专利名称：比伐卢定的液相合成方法
技术领域：
本发明涉及一种20肽，具体说涉及比伐卢定的合成，尤其是比 伐卢定的液相合成方法，属于多肽合成技术领域。
背景技术：
比伐卢定(bivalirudin)是2000年12月美国食品药物管理局FDA 批准上市的直接凝血酶抑制剂之一 (商品名Angiomax，由Medicines 制药公司出品)，它来源于水蛭素衍生物，是一种合成的含20个氨基 酸的多肽，是凝血酶直接的、特异的、可逆性抑制剂。其相对分子质 量为2180，氨基酸序列为D画Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ash -Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro隱Glu-G 1 u-Tvr-Leu 。
比伐卢定氨基端的D-Phe-Pro-Arg-Pro区域是与凝血酶活性点相 互作用的位点，它可与游离型或与结合型凝血酶催化位点和底物识别 位点发生特异性结合，从而直接抑制凝血酶的活性。因凝血酶可水解 本品多肽顺序中Arg3和Pro4之间的肽键，使本品失活，所以比伐卢 定对凝血酶的抑制作用是可逆而短暂的。比伐卢定与水蛭素相反，经 肾排泄不是其主要的清除途径，它可能是被内源性多肽酶降解，可安 全用于肾损害患者，肾功能正常时，比伐卢定的半衰期为25min。基 于比伐卢定的以上特点与生物学活性，用比伐卢定作为防治血栓的药 物有诸多优点(O专一性强，特异性直接抑制凝血酶活性，且对血 栓结合的凝血酶也有抑制作用；(2)半衰期短，且对凝血酶的抑制作 用是可逆性的，故而抗凝效果可以被预测，不需要实验室监测；(3) 可安全用于肾损害患者。
4比伐卢定在药理学上克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，
用于抗凝防栓安全有效。诸多临床试验研究表明，它可替代肝素安全、
有效地用于冠状动脉血管成形术(PCI)、不稳定型心绞痛以及急性心
肌梗死溶栓辅助治疗，尤其在肝素诱导的血小板减少症Hf的抗栓治
疗中有独特的优势，且在外周动脉介入治疗PPI、心肺移植手术及肾
功能不全患者防栓抗栓治疗中亦显示出良好的作用。因此，比伐卢定 是一种有着很好临床应用前景的药物，目前已经被欧美和其它地区，
如加拿大、以色列、新西兰、阿根廷等国家批准，允许其上市。2005 年全球销售1.5亿美元，2006年全球销售2.1亿美元，2007年全球销 售2.55亿美元，其市场应用正在不断扩大。然而，比伐卢定在我国 尚未上市，Medicines公司也没有在亚洲地区的上市计划，这在很大 程度上延误了我国心血管医疗事业——尤其是冠状动脉血管成形术 的发展。实现比伐卢定的规模化和产业化生产，能够很好地促进比伐 卢定药物在我国医疗事业的应用，提高心脏手术的医疗水平。
比伐卢定作为一个很有合成难度的多肽药物，其高昂的合成成本 限制了大规模生产和市场应用。目前，国内外尚无使用液相合成法制 备比伐卢定的文献和专利报道。己有的主要研究论文及专利如下
美国专利US5196404是比伐卢定的化合物专利，最早报导了比 伐卢定的制备方法(1990年7月6日申请)，以BOC保护的氨基酸 为原料，采用固相合成，最后用强刺激、剧毒的HF，在特殊的聚四 氟乙烯装置中切肽树脂。此方法不适合规模化合成。隆萨股份公司于 2006年3月4日申请的WO2006045503专利，与EP1737889、 CN 200580043573.1是同族专利，采用对酸不稳定的树脂，得到脱保护肽 或部分保护肽，后者经纯化再脱保护得到目的肽。此法可以减少9位天冬酰胺变为天冬氨酸的副反应，能够得到纯度大于99%的目的肽。
上海子能2006年3月10日申请的CN200610024611.5专利，名称为 "固相多肽合成比伐卢定的制备方法"，系用Wang树脂或CTC树脂 合成；Novetide公司2007年3月22日申请的WO2007033383专利， 与EP1805204、 US2007093423是同族专利，名称为Process for production of Bivalirudin，也是采用CTC树脂进行合成。
上述文献报道的比伐卢定的固相合成方法，需采用昂贵的特殊树 脂和大过量的特殊保护氨基酸及縮合试剂，难以实现大规模合成，生 产成本高。有的工艺需要用到剧毒的氟化氢，需要特殊的反应装置， 也很难实现大规模生产。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述问题，提供一种生产成 本相对较低、适宜规模化生产的比伐卢定的液相合成方法。
本发明的技术解决方案是
首先，用液相法逐步合成三个全保护片段，艮P:
"片段A", N-端全保护的6肽W-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3，
"片段B"，中段全保护的6肽Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3，
"片段C"， C-端全保护的8肽I^-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro -Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;
然后，将"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端全保护的14肽W-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4)隱Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3;接着，将"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐卢定的全保护
20肽R、D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4) -Phe-Glu ( R4 ) -Glu ( R4 )誦Ile-Pro隱Glu (R4 ) -Glu (R4) -Tyr ( R5) -Leu-OR3;
最后，脱除上述全保护20肽的所有保护基团Ri R5，得到比伐 卢定的粗品，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe陽Glu-Glu-Ile-Pro國Glu陽Glu画Tyr画Leu。
本发明采用液相合成法制备比伐卢定，所需设备简单，与固相合
成法相比，具有许多优点(1)不需要树脂和大过量的保护氨基酸及 縮合剂；(2)易于实现规模化生产，大大降低生产成本；(3)不需大 量的洗涤溶剂，常用溶剂可回收再利用；(4)不必使用剧毒的氟化氢 和有一定神经毒性的六氢吡啶，易于实现安全生产，没有传统固相多 肽工艺面临的巨大环保压力。
具体实施例方式
本发明以液相合成比伐卢定为目的，综合固相法与液相法合成多 肽的先进方法和技术，通过对比伐卢定所含氨基酸的正交保护策略、 縮合剂和溶剂的选择、反应条件的优化、粗产品的纯化等多种因素进 行全面分析，设计出一条新颖的比伐卢定的液相合成路线，能够在保 证产品质量的前提下，最大限度地降低比伐卢定的合成成本。
本发明的主要技术路线是——
首先合成三个较大的全保护片段"片段A" N-端全保护的6肽， R^-D-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly-OR3;"片段B"中段全保护的6 肽，Ri-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-OR3;"片段C"C-端全保护 的8肽，RLG1u (R4) -Glu (R4)画Ile-Pro-Glu (R4)陽Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu-OR3。然后将"片段B"和"片段C"縮合，得到"片段D"，即C-端
全保护的14肽:R!-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4) -Glu (R4) -Ile-Pro-Glu (R4) -Glu (R4) -Tyr (R5) -Leu画OR3。
再将"片段A"和"片段D"縮合，得到比伐卢定的全保护20 肽RLD-Phe-Pro-Arg (R2) -Pro-Gly-Gly匪Gly-Gly-Asn-Gly-Asp (R4) -Phe-Glu (R4)誦Glu ( R4 ) -Ile-Pro-Glu ( R4 ) -Glu (R4 ) -Tyr ( R5) -Leu-OR3 。
最后，脱除上述全保护20肽的所有保护基团Ri R5，得到比伐 卢定的粗品，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly画Asn-Gly画Asp-Phe画Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr画Leu。
根据本发明技术方案，脱除所述全保护20肽的所有保护基团的 方法是用碱脱除C-末端保护，用酸脱除N-末端及所有侧链保护基。 优选地，可用TFA-TIS溶液一次性脱除所述全保护20肽的两端及侧 链的所有保护基团。脱除所有保护基团之后获得的比伐卢定粗品，可 以采用高效液相色谱(HPLC)进行纯化。
本申请发明人发现，上述液相法合成比伐卢定的方法中，保护基 团R1 115分别优选以下种类——
R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (苄氧羰基)，Fmoc (9-芴甲氧羰基)；
R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)，Pmc (2,2,5，7,8-五甲 基苯并二氢吡喃-6-磺酰基)，Pbf (2，2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)，N02 (硝基)，Z (苄氧羰基)，Z2 (双苄氧羰基)；
R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分别为乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (苄基)；
R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)；
R5=Bzl (节基)，tBu (叔丁基)。下面以具体实例进一步说明本发明液相法制备比伐卢定的过程， 其仅为典型范例，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
1、"片段A" N-端全保护6肽的合成。工艺过程如下
Boc-Gly-OHH-Gly-OMe.HC l
I_1
j DCC-HOBt-NMM
Boc-Gly匿Gly-OMe
J 4N HC1 in Dioxine Boc-Pro-OH H-Gly-Gly-OMe.HCl
j DCC-HOBt匿NMM Boc-Pro-Gly-Gly扁OMe
j 4N HC1 in Dioxine Z-Arg(Pbf)-OH H-Pro-Gly-Gly-OMe
I__I
J PyBOP-NMM Z-Arg(Pbf)-Pro-GIy-Gly-OMe j H2-Pd/C Z-Pro-OH H匿Arg(Pbf)-Pro画Gly-Gly-OMe
+ PyBOP-NMM Z-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe j H2-Pd/C
Boc-D-Phe-OH H-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe
j PyBOP-画M Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro匿Gly-Gly-OMe j 2N NaOH/H + Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH
1.1 H-Gly-Gly-OMe HC1的制备
将Boc-Gly-OH (30克，181.5mmol)溶于200ml THF中，室温 下依次加入H-Gly-OMe'HCl (22.6克，181.5mmol)， DCC(37.4克， 200mmol)禾n HOBt (24.5克，200mmol)，搅拌下滴加NMM (18.3 克，181.5mmol)，滴加完毕，室温搅拌30分钟。TLC跟踪反应，反 应完毕后，滤除固体，减压蒸去THF，加入150ml乙酸乙酯溶解残 余物，分别用10%的柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶 液洗涤乙酸乙酯溶液，分离有机相，经无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂， 减压蒸去乙酸乙酯，加入200ml石油醚，冰浴冷却，析出固体。滤集固体，干燥后得32克Boc-Gly-Gly-OMe，收率76%,产物Rf = 0.5 (甲醇乙酸乙酉旨=1:20)。将32克Boc-Gly-Gly-OMe与150ml、 4N 的HCl/二氧六环在室温下反应1小时，反应析出固体，滤集固体， 干燥后得17.5克H-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+lT): 147.00 (分 子量146.14)。
1.2 H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1的制备
冰浴下，将Boc-Pro-OH (17.5克，70mmo1)和12.7克(70mmo1) H-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入DCC (15.86克， 70mmol)， HOBT (10.4克，77mmo1)， NMM (7.86g， 77mmo1)，缓 慢升温至室温反应l小时(TLC跟踪反应)。反应完毕后，过滤，收 集滤液，减压除去溶剂，残余物用100ml乙酸乙酯溶解，分别用10% 拧檬酸、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤， 无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，残余物经硅胶柱层析纯化得22.3 克Boc-Pro匿Gly画Gly隱OMe，收率93%。将22.3克Boc-Pro-Gly隱Gly陽OMe 与100ml、 4N的HCl/二氧六环在室温下反应1小时，反应析出固体， 滤集固体并干燥，得18.0克H-Pro-Gly-Gly-OMe HC1， ESI-MS (M+H^: 244.13 (分子量:243.27)。
1.3 H-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe的制备
冰浴下，将Z-Arg (Pbf) -OH (16克，28.5mmo1)和6.93克 (28.5mmo1) H画Pro-Gly-Gly-OMe HC1溶于150ml THF中，加入 PyBOP (14.1克，27mmol)， NMM (2.3克，28.5mmo1)，缓慢升温 至室温反应1.5小时(TLC跟踪反应)。反应完毕后，减压除去溶剂， 剩余物经硅胶柱层析纯化得20克Z-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe， 收率90% 。室温下，将Z-Arg( Pbf)-Pro-Gly-Gly-OMe( 20克，25.4mmo1)和10。/。Pd/C (2克)加入至100ml甲醇中，氢气保护下反应2小时， 减压除去溶剂后，得固体16.5克，收率99%， ESI-MS(M+lT): 652.30 (分子量651.47)。
1.4 H-Pro-Arg (Pbf)隱Pro-Gly-Gly隱OMe的制备
冰浴下，将Z-Pro-OH(11.9克，47.6mmol)和31.0克(47.6mmo1) H-Arg (pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe溶于100ml THF中，加入PyBOP (23.5 克，45.2mmol)， NMM (4.8克，47.6mmo1)。缓慢升温至室温反应3 小时(TLC跟踪反应过程)。反应完毕后，减压蒸去溶剂，残余物经 硅胶柱层析纯化得40克Z-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OMe，收率 96%。室温下，将Z画Pro画Arg (Pbf)画Pro画Gly-Gly画OMe (16克，18mmo1) 和10%Pd/C (1.6克)加入至100ml甲醇中，氢气保护下反应2小时， 减压除去溶剂后，得产物13.0克，收率99%， ESI-MS (M+I^): 749.47 (分子量748.43)。
1.5 Boc-D-Phe-Pro画Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH的制备 冰浴下，将Boc誦D-Phe-OH (11.5克，43.5mmo1)和H-Pro陽Arg
(Pbf)國Pro画Gly-Gly画OMe (32.5克，43.5mmo1)溶于150mlTHF中， 加入PyBOP (21.5克，41.5mmol)， NMM (4.4克，43.5mmo1)，缓 慢升温至室温，反应2小时(TLC跟踪反应过程)。反应完毕，减压 蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化得41.0克Boc-D-Phe-Pro-Arg
(Pbf)國Pro-Gly國Gly-OMe，收率98%。将Boc國D-Phe-Pro國Arg (Pbf) -Pro隱Gly-Gly國OMe (10克，lOmmol)禾B NaOH (400毫克，lOmmol) 溶于50mlMeOH中，室温搅拌2小时，减压除去溶剂，剩余物用水 溶解，用1NHCl调pH值到1-2，有固体析出，过滤干燥得9.4克产 物，收率950/0， ESI-MS (M-H) 980.65 (分子量:981.63)。2、"片段B"中段全保护的6肽的合成。工艺过程如下:
Z-Asp(OtBu)-OH H隱Phe隱OMe.HCl
Z-Gly-OH H-Gly-OMe.HCl
DCC-HOBt-丽M
Z-Gly-Gly-OMe
j 2N NaOH/H+
Z-Gly,Gly-OH
'(I) HOSu-DCC r (2; H-Asn(Trt)-OH/NaHC03
Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-OH
j DCC-HOBt-丽M Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe j H2-Pd/C Z-Gly-OH H-Asp(OtBu)-Phe-OMe
+ HBTU-HOBt-NMM Z-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
I H2-Pd/C H-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OMe
HBTU-HOBt-NMM
Z-Gly-Gly-Asn-GIy-Asp(OtBu)-Phe-OMe I 2NNaOH/H+
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH
2.1 H-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制备
冰浴下，将Z-Asp (OtBu) -OH.H20 (30克，88mmol)和18.96 克(88mmol)的H-Phe-OMe HCl溶于250ml THF中，依次加入DCC
(18.12克，88.0mmol)、 HOBT (11.88克，88mmol)、 NMM (8.88 克，88mmol)，缓慢升温至室温反应2小时(TLC跟踪反应过程)。 反应完毕后，过滤，收集滤液，减压除去溶剂，剩余物用150ml乙酸 乙酯溶解，分别用10%柠檬酸、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、 饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压 蒸去乙酸乙酯，得50克Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率88%。
室温下，将Z-Asp (OtBu) -Phe-OMe (50克，103.2mmol)和 10%Pd/C (3.75克)加入至150ml甲醇中，氢气保护下反应2小时， 减压除去溶剂，得27克产物，收率99%， ESI-MS (M+lT): 351.10
(分子量:349.85)。2.2 H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe的制备
冰浴下，将Z-Gly-OH (12.9克，57,lmmol)和H國Asp (OtBu) -Phe-OMe (20克，57. lmmol)溶于250ml THF中，加入HBTU(21.67 克，57.1mmol)， NMM (5.77克，57.1mmol)，缓慢升温至室温，反 应2小时(TLC跟踪反应过程)。反应完毕后，减压除去溶剂，剩余 物用乙酸乙酯溶解，分别用10%柠檬酸、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸 氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。滤除干 燥剂，减压除去溶剂，剩余物柱层析纯化得27克Z-Gly-Asp (OtBu) 画Phe-OMe，收率90%。
室温下，将Z画Gly隱Asp (OtBu) -Phe隱OMe (27克，51.4mmo1) 和10%Pd/C (2.7克)加入至150ml甲醇中，氢气保护下反应2小时， 减压除去溶剂，得20.5克产物，收率99%， ESI-MS (M+Na+): 430.10 (分子量407.36)。
2.3 Z-Gly-Gly-OH的制备
冰浴下，将Z-Gly-OH (10克，48mmo1)和H-Gly-OMe HC1 (6 克，48mmol)溶于250ml THF中，依次加入DCC( 10.83克，53mmo1)、 HOBT (7.1克，53mmo1)和NMM (9.66克，96mmo1)。缓慢升温至 室温反应2小时(TLC跟踪反应过程)。反应完毕后，过滤，收集滤 液，减压除去溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶解，分别用10%柠檬酸、饱 和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用 无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，剩余物柱层析纯化 得14克Z-Gly-Gly-OMe，收率93%。
将Z-Gly-Gly-OMe (4.9克，17.42mmo1)和NaOH (1.05克，26.1 mmol)，溶于50ml MeOH中，室温搅拌2小时，减压除去溶剂，剩余物用水溶解，1NHCl调pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)， 合并有机相，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂，干燥后 得4.2克产物，收率90%。
2.4 Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH的制备
室温下，将Z-Gly-Gly画OH (8克，30.14mmo1)， HOSu (3.63克， 31.55mmol)， DCC (6.5克，31.55mmo1)溶于150mlTHF，搅拌反应 2小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，过滤，收集滤液。
室温下，将H-Asn (Trt) -OH (14.53克，38.8mmol)， NaHC03 (6.52g， 77.6mmo1)溶于50mlTHF和50ml水的混合溶剂中，将上 一步得到的滤液缓慢滴加至该体系中，继续搅拌2小时。减压除去溶 剂，用1NHCI调pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(50mlX3)，合并有机 相，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，得20.9克产 物，收率87%。
2.5 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)画Gly画Asp (OtBu)國Phe-OH的制备 冰浴下，将Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -OH (8.42克，13.52mmo1)和
H-Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe (5.51克，13.52mmo1)溶于150mlTHF 中，依次加入DCC(2.93克，M.2mmo0、 HOBT(1.92克，14.2mmo1) 和NMM(1.34克，13.52mmo1)。缓慢升温至室温，反应2小时(TLC 跟踪反应过程)。反应完毕后，过滤，收集滤液，减压除去溶剂，剩 余物用乙酸乙酯溶解，分别用10%柠檬酸、饱和氯化钠溶液、饱和碳 酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。滤除 干燥剂，减压除去溶剂后，剩余物柱层析纯化得11.94克 Z-Gly-Gly-Asn (Trt)画Gly-Asp (OtBu) -Phe-OMe，收率87%。
将Z-Gly画Gly画Asn (Trt) -Gly画Asp (OtBu)誦Phe-OMe (IO克，10mmol)， NaOH(1.2克，30mmol)，溶于100ml MeOH中，室温搅拌 2小时，减压除去溶剂，剩余物用水溶解，用1NHCl调pH至3-4， 析出白色固体，滤集固体，干燥后得产物9.2克，收率91%， ESI-MS (M-H-): 999.25 (分子量1000.12)。
3、"片段C" C-端全保护8肽的合成。工艺过程如下
Z-Glu(OtBu)-OSu H-Glu(OtBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH j DCC-HOSu
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H-Tyr(tBu)-OH
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-OH H-Leu-OMe
+ DCC-HOBt Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)隱Leu-OMe ,H2-Pd/C
Z-Pro-OH H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
丄 DCC-HOBt
Z隱Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OSu H國Ile-OH T
I i Z-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
H2-Pd/C
Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile"OH H-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
+ DCC-HOBt
Z-Glu(O氾u)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(Otfiu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
j H2-Pd/C
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)Tyr(tBu)-Leu-OMe
3.1 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH的制备
室温下，将Z-Glu (OtBu) -OH (101克，300mmol)， HOSu (44.5 克，300mmol)， DCC (68.0克，330mmol)溶于300ml THF,搅拌反 应2小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，过滤，收集滤液。
室温下，将H画Glu (OtBu)陽OH (60.9克，300mmol)， NaHC03(50.4克，600mmol)溶于200ml THF和200ml水的混合溶剂中，将 上一步得到的滤液缓慢滴加至该体系中，继续搅拌2小时。减压除去 溶剂，用IN HCl调pH至1-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有机相，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，得142.9 克产物，收率92%。
3.2 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH的制备 室温下，将Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH(105.2克，200mmol)，
HOSu (33克，200mmol)， DCC (45.3克，220mmol)溶于200ml THF， 搅拌反应2小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，过滤，收集滤 液。
室温下，将H-Tyr (tBu) -OH (57.46克，200mmol)， NaHC03 (33.6g， 400mmol)溶于150ml THF和150ml水的混合溶剂中，将 上一步得到的滤液缓慢滴加至该体系中，继续搅拌2小时。减压除去 溶剂，用1NHCl调pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(300mlX3)，合并 有机相，用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，得129.1 克产物，收率87%。
3.3 H國Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)画Leu-OMe的制备 冰浴下，将Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -OH (111.3
克，150mmo1)和H-Leu-OMe . HC1 (27.3克，150mmo1)溶于100ml THF,依次加入DCC(30.9克，150mmol)、 HOBT (20.2克，150mmo1) 和NMM(15.5克，150mmo1)。缓慢升温至室温，反应4小时(TLC 跟踪反应过程)。反应完毕后，过滤，收集滤液，减压除去溶剂，剩 余物用150ml乙酸乙酯溶解，分别用10%柠檬酸、饱和氯化钠溶液、 饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，剩余物经柱层析纯化得110.6克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率85%。
室温下，将Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (86.9克，lOOmmol)和腦Pd/C (3.6克)加入至150ml甲醇中，
氢气保护下反应2小时，减压除去溶剂后，得固体69.8克，收率95%,
ESI-MS (M+HO: 736.15 (分子量734.93)。
3.4 H-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe的
制备
冰浴下，将Z画Pro-OH (12.5克，50mmo1)和H- Glu (OtBu)陽Glu (OtBu) -Tyr (tBu)隱Leu-OMe (36.7克，50mmo1)溶于100mlTHF 中，加入PyBOP (26克，50mmo1)， NMM (5克，50mmo1)。缓慢 升温至室温反应6小时(TLC跟踪反应过程)。反应完毕后，减压蒸 去溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化得45.8克Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率94%。
室温下，将Z-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (35克，36mmo1)和10% Pd/C (3.2克)加入至150ml甲醇中，氢 气保护下反应3小时，减压除去溶剂后，得产物28.7克，收率96%， ESI-MS (M+H"): 832.87 (分子量832,05)。
3.5 Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH的制备
室温下，将Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -OH (26克，5Ommo1)， HOSu (5.75克，50mmol)， DCC (U.3克，55mmo1)溶于100mlTHF， 搅拌反应2小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，过滤，收集滤 液。
室温下，将H-Ile-OH(6.6克，50mmol)， NaHC03(8.4g， lOOmmol)溶于30ml THF和30ml水的混合溶剂中，将上一步得到的滤液缓慢滴加至该体系中，继续搅拌2小时。减压除去溶剂，用IN HC1调pH至l-2，用乙酸乙酯萃取(80mlX3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥。滤除干燥剂，减压除去溶剂后，得28.5克产物，收率90%。
3.6 H-Glu ( OtBu ) -Glu (OtBu ) -Ile-Pro-Glu ( OtBu) -Glu ( OtBu)-Tyr (tBu) -Leu-OMe的制备
冰浴下，将Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-OH (12.7克，20mmo1)和H-Pro-Glu (OtBu)國Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu扁OMe (16.6克，20mmo1)溶于50ml DMF中，加入PyBOP (10.4克，20mmol)， NMM
(2克，20mmo1)。缓慢升温至室温反应12小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化后得24.3克Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -lie-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)國Tyr
(tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室温下，将Z-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)画Tyr (tBu)誦Leu-OMe (20克，13.8mmol)禾卩10%Pd/C
(1.6克)加入至100ml甲醇中，氢气保护下反应6小时，减压除去溶剂后，得产物16.5克，收率91%， ESI-MS (M+2lT): 658.67 (分子量1315.65)。
4、"片段B"与"片段C"縮合形成"片段D"。工艺过程如下
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-OH —H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe-l pyBop NMM
Z-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-GIu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
,,HrPd/C
H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(O但u)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe冰浴下，将Z-Gly國Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)國Phe-OMe (8.2克，8.2mmo1)和H-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe (10.8克，8.2mmol)溶于30ml DMF中，加入PyBOP (4.2克，8.2mmol)，菌M (0.8克，8.2mmol)。缓慢升温至室温反应24小时(TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化后得15.8克Z-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp (OtBu)画Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率84%。
在室温下，将Z-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)-Leu-OMe， (14克，6mmo1)和10% Pd/C (0.8克)加入至30ml甲醇中，氢气保护下反应8小时，减压除去溶剂后，得产物11.9克，收率92%， ESI-MS (M+3H^): 722.27 (分子量:2163.62)。
5、"片段A"与"片段D"缩合。工艺过程如下
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-OH—H-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-ne-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(氾u)-Leu-OMe」 p^op.薩
Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)"Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-OMe
2N歸H/lT
Boc-D-Phe-Pra-Arg(Pbf)-PrO"Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(OtBu)-Phe"Glu(OtBu>Glu(OtBu>Ile-PrO"Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(ffiu)-Leu-OH
TFA-TIS
D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH
冰浴下，将Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-OH (4.8克，4.9mmol)和H-Gly國Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu)-Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe(10.6克，4.9mmol)溶于25ml DMF中，加入PyBOP (2.5克，，4.9mmol)。缓慢升纟显至室温反应24小时 (TLC跟踪反应过程)，反应完毕后，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶 柱层析纯化后得12.2克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly 陽Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) - Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)曙Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OMe，收率80%。
在室温下，将Boc誦D画Phe-Pro-Arg(Pbf)國Pro画Gly國Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe國Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)画Tyr (tBu) -Leu画OMe (10克，3.2mmol)和 NaOH (0.256克，6.4mmol)，溶于20ml MeOH中，室温搅拌4小时， 减压除去溶剂，剩余物用水溶解，用1NHCl调pH至3-4，析出白色 固体，滤集固体，干燥后得9.3克Boc-D-Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly隱Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu)陽Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)画Leu-OH，收率93%， ESI-MS (M-H'): 777.61 (分子量3113.74)。
将Boc-D-Phe-Pro國Arg (Pbf) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu-OH (6.3克，2mmo1)溶于冰浴冷却的 200ml TFA/TIS (95:5)中，搅拌，逐渐升温至室温，反应2小时后 减压除去溶剂，加入冰浴冷却的500ml乙醚，得白色固体沉降，即为 比伐卢定粗品。经HPLC纯化和冰冻干燥，得3.4克干粉比伐卢定， 纯度98.5%，收率78%， ESI-MS (M+3tf): 778.31 (分子量2180.33)。
权利要求
1、比伐卢定的液相合成方法，其特征在于依次包含下列步骤首先，用液相法逐步合成三个全保护片段，即“片段A”，N-端全保护的6肽R1-D-Phe-Pro-Arg (R2)-Pro-Gly-Gly-OR3，“片段B”，中段全保护的6肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-OR3，“片段C”，C-端全保护的8肽R1-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；然后，将“片段B”和“片段C”缩合，得到“片段D”，即C-端全保护的14肽R1-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；接着，将“片段A”和“片段D”缩合，得到比伐卢定的全保护20肽R1-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R4)-Glu(R4)-Ile-Pro-Glu(R4)-Glu(R4)-Tyr(R5)-Leu-OR3；最后，脱除上述全保护20肽的所有保护基团R1～R5，得到比伐卢定的粗品，进一步纯化得到比伐卢定纯品，即D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu。
2、 根据权利要求1所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在于所述保护基团W RS优选——R^Boc (叔丁氧羰基)，Z (苄氧羰基)，Fmoc (9-芴甲氧羰基)； R2=Mtr (4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基)，Pmc (2，2，5，7，8-五甲 基苯并二氢吡喃-6-磺酰基)，Pbf (2,2，4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)，N02 (硝基)，Z (苄氧羰基)，Z2 (双苄氧羰基)；R3=CH3 (甲基)，(CH2) nCH3 (其中n取l-4，分别为乙基、 丙基、丁基、戊基)，C6H5 (苯基)，Bzl (苄基)； R4=OBzl (,酯)，OtBu (叔丁酯)； R5=Bzl (节基)，tBu (叔丁基)。
3、 根据权利要求1或2所述的比伐卢定的液相合成方法，其特 征在于脱除所述全保护20肽的所有保护基团的方法是，用碱脱除 C-末端保护，用酸脱除N-末端及所有侧链保护基。
4、 根据权利要求3所述的比伐卢定的液相合成方法，其特征在 于用TFA-TIS溶液一次性脱除所述全保护20肽的两端及侧链的所 有保护基团。
5、 根据权利要求1或2所述的比伐卢定的液相合成方法，其特 征在于采用高效液相色谱对所述比伐卢定粗品进行纯化。
全文摘要
本发明提供一种比伐卢定的液相合成方法。首先逐步合成三个全保护的片段N-端全保护的6肽、中段全保护的6肽、C-端全保护的8肽，然后将这三个片段依次缩合得到全保护的比伐卢定，最后脱除所有保护基团得到比伐卢定粗品，再经过高效液相色谱纯化，得到比伐卢定纯品。该方法不需要树脂和大过量的保护氨基酸及缩合剂，易于实现规模化生产，且生产成本相对较低。
文档编号C07K7/00GK101475631SQ20091002879
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月8日 优先权日2009年1月8日
发明者王良友, 黄仰青 申请人:苏州中科天马肽工程中心有限公司