专利名称：用于微生物检测的多肽的制作方法
用于微生物检测的多肽相关专利申请的交叉引用本申请要求2008年2月14日提交的美国临时申请序列号61/028，896的权利，该临时申请以引用的方式并入本文。
背景技术：
溶细胞肽或者说溶细胞素以前已被用来从脂质体或细胞释放活性剂或“有效载荷 (payload) ”。这种肽的作用方式涉及对脂质体或细胞膜的扰动。这些肽包括来自昆虫、鱼类 的毒素，抗菌肽和合成肽如蜂毒肽、丙甲甘肽、短杆菌肽、爪蟾抗菌肽和摩西鱼毒肽、GALA、 KALA、血凝素亚单位HA-2。天然的强力溶细胞肽在从昆虫到哺乳动物中广泛存在，特别是作 为抗微生物肽或防御素存在；这种肽在这些动物中在粘膜处参与先天防御和在淋巴细胞中 作为溶细胞素。为了使这种肽的溶细胞作用靶向目标并限于局部，需要特异性的步骤(例 如活化合成、从溶酶体的释放和前肽的切割)。这种肽的生物递送活性受到严格控制。溶细 胞素活性通过复杂的机制得到掩护。涉及使用溶细胞素的诊断方法由于与替代方法相比灵敏度差和背景会发生非特 异性变化，因而妨碍了人们对它的接受。脂质体以前已被应用于使用补体介导的裂解的均 相测定法中(Anal. Biochem. 1 18(198 1)286-293)。但是，这类测定法被认为是不可靠的， 因为它们涉及许多不稳定的成分，任何一种成分都可能失活，从而不能使有效载荷释放。溶 细胞肽的稳定性和水溶性的保持仍是它们用于诊断应用的障碍。为进行可靠的测定，可检测标记分子的释放应仅仅响应外部触发因素而发生，标 记分子的任何泄漏应为最小限度，例如接近零，或者至少在测定期间保持恒定。因此，在这 种测定中，总是存在由标记分子的逐步释放引起的背景信号或干扰的危险。对于多种诊断 测定法而言，存在着更好地控制溶细胞素的活性的需求。
发明内容
本公开涉及能够调节脂质囊泡的渗透性的多肽(例如溶细胞多肽)。优选地，该多 肽包含能控制其调节脂质囊泡渗透性的能力的可活化基团。该多肽可响应环境刺激(如环 境PH的变化)而被活化。或者，该多肽可充当水解该可活化基团从而控制该多肽调节脂质 囊泡渗透性的能力的酶的酶底物。在某些优选的实施例中，该多肽包含多个可活化基团。本公开还涉及所述多肽在检测靶标微生物的方法中的用途。该多肽可响应靶标微 生物的代谢活性(例如酸性代谢物的产生或者能活化该多肽的酶的合成)。在一个方面，本公开包括用于使物质从脂质囊泡中释放出来的多肽。该多肽可包 含可活化的孔形成部分，该部分当被活化时能调节脂质囊泡的渗透性。该多肽还可包含至 少三个磷酸基团。至少一个磷酸基团的水解可活化该多肽的孔形成部分。在另一个方面，本公开包括包含SEQ ID No. 1、连接有至少一个磷酸基团的纯化多 肽。本公开还包括这样的组合物，其包含有该包含SEQID No. 1、连接有至少一个磷酸基团的 纯化多肽和包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡。
在另一个方面，本公开包括包含SEQ ID No. 2、连接有至少一个磷酸基团的纯化多 肽。本公开还包括这样的组合物，其包含有该包含SEQID No. 2、连接有至少一个磷酸基团的 纯化多肽和包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡。在另一个方面，本公开包括包含SEQ ID No. 3、连接有至少一个磷酸基团的纯化多 肽。本公开还包括这样的组合物，其包含有该包含SEQID No. 3、连接有至少一个磷酸基团的 纯化多肽和包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡。在另一个方面，本公开包括包含SEQ ID No. 4、连接有至少一个磷酸基团的纯化多 肽。本公开还包括这样的组合物，其包含有该包含SEQID No. 4、连接有至少一个磷 酸基团的 纯化多肽和包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡。在另一个方面，本公开包括用于检测样品中的靶标微生物的方法。该方法包括提 供样品、包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡和多肽。该多肽可包含可活化的孔形 成部分，该部分当被活化时能调节脂质囊泡的渗透性。该多肽还可包含至少三个磷酸基团。 该方法还包括使样品、脂质囊泡和多肽之间接触；和检测可检测信号。在另一个方面，本公开包括用于检测靶标微生物的方法。该方法包括提供样品、包 含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡、包含培养基的培养装置和多肽。该多肽可包含 可活化的孔形成部分，该部分当被活化时能调节脂质囊泡的渗透性。该多肽还可包含至少 三个磷酸基团。该方法还可包括使样品和培养基之间在如果样品中存在靶标微生物容许靶 标微生物的代谢活性的条件下接触。该方法还可包括使样品、脂质囊泡和多肽之间在如果 存在靶标微生物使脂质囊泡靠近靶标微生物的条件下接触；和检测可检测信号。本文所用的术语“分析物”和“抗原”可互换使用，指目的微生物特征性的各种分子 (例如酵母聚糖)或分子表位(例如酵母聚糖的不同结合位点)或者该微生物全细胞。它 们包括细胞壁成分(例如细胞壁蛋白质)、细胞壁外成分(例如甘露聚糖、几丁质或酵母聚 糖)、细胞内成分(例如细胞质膜蛋白质)等。术语“信号元件”指起到提供可检测信号(例如光的吸收、光的反射、荧光、发光、 电导、阻抗等)的作用的分子或组合物。信号元件可以是“明显的信号元件”，这样它们可提 供直接的和/或显而易见的可检测信号(例如荧光染料)。或者，信号元件可以是“潜在的 信号元件”，这样它们必须被活化以提供可检测信号。术语“识别元件”指能识别和选择性结合分析物的分子。识别元件包括例如抗体 和从其衍生的抗原结合位点。识别元件还包括受体和从其衍生的受体结合位点。本文所用 的术语“捕获剂”指连接到载体材料(例如颗粒、基材、膜、纤维、水凝胶等)的识别元件。词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施 例。然而，在相同的或其他的情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，述及一个或多个 优选的实施例并非暗示其他实施例不可用，也并非旨在将其他实施例排除在本发明的范围 之外。术语“包含”和其变型形式在说明书和权利要求书中出现时不具有限制性意义。本文所用的“ 一种”、“至少一种”和“ 一种或多种”可互换使用。因此，例如，被怀 疑含有“一种”脂质囊泡的样品可认为是意指该样品可包含“一种或多种”脂质囊泡。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组
I=I O
另外，在本文中，由端点界定的数值范围包括该范围内所含的所有数值(如，1至5 包括 1、1· 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)上述的“发明内容”并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。下 面的描述更为具体地举例说明了示例性的实施例。在本专利申请中的几个地方，通过实例 的列表来提供指导，这些实例可以以各种组合来使用。在每种情况中，所述及的列表只是用 作代表性的群组，不应被解释为是排他性的列表。
本发明将结合下面所列的附图进行进一步的阐述，其中在几个视图中相同的结构 由相同的数字指代。图1是使用捕获剂检测样品中的靶标微生物的方法的框图。图2是检测样品中的靶标微生物的方法的框图。图3是使用生长步骤检测样品中的靶标微生物的方法的框图。
具体实施例方式本发明涉及快速检测微生物的组合物和方法。所述方法包括使用可活化多肽， 其当被活化时能调节脂质囊泡的渗透性。优选地，该多肽包含多个可按类似方式活化的 类似可活化基团。可活化多肽在标题为“颗粒物(PARTICLES)”的国际专利申请号PCT/ GB98/03071和在标题为“受护肽(ARMED PEPTIDES) ”的国际专利申请号PCT/GB02/00033中 有公开，这两个专利申请全文以引用方式并入。表1显示了可破坏脂质囊泡(例如细胞或脂 质体)的渗透性的多肽的列表。使用可活化多肽检测靶标微生物的方法在2008年2月14 日提交、标题为“检测微生物的方法和组合物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING MICROORGANISMS)”的美国专利申请号61/028，898中有描述，该专利申请全文以引用方式 并入。表1.可破坏脂质体渗透性的肽
权利要求
一种用于使物质从脂质囊泡中释放出来的多肽，所述多肽包含可活化的孔形成部分，其当被活化时调节脂质囊泡的渗透性；以及至少三个磷酸基团，其中所述磷酸基团中的至少一个的水解使所述多肽的孔形成部分活化。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述磷酸基团中的至少两个的水解使所述多肽的 孔形成部分活化。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述磷酸基团中的至少三个的水解使所述多肽的 孔形成部分活化。
4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述磷酸基团中的至少四个的水解使所述多肽的 孔形成部分活化。
5.前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所有磷酸基团的水解使所述多肽的孔形成 部分活化。
6.前述权利要求中任一项所述的多肽，其还包含脂族基团。
7.一种包含SEQ ID No. 1、连接有至少一个磷酸基团的多肽。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个与其连接的磷酸基团。
9.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽包含至少三个与其连接的磷酸基团。
10.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽包含至少四个与其连接的磷酸基团。
11.一种包含SEQ ID No. 3、连接有至少一个磷酸基团的多肽。
12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含至少两个与其连接的磷酸基团。
13.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含至少三个与其连接的磷酸基团。
14.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含至少四个与其连接的磷酸基团。
15.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含至少六个与其连接的磷酸基团。
16.一种包含SEQ ID No. 2的多肽。
17.一种用于检测靶标微生物的组合物，所述组合物包含 包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡；以及 根据前述权利要求中任一项所述的多肽。
18.一种用于检测样品中的靶标微生物的方法，所述方法包括提供样品、包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡、和根据权利要求1-15中任一 项所述的多肽；使样品、脂质囊泡、和多肽接触；以及 检测能检测信号。
19.一种用于检测靶标微生物的方法，所述方法包括提供样品、包含产生能检测信号的信号元件的脂质囊泡、包含培养基的培养装置、和根 据权利要求1-15中任一项所述的多肽；使样品和培养基在如果样品中存在靶标微生物容许靶标微生物的代谢活性的条件下 接触；使样品、脂质囊泡、和多肽在如果存在靶标微生物使脂质囊泡靠近靶标微生物的条件 下接触；以及检测能检测信号。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述培养装置包括膜培养装置。
全文摘要
本发明公开了能被活化以造成在脂质膜中形成孔的多肽。本发明还公开了用于检测靶标微生物的多肽组合物和使用所述组合物的方法。
文档编号C07K9/00GK101952301SQ200980105331
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月12日 优先权日2008年2月14日
发明者何毅, 史蒂芬·B·罗斯科, 斯特凡妮·J·莫勒, 理查德·B·罗斯 申请人:3M创新有限公司