专利名称：：守宫糖肽及制备方法和其医药应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物中药材中具有很高药用价值的活性成分及制备方法和其医药应用，特别涉及一种守宫糖肽及制备方法和其医药应用。
背景技术：
：中医是我国的国粹，中药材是中医药理论的物质宝库，中药材分为植物中药材、动物中药材和矿物中药材；传统中医的理论、临床与现代研究均表明动物药材治疗恶性肿瘤是中医的一大特色，如在斑蝥中提取斑蝥素、斑蝥酸盐应用于治疗恶性肿瘤取得一定效果，并且还具有一定的抗病毒的作用。一般来说，多数动物中药对人体都具有一定的毒性，限制了这类药物在治疗时的用药量，使得治疗效果受到较大的影响。如何在保持药用活性的同时降低其对人体的不良影响，是药学家们研究的热点。同时，明确药物的活性成分以及其作用机理是天然药开发的首要任务。在有抗癌作用的动物中药中提取有抗癌作用的活性物质则是我国乃至世界各国的药学家、研发机构的工作重心。守宫是传统的中药材，为壁虎科动物无蹼壁虎GekkoswinhonisGiienther或其它几种壁虎[多疣壁虎Gekkojaponicus(Dum&il&Bibron);无疵壁虎GekkosubpalmatusGtienther;蹊趾壁虎GekkochinensisGray]的全体，是中医传统的咸寒软坚药。中医长期以来使用守宫治疗瘰疬癌肿(《青嚢杂篡》、《得配本草》、《四川中药志》)，国内较多医家使用守宫治疗恶性肿瘤也取得了;f艮好的疗效。体外研究发现守宫水溶液可抑制人肝癌细胞的呼吸，并已明确守宫含有与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质、脂肪油、多种氨基酸、；(效量元素和维生素，但上述成分均不足以解释守宫的抗肿瘤作用，我们既往的研究发现守宫多糖具有抗肿瘤、抗病毒与免疫调节的活性成分；参见本申请人在先申请ZL200510065309.X,关于《守宫多糖及制备方法和其医药应用》的专利。多糖或糖肽是一类天然大分子物质，是构成生命的基本物质之一。大量研究表明，多糖或糖肽具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。一般情况下，多糖或糖肽是良好的免疫调节剂。多糖或糖肽可以活化巨噬细胞，促进淋巴细胞有丝分裂，增强NK细胞(自然杀伤细胞)与LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)活性，增强To细胞(迟发性超敏反应T细胞)功能，诱生白细胞介素(尤其是IL-1、IL-2)、IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)等细胞3因子，活化补体，增强红细胞免疫，调节神经-内分泌-免疫网络。新近的研究表明含硫酸根的乡糖或糖肽具有抗mv的作用，因而硫酸多糖或糖肽已成为国内外研究的热点。IL-8肿瘤转移有非常密切的关系，肿瘤细胞可分泌IL-8，促进其侵袭与转移，而肿瘤的复发与转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，也是导致肿瘤患者最终死亡的重要原因。因此，抑制肿瘤细胞分泌促进侵袭与转移的细胞因子如IL-8具有重要科学意义与广泛应用前景。因此，提供一种更加有效治疗人体恶性肿瘤及病毒感染性等疾病，增强人体免疫力的守宫糖肽及制备方法和其医药应用，造福于人类，将是该
技术领域：
科研人员急需深入研究开发的新课题之一。
发明内容本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种应用效果非常显著即源自动物中药守宫的守宫糖肽及制备方法和其医药应用。该守宫糖肽对恶性肿瘤有很强的抑制作用，同时由于该守宫糖肽含有疏酸根对fflV等病毒性疾病有明显的抗病毒作用，守宫糖肽也是一具有广泛免疫调节作用的生物治疗剂；本发明的另一发明目的是提供制备该守宫糖肽的方法及守宫糖肽在医药领域的应用。为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下守宫糖肽，其特征在于重均分子量大于2，000，000Da;比旋光度为-60°;碳元素的质量百分含量为23.39%,氢元素的质量百分含量为4.925%，氮元素的质量百分含量为6.51%;其组成的糖部分含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，M葡萄糖，摩尔比为鼠李糖岩藻糖甘露糖葡萄糖半乳糖氨基葡萄糖=1.334:3.363:3.375:6.983:10.480:0.019;单糖的连接方式为鼠李糖以1，3-，1，3，4-和1,2，3-连接的形式存在，岩藻糖以l-,1，4-和1，2-连接的形式存在，甘露糖以1，4-连接的形式存在，葡萄糖以l-，1,3,4-连接的形式存在，半乳糖以1，4-，1,4,6-连接的形式存在，氩基葡萄糖以1，4-连接的形式存在；糖醛酸的质量百分含量为3.08%;其结合型蛋白质部分含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33%;糖肽键的类型含有O-连接；硫酸基的质量百分含量为14.7%。守宫糖肽的制备方法，其特征在于将守宫干燥、破碎后用有机溶剂抽提出脂溶性物质，将脱脂后的药渣用按守宫质量的1-IO倍热水在30-100°C条件下浸提2-12小时，水提液过滤后分次加入乙醇至15%-80%浓度(V/V)沉淀，将沉淀溶解于水，1000-10000r/min离心取上清，常规sevage法除去杂蛋白，透析，干燥成粉，复溶解于粉末质量30-180倍的含有0.5mol/L氯4化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的O.lmol/L的磷酸盐緩冲液，pH6.5,加入粉末质量0.5%-4。/。的木瓜蛋白酶及0.5-2倍的曱苯，50。C-80。C水浴4h-48h后补加粉末质量0.2%-2%的木瓜蛋白酶，继续水浴4h-24h;水解液浓缩后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，复溶于水，过滤，常规sevage法除去杂蛋白，浓缩，透析，千燥，得守宫糖肽。将上述守宫糖肽制成符合药剂学要求的注射剂型。将上述守宫糖肽制成符合药剂学要求的口服剂型。上述守宫糖肽在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。上述守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。上述守宫糖肽在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。上述守宫糖肽在制备治疗fflV感染的药物中的应用。上述守宫糖肽在制备免疫调节剂中的应用。本发明的有益效果是本发明深入研究发现守宫多糖是与肽牢固结合在一起的，进一步将天然守宫多糖与肽的复合物(筒称守宫多糖)用蛋白酶水解，得到一新的守宫糖肽(简称守宫糖肽)，具有比天然守宫多糖更好的生物活性。守宫糖肽高剂量(200pg/ml)、中剂量(100^ig/ml)与低剂量组(10^ig/ml)均对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用。而守宫多糖仅高剂量(200|xg/ml)、中剂量组(100pg/ml)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用，低剂量组(10pg/ml)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖没有抑制作用。可见守宫糖肽在10pg/ml浓度即能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，而守宫多糖在100pg/ml浓度抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖。另外，IL-8肿瘤转移有非常密切的关系，而肿瘤的复发与转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，也是导致肿瘤患者最终死亡的重要原因。守宫糖肽高剂量(20(Hig/ml)、中剂量组(100pg/ml)均对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8有明显抑制作用。而守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8没有抑制作用。以上结果表明守宫糖肽具有比守宫多糖更好的生物活牲。本发明在应用守宫多糖的基础上进一步研究，并得到科学验证；守宫糖肽较比守宫多糖对恶性肿瘤有更高的疗效，显示了极高的抑癌活性，并且可抑制肿瘤细胞分泌促进肿瘤转移的细胞因子IL-8，可单独用于恶性肺瘤的治疗，也可用于恶性肿瘤手术、放疗、化疗与介入治疗的辅助治疗；守宫糖肽含有硫酸根，在艾滋病等病毒感染性疾病的防治上具有极其光明的应用前景；糖肽通常具有良好的免疫调节作用，使用守宫治疗免疫低下也有纟艮好的治疗效5果，守宫糖肽可作为一种新的免疫调节剂，用于恶性肿瘤、慢性感染等疾病的治疗；守宫对人体的毒性限制了其临床大剂量应用，故守宫的日用量一般仅1.5~4.5g,守宫糖肽起到了很好的减毒增效作用。图1是守宫多糖的高效液相色谱图。图2是守宫糖肽的高效液相色谱图。图3是守宫糖肽的红外光谱图。图4是标准糖样的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图；图中l鼠李糖，2阿拉伯糖，3岩藻糖，4甘露糖，5葡萄糖，6半乳糖，7肌醇。图5是守宫糖肽的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图中l鼠李糖，2岩藻糖，3甘露糖，4葡萄糖，5半乳糖，6肌醇。图6是标准糖样的糖醇乙酸酯衍生物的气相色谱图中l肌醇，2M半乳糖，3氨基葡萄糖。图7是守宫糖肽的糖醇乙酸酯衍生物的气相色谱图中l肌醇，2氨基葡萄糖。图8是守宫糖肽的总离子流图。图9是守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响曲线分析示意图；图中1空白对照组，2守宫多糖高剂量组(200ng/ml)，3守宫多糖中剂量组(100pg/ml),4守宫多糖低剂量组(lOpg/ml)。图IO是守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响曲线分析示意图；图中1空白对照组，2守宫糖肽高剂量组(200(ig/ml),3守宫糖肽中剂量组(100pg/ml)，4守宫糖肽低剂量组(10pg/ml)。具体实施例方式以下结合附图和较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下实施例1守宫糖肽，其特征在于重均分子量大于2,000,000Da;比旋光度为-60°;碳元素的质量百分含量为23.39%，氢元素的质量百分含量为4.925%，氮元素的质量百分含量为6.51%;其组成的糖部分含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，氨基葡萄糖，摩尔比为鼠李糖岩藻糖甘露糖葡萄糖半乳糖氨基葡萄镩-1.334:3.363:3.375:6.983:10.480:0.019;单糖的连接方式为鼠李糖以1，3-，1，3，4-和1,2,3-连接的形式存在，岩藻糖以l-,1,4-和1,2-连接的形式存在，甘露糖以1，4-连接的形式存在，葡萄糖以l-，1,3,4-连接的形式存在，半乳糖以1，4-，1，4，6-连接的形式存在，氨基葡萄糖以1，4-连接的形式存在；糖醛酸的质量百分含量为3.08%;其结合型蛋白质部分含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33%;糖肽键的类型含有O-连接；硫酸基的质量百分含量为14.7%。守宫糖肽的制备取守宫全体1000g,切成0.3cm长的碎块，分别用4000ml，2000ml的曱醇浸泡3h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml，8000ml,6000ml的热水100。C提取三次，提取时间分别为6h,4h,3h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度80。/。(V/V)的乙醇沉淀，离心(2000r/min,20min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(2000r/min,20min)，取上清，常规sevage法除去游离蛋白10次，浓缩，透析，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化钠，1Ommol/L半胱氨酸，1Ommol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐緩冲液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml曱苯，65。C水浴12h,后补加120mg的木瓜蛋白酶，继续65。C水浴12h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，80。/。(V/V)乙醇沉淀，静置lh。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，65-70。C干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白6次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。实施例2守宫糖肽的制备取守宫全体1000g，切成0.2cm长的碎块，分别用6000ml，3000ml的曱醇浸泡2h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用8000ml，6000ml，4000ml的热水100。C提取三次，提取时间分别为6h,4h,3h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度80%(V/V)的乙醇沉淀，离心(3200r/min,10min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(3200r/min，10min)，取上清，常规sevage法除去游离蛋白10次，浓缩，透析，浓缩，干燥。取干燥粉末24g溶解于1200ml含有0.5mol/L氯化钠，1Ommol/L半胱氨酸，1Ommol/L乙二胺四乙酸的O.lmol/L的磷酸盐緩冲液(pH6.5)，加入120mg木瓜蛋白酶及10mi曱苯，60。C水浴48h,后补加60mg的木瓜蛋白酶，继续60。C水浴24h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，80%(V/V)乙醇沉淀，静置12h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，65-70。C干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白6次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例1。实施例3守宫糖肽的制备取守宫全体1000g，粉碎为粗末，过1号篩，用3000ml的曱醇浸泡12h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml的热水60。C提取三次，提取时间为6h。合并提取液，过滤，浓缩至1000ml，加入终浓度70%(V/V)的乙醇沉淀，4。C静置24h,离心(4000r/min,6min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(4000r/min,6min)，取上清，透析，干燥。取干燥粉末2化溶解于4200ml含有0,5mol/L氯化钠，1Ommol/L半胱氨酸，1Ommol/L乙二胺四乙酸的O.lmol/L的磷酸盐緩冲液(pH6.5)，加入480mg木瓜蛋白酶及40ml曱苯，7(TC水浴8h,后补加240mg的木瓜蛋白酶，继续70。C水浴4h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml,80%(V/V)乙醇沉淀，静置24h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常关见sevage法除去杂蛋白4次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例l。实施例4守宫糖肽的制备取守宫全体1000g,切成0.3cm长的碎块，分别用4000ml,2000ml的无水乙醇浸泡4h,过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml的热水30。C提取三次，提取时间为12h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度30%(V/V)的乙醇沉淀，4。C静置24h,离心(10000r/min，5min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(10000r/min，5min)，取上清，常规sevage法除游离蛋白4次，浓缩，透析，浓缩，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化钠，1Ommol/L半胱氨酸，1Ommol/L乙二胺四乙酸的O.lmol/L的磷酸盐緩冲液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml曱苯，60。C水浴12h,后补加120mg的木瓜蛋白酶，继续60。C水浴24h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，40%(V/V)乙醇沉淀，静置12h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，冻干成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白8次,减压浓缩,透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例1。8守宫糖肽结构分析(一)守宫多糖纯度分析1、材料与方法采用高效液相色谦法(HPLC)检测守宫多糖纯度。液相色谱柱为ShodexKS-805,流动相为双蒸馏水，流速为lml/min，柱温35°C。配制样品的水溶液，进样02、结果参见图1,在玍883分钟出现单一对称峰，提示守宫多糖是均一组分。(二)守宫糖肽纯度分析及相对分子质量测定1、材料与方法采用高效液相色谱法(HPLC)检测守宫糖肽纯度及相对分子质量。采用标准葡聚糖DextranT系列制作标准曲线，根据守宫糖肽样品在相同色语条件下的保留时间，用标准曲线计算该样品的相对分子质量。液相色i普柱为ShodexKS-805,流动相为双蒸馏水，流速为lmL/min,柱温为35°C。配制葡萄糖，各个标准TIO，T40，T70，Tll，T500，2000,蓝色葡聚糖的2%(W/V)溶液，各溶液进样后得到相应的液相图镨，绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的保留时间，从回归方程上求得分子量。2、结果2.1纯度参见图2，在7.980分钟出现单一对称峰，提示守宫糖肽是均一组分。守宫多糖的出峰时间为5.883分钟(见图1)，提示守宫糖肽较守宫多糖的分子量小，说明守宫糖肽是守宫多糖经过蛋白酶水解得到的新化合物。2.2分子量根据回归方程求得守宫糖肽重均分子量(Mw)大于2，000，000Da。(三)守宫糖肽比旋光度的测定1、材料与方法取守宫糖肽4mg,溶于2ml双蒸水，用自动旋光仪测量旋光度，用公式=a/(lxC)计算比旋光度。[a]为比旋光度，a为旋转角，1为池长(dm)、c为浓度(g/ml)。2、结果如下表:.旋转角浓度(g/ml)比旋光度守宫糖肽一0.032-60°(四)守宫糖肽元素分析如下表:样品名元素质量百分含量(％)守宫糖肽碳23.39氢4.925氮6.51(五)守宫糖肽红外光谱1、材料与方法取1-2mg守宫糖肽，用溴化钾压片后进行红外光镨分析。2、结果参见图3，在3421.4cm"处出现的宽峰为0-H的伸缩振动引起，2929.5cm"处左右出现的比较弱吸收峰，为C-H伸缩振动引起，1409.8cm"处出现的吸收峰为C-H变角振动引起，此3组吸收峰是糖类物质的特征峰。1601.8cm"处出现的强吸收峰为N-H变角振动引起，提示含有M葡萄糖和蛋白质，说明该样品是多糖和蛋白质的复合物。859.2cm"处吸收峰是由C-0-S伸缩振动引起，提示含有硫錄。(六)守宫糖肽单糖的组成与连接方式1、单糖的组成及比例1.1、薄层层析(TLC)l丄l、材料与方法为检测守宫糖肽的中性糖和氨基糖的组成，样品分别用三氟乙酸和盐酸水解。三氟乙酸的水解条件为称取守宫糖肽6mg,加入4mol/L三氟乙酸6ml，封管，105。C水解4h;盐酸的水解条件为称取守宫糖肽10mg，加入6mol/L盐酸10ml,封管，105。C水解8h。然后分别反复加入曱醇45。C减压蒸干，以完全除去三氟乙酸和盐酸。再分别向样品中加入少量的水使样品溶解，取少量在硅胶板上进行薄层层析，采用标准单糖对照以初步确定样品单糖组成。10中性糖的标准单糖对照为阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，岩藻糖，鼠李糖；氨基糖的标准单糖对照为葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，N-乙酰基葡萄糖，氨基半乳糖，氨基葡萄糖。乙酸乙酯曱醇乙酸水(12ml:3ml:3ml:2ml)展开，苯胺-邻苯二曱酸显色。根据标准单糖和样品的Rf值(比移值)的比较来确定样品中组成单糖的种类。l丄2、结果1.1.2.1、守宫糖肽中性糖的组成如下表:名称比移值标阿拉伯糖0.387葡萄糖0.338准甘露糖0.336半乳糖0.296口p岩藻糖0.444鼠李糖0.549样品守宫糖肽0.338,0.444样品经展开显色后，有两个点，其Rf值与葡萄糖和岩藻糖相同，提示样品中含有葡萄糖与岩藻糖。1.1.2.2、守宫糖肽氨基糖的组成如下表:名称比移值标葡萄糖醛酸0.223半乳糖醛酸0.169准N-^酰基葡萄糖0.365氨基半乳糖0.095口n氨基葡萄糖0.128样品守宫糖肽0.128,0.257样品经展开显色后，有两个点，其中一个点的Rf值与氛基葡萄糖相同，提示样品中含有氨基葡萄糖。另外一个点的Rf值接近葡萄糖醛酸，提示样品中可能含有糖醛酸。ii1.2、气相1.2.1、中性糖的4企测1.2.1.1、材料与方法样品精密称取守宫糖肽8.4mg，加入4mol/L三氟乙酸，封管，105°C水解4h,反复加曱醇于45。C减压浓缩至干。加lmg肌醇，16mg盐酸羟胺，lml吡啶，卯。C加热反应30分钟。取出冷却至室温，加入lml乙酸酐，90。C继续加热反应30分钟，反复加曱醇于45。C减压浓缩至干，然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖腈乙酸酯的衍生物，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样1W。混标精密称取鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖，岩藻糖，葡萄糖，半乳糖各lmg,肌醇lmg，加盐酸羟胺14mg，吡啶lml，同上操作，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样lpl。根据标准单糖和样品的保留时间的比较来确定样品中组成单糖的种类。根据标准单糖和样品的峰面积和进样量来计算样品中组成单糖的摩尔比。1.2.1.2、结果如下表:单糖保留时间(min)摩尔比鼠李糖9.7481.334岩藻糖10.4773.636甘露糖16.8443.375葡萄糖17.1716.983半乳糖18.08510.480样品含鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖。摩尔比为鼠李糖岩藻糖甘露糖葡萄糖半乳糖=1.334:3.363:3.375:6.983:10,480，参见图4、图5。1.2.2、^J4唐的检测1.2.2.1、材料与方法样品精密称取守宫糖肽8mg，加入6mol/L盐酸，封管，105°C水解8h,反复加入甲醇45。C減压蒸干，以完全除去盐酸。再加入lmg肌醇，四氢硼钠20mg,双蒸水2ml，室温还原3h，再用25。/。乙酸(V/V)中和过量的四氬硼钠，反复加甲醇于45。C减压浓缩至干，然后置P20s的干燥器中过夜，次日在80。C加热15min除去水分。力。3ml乙酸酐，封管，i00。C加热反应lh，反复加入曱苯45。C减压蒸干，除去乙酸酐，然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖醇乙酸酯的衍生物，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样lpl。混标精密称取氨基葡萄糖，氨基半乳糖，肌醇各lmg,四氩硼钠20mg，同上操作，反应产物用O.lml氯仿溶解，进样1^1。根据标准单糖和样品的保留时间的比较来确定样品中组成单糖的种类。根据标准单糖和样品的峰面积和进样量来计算样品中组成单糖的摩尔比。1.2.2.2、结果样品含M葡萄糖。保留时间14.151min，摩尔数为0.019，参见图6、图7。1.3、糖醛酸含量测定1.3.1、材料与方法(usy。(w/v)间羟联苯，用0."/。(W/V)氬氧化钠配置,在冰箱中避光保存，l月内稳定；四硼酸钠-辟u酸溶液0.0125mol/L四硼酸钠的辟u酸溶液；半乳糖醛酸标准溶液60ug/ml;精密量取标准溶液O，0.05,0.1，0.15,0.2，0.25ml值试管中，用双蒸水补加至0.25ml，在水浴中预冷后加入1.5ml的四硼酸钠-石危酸溶液。混匀，在沸腾水浴中加热5min，用冰浴冷却至室温后，加25ul的间羟联苯试剂，混匀，在520nm处测定光吸收。吸取样品溶液(lmg/ml)0.25ml，同前操作，为避免样品中非己糖醛酸成分与四硼酸钠-硫酸溶液反应的干扰，以25ul的0.5%(W/V)氬氧化钠代替间羟联苯试剂，测得的光吸收值从样品吸收值中扣除。根据标准品糖醛酸的含量和其对应的吸光度绘制出标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的吸光度，从回归方程上求得糖醛酸的含量。1.3.2、结果'根据回归方程求得守宫糖肽的糖醛酸质量百分含量3.08%。2、单糖的连接方式——甲基化2.1、材料与方法2丄1、甲基化反应称取守宫糖肽8mg,加入2ml二曱基亚砜溶解。加入干燥的氢氧化钠20mg，超声10min，室温下静置90min。在冰浴下逐滴加入碘曱烷lml，直至反应物成为亮黄色溶液。然后恢复至室温，继续超声10min，减压蒸馏除尽过量的碘曱烷，用氯仿3ml溶解，转移至分液漏斗中，然后加入等体积的水，洗涤3次，去除水层。反复曱基化7次，经IR分析，在3500cm^左右强而宽的羟基吸收峰基本消失，而2900cm处的曱基峰显著增强时，提示多糖上的羟基已经被曱基化。132丄2、曱基化的多糖解聚，水解，制备糖醇乙酸酯的衍生物。将曱基化的样品加入卯。/。曱酸(V/V)4ml，封管，100。C水解6h，向反应瓶中加入2~3mL曱醇，45。C下减压浓缩蒸干，重复以上操作以除尽过量曱酸。再加入4mol/L三氟乙酸4ml溶解，密封，105。C水解4h，向反应瓶中加入23rnL甲醇，45。C下减压浓缩蒸干，重复以上操作以除尽过量三氟乙酸。水解后样品加入四氢硼钠20mg，双蒸水2ml，室温还原3h，25%乙酸中和，向反应瓶中加入23mL曱醇，45。C下减压浓缩蒸千，重复以上操作以除尽过量乙酸。剩余物在80。C加热15min除去水分。加3ml乙酸酐，100。C加热反应lh，向反应液中加入2ml曱苯，振荡后45。C下减压蒸去未反应的醋酐，如此重复多次以除尽醋酐。然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖醇乙酸酯的衍生物，反应产物用O.lml氯仿溶解，进行气质联用分析(GC-MS)。2.2、结果2.2.1总离子流图，参见图8。2.2.2、曱基化分析如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(七)蛋白质组成和含量分析1、材料与方法取适量守宫糖肽，加盐酸，封管，110。C水解24h，浓缩，调节pH值为6.2-6.3，经氨基酸自动分析^义测定氨基酸组成和含量。2、结果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表中表明守宫糖肽含有16种氨基酸，氨基酸的质量百分含量为16.33%。(八)糖肽键的类型——P消去反应1、材料与方法称取守宫糖肽4mg，溶解于2ml0.3mol/L的氢氧化钠-lmol/L四氬硼钠中，加一滴曱苯，45。C水解24h,加入25%乙酸(V/V)中和稀碱溶液以终止反应，取0.5ml检测氨基酸的组成与含量，配制相同浓度的样品水溶液作为空白对照。2、结果守宫糖肽经卩消去反应前后氨基酸组成及含量比较(ng/mg)氨基酸名称守宫糖肽(不加氩氧化钠)守宫糖肽(加氬氧化钠)天冬氨酸29.927.62苏氨酸7.123.64丝氨酸8.586.32谷氨酸32.6829.46甘氨酸27.2625.98丙氨酸8.566.88缬氨酸2.582.16蛋氨酸0.90.88异亮氨酸4.944.22亮氨酸4.864.02酪氨酸1.481.14苯丙氨酸0.90.6氛基丁酸01.16赖氨酸13.7413.24组氨酸3.963.62精氨酸11.28.38脯氨酸4.625.98守宫糖肽经j3消去反应后，每毫克守宫糖肽中，苏氨酸的含量由7.12mg下降为3.64mg，氨基丁酸的含量由0mg上升为1.16mg。提示守宫糖肽键托类型含有O—连接。(九)；危睃基的测定1、材料与方法16明胶2g明胶在60-70。c溶解于400ml水中，4。c保存；氯化钡明胶试剂0.5g氯化钡溶解于100ml明胶溶液中，4。c保存；三氯乙酸8。/q水溶液(W/V);石克酸盐的标准品400ug/ml;所有器具用HN03洗后，再用去离子水冲洗。精密吸取标准品0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4ml，用水补足至0.4ml，分别加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化钡明胶试剂，混匀，静置15min,在360nm处测定浊度。精密称取守宫糖肽2mg，6mol/L盐酸水解6h，反复加入曱醇45。c减压蒸干，残渣各用lml水溶解，守宫糖肽吸取0.4mlx2份。取1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化钡明胶试剂；另1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml明胶试剂，混匀，静置15min，在360nm处测定浊度。有氯化钡存在时的吸光度减去无氯化钡存在时的吸光度，用这项对照消除水解液中含有的紫外吸收物质的影响。根据标准品硫酸基的含量和其对应的吸光度绘制出标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的吸光度，从回归方程上求得硫酸基的含量。2、结果根据回归方程求得守宫糖肽的硫tt质量百分含量14.7%守宫糖肽与守宫多糖对比活性分析1、守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响我们原有的研究观察了守宫多糖对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响，发现守宫多糖可抑制人肝癌BEL-7402细胞的增殖。^研究同时观察守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。1.1、守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响1.1.1、材料与方法SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司产品；守宫多糖用PBS緩冲液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。SMMC-7721细胞在5%CO;j孵箱中培养，培养基为含IO%灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1%双抗(青霉素和链霉素)。每3~4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5xl(y7ml个细胞(2ml培养体系)，共接种84孔。接种后24小时加药培养，分设守宫多糖高(200pg/ml)、中(100ng/ml)、低剂量组(10pg/ml)与PBS阴性对照组。分别于加药后30分钟、16天每组分别收集3孔细胞，台盼蓝染色，计数活细胞和死细胞，作生长曲线，计算细胞存活率。以下式计算细胞存活率细胞存活率(％)=(活细胞/活纟田胞+死细胞)xl00%。统计方法采用双因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version:16.0,Chicago,USA)完成。l丄2、结果守宫多糖高剂量、中剂量组对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用，但低剂量组对人肝癌SMMC-7721细胞增殖没有抑制作用，参见图9。1.2、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响1.2.1、材料与方法SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GEBCO公司产品；守宫糖肽用PBS緩冲液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。SMMC-7721细胞在5%(302孵箱中培养，培养基为含IO%灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1%双抗(青霉素和链霉素)。每3-4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5xl(^/ml个细胞(2ml培养体系)，共接种84孔。接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200pg/ml)、中(lOO^g/ml)、低剂量组(10pg/ml)与PBS阴性对照組。分别于加药后30分钟、1~6天每组分别收集3孔细胞，台盼蓝染色，计数活细胞和死细胞，作生长曲线，计算细胞存活率。以下式计算细胞存活率细胞存活率(°/。)=(活细胞/活细胞+死细胞)xl00%。统计方法采用双因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version:16.0,Chicago,USA)完成。1.2.1、结果'守宫糖肽高剂量、中剂量与低剂量组均对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用。以上结果表明守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用优于守宫多糖，参见图10。2、守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响2.1、守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响2丄1、材料与方法SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司产品；守宫多糖用PBS緩沖液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。SMMC-7721细胞在5%0)2孵箱中培养，培养基为含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1%双抗(青霉素和链霉素)。每3~4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5xl(^/ml个细胞(2ml培养体系)，接种后24小时加药培养，分设守宫多糖高(200ng/ml)、中(lOOpg/ml)、低剂18量组(l(Vg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞上清，离心，取上清。用双抗体夹心法检测IL-8的表达。IL-8的标准品的浓度梯度设置为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml,62.5pg/ml，31.25pg/ml,15.625pg/ml,7.8pg/ml,Opg/ml，每个剂量组平行设2孔。样品每个剂量组平行设3孔。才艮据标准品的各个浓度与其对应的吸光度(OD值)拟合曲线方程，再将样品的OD值代入方程计算其浓度。统计方法采用单因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version:16.0，Chicago,USA)完成。2丄2、结果守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的影响分组均数±标准差空白对照纽L249.337±13.052高剂量组(200ng/ml)224.577±15.275中剂量组(lOOpg/ml)229.420±5.082低剂量组(10pg/ml)249.940±17.811P=0.108表明守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8没有抑制作用。2.2、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响2.2.1、材料与方法SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司产品；守宫糖肽用PBS緩冲液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。SMMC-7721细胞在5%0)2孵箱中培养，培养基为含IO%灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1%双抗(青霉素和链霉素)。每3~4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5xl(yVml个细胞(2ml培养体系)，接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200ng/ml)、中(lOOpg/ml)、低剂量组(10pg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞上清，离心，取上清。用双抗体夹心法检测IL-8的表达。IL-8的标准品的浓度梯度设置为500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml，31.25pg/ml,15.625pg/ml,7.8pg/ml，Opg/ml，每个剂量组平行设2孔。样品每个剂量组平行设3孔。根据标准品的各个浓度与其对应的吸光度(OD值)拟合曲线方程，再将样品的OEH3i代入方程计算其浓度。统计方法采用单因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version:16.0，Chicago,USA)完成。2.2.2、结果19守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的影响分组均数i标准差空白对照组269.183±33.716高剂量组(20(Hig/ml)185.773士11.470參A中剂量组(100pg/ml)202.543±7.665o低剂量组(10Hg/ml)230.400±21.341P=0.006*与空白对照组比4交，P=0.001o与空白对照组比较l,P=0.005A与低剂量组比较，户=0.032说明守宫糖肽高剂量、中剂量组均对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8有明显抑制作用。以上结果表明守宫糖肽具有守宫多糖不具备的抑制人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的功能。应用实施例1:将守宫糖肽制成符合药剂学要求的注射剂型。含守宫糖肽的注射液的制备守宫糖肽，蒸馏水溶解，过滤，透析3次，调整浓度为10mg/ml，除菌，除热原，无菌分装为2ml/瓶。应用实施例2:将守宫糖肽制成符合药剂学要求的口服剂型。含守宫糖肽口服胶嚢的制备守宫糖肽，装入空心胶嚢，每粒50mg，封口，除粉，装瓶。含守宫糖肽口服片剂的制备守宫糖肽，加糊精2份，淀粉2份，糖粉1份，氬氧化凝胶达总量的3%，压片为50mg/片，装瓶。守宫糖肽在制备治疗恶性胂瘤的药物中的应用。守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。守宫糖肽在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。守宫糖肽在制备治疗HIV感染的药物中的应用。守宫糖肽在制备免疫调节剂中的应用。上述参照实施例对该守宫糖肽及制备方法和其医药应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。权利要求1、守宫糖肽，其特征在于重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度为-60°；碳元素的质量百分含量为23.39％，氢元素的质量百分含量为4.925％，氮元素的质量百分含量为6.51％；其组成的糖部分含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，氨基葡萄糖，摩尔比为鼠李糖∶岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶氨基葡萄糖＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；单糖的连接方式为鼠李糖以1，3-，1，3，4-和1，2，3-连接的形式存在，岩藻糖以1-，1，4-和1，2-连接的形式存在，甘露糖以1，4-连接的形式存在，葡萄糖以1-，1，3，4-连接的形式存在，半乳糖以1，4-，1，4，6-连接的形式存在，氨基葡萄糖以1，4-连接的形式存在；糖醛酸的质量百分含量为3.08％；其结合型蛋白质部分含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33％；糖肽键的类型含有O-连接；硫酸基的质量百分含量为14.7％。2、根据权利要求1所述守宫糖肽的制备方法，其特征在于将守宫干燥、破碎后用有机溶剂抽提出脂溶性物质，将脱脂后的药渣用4安守宫质量的1-10倍热水在30-100。C条件下浸提2-12小时，水提液过滤后分次加入乙醇至15%-80%浓度(V/V)沉淀，将沉淀溶解于水，1000-10000r/min离心取上清，常规sevage法除去杂蛋白，透析，干燥成粉，复溶解于粉末质量30-180倍的含有0.5mol/L氯化钠，1Ommol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐緩沖液，pH6.5，加入粉末质量0.5%_4%的木瓜蛋白酶及0.5-2倍的曱苯，50°C-80。C水浴4h-48h后补加粉末质量0.2%-2%的木瓜蛋白酶，继续水浴4h-24h;水解液浓缩后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，复溶于水，过滤，常類Lsevage法除去杂蛋白，浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。3、根据权利要求l所述的守宫糖肽，其特征在于将其制成符合药剂学要求的注射剂型。'4、根据权利要求l所述的守宫糖肽，其特征在于将其制成符合药剂学要求的口服剂型。5、根据权利要求1所述的守宫糖肽在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。6、根据权利要求1所述的守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。7、根据权利要求1所述的守宫糖肽在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。8、根据权利要求1所述的守宫糖肽在制备治疗fflV感染的药物中的应用。9、根据权利要求1所述的守宫糖肽在制备免疫调节剂中的应用。全文摘要本发明涉及一种守宫糖肽及制备方法和其医药应用，所述守宫糖肽，重均分子量大于2,000,000Da；组成糖含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，氨基葡萄糖，糖醛酸；其结合型蛋白质含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33％；硫酸基质量百分含量为14.7％；本发明在应用守宫多糖的基础上进一步研究，并得到科学验证；守宫糖肽较守宫多糖对恶性肿瘤有更高的疗效，并具有守宫多糖不具备的抑制肝癌细胞分泌白介素-8的功能；可单独用于恶性肿瘤的治疗，也可用于肿瘤手术、放疗、化疗与介入治疗的辅助治疗；以及艾滋病等病毒感染性疾病的防治；同时可作为一种新的免疫调节剂，用于肿瘤与慢性感染等疾病的治疗。文档编号C07K9/00GK101486755SQ20091006789公开日2009年7月22日申请日期2009年2月20日优先权日2009年2月20日发明者吴雄志申请人:吴雄志