通过基因疗法治疗眼疾病的方法

专利名称：通过基因疗法治疗眼疾病的方法
技术领域：
本发明提供通过给有需要的受试者施用编码ABCR蛋白(“视网膜ATP结合盒转运 蛋白(ATP-binding cassette transporter-retinal)”)的腺相关病毒(adeno-associated viral)载体来治疗与ABCA4基因中的突变相关的疾病的方法。本发明还包括用于该方法的 基因构建体和腺相关病毒载体。
背景技术：
Stargardt 病(Deutman, A. F. a. H. C. B. 2001. Macular dystrophies. St Louis, Missouri, Usa : Schachat，A. P. 1210-1257 pp.) (STCD)是包括在黄斑变性类疾病中的常 染色体隐性遗传病，其在于双眼的中心凹中视锥细胞的进行性丧失，从而导致不同水平的 中心视力减退。在眼底镜检查时，常观察到在黄斑周围存在黄色雀斑，称为黄色斑眼底 (fundus flavimaculatus)病症。其通常在7至12岁之间发生，估计流行率为1/10，000个 体，这使得该疾病成为在生命的第一和第二个十年中影响感光细胞的遗传性黄斑变性的首 要原因，并且相应于所有视网膜营养不良(retinian dystrophy)的7%。该疾病最初被描 述为常染色体隐性遗传病，但存在一些显性模式的报道病例。隐性模式包括90%以上的病 例，是因染色体Iq21_pl3的缺陷导致的。显性模式似乎与第6号染色体上的变化相关，但 一些研究还报导了在第12号染色体上的定位。负责隐性Stargardt病的基因已被鉴定为ABCA4基因(Allikmets，R.，等人1997. A photoreceptor cell-specific ATP-binding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy. Nat Genet 15 :236_246),该基因编码 ABCR 蛋 白——ATP-结合盒(ABC)转运蛋白家族的成员。其在感光器中表达并且已被定位在外节盘缘。与ABCA4中的突变相关的其他疾病包括视锥视杆营养不良(cone-rod distrophy)(Maugeri, Α.,等 A, 2000, "Mutations in the ABCA4(ABCR) gene are the major cause of autosomal recessive cone-rod dystrophy，，Am JHum Genet 67: 960-966.)和色素性视网膜炎(Cremers，F. P.,等人 I"8. "Autosomal recessive retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy caused by splice site mutations in the Stargardt' s disease gene ABCR" Hum Mol Genet 7 :355_362 ;Martinez_Mir,等人 1998. “Retinitis pigmentosa caused by a homozygous mutation in the Stargardt disease gene ABCR"Nat Genetl8 :11_12)。重要地，人中杂合 ABCA4 突变(Allikmets， R. ^A 1997"Mutation of the Stargardt disease gene (ABCR) in age-related macular degeneration，，Science 277 1805-1807)已经与年龄相关性黄斑变性(AMD)(老年人中 最常见的致盲疾病)相关(Seddon, J. M. 2001. Epidemiology of Age-Related Macular Degeneration. St Louis, Missouri, USA Schachat, A. P.1039_1050pp)。发明描述本发明基于如下发现具有AAV5壳体的编码ABCA4的腺相关病毒载体的施用(优 选眼内施用)导致该蛋白质定位在视杆外段和Abca4-/-视网膜的显著并且稳定的形态学和功能性改善。特别地，已发现在STCD动物模型中，rAAV2/5-CMV-Abca4的视网膜下给药 导致脂褐素(lipofuscin)水平、RPE异常和视网膜功能的显著矫正。这些发现为隐性Stargardt病(最常见的遗传性黄斑变性)以及与ABCA4突变相 关的其他疾病例如视锥视杆营养不良，色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性(AMD)(老 年人中最常见的致盲疾病)提供了有价值的治疗方法。因此，在第一方面，本发明涉及用于在受ABCA4基因突变相关疾病影响的哺乳动 物受试者中，特别是在人个体中，矫正视网膜异常和/或视网膜功能的方法，所述疾病优 选选自隐性Stargardt疾病、视锥视杆营养不良、色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性 (AMD)，本发明的方法包括步骤1)提供具有AAV5壳体的重组腺相关病毒(AAV)载体，所述载体具有包含编码功能 性ABCR蛋白的核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子有效地连接至指导其转录和翻译的 调控元件上；2)使用所述重组AAV载体转导感光细胞，从而在所述细胞中诱导ABCR蛋白的表达。具有AAV5壳体的载体经证明能够比其他血清型更有效地包装多达9kb，优选大约 4. 7至9kb的基因组，因此优选根据本发明使用它们递送ABCA4基因。尤其优选重组AAV2/5 载体，该载体优选被递送至视网膜下间隙，导致合适分子量和生物学活性的功能性ABCR蛋
白产生。“功能性ABCR蛋白”是指，该ABCR蛋白展示天然蛋白质的功能，例如蛋白质在体内 充分结合ATP以为感光细胞提供功能。优选，功能性ABCR蛋白展示至少80%，更优选至少 90%，和最优选至少95%的天然蛋白质的功能。可以例如按照Sun等人，Nature Genetics 26,242-246(2000)(通过引用合并入本文)中描述的方法进行功能活性的测定。为了本发明的目的，将ABCA4的编码序列与能够在哺乳动物视网膜细胞，特别是 感光细胞中调控其表达的启动子序列功能性地连接，其中所述ABCA4编码序列优选选自 SEQ ID N0:1(人)和SEQ ID N0:6(鼠)或由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸序列 的序列。可根据本发明使用的合适的启动子包括CMV (SEQ ID NO: 2)、人RHO (SEQ ID NO: 3)、人ABCA4(SEQ ID NO 4)和CBA(SEQ ID NO 5)启动子、其保留转录启动子活性的片段和 变体。可按照对于本领域技术人员来说是已知的方法和使用本领域技术人员来说是已 知的技术进行AAV载体的构建。关于腺相关病毒载体的构建和治疗应用的理论和实践 已经在几篇科学和专利出版物中进行过举例说明(下列参考书目通过引用合并入本文 Flotte TR. Adeno—associated virus-based gene therapy for inherited disorders. Pediatr Res. 2005Dec ；58 (6) 1143-7 ；Goncalves MA. Adeno-associated virus :from defective virus to effective vector, Virol J. 2005 May 6 ；2 :43 ；Surace EM, Auricchio A· Adeno—associated viral vectors for retinal gene transfer. Prog Retin Eye Res. 2003 Nov ；22 (6) 705-19 ；Mandel RJ, Manfredsson FP, Foust KD, Rising A， Reimsnider S，Nash K，Burger C. Recombinant adeno associated viral vectors as therapeutic agents to treat neurological disorders. Mol Ther. 2006 Mar ； 13 (3) 463-83)ο
4
在再一方面，本发明涉及药物组合物，其包含表达ABCA4编码序列的AAV载体，优 选为适于眼施用的形式。合适的施用形式包括但不限于可注射溶液或悬浮液、眼洗剂和眼 膏。在优选实施方案中，通过视网膜下注射，例如通过在视网膜下间隙，在前房或在眼球后 间隙中注射，施用AAV载体。优选通过视网膜下方法(如Bermicelli J，等人Mol Ther. 2008 Jan 22 ；Reversal of Blindness in Animal Models of Leber Congenital Amaurosis Using Optimized AAV2-mediated Gene Transfer ΦIjfifiiSW )取决于施用途径、疾病的严重度、患者的一般状况和其他临床参数，基于个案，确 定用于治疗的病毒的剂量。一般地，合适的剂量将在IO9至IO13Vg(载体基因组)/眼。附图概述

图1. rAAV2/5-CMV-Abca4 的基因组完整性。(A) UrAAV 大量制备物(2. 5xl010GC/ 泳道)直接分离并且在碱性琼脂糖凝胶上分离的载体DNA的Southern印迹分析。泳 道1含有通过限制性酶切从PAAV2. 1-CMV-Abca4质粒获得的标志DNA片段；泳道2含有 用DNA酶I降解的与泳道1相同的DNA片段，作为DNA酶I活性的对照；泳道3和4 从 rAAV2/5-CMV-Abca4分离的基因组。泳道3中的样品用DNA酶I进行了处理。(B)体内递 送后rAAV2/5-CMV-Abca4基因组长度的估量。(上图)图示rAAV2/5_CMV_Abca4基因组和 用于Southern印迹分析的2个探针。(中图Southern印迹分析来自未注射的肌肉的基因 组DNA(泳道1和3)和等量的来自注射了 rAAV2/5-CMV-Abca4的鼠肌肉的基因组DNA(泳 道2和4)，所述基因组DNA用NcoI和NotI (泳道1和2)或单独的NcoI (泳道3和4)消 化。泳道属于相同的凝胶但不相邻。箭头指向预期大小的条带。(下图)使用特异于用作 上样对照的PDE6B基因的探针进行的Southern印迹分析。分子量示于左边。(C)对来自 转导了 rAAV2/5的Cos细胞的裂解物的Western印迹分析，其中使用抗ABCA4(上图)或 抗α微管蛋白(下图)抗体进行该分析。泳道1 来自野生型小鼠的视网膜；泳道2 使用 rAAV2/5-CMV-Abca4转导的样品；泳道3 使用rAAV2/5-CMV-EGFP转导的样品。抗α微管 蛋白用作上样对照。上样的蛋白质的量(微克，Pg)标示在各自泳道的下方。图2.在rAAV2/5递送后ABCA4的表达。Western印迹分析来自转导了 rAAV2/5的Abca4-/-视网膜的裂解物，其中使用 抗-ABCA4(上图)、抗-α微管蛋白(中图)抗体和8_叠氮基-[α-32P]-ATP标记ABCA4 (下 图)。泳道1 来自野生型小鼠的视网膜；泳道2 使用rAAV2/5-CMV-Abca4转导的样品；泳 道3:使用rAAV2/5-CMV-EGFP转导的样品。将抗-α微管蛋白用作上样对照。上样的蛋白 质的量(微克，Pg)标示于各自泳道的下方。图3.在rAAV-介导的基因转移后Abca4-/-视网膜的形态学分析。㈧使用 抗-ABCA4(Rim 3F4)抗体，免疫组织化学分析视网膜切片，所述切片来自在1月龄时视网膜 下注射了 rAAV2/5-CMV-EGFP 而在对侧眼注射了 rAAV2/5_CMV_Abca4 的 4 月龄 Abca4_/_ 色 素沉着小鼠和4月龄Abca4+/+小鼠。RPE，视网膜色素上皮；0S，外节(光感受器)；0NL, 外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。放大倍数20x. (B)电子显微镜分析来自5月龄 色素沉着Abca4-/-小鼠的视网膜色素上皮。视网膜色素上皮(RPE)来自在1月龄时视网 膜下注射了 rAAV2/5-CMV-EGFP (左)的一只眼和注射了 rAAV2/5_CMV_Abca4 (右)的对侧 眼。Ch，脉络膜；BrM，布鲁赫膜。白色箭头指示区别于更大的椭圆形黑色素体的不规则形 状的脂褐素色素颗粒。在相同的放大倍数(6，000X)获得显微照片。(C)视网膜下注射了rAAV2/5-CMV-EGFP 或 rAAV2/5-CMV-Abca4 的 Abca4_/_ 小鼠或 Abca4+/+ 小鼠(η = 2 眼 / 组)的RPE中脂褐素颗粒数(左)和RPE厚度(右)。图4.在注射了 rAAV2/5-CMV_Abca4的Abca4_/_小鼠中脂褐素水平的降低和改 善的自光感受器脱敏的恢复。(A)rAAV2/5-介导的Abca4基因转移对Abca4-/-小鼠视 网膜中脂褐素累积的影响。在4和6月龄的白化(albino)和色素沉着Abca4-/-小鼠的 视杯(eyecup)中A2E(组合的A2E和异-A2E)、atRALdi-E和atRALdi-PE的水平，所述 小鼠在出生后30天在一只眼中注射了 rAAV2/5-CMV-Abca4 (灰柱)并且在对侧眼中注 射了 rAAV2/5-CMV-EGFP(空柱)。年龄匹配的白化Balb/c小鼠和色素沉着Abca4+/+小 鼠以有条纹的柱表示。值为两个独立的样品(各自含有4个视杯)的平均值。(B)在 rAAV2/5-CMV-Abca4处理的Abca4-/-小鼠中挽救自光感受器脱敏的延迟恢复。在视网膜 下注射了 rAAV2/5-CMV-Abca4(红色三角形，η = 4只眼)或rAAV2/5_CMV_EGFP (绿色正方 形，η = 4只眼)的4月龄Abca4-/-小鼠中和在年龄匹配的野生型Balb/c小鼠(黑色圆 圈，n= 10只眼)中，漂白后b-波振幅的渐近式恢复。数据显示为平均值+/_标准误差。 星号描述了统计学上显著的差异(P ( 0. 05)。实验部分方法质粒构建体的产生为了产生编码EGFP 和 ABCA4 的 rAAV，使用 pAAV2. 1 CMV-EGFP (Auricchio, Α.， 等人 J. Μ· 2001. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single Step Gravity-Flow Column. Hum Gene Ther 12 :71_76) 和 pZac2. 1-CMV-Abca4 质粒(CMV 序列来自 NC001347. 3 的 nt 174661 至 175243)。将鼠 Abca4 cDNA(7, 268bp，包括编码序列和一些5，和3，UTR区)克隆在pZac2. 1质粒(Gao, G. , ^A J- M. 2000. Purification of recombinant adeno associated virus vectors by column chromatography and its performance in vivo. Hum Gene Ther 11 2079-2091) 的EcoRI与Sail位点之间，获得该pZac2. l_CMV_Abca4。通过用EcoRI和XhoI酶消化，自 pBluescript SK(-)Abca4 质粒，获得该 Abca4 cDNA。动物模型和载体施用按照规定的动物研究指导方针进行在动物上的所有程序。使用通过与Balb/c小 鼠[对于Rpe65 Leu450(44)是纯合的]、Shaker 1小鼠[具有4626SB等位基因，C57BL/6HNSD 背景上有效的无效突变(Gibson, F.等人，S. D. 1995. A type VII myosin encoded by the mouse deafness gene shaker-1. Nature374 62~64)]以及野生型 C57/BL6 和 Balb/ c小鼠(Harlan Italy)连续杂交和回交产生的色素沉着的(ffeng, J.，等人，G. H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt' s disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell 98 13-23) 禾口白化的 Abca4-/-(Radu, R.A.,等人，G. H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2Eoxiranes in a mouse model of Stargardt' s macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA 101 :5928_5933)小鼠。进行视网膜下或肌内注射。如所描述的(Liang， F. Q.等人，J. 2000. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods In Molecular Medicine 47 :125_139)，在1月龄Abca4_/_小鼠中进行视网膜下载体施用。对于图IB禾口 3 中描述的实验(Grieger, J. C. ， and Samulski， R. J. 2005. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. JVirol 79 :9933_9944)，使用 40 μ M 的蛋白酶体抑制剂(LnLL, Sigma Aldrich)补充视网膜下施用和肌内注射，以增加rAAV转导。对于目的在于评估AAV-介 导的形态学和功能援救(图3和4)的体内实验，不使用蛋白酶体抑制剂。在载体施用之 前，以2ml/100g体重腹膜内注射阿佛丁麻醉小鼠(Papaioannou，V. E.，和Fox, J. G. 1993. Efficacy of tribromoethanol anesthesia in mice. Lab Anim Sci 43 :189_192)。然后， 用 2μ lrAAV2/5-CMV-Abca4(l. 2x109GC)注射小鼠右眼。将相同剂量的 rAAV2/5_CMV_EGFP 递送至左眼，作为阴性对照。使用150 μ lrAAV2/5-CMV-Abca4(QxIOkiGC)在C57/BL6小鼠的 右腓肠肌中进行肌内(IM)注射。统计分析数据表示为平均值士标准误差。使用Student t_检验分析、ANOVA和多重比较 检验(对于多重性使用Bonferroni调整)确定统计学显著性，如所示。rAAV载体DNA的Southern印迹分析从2，5xl010个病毒颗粒(按基因组拷贝测量)提取DNA。为了消化未包装的基因 组，在37°C在总共250 μ 1的体积(含有50mM Tris pH7. 5和ImMMgCl2)中将载体溶液与 11 μ 1 DNA酶(Roche) —起温育1小时。然后用50mM EDTA灭活DNA酶，接着在50°C与蛋白 酶K和2. 5%N-月桂基-肌氨酸钠(sarcosil)溶液一起温育45分钟以裂解壳体。用酚-氯 仿提取DNA 2次，用2倍体积的乙醇和10%醋酸钠3M进行沉淀。如之前所述(Sambrook， J. a. D. W. R. 2001. Molecular cloning :a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY Cold Spring Harbor Laboratory Press)进行碱性琼月旨糖(Alcaline agarose)凝胶电 泳。通过用NcoI和NotI双消化pZac2. l_CMV_Abca4产生7，835bp的条带来生成标志物 (Marker)。将探针2用于鉴定rAAV2/5-CMV-Abca4 (图1B，上图)，而为了鉴定所有其他rAAV 载体DNA，使用特异于polyA序列的探针。所有探针序列可应要求获得。在用rAAV转导后肌肉基因组DNA的Southern印迹分析在IM 注射后 21 天，通过 Hirt 提取法(Yang，G. S.，等人 2002. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus :effects of viral capsid and genome size. J Virol 76 :7651_7660 ；Hirt, B. 1967.Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. JMol Biol 26:365-369)从小鼠 腓肠肌分离DNA。用NcoI和NotI或单独的NcoI降解DNA (30 μ g)，在0，8%琼脂糖凝胶上 分离，然后用探针1和2(图1B，上图)或用特异于PDE6B基因(用作上样对照)的探针进 行检测，其中探针按照厂商说明书使用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham)和 α -32-CTP放射性标记。Cos细胞的rAAV感染将Cos细胞接种在6孔板中至3xl05个细胞/孔的浓度。44小时后，细胞在 具有10 μ M蛋白酶体抑制剂的无血清DMEM中与IO5GC/细胞的rAAV2/5_CMV_EGFP或 rAAV2/5-CMV-Abca4 一起温育。48小时后，刮下收获细胞以进行Western印迹分析。通过Western印迹法分析ABCA4表达在视网膜上和用rAAV感染的Cos细胞上进行Western印迹。如所描述的
7(Auricchio,A. ,^Aj- 2002. Pharmacological regulation of protein expression from adeno-associated viral vectors in the eye. Mol Ther 6 238)月莫。
SIE缓冲液[250mM蔗糖、3mM咪唑(ρΗ7· 4)、1 %乙醇和1 % ΝΡ-40]中裂解样品30分钟，37°C 于含有8M尿素的样品缓冲液中加热30分钟使蛋白质变性，然后通过6% SDS PAGE进行分 离。在进行印迹后，使用抗_ABCA4(Santa Cruz Biotechnology)、抗-α微管蛋白(Sigma) 和抗-RGR(mcDE5，RGR用作上样对照)抗体标记特定蛋白质。在感染的Cos细胞和视网膜上进行的光亲和标记试验在用rAAV感染后48小时从Cos膜提取蛋白质。在低渗缓冲液[IOmMTris-HCl (pH 7. 4)和0. 5mM EDTA]中收获细胞。在4°C 1小时后，将样品通过28-G针以破坏细胞，然后以 16，OOOxg离心1小时。将所得的膜沉淀溶解在重悬浮缓冲液[25mM HEPES (pH 7. 5)，150mM NaCl 禾口 5mMMgCl2]中。通过在100μ 1 的 45% 蔗糖、20mM Tris-HCl (pH 7. 4) UmM EDTA、2mM MgCl2、20yM 亮抑酶肽(Leup印tin)和2mM PMSF(21)中涡旋视网膜，从视杆外节提取蛋白质。然后，以 4，OOOxg离心视网膜10分钟，收集悬浮液，使用等体积的150mM NaCl、20mM Tris-HCL(pH 7. 4) UmMEDTA和2mM MgC12进行稀释，然后以16，OOOxg再离心1小时。将外节沉淀溶解于 30 μ 1的重悬浮缓冲液中。为了进行光亲和标记试验，将来自Cos膜或视杆外节的蛋白质提取物在室温 与 4μΜ 8-叠氮基-[a-32P]-ATP(Affinity Labeling Technologies Inc.)以 10cm 的距离在紫外光(320nm)下一起温育1分钟(Sun, H.，Smallwood, P.M.，和Nathans, J.2000.Biochemical defects in ABCR protein variants associated with human retinopathies. Nat Genet 26:242-246)。然后在不加热的条件下将样品与 SDS-PAGE样品缓冲液混合，然后通过SDS-PAGE解析蛋白质。通过放射自显影术，使用 PhosphorImager (Amersham)通过放射自显影检测8-叠氮基-[α -32Pj-ATP标记的蛋白质。RPE脂褐素色素的提取和HPLC分析对来自4月龄的白化和6月龄的色素沉着Abca4-/-小鼠(在一只眼中注射了 rAAV2/5-CMV-Abca4并且在对侧眼注射了 rAAV2/5_CMV_EGFP)的视杯进行HPLC分析。来 自年龄匹配的Abca4+/+和Balb/c小鼠的视杯用作对照。将适应了黑暗的小鼠的后视杯 (Posterior eyecup)混合(4个视杯/样品)、勻浆和在氯仿/甲醇(1 1)中提取3次 (Kim, S. R.,等人 2004. Rpe65 Leu450Met variant is associated with reduced levels of the retinal pigment epithelium lipofuscin fluorophores A2E and iso-A2E. Proc Natl Acad Sci USA 101 :11668_11672)。在离心(1，OOOxg 进行 2 分钟)后，将有机 提取物过滤通过棉和反相(C8 Sep-Pak, Millipore)柱(以甲醇中的0. 1% TFA)。然后通 过在氩气下蒸发溶剂来浓缩提取物，将其再溶解于50%氯仿甲醇溶液(1或2只眼/10 μ L 溶剂)，然后使用配备有2695分离组件、2996光电二极管阵列检测器和2475多λ荧光 检测器的Alliance系统(Waters)，通过反相HPLC进行分析。为了进行层析分离，使用分 析级Atlantis dC18(3ym，4.6xl50mm，Waters)柱，利用乙腈和水梯度以及0. 三氟 乙酸(90-100 %，O-IOmin ； 100 %乙腈，10至20分钟；在430nm处进行监控；10 μ L注射体 积)。在暗红光下进行提取和注射以进行HPLC。使用Empower 软件确定积分峰面积，通 过参考合成化合物外标准和通过标准化HPLC注射体积对总提取物体积的比率来计算每视杯的皮摩尔浓度。已确证了 A2E、atRALdi-E和atRALdi-PE的合成标准的结构(Fishkin， N. Ε·,等人 2005. Isolation and characterization of a retinal pigment epithelial cell fluorophore :an all-trans-retinal dimer conjugate. Proc Natl Acad Sci USA 102 7091-7096 ；Sakai，N.，等人 J. A. C. 1996. J. Am. Chem. Soc. : 1559-1560 ；Fishkin, N.， ^A 2004. Absolute configurational determination of an all-trans-retinal dimer isolated from photoreceptor outer segments. Chirality 16 :637_641)。电生理记录在4月龄白化Abca4-/-和野生型、年龄匹配的Balb/c小鼠中进行电生理分析 (ERG)。通过甘茨菲尔德剌激器(Ganzfeld stimulator) (Lace)产生10毫秒的光闪，激起 闪光ERG(Flash ERG)。通过与之前用奥布卡因(ossibuprocaine) (Novartis Pharma)麻醉 的角膜接触的在下眼睑下插入的镀金电极记录电生理信号。将各眼中的电极参照在相应的 额区(frontal region)水平上皮下插入的针电极。将不同电极连接至双通道放大器。在 180分钟的黑暗适应后，麻醉小鼠，将其在暗红光下松松地置于立体定位仪(stereotaxic apparatus)中，体温保持在37. 5°C。然后将小鼠暴露于强度设置在300cd/m2的恒定光照 下80秒(预适应光(pre-adapting light)，漂白条件)。在预适应光后在固定的间隔(0、 5、15、30、45、60分钟)监控b波的恢复。测量预适应光照后响应led JiT2iT1闪光的b波振 幅，将其表示为相对于在预适应光照前测量的振幅的相对值。电子显微镜、组织学分析和免疫组织化学通过心脏，用2%多聚甲醛和戊二醛(于PBS(pH7.4)中)灌注小鼠。然后取 出眼球，将其在含有2%多聚甲醛和2%戊二醛的0. IM 二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)中固定 过夜。解剖固定的眼球以除去晶状体和玻璃质，留下视杯。用四氧化锇处理视杯，然后 用的醋酸双氧铀水溶液进行染色。然后将样品脱水，并且包埋在Epon-812中。在超薄 切片机上(Leica)制备相应于注射侧的各眼的太阳穴侧的薄切片。使用ULTRA VIEWC⑶数 码相机，在FEI Philips Tecnai-12电子显微镜(Philips)下，从薄切片获得EM图像。在 6，000X放大倍数下获得显微照片。对于每一只眼通过计数3个不同视野来进行脂褐素颗粒 数的定量分析，可变密度的较小结构代表脂褐素颗粒，与代表黑色素体的高电子密度的大 椭圆形结构不同。每样品在20个不同的位置进行RPE厚度测量(在细胞较厚的细胞核区 域中进行10个测量，以及在细胞较薄的细胞_细胞边界进行10个测量)。然后，计算计数 的平均值。为了进行组织学分析，收获小鼠视杯，通过将其浸入4%多聚甲醛中来固定，然后 包埋在OCT(kaltek)中。对于每一只眼，沿着水平轴(horizontal meridian)切取系列切 片(11 μ m厚)，然后将其分配在10块载玻片上以使各载玻片包括整个眼于不同水平的代表 性切片。用苏木精和伊红(Sigma-Aldrich)对切片进行染色，通过光学显微镜分析视网膜 组织学。为了进行ABCA4染色，将组织切片与封闭溶液[lx PBS，0. 5% Tween-20，0. 牛 血清白蛋白)和10%胎牛血清(GIBC0 BRL-Invitrogen) 一起温育1小时。然后使用Rim 3F4 抗体(Robert S. Molday 惠赠，University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada)温育过夜。在清洗后，将切片与缀合至HRP的二抗小鼠IgG HRP (Vector laboratory) 一起温育1小时，然后进行30分钟DAB染色(Vector laboratory)。使用苏 木精(Sigma-Aldrich)复染1分钟。使用Eukitt(Kaltek)对已染色的切片进行封片。
结果rSTCD小鼠模型中rAAV2/5施用显著改善了视网膜形态和功能基于上面的结果，我们检测了 rSTCD鼠模型中AAV2/5-介导的视网膜基因转 移的功效。在色素沉着(Weng，J.，等人，G. H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt ' s disease from the phenotype in abcr knockout mice. Cell 98 :13_23)禾口 白化(Radu, R. Α.,等人 G.H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2Eoxiranes in a mouse model of Stargardt' s macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA 101 :5928_5933)小 鼠中靶向破坏Abca4基因座(Abca4-/-)，导致重现一些rSTCD特征的表型脂褐素RPE中 的累积、更厚的RPE细胞、缓慢的光感受器变性和延迟的暗适应(Weng，J.，等人，G. H. 1999. Insights into the function of Rim protein in photoreceptors and etiology of Stargardt' s disease from the phenotype in abcr knockout mice· Cell98 :13_23 ; Radu, R· A·，等人 G· H. 2004. Light exposure stimulates formation of A2E oxiranes in a mouse model of Stargardt' s macular degeneration.Proc Natl Acad Sci USA 101 5928-5933 ；Mata, N. L. , ^A G. H. 2001. Delayed dark adaptation and lipofuscin accumulation in abcr+/_mice :implications for involvement of ABCR in age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 42 :1685-1690)。 为 了检测 rAAV2/5-介导的基因递送是否导致Abca4-/-突变表型的矫正，在1月龄小鼠的一只眼中视 网膜下注射2 μ 1的rAAV2/5-CMV-Abca4 (相应于1. 2x109GC)，而在对侧眼中使用相同剂量 的rAAV2/5-CMV-EGFP。除非另外指出，否则在3个月后(动物的年龄4个月)评估基因转 移对Abca4-/-视网膜的影响。我们最初通过视网膜切片上的免疫组织化学分析重组ABCA4 表达，发现其如内源ABCA4 —样以及如根据报导的rAAV2/5向性所预期的一样正确地定位 至光感受器外节(图3A)。然后我们评价了 rAAV2/5_介导的基因转移对Abca4-/-RPE异常，例如存在脂褐 素颗粒和更厚的RPE，的影响。对位于注射区域中的RPE细胞的电子显微镜分析显示，与用 rAAV2/5-CMV-EGFP处理相比较，用rAAV2/5_CMV_Abca4处理的Abca4_/_视网膜中脂褐素 颗粒的数目减小并且RPE厚度减小(两者与在Abca4+/+RPE中看到的相似)(图3B和C)。 这表明rAAV2/5介导的Abca4基因转移改善了与Abca4-/-表型相关的RPE超微结构异常。与ABCA4 在 N-亚视黄基-磷脂酰乙醇胺(N-retinylidene-phosphatidylethanol amine)跨光感受器盘膜的转运中的作用相一致(Sun，H.，等人J. 1999. Retinal stimulates ATP hydrolysis by purified and reconstituted ABCR, the photoreceptor—specific ATP—binding cassette transporter responsible for Stargardt disease. J Biol Chem 274 8269-8281 ；Beharry, S. , ^ Λ 2004. N-retinylidene-phosphatidylethanola mine is the preferred retinoid substrate for the photoreceptor—specific ABC transporter ABCA4 (ABCR). J Biol Chem 279 :53972_53979)，存在于 Abca4_/_ 小鼠的 RPE 中的脂褐素颗粒包含双类视黄醇(bisretinoid)荧光团A2E、全反式视黄醛二聚体-乙醇 胺(atRALdi-E)和全反式视黄醛二聚体-磷脂酰乙醇胺(atRALdi-PE) (Fishkin, N. Ε.， 等人 2005. Isolation and characterization of a retinal pigment epithelial cell fluorophore :an all-trans-retinal dimer conjugate. Proc Natl Acad Sci USA 102 7091 7096)。与EGFP-处理的对侧眼相比较，在用rAAV2/5_CMV_Abca4处理的白化(年龄4 个月)和色素沉着(年龄6个月)Abca4-/_视网膜中荧光团A2E、atRALdi-E和atRALdi-PE 的水平均显著降低(图4A)。此外，与对照EGFP-处理的视网膜相比较，Abca4-/-光感受器 自光脱敏恢复的能力在用该治疗性载体治疗的视网膜中得到显著改善(图4B)。视网膜切 片的苏木精和伊红染色在Abca4或EGFP-处理的眼中未显示任何炎症性浸润或外核层厚度 的减小。
权利要求
具有AAV5壳体的重组腺相关病毒(AAV)载体，所述载体载有包含编码功能性ABCR蛋白的核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子有效地连接至指导其转录和翻译的调节控制元件上，所述载体用于在罹患ABCA4基因突变相关疾病的受试者中治疗视网膜异常和/或视网膜功能障碍。
2.权利要求1的重组AAV载体，其用于在罹患ABCA4基因突变相关疾病的受试者中治 疗视网膜异常和/或视网膜功能障碍，其中所述疾病选自隐性Stargardt病、视锥视杆营养 不良、色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性(AMD)。
3.权利要求1的方法，其中具有AAV5壳体的所述载体能够包装多达9kb的核酸。
4.权利要求3的重组载体，其为AAV2/5。
5.权利要求1的重组载体，所述载体载有表达盒，在所述表达盒中ABCA4的编码序列与 能够在哺乳动物视网膜细胞中调控其表达的启动子序列功能性连接。
6.权利要求5的重组载体，其中所述ABCA4的编码序列由SEQIDNO 1或编码与SEQ ID NO :1相同的氨基酸序列的序列组成。
7.权利要求5的重组载体，其中所述启动子序列选自SEQID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5、其保持转录启动子活性的片段或变体。
8.包含如权利要求1至7中定义的重组载体的药物制剂，其为适于经眼施用的形式。
9.权利要求8的药物组合物，其为可注射溶液的形式。
10.用于在罹患ABCA4基因突变相关疾病的受试者中矫正视网膜异常和/或视网膜功 能的方法，所述方法包括步骤1)提供具有AAV5壳体的重组腺相关病毒(AAV)载体，所述载体载有包含编码功能性 ABCR蛋白的核酸分子的表达盒，其中所述核酸分子与指导其转录和翻译的调节控制元件有 效连接；2)使用所述重组AAV载体转导感光细胞，由此在所述细胞中诱导ABCR蛋白的表达。
11.权利要求10的方法，其中所述受试者是人。
12.权利要求10的方法，其中所述疾病选自隐性Stargardt疾病、视锥视杆营养不良、 色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性(AMD)。
13.权利要求10的方法，其中具有AAV5壳体的所述载体能够包装多达9kb的核酸。
14.权利要求13的方法，其中所述载体是AAV2/5血清型。
15.权利要求10的方法，其中具有AAV5壳体的所述重组腺相关病毒(AAV)载体载有表 达盒，在所述表达盒中ABCA4的编码序列与能够在哺乳动物视网膜细胞中调控其表达的启 动子序列功能性连接。
16.权利要求15的方法，其中所述ABCA4的编码序列由SEQIDNO 1或编码与SEQ ID NO 1相同的氨基酸序列的序列组成。
17.权利要求15的方法，其中所述启动子序列选自SEQID NO :2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，其保持转录启动子活性的片段或变体。
18.权利要求10的方法，其中通过视网膜下施用所述载体或其药物物制剂来进行感光 细胞的转导。
全文摘要
本发明公开通过给有需要的受试者施用编码ABCR蛋白的腺相关病毒载体来治疗ABCA4基因突变相关疾病的方法；用于该方法的基因构建体和腺相关病毒载体。
文档编号C07K14/705GK101952307SQ200980105653
公开日2011年1月19日 申请日期2009年2月23日 优先权日2008年2月21日
发明者A·奥里基奥 申请人:电视募捐基金会