专利名称：一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白。
背景技术：
小麦是世界第一大粮食作物，而小麦高分子量谷蛋白亚基是直接影响小麦品质 的重要因子。小麦高分子量谷蛋白亚基(High-Molecular-Weight-Glutenin Subunit, HMW-GS)的类型和数量直接关系到面筋的弹性和强度，对面粉的烘烤品质具有重要作用。 Payne等(1984)发现仅占全部谷蛋白10%的HMW-GS就决定了面包烘烤品质的43%，而与 蛋白总量一起则共同决定了面包加工品质变异的68%左右。小麦基因组中编码HMW-GS的 Glu-I复合基因位点(Glu-Al、Glu-Bl、Glu-Dl)及其不同等位基因编码的HMW-GS对烘烤品 质的贡献大小不同，其中以5+10亚基组合对面包烘烤品质贡献最大，具有决定性作用，因 此5亚基被认为是优质亚基。但是，我国目前小麦面粉的烘烤品质普遍较差，这与我国品种缺少优质的HMW-GS 有关，因此创造与发掘新的优质谷蛋白亚基编码基因，并开展相关生化、农学、分子生物学 等方面研究、探讨优质的分子机理，对于培育优质小麦新品种具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种小麦优质高分子量麦谷蛋白业基基因及 其表达的蛋白，具有该基因的小麦能够提高其面粉的烘烤品质，在湿面筋含量、Zeleny沉降 值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉烘烤加工品质主要指标上都具有明显的提高。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种具有SEQID NO 1所示核酸 序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因。本发明的从小麦品系W958中克隆一个高分子量麦谷蛋白亚基新基因1Dx5’，该基 因编码亚基5，，全长为2505bp (含有1个终止密码子)，该基因长度比1Dx5 (长度为2520bp) 要小18bp，同时比1Dx2(长度为2517bp)要小15bp。研究表明，该基因编码的蛋白具有833 个氨基酸，分子量为774. SKDa0蛋白的1_21氨基酸为信号肽区域，N-端为含有88个氨基 酸残基非重复区，686个氨基酸残基的高度重复的中央区，C-端为含有1个Cys (半胱氨酸) 的42个氨基酸残基非重复区。中央区含有χ-型、y_型亚基所具有的重复结构，有22个六 肽PGQGQQ，有3个GYYPTS/PLQQ九肽。W958是我们培育的种间远缘杂交(四倍体硬粒小麦 T. durum Desf. X六倍体普通小麦T. aestivum L)优良品系，该品系在ID染色体上具有父 母本没有的新型亚基，由于此亚基在SDS-PAGE电泳中具有和5亚基一样的电泳迁移率，因 此我们将该亚基命名为5’亚基，将其编码基因命名为1Dx5’。一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因 所表达的蛋白。与1Dx2编码的蛋白相比，本蛋白在80位氨基酸残基处为脯氨酸，346位氨 基酸为精氨酸，394位氨基酸为谷氨酸，451位氨基酸为精氨酸，而在673位则与1Dx5编码的蛋白相同，比1Dx2编码的蛋白少6个氨基酸。SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺 凝胶电泳)结果表明1Dx5’编码的蛋白亚基5’电泳迁移率与1Dx5编码的亚基5相似，与 1Dx2编码的亚基2有显著差别。同时，蛋白飞行时间质谱(MOLDI-TOLF)结果表明该成熟蛋白的准确分子量为86815Da，明显小于1Dx5 (87188Da)和1Dx2 (87023Da)。这与蛋白序列的推导结果相似。一种具有SEQ ID NO :1所示核酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，包括下述步骤1.种子基因组DNA提取。a.干种子30mg(取胚乳部分)，研成粉沫，转入2ml离心管中。b.加入 200μ 1 提取缓冲液(200mM Tris-HCl pH7. 5,2. 88M NaCl,25mM EDTA, 0. 5% SDS)浸泡 30min。c.加入600μ 1提取缓冲液，剧烈震荡lmin，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清液
至新管。d.加入等体积预冷的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(Tris饱和酚、氯仿、异戊醇的 体积比为25 24 1)，混勻，4°C 12000rpm离心lOmin，小心将上清转入新管。e.加入等体积预冷氯仿/异戊醇(氯仿、异戊醇的体积比为24 1)，混勻，4°C 12000rpm离心lOmin，上清至新管。f.向上清液中加入600 μ 1预冷的异丙醇，轻轻颠倒几次，-20°C沉淀30min，4°C IOOOOrpm离心，弃上清。g.用500μ1 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C 8000rpm离心5min，重复一次。h.沉淀放超净工作台中室温干燥。i.加入 50 μ 1 灭菌 ddH20，4°C溶解 12h。j. 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。2. PCR 扩增(1)引物设计HMW-GS的N-端和C-端序列高度保守，根据已知IDx-型基因(Halford等，1987 ； Mackie等，1996)的序列，运用Primer Premier5. O软件自行设计了特异性引物:DX_1和 DX-2，用于扩增IDx亚基编码基因的序列，从起始密码子ATG开始，至下游15个碱基处结 束。引物序列如下DX-I 5' -ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3‘DX-2 5' -GCTGCAGAGAGTTCTATC-3‘(2) PCR 反应a.反应体系为ΙΟΟμ 1 TaKaRa LA Taq (5U/ul)1 μ 12 X GC Buffer II50 μ 1dNTP 混合物(各 2. 5mM)16 μ 1DX-I (20uM)2 μ 1DX-2 (20uM)2μ 1DNA 模板(IOOng)8μ 1
ddH2021 μ 1Total100 μ 1b.反应条件94°C预变性2分钟；94°C变性45秒，59°C退火1分钟，72°C延伸2. 5分钟，共35个 循环；最后72°C延伸10分钟。1 %琼脂糖胶检测PCR产物，Ikb DNA Ladder Markers为鼎国生物公司生产。(3) PCR产物的回收纯化琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带，用TaKaRa公司的DNA凝胶回收试剂 盒Ver 2. 0进行回收，步骤如下a.凝胶切碎放入2ml离心管，称重，以Img = 1 μ 1计算，加入3倍胶块体积量的胶 块融化液 DR-I buffer，75°C加热 lOmin，加 1/2 体积的 DR-II buffer，混勻。b.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上，溶液转至Spin Column 中，3600rpm离心lmin，弃滤液。c.加入 500 μ 1 的 Rinse A 至 Spin Column 中，3600rpm离心 30 秒，弃滤液。d.加入 700 μ 1 的 Rinse B 至 Spin Column 中，3600rpm 离心 30 秒，弃滤液，重复1次。e. 12000rpm 再离心 lmin。f.将Spin Column置于新的1. 5ml离心管上，在Spin Column膜的中央加入25 μ 1 的灭菌ddH20，60°C加热lmin，12000rpm离心lmin，即得到回收产物，可立即使用或于_20°C保存。3. PCR产物的克隆(1)连接反应回收的PCR产物与pGEM-T Easy vector (Promega) 4°C连接，反应体系如下2Xrapid ligation buffer5. 0 μ 1pGEM-T Eesy Vector0. 5 μ 1T4 DNA Ligase1·0μ1PCR 回收产物3·5μ1Total10 μ 1(2)感受态细胞的制备与大肠杆菌的转化a.划板复壮宿主菌DH-5 α。b.挑取1个生长良好的单菌落(直径2-3mm)至含有30ml LB液体养基的锥形瓶 中，37°C 200rpm振荡培养过夜。c.取500 μ 1菌液接种50ml LB液体培养基，37°C震荡培养至0D600 = 0. 3-0. 4。d.菌液转入无菌一次性使用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置lOmin。e. 4°C 4100rpm 离心 lOmin，收集细胞。f.弃上清，用IOml冰预冷的0. IM CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置10min，4°C 4100rpm离心lOmin，重复此步骤一次。g.用2ml冰预冷的0. IM CaCl2溶液悬浮细胞，加入灭菌甘油至终浓度30%，分装 后放至0°C备用或存于-70°c。
h.力卩5 μ 1连接产物至200 μ 1的感受态细胞中，轻弹管壁混勻内含物，冰上放置30minoi. 42°C热激90秒，立即插入冰中冷却2min。j.加入800 μ 1 37°C预热的LB液体培养基，37260°C rpm,摇培45分钟。k. 3600rpm离心30秒，吸掉800 μ 1上清，剩下的吹散细胞，均勻的铺于涂有IPTG， X-Gal和Amp 80 μ g/ml LB平板，37°C倒置培养12-16小时，置4°C冰箱中显色4_6小时。(3)质粒的小量提取用于酶切验证或PCR检测a.挑取单菌落于IOml LB+(Amp 80 μ g/ml)液体培养基，37°C培养过夜。b.取1.5ml菌液至的2ml离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体，重
复一次。c.加 100μ 1 冰预冷的溶液 I(50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8. OUOmM EDTA pH8. 0)，震荡，充分悬浮菌液，室温放置5分钟。d.加新鲜配制的200 μ 1的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1 % SDS)，上下颠倒不超过5次，冰
上放置5分钟。e.加 150 μ 1 冰预冷的溶液 III (60ml 5M 乙酸钾、11. 5ml 冰乙酸、28. 5ml ddH20)上下颠倒不超过5次，冰上放置，直至形成紧实的团块，12000rpm离心10分钟，上
清移至新离心管。f.加等体积的酚/氯仿(1 1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，上清移至新离心管。g.加2倍体积的无水乙醇，混勻，_20°C放置1小时，12000rpm离心10分钟。h.用75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复一次。i.吹干，溶于50 μ 1灭菌ddH20 (含0. 02mg/ml RNase)中，做电泳检测。(4)重组质粒PCR和酶切鉴定a.按3. 2PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定。b.酶切鉴定体系如下EcoRI1 μ 1IOXH Buffer2μ 1重组质粒5 μ 1灭菌水12 μ 1Total20 μ 137°C酶切4小时，然后琼脂糖凝胶电泳检测，限制性内切酶EcoRI购自大连宝 生物工程公司(TaKaRa)。(5)序列测定与拼接以上经鉴定的质粒，以SP6和T7为引物，由TaKaRa公司进行DNA序列测定和拼接。综上，本发明的有益效果是在遗传背景相似的条件下，具有本发明5’亚基(由 1Dx5’基因编码)的小麦在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等 面粉加工品质主要指标上部明显优于具有5亚基的小麦。因此，我们认为小麦高分子量麦 谷蛋白新亚基5’对小麦面粉的加工品质的贡献优于亚基5，其编码基因1Dx5’在小麦品种的加工品质改良方面具有重要的利用价值和开发潜力。
具体实施例方式实施例1 具有基因IDx 5’(编码亚基5’)的小麦W958与具有基因IDx 5 (编码亚基5)的小麦W168相比，W958湿面筋含量为39. 3%，W168湿面筋含量为26. 1%，具有基因IDx 5，的小麦W958比具有基因1Dx5的小麦W168的湿面筋含量提高了 50. 6%。实施例2 具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx5的小麦品种川麦107相比，W958湿面筋含量为39.6%，川麦107湿面筋含量为31.2%，具有基因IDx 5，的小麦W958比具有基因IDx 5的小麦川麦107的湿面筋含量提高了 26. 9%。实施例3 具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx 5的小麦W168相比，W958的Zeleny 沉降值为40. 5ml,W168的Zeleny沉降值为27. 4ml，前者提高了 47.8%。实施例4 具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx 5的小麦W7相比，W958的Zeleny 沉降值为40. 2ml, W7的Zeleny沉降值为30. 1ml，前者提高了 33.6%。实施例5 具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx 5的小麦W168相比，W958粉质仪面团形成时间为5分钟，W168面团形成时间为1. 5分钟，前者形成时间比后者长3. 5分钟。实施例6:具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx 5的小麦W168相比，W958粉质仪 面团稳定时间为4分钟，W168面团稳定时间为1分钟，前者稳定时间比后者长3分钟。实施例7:具有基因IDx 5，的小麦W958与具有基因IDx 5的小麦川麦107相比，W958粉质仪面团稳定时间为4. 5分钟，川麦1078面团稳定时间为2分钟，前者稳定时间比后者长2. 5 分钟。序列表<110>中国科学院成都生物研究所<120> 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白<130> 一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2505<212>DNA<213> 小麦<400>1atggctaagc ggttagtcct ctttgtggcg gtagtcgtcg ccctcgtggc tctcaccgtc 60
gctgaaggtg aggcctctga gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gctccaggag120cgcgagctca aggcatgcca gcaggtcatg gaccagcagc tccgagacat tagccccgag180tgccaccccg tcgtcgtcag cccggtcgcg ggacaatacg agcagcaaat cgtggtgccg240cccaagggcg gatctttcta ccccggcgag accacgccac cgcagcaact ccaacaacgt300atattttggg gaatacctgc actactaaaa aggtattacc caagtgtaac ttctccgcag360caggtttcat actatccagg ccaagcttct ccgcaacggc caggacaagg tcagcagcca420ggacaagggc aacaatcagg acaaggacaa caagggtact acccaacttc tccgcaacag480ccaggacaat ggcaacaacc ggaacaaggg caaccagggt actacccaac ttctccgcag540cagccaggac aattgcaaca accagcacaa gggcagcaac caggacaagg acaacaaggt600cggcagccag gacaagggca accagggtac tacccaactt cttcgcagct gcagccagga660caattgcaac aaccagcaca agggcaacaa gggcagcaac caggacaagg gcaacaaggt720caacagccag gacaagggca acaaccagga caaggacaac aaggtcaaca gccaggacaa780gggcaacaac caggacaagg gcaacaaggt cagcagctcg gacaaggaca acaagggtac840tacccaactt ctctgcaaca gtcgggacaa gggcaaccag ggtactaccc aacttctctg900cagcagctag gacaagggca atcagggtac tacccaactt ctccgcagca accaggacaa960gggcagcagc caggacaatt gcaacaacca gcacaagggc agcaaccaga acaagggcaa1020caaggtcagc agccacgaca agggcaacaa ggccagcagc caggacaagg gcagcaaccg1080ggacaagggc aaccagggta ctacccaact tctccgcagc agtcaggaca agggcaacca1140gggtactacc caacttcttc gcagcagcca acacaatcgc agcaaccaga acaagggcaa1200caaggtcagc aggtaggaca agggcaacaa gctcagcagc caggacaggg gcagcaaccg1260ggacaagggc agccagggta ctacccaact tctccgctgc agtcaggaca agggcaacca1320gggtactacc taacttctcc gcagcagtca ggacgagggc agcagccagg acaattgcaa1380caatcagcac aagggcaaaa aggacagcaa ccaggacaag gtcaacagcc agggcaaggg1440caacaaggtc agcagccagg acaagggcaa caaggtcagc aaccggggca agggcagcca1500gggtactacc caacttctcc gcagcaatca ggacaagggc aacagccagg acaatggcaa1560caaccaggac aagggcaacc aggatactac ccaacttctc cgttgcagcc aggacaaggg1620caaccagggt acgacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcagca accaggacaa1680ttgcaacaac cagcacaagg gcaacaaggg cagcaactag cacaagggca acaagggcag1740caaccagcac aagtgcaaca agggcagcag ccagcacaag ggcaacaagg tcagcagcta1800ggacaagggc aacaaggtca gcagccagga caagggcagc aaccagcaca agggcaacaa1860ggtcagcagc caggacaagg gcaacaaggt cagcagccag gacaagggca gcaaccggga1920caagggcagc catggtacta cccaacttct ccgcaacagc caggacaatg gcaacaacca1980ggacaatggc aacaaccagg acaagggcaa ccagggtact acctaacttc tccgttgcag2040ctaggacaag ggcaacaagg gtactaccca acttctctgc aacaaccagg acaagggcag2100caaccaggac aatggcaaca atcgggacaa gggcaacatg ggtactaccc aacttctccg2160cagctgtcag gacaagggca acggccagga caatggctgc aaccaggaca agggcaacaa2220gggtactacc caacttctcc gcaacagtca ggacaagggc aacaactagg acaatggctg2280caaccaggac aagggcaaca agggtactac ccaacttctc tgcaacagac aggacaaggg2340cagcaatcag gacaagggca acaaggctac tacagctcat accatgttag cgtggagcac 2400
caggcggcca gcctaaaggt ggcaaaggcg cagcagctcg cggcacagct gccggcaatg 2460tgccggctgg agggcggcga cgcattgtcg gccagccagt gatag 2505<210>2<211>833<212>PRT<213> 小麦<400>2Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Val Ala Val Val Val Ala Leu Val151015Ala Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Glu Gln Leu Gln Cys Glu202530Arg Glu Leu Gln Glu Leu Gln Glu Arg Glu Leu Lys Ala Cys Gln Gln354045Val Met Asp Gln Gln Leu Arg Asp lie Ser Pro Glu Cys His Pro Val505560Val Val Ser Pro Val Ala Gly Gln Tyr Glu Gln Gln lie Val Val Pro65707580Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr Thr Pro Pro Gln Gln859095Leu Gln Gln Arg lie Phe Trp Gly lie Pro Ala Leu Leu Lys Arg Tyr100105110Tyr Pro Ser Val Thr Ser Pro Gln Gln Val Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln115120125Ala Ser Pro Gln Arg Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln130135140Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln145150155160Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro165170175Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln180185190Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Arg Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro195200205Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Ser Gln Leu Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln210215220Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly225230235240Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln245250255
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln260265270Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Ser275280285Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Leu Gly290295300Gln Gly Gln Ser Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln305310315320Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Pro325330335Glu Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Arg Gln Gly Gln Gln Gly Gln340345350Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr355360365Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro370375380Thr Ser Ser Gln Gln Pro Thr Gln Ser Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln385390395400Gln Gly Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln405410415Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro420425430Leu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Gln435440445Gln Ser Gly Arg Gly Gln Gln Pro Gly Gln Leu Gln Gln Ser Ala Gln450455460Gly Gln Lys Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly465470475480Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly485490495Gln Gly Gln Pro Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln500505510Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly515520525Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly Tyr530535540Asp Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln 545550555560Leu Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Ala Gln Gly
565570575Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Val Gln Gln Gly Gln Gln Pro Ala580585590Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln595600605Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro610615620Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly625630635640Gln Gly Gln Pro Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln645650655Trp Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Pro Gly660665670Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Leu Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr675680685Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln690695700Trp Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln His Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro705710715720Gln Leu Ser Gly Gln Gly Gln Arg Pro Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly725730735Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln740745750Gly Gln Gln Leu Gly Gln Trp Leu Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly755760765Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly770775780Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Ser Ser Tyr His Val Ser Val Glu His785790795800Gln Ala Ala Ser Leu Lys Val Ala Lys Ala Gln Gln Leu Ala Ala Gln805810815Leu Pro Ala Met Cys Arg Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser820825830 Gln
权利要求
一种具有SEQ ID NO1所示核酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因。
2.一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因所 表达的蛋白。
3.—种权利要求1所述小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，其特征在 于，包括下述步骤1)种子基因组DNA提取a.取小麦品种W958干种子30mg，研成粉沫，转入2ml离心管中；b.加入200μ1提取缓冲液浸泡30min，提取缓冲液的组成成分及含量为200mM Tris-HCl ρΗ7· 5,2. 88Μ NaCl,25mM EDTA，0. 5% SDS ；c.加入600μ 1提取缓冲液，剧烈震荡Imin, 40C 12000rpm离心lOmin，取上清液至新管；d.加入等体积预冷的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇，混勻，4°C12000rpm离心lOmin，小 心将上清转入新管，Tris饱和酚、氯仿、异戊醇的体积比为25 24 1 ；e.加入等体积预冷氯仿/异戊醇，混勻，4°C12000rpm离心lOmin，取上清液至新管，冷 氯仿、异戊醇的体积比为24 1 ；f.向上清液中加入600μ 1预冷的异丙醇，轻轻颠倒几次，-20 V沉淀30min， 4°C IOOOOrpm离心lOmin，弃上清液；g.用500μ 1 70%的乙醇清洗DNA沉淀，4°C 8000rpm离心5min，重复一次；h.沉淀放超净工作台中室温干燥；i.加入50 μ 1 灭菌 ddH20,4°C溶解 12h ； j. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度；2)PCR扩增(1)引物设计 引物序列如下DX-I 5' -ATGGCTAAGCGGTTAGTC-3‘ DX-2 5 ‘ -GCTGCAGAGAGTTCTATC-3‘(2)PCR反应a.反应体系为ΙΟΟμ1 TaKaRa LA Taq (5U/ul)1 μ 12XGC Buffer II50 μ 1dNTP 混合物(各 2. 5mM)16 μ 1DX-I(20uM)2 μ 1DX-2(20uM)2 μ 1DNA 模板(IOOng)8μ 1ddH2021 μ 1Total100 μ 1b.反应条件94°C预变性2分钟；94°C变性45秒，59°C退火1分钟，72°C延伸2. 5分钟，共35个循 环；最后72°C延伸10分钟；琼脂糖胶检测PCR产物； (3) PCR产物的回收纯化琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下切下目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，步骤如下a.凝胶切碎放入2ml离心管，称重，以Img= 1 μ 1计算，加入3倍胶块体积量的胶块融 化液 DR-I buffer，75°C加热 IOminJ 1/2 体积的 DR-II buffer，混勻；b.将试剂盒中的SpinColumn安置于Collection Tube上，溶液转至Spin Column中， 3600rpm离心lmin，弃滤液；c.加入500 μ 1 的 Rinse A 至 Spin Column 中，3600rpm 离心 30 秒，弃滤液；d.加入700μ 1的Rinse B至Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃滤液，重复1次；e.12000rpm 再离心 Imin ；f.将SpinColumn置于新的1. 5ml离心管上，在Spin Column膜的中央加入25 μ 1的 灭菌ddH20，60°C加热lmin，12000rpm离心lmin，即得到回收产物，可立即使用或于_20°C保 存；3) PCR产物的克隆(1)连接反应回收的PCR产物与pGEM-T Easy vector 4°C连接，反应体系如下2Xrapid ligation buffer5. 0 μ 1pGEM-T Easy Vector0. 5 μ 1T4DNA Ligase1·0μ1PCR回收产物3. 5μ1Total10 μ 1(2)感受态细胞的制备与大肠杆菌的转化a.划板复壮宿主菌DH-5ci；b.挑取1个生长良好的单菌落至含有30mlLB液体养基的锥形瓶中，37°C 200rpm振荡 培养过夜；c.取500μ 1菌液接种50ml LB液体培养基，37°C震荡培养至0D600 = 0. 3-0. 4 ；d.菌液转入无菌一次性使用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置IOmin；e.40C 4100rpm 离心 IOmin,收集细胞；f.弃上清，用IOml冰预冷的0.IM CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置10min，4°C 4100rpm 离心lOmin，重复此步骤一次；g.用2ml冰预冷的0.IM CaCl2溶液悬浮细胞，加入灭菌甘油至终浓度30%，分装后放至0°C备用或存于-70°C ；h.加5μ1连接产物至200μ 1的感受态细胞中，轻弹管壁混勻内含物，冰上放置 30min ；i.42°C热激90秒，立即插入冰中冷却2min ；j.加入800 μ 1 37°C预热的LB液体培养基，37°C 260rpm,摇培45分钟； k. 3600rpm离心30秒，吸掉800 μ 1上清，剩下的吹散细胞，均勻的铺于涂有IPTG， X-Gal和Amp 80 μ g/ml的LB平板，37°C倒置培养12-16小时，置4°C冰箱中显色4_6小时；(3)质粒的小量提取用于酶切验证或PCR检测a.挑取单菌落于IOml含Amp80 μ g/ml的LB液体培养基，37°C培养过夜；b.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体，重复一次；c.加100μ 1冰预冷的溶液I，震荡，充分悬浮菌液，室温放置5分钟，溶液I的组成成 分及含量为50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8. OUOmM EDTA pH8. 0 ；d.加新鲜配制的200μ 1的溶液II，上下颠倒不超过5次，冰上放置5分钟，溶液II组 成成分及含量为0. 2Μ NaOH, 1 % SDS ；e.加150μ 1冰预冷的溶液III，溶液III的组成成分及含量为60ml 5M乙酸钾、 11. 5ml 冰乙酸、28. 5ml ddH20 ；上下颠倒不超过5次，冰上放置，直至形成紧实的团块，12000rpm离心10分钟，上清移 至新离心管；f.加等体积的酚/氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，上清移至新离心管，酚、氯仿 的体积比为1:1;g.加2倍体积的无水乙醇，混勻，_20°C放置1小时，12000rpm离心10分钟；h.用75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，重复一次；i.自然吹干，溶于50μ1含0. 02mg/ml RNase的灭菌ddH20中，做电泳检测；(4)重组质粒PCR和酶切鉴定；a.按上述PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定；b.酶切鉴定体系如下EcoR I1 μ 1IOXH Buffer2μ 1重组质粒5 μ 1灭菌水12 μ 1Total20 μ 137°C酶切4小时，然后琼脂糖凝胶电泳检测；(5)序列测定与拼接以上经鉴定的质粒，以SP6和T7为引物，进行DNA序列测定和拼接。
4.根据权利要求3所述小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因的制备方法，其特征在 于，所述小麦品种W958由四倍体硬粒小麦T. durum Desf. X六倍体普通小麦Τ. aestivum L 种间远缘杂交获得。
全文摘要
本发明公开了一种小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因及其表达的蛋白。小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因序列如SEQ ID NO1所示，小麦优质高分子量麦谷蛋白亚基基因所表达的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。在遗传背景相似的条件下，具有本发明5’亚基(1Dx5’基因编码)的小麦在湿面筋含量、Zeleny沉降值、粉质仪面团形成时间和稳定时间等面粉加工品质主要指标上都明显优于具有5亚基的小麦。因此，我们认为小麦高分子量麦谷蛋白新亚基5’对小麦面粉的加工品质的贡献优于亚基5，其编码基因1Dx5’在小麦品种的加工品质改良方面具有重要的利用价值和开发潜力。
文档编号C07K14/415GK101798575SQ20091021663
公开日2010年8月11日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者冯波, 吴宁, 徐智斌, 王涛 申请人:中国科学院成都生物研究所