 131的第114-121位氨基酸表示的氨基酸序列为CDRL30此外，编码hSH357-l-T3L型轻链CDRL1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 132 表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:133表示；⑶RL2的核苷酸序列由序列表的SEQ ID N0: 134表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 135表示；CDRL3的核苷酸序列由序列表的SEQID N0: 136表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:137表示。10-2-4) SH357-1 重链的人源化10-2-4-1) hSH-357-l-TlH 型重链如下设计人源化SH357-1重链并命名为“hSH357-l_TlH型重链”将序列表中SEQ ID NO 51所示的SH357-1重链可变区中第2 (异亮氨酸)、9 (脯氨酸)、11 (亮氨酸)、16 (谷 氨酸)、17(苏氨酸)、20(异亮氨酸)、38(赖氨酸)、43(赖氨酸)、46(赖氨酸)、68(苯丙氨酸)、69(丙氨酸)、70(苯丙氨酸)、71(丝氨酸)、72(亮氨酸)、73(谷氨酸)、76(丙氨 酸)、82 (谷氨酰胺)、83 (异亮氨酸)、85 (天冬酰胺)、87 (赖氨酸)、88 (天冬酰胺)、93 (丝 氨酸)、95(苯丙氨酸)、114(苏氨酸)和115(亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代 缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、缬氨酸、苏氨 酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、精氨酸、丝氨酸、 缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。编码hSH357-l-TlH型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 138表示，其氨基 酸序列由SEQ ID NO 139表示。由SEQ ID NO 138的第1_57位核苷酸表示的核苷酸序列 为分泌信号序列。由SEQID NO :138的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由 SEQ ID NO :138的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 138 的第145-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH115由SEQ ID NO 138的第205-255位核 苷酸表示的核苷酸序列为⑶RH2。由SEQ ID NO: 138的第352-381位核苷酸表示的核苷酸 序列为CDRL3。由序列表中SEQ ID NO 139的第1_19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO 139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO 139的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由其第49-54位氨基酸表示的氨 基酸序列为⑶RH115由SEQ ID NO 139的第69-85位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RH2。由 SEQ ID NO 139的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RH3。此外，编码hSH357-l-TlH型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 140 表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 141表示；⑶RH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 142表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 143表示；⑶RH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 144表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 145表示。10-2-4-2) hSH357-l_T3H-型重链如下设计人源化SH357-1重链并命名为“hSH357-l_T3H型重链”将序列表中SEQ ID NO 51所示的SH357-1重链可变区中第9 (脯氨酸)、11 (亮氨酸)、16 (谷氨酸)、17 (苏 氨酸)、20 (异亮氨酸)、38 (赖氨酸)、43 (赖氨酸)、73 (谷氨酸)、76 (丙氨酸)、82 (谷氨酰 胺)、83 (异亮氨酸)、85 (天冬酰胺)、87 (赖氨酸)、88 (天冬酰胺)、93 (丝氨酸)、95 (苯丙 氨酸)、114(苏氨酸)和115 (亮氨酸)位氨基酸分别用以下氨基酸取代丙氨酸、缬氨酸、 丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸、精 氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、亮氨酸和缬氨酸。编码hSH357-l_T3H型重链的核苷酸序列由序列表中SEQ IDNO 146表示，其氨基 酸序列由SEQ ID NO 147表示。由SEQ ID NO 146的第1_57位核苷酸表示的核苷酸序列 为分泌信号序列。由SEQID NO :146的第58-414位核苷酸表示的核苷酸序列为可变区。由 SEQ ID NO :146的第415-1404位核苷酸表示的核苷酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 146 的第145-162位核苷酸表示的核苷酸序列为CDRH115由SEQ ID NO 146的第205-255位核 苷酸表示的核苷酸序列为⑶RH2。由SEQ ID NO: 146的第352-381位核苷酸表示的核苷酸 序列为CDRL3。由序列表中SEQ ID NO 147的第1_19位氨基酸表示的氨基酸序列为分泌信号序 列。由SEQ ID NO 147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列为可变区。由SEQ ID NO 147的第139-468位氨基酸表示的氨基酸序列为恒定区。由SEQ ID NO 147的第49-54位 氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RHp由SEQ ID NO 147的第69-85位氨基酸表示的氨基酸 序列为⑶RH2。由SEQ ID NO 147的第118-127位氨基酸表示的氨基酸序列为⑶RH3。此外，编码hSH357-l-T3H型重链CDRH1的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 148 表示，其氨基酸序列由SEQ ID N0:149表示。⑶RH2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 150表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO 151表示；⑶RH3的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO 152表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 153表示。(实施例11)人源化抗EPHA2抗体的制备为检测人源化SH348-1和人源化SH357-1的活性，如下所示构建具有实施例10中得到的人源化抗EPHA2抗体的重链和轻链的质粒。11)-1人源化抗EPHA2抗体表达载体的构建11)-1-1多功能人源化抗体轻链的表达载体(pEF6/KCL)的制备合成序列表中SEQ ID NO 154所述的编码人抗体轻链信号序列和人Ig轻链(κ 链)恒定区的基因(Invitrogen公司；人工基因合成服务)并用限制性内切酶NheI和PmeI 切割基因，将所切割的DNA片段插入pEF6/V5-HisB(Invitrogen公司)的Nhel/Pmel位点 中以构建多功能人源化抗体轻链表达载体(PEF6/KCL)。11)-1-2多功能人源化抗体重链表达载体(pEFl/FCXU-l)的制备合成序列表中SEQ ID NO 155所述的编码人抗体重链信号序列和人IgGl恒定区 的基因(Invitrogen公司；人工基因合成服务)并用限制性内切酶NheI和PmeI切割所述 基因，将所切割的DNA片段插入pEFl/myc-HisB载体(InVitrogen公司)的Nhel/Pmel位 点中，以构建多功能人源化抗体H链表达载体(p EF1/FCXU-1)。ll)-l-3hSH348-l-TlL 型轻链和 hSH348_l_T3L 型轻链的表达载体合成包含编码由序列表中SEQ ID NO 156和157表示的hSH348_l_TlL型轻链和 hSH348-l-T3L型轻链可变区的基因并融合了分泌信号的各DNA(Invitrogen公司；人工基 因合成服务)，并用限制性内切酶NdeI和BsiWI切割所述DNA。分别将所得DNA片段插入 预先用限制性内切酶NdeI和BsiWI消化的用于人源化抗体轻链表达的多功能载体(pEF6/ KCL)的位点中，从而构建出hSH348-l-TlL型轻链和hSH348-l-T3L型轻链的表达载体。所 得表达载体分别命名为 “pEF6/KCL/hSH348-l-TlL” 和 “pEF6/KCL/hSH348-l_T3L”。ll)-l-4hSH348-l-TlH型重链和hSH348-l_T3H型重链的表达载体的构建合成包含编码由序列表中SEQ ID NO 158和159表示的hSH348-l_TlH型重链 和hSH348-l-T3H型重链可变区的基因的各DNA (Invitrogen公司；人工基因合成服务)， 并用限制性内切酶BlpI消化所述DNA。分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶 BlpI消化的用于人源化抗体H链表达的多功能载体(pEFl/FCCU-Ι)的位点中，从而构建 出hSH348-l-TlH型重链和hSH348-l_T3H型重链的表达载体。所得表达载体分别命名为 “pEFl/FCCU/hSH348-l-TlH” 和 “pEFl/FCCU/hSH348-l_T3H”。ll)-l-5hSH357-l-TlL型轻链和hSH357_l_T3L型轻链的表达载体的构建合成包含编码分别由序列表中SEQ ID NO 160或161表示的hSH357_l_TlL型轻 链和hSH357-l-T3L型轻链可变区的基因并融合了分泌信号的各DNA(Invitrogen公司；人 工基因合成服务)，并将用限制性内切酶NdeI和BsiWI消化所述DNA，分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶Ndel和BsiWI消化的用于人源化抗体L链表达的多功能载体 (PEF6/KCL)的位点中，从而构建hSH357-l-TlL型轻链和hSH357-l-T3L型轻链的表达载体。 所得表达载体分别命名为 “pEF6/KCL/hSH357-l-TlL” 和 “pEF6/KCL/hSH357-l_T3L，，。ll)-l-6hSH357-l-TlH型重链和hSH357_l_T3H型重链的表达载体的构建合成包含编码分别由序列表中SEQ ID NO :162或163表示的hSH357-l_TlH型重 链 或hSH357-l-T3H型重链可变区的基因的各DNA (Invitrogen公司；人工基因合成服务)并 用限制性内切酶BlpI消化DNA。分别将所得DNA片段插入预先用限制性内切酶BlpI消化的 用于人源化抗体H链表达的多功能载体(pEFl/FCXU-l)的位点中，从而构建hSH357-l-TlH 型重链和hSH357-l-T3H型重链的表达载体。所得表达载体分别命名为“pEFl/FCXU/ hSH357-l-TlH” 和 “pEFl/FCCU/hSH357-l_T3H”。11) _2人源化抗体的制备将处于对数生长期的293FreeStyle细胞按1. 2X 109个细胞接种于1. 2L新鲜 Freestyle 293表达培养基(Invitrogen公司)中并在保温箱内在37°C下，8% C02中振荡 培养(125rpm)。将 12mg 的聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)溶解于 40mL 的 Opti-Pro SFM 培养基(购自Invitrogen公司)中并在室温下放置5分钟。将用PureLink HiPurePlasmid 试剂盒(Invitrogen公司)制得的H链表达质粒(0. 6mg)和L链表达质粒(1. 8mg)悬浮 于40mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen公司)中。将40mL聚乙烯亚胺/OptiPro SFM的混合液在室温下放置5分钟，向其中加入40mL表达质粒/OptiPro SFM混合液中并 在室温下再放置5分钟。然后，将80mL聚乙烯亚胺/表达质粒/OptiPro SFM的混合液加 入293FreeStyle细胞悬液中，并持续振荡培养。在37°C下，8% C02中培养7天后，收集培 养上清液。11) -3人源化抗体的纯化将第11)_2节中所得培养上清液通过Disposable Capsule Filter(Advantec MFS Inc.，#CCS-045-ElH)过滤，并随后通过蛋白A亲和柱层析纯化。将培养上清液上样至用 PBS 平衡的 MabSelect SuReHiTrap lmL(购自 GE Healthcare Bio-sciences 公司)中，并 用PBS洗涤。接下来，向其加入2M精氨酸溶液(pH 4.0)并收集含抗体的部分。调整pH至 7并将含抗体的部分上样至预先用PBS平衡的HiPr印Desalting Column (26/10, 50mL) (GE Healthcare Bio-sciences公司)中。在用PBS替换后，将含抗体的部分通过0. 2_ ii m滤器 以制得纯化样品。通过洗脱与P0R0S G 20 u m Column，PEEK，4. 6mmX 100mm，1. 7ml (购自 Applied Biosystems)结合的抗体并检测洗脱液的吸光度(0. D. 280nm)以测定抗体的浓度，随后与 标准品(人IgGl)比较峰面积。通过将pEF6/KCL/hSH348-l-TlL 与 pEFl/FCCU/hSH348-l_TlH 组合制得的人源化 抗体 SH348-1 命名为“hSH348-l-Tl “；而通过将 pEF6/KCL/hSH348-l_T3L 与 pEFl/FCCU/ hSH348-l-T3H组合制得的人源化抗体SH348-1命名为〃 hSH348_l_T3〃。此外，通过将pEF6/KCL/hSH357-l-TlL 与 pEFl/FCCU/hSH357-l-TlH 组合制得的人 源化抗体 SH357-1 命名为“hSH357-l-Tl “；通过将 pEF6/KCL/hSH357_l_T3L 与 pEFl/FCCU/ hSH357-l-T3H组合制得的人源化抗体SH357-1命名为〃 hSH357_l_T3〃。(实施例12)人源化抗EPHA2抗体与抗原的结合活性的确定
依照实施例6中方法(除了使用Fc y片段特异性过氧化物酶AffiniPure羊抗人 IgG(购自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ,#109-035-098)作为第二抗体之 外)确定抗体 hSH348-l-Tl、hSH348-l-T3、hSH357_l_Tl 和 hSH357_l_T3 与抗原结合的能 力。在图12A)-12D)的图表中，吸光度表示为平均值士标准差(n = 3)。结果显示，人 源化抗 EPHA2 抗体 hSH348-l-Tl、hSH348-l-T3、hSH357-l-Tl 和 hSH357_l_T3 均确定为具有 与EPHA2胞外区的结合活性。(实施例13)竞争性抑制SH348-1或SH357-1与EPHA2结合的活性的检测hSH348-l-Tl和hSH348_l_T3竞争性抑制SH348-1与EPHA2结合的活性以及 hSH357-l-Tl和hSH357-l-T3竞争性抑制SH357-1与EPHA2结合的活性通过下述方法检测。用EZ-Link Sulfo-NHS-LC 生物素化试剂盒(购自 Thermo FisherScientific K. K.，#21435)，依照试剂盒中所含方案分别对鼠单克隆抗体SH348-1和SH357-1进行生物 素化(在下文中生物素化的SH348-1和SH357-1分别称作〃 bSH348_l〃和〃 bSH357_l")。 竞争性抑制实验中使用的bSH348-l、bSH357-l和未标记的抗体(SH348-1、SH357-1、 hSH348-l-Tl、hSH348-l-T3、hSH357-l-Tl、hSH357-l-T3 和 Ab96-1)的浓度用 BCA Protein Assay Reagent (购自 PIERCE)检测。用PBS 将 EPHA2 胞外区多肽(购自 R&D Systems, Inc.，#3035-A2_100)稀释至 0. 5iig/ml，然后按lOOiil/孔分配至免疫微量板(购自Nunc，#442404)上，并在4°C下孵 育过夜，从而使蛋白吸附在所述板上。次日，用稀释缓冲液(PBS，0.05% (v/v)Tween 20)洗 涤各孔一次。然后将用PBS稀释4倍的Block Ace溶液(将一袋BlockAce粉溶解于100ml 超纯水中)以200 yl/孔分配于各孔中，并在室温下温育4小时。去除各孔内溶液。然后， 将生物素化的抗体(5 u g/ml)与各个浓度(Oy g/ml、lii g/ml、5ii g/ml、25ii g/ml、50ii g/ ml和125 u g/ml)的未标记抗体(溶剂含0. 05% (v/v)(终浓度)Tween 20的PBS)分别 以100 yl/孔分配至各孔中，并在室温下温育1小时。用稀释缓冲液(PBS，0.05% (v/v) Tween 20)洗涤各孔两次。然后，以100 yl/孔加入用稀释缓冲液稀释了 500倍的链霉亲 禾口素-辣 *艮过氧化物醇缀合物(Streptavidin-horseradish Peroxidase Con jugate)(购 自GE Healthcare Bio-Sciences公司，#RPW231V)，并在室温下温育1小时。去除各孔内 液体，用稀释缓冲液洗涤各孔两次。然后通过以100 yl/孔加入0PD显色液并搅拌来进行 显色反应。显色后，通过加入lOOiil/孔的1M HC1终止显色反应。用酶标仪检测490nm处 的吸光度。结果显示，补充了单独的bSH348_l或bSH357_l的各孔的吸光度分别为 0. 780 士 0.016 和 0. 978 士 0. 007 (平均值 士 标准差(n = 3))。在图13A)和13B)的图表中，吸光度表示为平均值士标准差(n = 3)。SH348-1或 SH357-1对EPHA2的结合不被与其表位不同的Ab96-1所抑制。另一方面，结果显示，SH348-1 对EPHA2的结合被抗体SH348-1本身或其人源化抗体hSH348_l_Tl和hSH348_l_T3所抑制 (图13A)。同样地，结果显示，SH357-1对EPHA2的结合被抗体SH357-1本身或其人源化抗 体 hSH357-l-Tl 和 hSH357-l-T3 所抑制(图 13B)。(实施例14)人源化抗EPHA2抗体对印hrin-Al依赖性EPHA2酪氨酸残基磷酸化 的抑制作用
依照实施例8中所述方法，检测人源化抗EPHA2抗体抑制EPHA2酪氨酸残基 的ephrin-Al依赖性磷酸化的能力。结果显示，所有抗体hSH348_l_Tl、hSH348_l_T3、 hSH357-l-Tl和hSH357-l-T3均显示出保持抑制Ephrin_Al/Fc诱导的EPHA2酪氨酸残基的 磷酸化的活性(图14)。工业实用性本发明的抗EPHA2抗体具有抗肿瘤活性。包含抗EPHA2抗体的药物组合物可用作 抗癌药物。
权利要求
一种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)的抗体识别的表位。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体具有以下a)_d)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和d)具有体内抗肿瘤活性。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；d)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和e)具有体内抗肿瘤活性。
4.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8的第426-534位氨基酸所 表示的氨基酸序列组成的多肽。
5.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8的第426-534位氨基酸所 表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)_d)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和d)具有体内抗肿瘤活性。
6.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8的第426-534位氨基酸所 表示的氨基酸序列组成的多肽并且具有以下a)_e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；d)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和e)具有体内抗肿瘤活性。
7.权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQID NO 8 的第439-534位氨基酸所表示的氨基酸序列组成的肽。
8.权利要求1-7中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
9.权利要求1-7中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2，但抑制 由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
10.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8所表示的氨基酸序列组 成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO 59,61和63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代 或添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO 65,67和69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
11.一种特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8所表示的氨基酸序列组成的多肽的抗 体，所述抗体特征在于以下1)和2)1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4-(I)其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中SEQ ID NO :59表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或 添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表 中SEQ ID NO :61表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、 取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由 序列表中SEQ ID NO :63表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸 的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其 中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽 -Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL1表示由序列表中SEQ ID NO 65表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添 加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中 SEQ ID NO 67表示的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL3 表示由序列表中SEQ ID NO :69表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个 氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序 列；其中这些氨基酸彼此通过肽键连接。
12.—种抗体，所述抗体识别由产生自杂交瘤SH357-1 (FERMBP-10837)的抗体识别的 表位。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体具有以下a)-d)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；c)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和d)具有体内抗肿瘤活性。
14.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8的第426-534位氨基酸 表示的氨基酸序列组成的肽并且具有以下a)-e)的性质a)不具有磷酸化EPHA2酪氨酸残基的能力；b)不表现出降低EPHA2蛋白水平的作用；c)具有针对表达EPHA2的细胞的ADCC活性；d)具有针对表达EPHA2的细胞的⑶C活性；和e)具有体内抗肿瘤活性。
15.权利要求12-14中任一项的抗体，其中所述抗体特异性结合由序列表中SEQID NO 8的第439-534位氨基酸表示的氨基酸序列组成的肽。
16.权利要求12-15中任一项的抗体，其中所述抗体抑制由EPHA2配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
17.权利要求12-15中任一项的抗体，其中所述抗体不抑制EPHA2配体结合EPHA2，但 抑制由所述配体诱导的EPHA2酪氨酸残基的磷酸化。
18.一种抗体，所述抗体特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8表示的氨基酸序列组成的多肽，其中所述抗体具有作为重链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID N0:7U 73和75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或 添加的氨基酸序列，并且具有作为轻链可变区中的互补决定区的由序列表中SEQ ID NO 77,79和81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代 或添加的氨基酸序列。
19.一种特异性结合由序列表中SEQ ID NO :8所表示的氨基酸序列组成的多肽的抗 体，所述抗体特征在于以下1)和2)1)具有包含由通式(I)表示的氨基酸序列的重链肽-Frh1-Cdrh1-Frh2-Cdrh2-Frh3-Cdrh3-Frh4-(I)其中，FRH1表示由18-30个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RH1表示由序列表中SEQ ID NO :71表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或 添加的氨基酸序列；FRH2表示由14个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH2表示由序列表 中SEQ ID NO :73表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、 取代或添加的氨基酸序列；FRH3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRH3表示由 序列表中SEQ ID NO :75表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸 的缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRH4表示由11个氨基酸组成的任意氨基酸序列，其 中这些氨基酸彼此通过肽键连接；和2)具有包含由通式(II)表示的氨基酸序列的轻链多肽 -Frl1-Cdrl1-Frl2-Cdrl2-Frl3-Cdrl3-Frl4- (ii)其中，FRL1表示由23个氨基酸组成的任意氨基酸序列；⑶RL1表示由序列表中SEQ ID NO 77表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取代或添 加的氨基酸序列；FRL2表示由15个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL2表示由序列表中 SEQ ID NO :79表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的缺失、取 代或添加的氨基酸序列；FRL3表示由32个氨基酸组成的任意氨基酸序列；CDRL3表示由序 列表中SEQ ID NO :81表示的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸的 缺失、取代或添加的氨基酸序列；而FRL4表示由10个氨基酸组成的任意氨基酸序列；其中 这些氨基酸彼此通过肽键连接。
20.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人源化抗体。
21.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为人抗体。
22.权利要求1-19中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为IgG抗体。
23.权利要求1-9和12-17中任一项的抗体，其特征在于所述抗体为选自以下的任何抗 体Fab、F(ab' )2、Fv、scFv、双抗体、线性抗体和多特异性抗体。
24.一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH348-1 (FERMBP-10836)。
25.一种抗体，所述抗体产生自杂交瘤SH357-1 (FERMBP-10837)。
26.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQID NO 35的第1_119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽 或包含由序列表中SEQ ID NO 39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽；和2)包含由序列表中SEQID NO 37的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽 和包含由序列表中SEQ ID NO 41的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
27.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQID NO :35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽， 和包含由序列表中SEQ ID NO 37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽；和2)包含由序列表中SEQID NO :39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多肽， 和包含由序列表中SEQ ID NO 41的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
28.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQID NO :35表示的氨基酸序列的重链多肽，或包含由序列表中 SEQ ID NO :39表示的氨基酸序列的重链多肽；和2)包含由序列表中SEQID NO :37表示的氨基酸序列的轻链多肽，或包含由序列表中 SEQ ID NO :41表示的氨基酸序列的轻链多肽。
29.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQID NO :35表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中 SEQ ID NO 37表示的氨基酸序列的轻链多肽；和2)包含由序列表中SEQID NO :39表示的氨基酸序列的重链多肽和包含由序列表中 SEQ ID NO :41表示的氨基酸序列的轻链多肽。
30.一种抗体，所述抗体通过人源化权利要求24-29中任一项的抗体得到。
31.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQID NO 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，或包含由序列表中SEQ ID NO 115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽；和2)包含由序列表中SEQID NO :91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽，或包含由序列表中SEQ ID NO :99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
32.—种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQID NO: 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，和包含由序列表的SEQ ID NO :91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽； 禾口2)包含由序列表中SEQID NO 115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
33.一种抗体，所述抗体由以下1)和2)组成1)包含由序列表中SEQID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，或包含由序列表中SEQ ID NO 147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽；和2)包含由序列表中SEQID NO 123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽，或包含由序列表中SEQ ID NO :131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多肽。
34.一种抗体，所述抗体由以下1)或2)组成1)包含由序列表中SEQID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，和包含由序列表中SEQ ID NO 123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽；和2)包含由序列表中SEQID NO 147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的重链多 肽，和包含由序列表中SEQ ID NO :131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的轻链多 肽。
35.衍生自权利要求24-34中任一项的任何抗体的Fab、F(ab') 2、Fv、scFv、双抗体、 线性抗体或多特异性抗体。
36.选自以下1)_20)中任何一种的多肽1)包含由序列表中SEQID NO 35的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；2)包含由序列表中SEQID NO 39的第1-119位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；3)包含由序列表中SEQID NO 37的第1-112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；4)包含由序列表中SEQID NO 41的第1_112位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；5)包含由序列表中SEQID NO 107的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；6)包含由序列表中SEQID NO 115的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；7)包含由序列表中SEQID NO 107的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；8)包含由序列表中SEQID NO 115的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；9)包含由序列表中SEQID NO 91的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；10)包含由序列表中SEQID NO 99的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；11)包含由序列表中SEQID NO 91的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；12)包含由序列表中SEQID NO 99的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；13)包含由序列表中SEQID NO 139的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；14)包含由序列表中SEQID NO 147的第20-468位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；15)包含由序列表中SEQID NO 139的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；16)包含由序列表中SEQID NO 147的第20-138位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；17)包含由序列表中SEQID NO 123的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；18)包含由序列表中SEQID NO :131的第21-239位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；19)包含由序列表中SEQID NO 123的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽；禾口20)包含由序列表中SEQID NO 131的第21-134位氨基酸表示的氨基酸序列的多肽。
37.小鼠杂交瘤SH348-1 (FERM BP-10836)。
38.小鼠杂交瘤SH357-1 (FERM BP-10837)。
39.一种药物组合物，所述药物组合物特征在于包含选自权利要求1-35的抗体中的至 少一种抗体。
40.一种用于癌症治疗的药物组合物，所述药物组合物特征在于包含选自权利要求 1-35的抗体中的至少一种抗体。
41.一种用于抑制哺乳动物中肿瘤生长的方法，所述方法包括给予选自权利要求 1-35,39和40的抗体中的任何抗体。
42.权利要求41的用于抑制肿瘤生长的方法，所述方法特征在于所述肿瘤为表达 EPHA2的肿瘤。
43.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-36中任一项的抗体或多肽。
44.一种宿主细胞，所述宿主细胞转化了权利要求43的多核苷酸。
45.一种用于制备抗体的方法，所述方法利用权利要求44的宿主细胞。
全文摘要
本发明公开的是能够抑制细胞癌变和/或肿瘤细胞增殖等的抗体。本发明具体公开的是识别由产生自杂交瘤SH348-1(FERMBP-10836)或杂交瘤SH357-1(FERM BP-10837)的抗体识别的表位的抗体、产生自杂交瘤SH348-1或杂交瘤SH357-1的抗体、通过人源化产生自杂交瘤SH348-1或杂交瘤SH357-1的抗体而得到的抗体以及包含作为有效成分的上述抗体的药物等。
文档编号C07K16/28GK101848998SQ20088011462
公开日2010年9月29日 申请日期2008年8月29日 优先权日2007年8月30日
发明者中原薰, 大塚敏明, 山口淳子, 我妻利纪, 泷沢刚, 浦野敦司, 长谷川纯 申请人:第一三共株式会社