疫苗组合物的制作方法

专利名称：疫苗组合物的制作方法
疫苗组合物本发明涉及用于在受试者中诱发针对甲型流感病毒具有保护性的免疫应答的疫苗组合物。本发明还涉及用于家禽和其他禽类的针对高致病性禽流感H5m的接种的组合物。 流感是由正粘病毒科(Orthomyxovihdae)的RNA病毒引起的哺乳动物和禽类的传染病。一般地，其通过咳嗽和打喷嚏产生含病毒的气雾(aerosol)从被感染的动物以及通过其粪便从禽类传播。所述疾病还可通过与被感染的受试者的体液和与已被这类体液污染的表面接触传播。术语“禽流感病毒”通常被理解为意指甲型流感病毒，因为野生禽类是甲型流感病毒的天然宿主。一些甲型株被称为低致病性的，因为此类株(LPAI病毒)通常具有低毒力， 虽然它们作为高致病性株(HPAI病毒)的前体(progenitor)。甲型流感H5m亚型的高致病性株在东南亚的禽类中是地方性的并且被认为代表长期世界性大规模疫病流行的威胁。这些株是在家禽例如鸡与火鸡之间传染性很强。疾病在通常将禽类彼此紧密接触集中饲养的家禽农场中爆发已导致100%的禽类死亡率。流感病毒在其表面具有两种主要的抗原性糖蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)(也称为唾液酸酶)。HA的主要功能是结合上呼吸道的细胞膜上和红细胞的表面上的唾液酸受体位点和促进病毒基因组进入宿主中的靶细胞。NA具有帮助和促进子代病毒从被感染的细胞释放的功能以及还在促进病毒进入宿主细胞中起作用。制药工业已产生了用于抵抗流感感染的神经氨酸酶抑制剂。此类抑制剂通过阻止或抑制病毒神经氨酸酶行使其功能起作用。此类神经氨酸酶抑制剂的实例包括扎那米韦 (Zanamivir)和奥塞米韦(Oseltamivir)("达菲“)，它们通过阻断病毒神经氨酸酶在从被感染的细胞释放子代病毒颗粒中的活性起作用。不幸地，使用此类化合物的药物疗法通常在疾病被临床识别后是无效的，因为到此时病毒已得到良好确立。此类化合物在家禽治疗中的预防性使用对于家禽饲养场主，特别是其中H5W是地方性的地域的区域中的家禽饲养场主来说通常太昂贵了。本发明的目的是提供可用于针对甲型流感感染的预防性治疗的大规模免疫计划的高性价比的疫苗。因此，本发明提供了含有灭活的甲型流感病毒抗原和细菌唾液酸酶的疫苗组合物。令人惊讶地，已发现向疫苗组合物中掺入细菌唾液酸酶具有增加疫苗效价的作用。虽然我们不希望受理论束缚，但细菌唾液酸酶的增效作用可能因通过唾液酸酶从存在于宿主上皮表面上的唾液酸化膜糖脂选择性除去唾液酸(从而阻止任何流感病毒结合在这些唾液酸受体位点上)而引起。通过阻止病毒进入宿主的易受攻击的细胞，为由疫苗组合物中的抗原诱发的宿主的免疫应答提供更多时间来抵抗攻击性流感病毒。此外，细菌唾液酸酶本身在宿主中可具有抗原性作用，从而可利用宿主的免疫系统诱发可具有抗流感神经氨酸酶作用的抗细菌唾液酸酶抗体的产生。已纯化和表征了许多不同的细菌唾液酸酶。用于本发明的疫苗组合物的细菌唾液酸酶通常为不需要为了活性而存在任何金属离子并且可来源于任何适当的细菌来源的唾液酸酶。取决于种，细菌唾液酸酶通常具有67 kD至90kD范围内的分子量。唾液酸酶的适当来源的实例包括铜绿假单胞菌i^Pseudomorms)、产气荚膜梭菌
{Clostridium(.Clostridium cAa歸ei )和败血梭状芽
孢杆菌(CVosirii/i Septicum^0优选，细菌唾液酸酶获自产气荚膜梭菌，更优选获自A 型产气荚膜梭菌菌株107 (高唾液酸酶菌株)。细菌唾液酸酶包括产气荚膜梭菌唾液酸酶白勺)iz^生 / 纯Ulil James Τ. Cassidy ^A ； Purification and Properties of sialidase from Clostridium perfringens \ J. Biol. Chem；第 240 卷，No. 9，September 1965, ρ 3501-3506进行了论述。在本文中在下列实施例中描述了来自A型产气荚膜梭菌菌株107 的唾液酯酶的纯化样品的制备。根据本文中使用的方法，处理培养的细菌细胞以产生用福尔马林处理的产气荚膜杆菌类毒素，接着用硫酸铵处理该类毒素，然后通过透析浓缩来产生纯化的酶。如上所述，用于本发明的优选实施方案的生产中的产气荚膜杆菌唾液酸酶组分包含类毒素。已知产气荚膜杆菌α毒素的非类毒素化形式(non-toxoided form)具有溶血性和坏死性并且是鸡中传染性坏死性肠炎的原因。据信，本发明的疫苗组合物中产气荚膜杆菌唾液酸酶的使用在对其施用疫苗组合物的鸡中具有提高对传染性坏死性肠炎的抗性的额外作用。用于本发明的疫苗组合物的灭活的甲型流感抗原可以是来源于灭活的甲型流感病毒的任何抗原性材料。例如，其可包含灭活的完整病毒颗粒。可选地，其可包含其中免疫原性蛋白质例如M2离子通道蛋白或糖蛋白得到保留的破裂病毒(disrupted virus)(裂解病毒，split virus) 0甲型流感病毒膜糖蛋白血细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA) 的纯化制剂可用作疫苗组合物中的抗原性材料。根据本发明的疫苗组合物可包含一种或多种类型的此类抗原性材料。用于制备疫苗组合物的甲型流感病毒当然将取决于所述疫苗的受者将被保护免受其害的甲型流感。鉴于由H5W造成的威胁，优选疫苗组合物包含来源于甲型流感病毒H5W亚型的至少一个株的灭活的抗原性材料。更优选，疫苗组合物可包含来自超过1个H5W株的灭活的抗原性材料，以便在受试者中诱发抗循环中不同H5W株的更广泛的保护作用。疫苗组合物可包含任何一种或多种适当的载体、赋形剂、稳定剂或其他添加剂，这在本领域内是常规的。由于流感病毒进入宿主细胞的主要点是通过上呼吸道中的粘膜表面，因此本发明的优选实施方案是使疫苗组合物适合于粘膜施用，更优选适合于鼻内施用，鼻内施用的疫苗当然是公知的并且本领域技术人员的共同一般知识教导可如何制备用于鼻内施用的疫苗。疫苗领域中也公知的是将佐剂与疫苗的抗原性组分结合使用。佐剂是在受试者中增强对抗原的免疫应答的物质。除了抗原性材料以外，还已使用壳聚糖(以利用其加强穿过粘膜上皮的跨细胞和细胞旁转运的能力)制备适合于粘膜施用的疫苗，特别是适合于鼻内施用的疫苗。壳聚糖是赋予一类通过壳多糖的去乙酰化作用制备的阳离子多糖的通用名称。壳多糖是在海洋甲壳类动物的外骨骼中丰富存在的天然生物聚合物。壳聚糖是线性阳离子聚电解质，其是无毒的、生物可降解的和生物相容的并且是白色或灰白色无定形半透明固体(该固体在稀释的有机酸中是可溶的)。壳聚糖可有利地以无毒性酸加成盐例如盐酸壳聚糖的形式使用，该盐形式比壳聚糖更可溶。此类材料可从NovaMatrix获得。根据特别优选实施方案，本发明提供了用于鼻内施用的疫苗组合物，其包含灭活的甲型流感抗原、细菌唾液酸酶和壳聚糖。壳聚糖通常是脱乙酰壳多糖，其至少70%脱乙酰化，优选至少80%脱乙酰化。壳聚糖(大于75%脱乙酰化)可从Sigma-Aldrich获得。可以以有效地刺激对鼻内施用的甲型流感病毒抗原的免疫应答的任何量使用壳聚糖。用于本发明的疫苗组合物的壳聚糖的常见浓度基于水相疫苗组合物的体积按重量计在0. 05至5%，优选0. 1至2. 0%，更优选0.2至1.0%的范围内。 可按照本领域内已知的方法将本发明的疫苗组合物，包括配制用于鼻内施用的疫苗组合物，配制为液体或干粉。优选，可将疫苗组合物配制为液体，尤其是水相分散系、悬浮液或溶液，以作为滴剂或气雾剂施用。本发明的疫苗组合物在水相体系(aqueous system) 中的使用是特别优选的，因为这使得可能进行有效的大规模接种计划(mass vaccination programme),由此可通过微滴或喷雾施用快速且相对便宜地治疗大量禽类。鼻内施用，例如通过对待治疗的禽类的一个鼻孔施用一滴水相疫苗，可由不熟练的操作者容易地在实地进行。此外，由于因鼻内接种而引起的增加的粘膜IgA水平，从而使得能够产生抗天然感染途径的随后保护作用。当将壳聚糖在本发明的水相疫苗组合物中用作佐剂时，其是有益的，以便维持壳聚糖在水介质中的溶解性同时确保疫苗的抗原组分免受不利的影响，确保所述水性疫苗组合物具有约5. 0至6. 5范围内的pH，优选约5. 0的pH。将以有效地诱发对甲型流感病毒的免疫应答的量给受试者施用本发明的疫苗。确定将给受试者施用的适当和有效的剂量在本领域技术人员的能力和知识范围内。虽然被施用疫苗的受试者可以是人，但本发明的优选实施方案是配制用于给禽类特别是家禽施用的疫苗。如下列实施例中所显示的，使用对一个鼻孔以0.03 ml —滴的鼻内施用单剂量(含有(每0.03 ml剂量)悬浮于0. 5% w/v壳聚糖溶液中的100个病毒HA单位，122个产气荚膜梭菌唾液酸酶单位)的液体疫苗来实现家禽的抗H5W Al病毒的成功接种。根据本发明，将细菌唾液酸酶掺入含有灭活的流感抗原的疫苗具有增加疫苗的效价的作用。因而，根据其他方面，本发明涉及细菌唾液酸用以提高疫苗，特别是鼻内施用的含有灭活的流感抗原的疫苗的效价的用途。本发明还涉及通过加入细菌唾液酸酶提高此种疫苗的效价的方法。实验方法
1.灭活的病毒抗原的制备
在11日龄孵育的无特定病原鸡胚中繁殖从被感染的鸡分离和鉴定的高致病性H5m同株。使用含有128个HA单位/25 μ 1的工作种子病毒，通过用0. 2ml在磷酸缓冲盐溶液pH 7.4 (PBS) +卡那霉素20mg/ml中的1/1000稀释物注射至每一个胚的尿膜囊(allantoic sac)内来接种胚。然后将鸡胚在37°C下孵育72小时。在25至27小时内记录下胚胎死亡。将死亡的胚胎在4°C下冷冻，收集尿囊液，以3000 rpm离心15分钟使尿囊液澄清， 以除去不需要的碎片。离心后，弃去沉淀的物质，含病毒的上清液经测试显示具有血细胞凝集活性(通过引起鸡红细胞的凝集)。通过加入0. 1%福尔马林，然后在37°C孵育18小时来处理上清液以灭活病毒。然后在4°C下持续搅拌的情况下，用0. 5% ν/ν氯仿裂解病毒，进行18小时。在28°C于IOOmbar的真空下进行2小时除去残留的氯仿，并且就血细胞凝集活性再测试样品。通过用0. 2ml的灭活的病毒悬浮液接种11日龄的孵育的鸡胚来证明毒力的丧失。 全部胚胎在于37°C下再孵育5天后仍然活着。通过过滤使病毒液体澄清，将其于-20°C下贮存。2.细菌唾液酸酶的制备
(a)通过组合如下物质制备培养基
Oxoid L37 蛋白胨 2%
水解乳蛋白1 %
酵母提取物0. 5%
NaCl 1.0%
加水至4. 0升的体积
将培养成分(PH 7. 4)置于IOL Pyrex瓶中并且在121°C下高压灭菌30分钟。向高压灭菌的培养成分中加入葡萄糖水溶液(50% w/v无菌葡萄糖水溶液)以在终培养基中产生 1. 0%的葡萄糖含量。然后将培养基快速冷却至37°C以保持还原条件。通过在Robertson煮肉肉汤中重建冷冻干燥的种子来制备A型产气荚膜梭菌菌株 107的接种物。向400ml培养基中加入接种物，然后将其加回大批培养基至4. OL的总体积。 在3个半小时的生长期中通过加入5/N NaOH来使培养基的pH维持在7. 0，并且将温度维持在37°C。在生长期后，冷却培养物，离心以除去细胞和其他固体物质。收集上清液，向其中加入0. 6% ν/ν福尔马林，将用福尔马林处理的溶液在37°C下孵育18小时以形成类毒素。利用下列方法测定产气荚膜梭菌类毒素中受体破坏酶(RDE)即唾液酸酶的滴度。 使用96孔U形底微量培养板，在12个孔中于pH 5. 5磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行类毒素的二倍稀释，在每一个孔中每一个稀释度留下25 μ 1。向孔中的每一个稀释物中加入25 μ 1 1%的pH 7.4 PBS中的经洗涤的鸡红细胞(RBC)，然后轻轻地混合每一个孔的内容物。让唾液酸酶在28°C下吸附至RBC，进行1个半小时。向每一个孔中加入25 μ 1 4个HA单位的福尔马林灭活的H5W血细胞凝集素，将每一个孔的内容物放置3小时，将温度保持在28°C。 然后研究每一个孔的内容物，记录抑制鸡RBC凝集的类毒素的最高稀释度。将凝集的抑制程度(即，酶的滴度)记录为抑制凝集的类毒素的最高稀释度的倒数，发现其为1024个RDE 单位 /25 μ 1 (40960 个单位 /ml)。按照下列方法纯化和浓缩如上所述制备的产气荚膜梭菌类毒素。向类毒素中加入50% w/v硫酸铵。弃去产生的沉淀，保留上清液以待进一步处理。向上清液中加入另外的35% w/v的硫酸铵(至饱和)，让混合物静置12小时。在静置后，发现混合物含有褐色固体。当该固体漂浮至溶液的表面时通过撇取其来收集其。然后将收集的固体溶解于蒸馏水中，将其用蒸馏水透析8小时以除去残留硫酸铵。然后按照已知的技术，通过使用聚乙二醇 (PEG)(分子量20，000)进一步透析来浓缩透析物，之后将其在-20°C下贮存。使用上述用于测定RDE滴度的方法，测定了如上所述制备的纯化和浓缩的物质的RDE滴度。3.壳聚糖原液
将85%的螃蟹来源的脱乙酰化壳聚糖(NovaMatrix)在1% ν/ν pH 5.0醋酸水溶液、醋酸钠缓冲液中配制为0. 5% w/v的溶液，通过将其在紧密的密封瓶中于121°C下高压灭菌20 分钟来进行灭菌。
4.疫苗的制备
向每100，000个HA单位的如上制备的灭活的病毒中加入3.0 ml (122880个RDE单位)的产气荚膜梭菌唾液酸酶(未纯化的，未浓缩的)制剂。通过在4°C下搅拌1小时混合灭活的病毒和细菌唾液酸酶。然后通过加入0.5% w/v的醋酸/醋酸盐缓冲的无菌壳聚糖 CpH 5. 0)将混合物补足至30ml的总体积，然后在4°C下再搅拌1小时。测试最终的大批疫苗的无菌性，将其置于无菌的30 ml聚丙烯瓶中，该瓶中引入递送每滴0.03 ml的滴嘴(dropper nozzle)。因此，每一个0.03 ml的剂量由悬浮于0. 5% w/ ν无菌壳聚糖pH 5.0中的100个HA单位的病毒和约122个RDE单位的细菌唾液酸酶组成。实施例1
A.使用无细菌唾液酸酶的普通疫苗的IgA反应
在一组鸡中研究IgA血清学反应，已通过向一个鼻孔中施加一滴30 μ 1的水相疫苗来接种该组的每一只鸡。所述水相疫苗包含(a)在鸡胚中制备的且随后用福尔马林灭活的同源(homologous) H5W和(b)商购壳聚糖(85%脱乙酰化)。每30 μ 1剂量的灭活的病毒的水平是结合0.4% w/v 85%脱乙酰化壳聚糖的100个HA单位。用于本实施例的鼻内疫苗因而不包含任何细菌唾液酸酶。疫苗的pH为5. 0。将总共30只9周龄的产蛋鸡用于实验中。首先在12日龄时用鼻内疫苗接种鸡。 使用相同的疫苗在9周龄进行第二次接种。将鸡分成6组，每一组由每组5只鸡组成。在9周时期接种之前，从第一组获得气管拭子(tracheal swab)。如下文中所示，在9周时期接种后在不同时期从其他组获取气管拭子。Pre 在接种前从组I获得气管拭子
1在接种后1周从组II获得气管拭子
2在接种后2周从组III获得气管拭子
3在接种后3周从组IV获得气管拭子
4在接种后4周从组V获得气管拭子
5在接种后5周从组VI获得气管拭子
使用酶联免疫吸附测定检测鼻内接种的鸡的粘膜IgA反应。用于ELISA的试剂、条件和装置如下 ELISA
包被 Ag:灭活的 Al (H5N1 )病毒(256 HA), 1 1600
样品稀释于300 μ 1 PBS的气管拭子
取样每周一次(在接种后5周前)
封闭TEN (Tris 碱，EDTA, NaCl) +0.2% 酪蛋白过夜
缀合物1:1500 (山羊抗鸡 IgA-HRP (Bethyl Lab, Inc)
底物ABTS
ELISA 读数器在 415 nm 的 Titertek EX
显示为405 nm处的光密度的根据ELISA的结果(5个样品的平均)如下 组1 (接种前) 0. 33 组2 (接种后1周)0.44组3 (接种后2周)0.31 组4 (接种后3周)0.33 组5 (接种后4周)0.37 组6 (接种后5周)0.4 这些结果也图示于

图1中。结果通过在接种后2至5周的时期内递增的获自免疫的禽类的鼻洗出液中IgA的出现证明了粘膜应答。接种后第一周内IgA的早期产生可能解释在患病群体上进行的干预中观察到的快速疾 病控制。在未免疫的组中存在可能来自母源卵内抗体(maternal in ovo antibody)的IgA的背景水平。实施例2
用本发明的疫苗鼻内接种的鸡中的IgA反应
将24只20周龄的鸡(从无特定病原的蛋孵育的)用于本实施例。将鸡分成6组，每组包括4只鸡。第一组鸡不接种。通过对一个鼻孔施用一滴30 μ 1的液体疫苗鼻内接种其他组中的每一只鸡。液体疫苗包含(a)在鸡胚中制备并且随后用福尔马林灭活和用氯仿裂解的同源H5m，(b)商业壳聚糖(85%脱乙酰化)和(c)获自A型产气荚膜梭菌菌株107 的细菌唾液酸酶。组分(b)与实施例中1所使用的相同。按照上述实验方法制备组分(c) (唾液酸酶)。鼻内疫苗在每30 μ 1的剂量中包含悬浮于0. 5% w/v壳聚糖(85%脱乙酰化)，pH 5. 0中的100个HA单位的病毒和122个单位的产气荚膜杆菌唾液酸酶。如下从鸡获得气管拭子 组1 未接种的
组2 :接种后1周组3 :接种后2周组4 :接种后3周组5 :接种后4周组6 :接种后5周
将每一个拭子的内容物洗提于0.4 ml PBS +抗生素(卡那霉素-10 mg/ml)中，然后于4°C下贮存。利用ELISA检测鸡(未接种的和鼻内接种的)的粘膜IgA反应。按照由Bethyl Laboratories Inc.对于禽类IgA的检测所描述的测试方法进行ELISA。用于ELISA的试齐U、条件和装置如下所示。ELISA 方法
微量培养板Nunc Maxisorp, U形底96孔
包被抗原裂解病毒1/200的4HA，稀释于碳酸盐缓冲液pH 9. 6中。于4 °C下保持过夜。使用0. 2%酪蛋白进行封闭过夜。将粘膜样品稀释至1/5，在室温下振荡1小时。缀合亲和纯化的HRP缀合的抗IgA (Bethyl Lab) 1/2000，在室温下振荡1小时。底物ABTS 在415 nm读数。
显示为在405 nm记录的光密度的根据ELISA的结果(平均值)如下 对照缀合物OD (未加入样品)0. 065
组1 (未接种的)0.674
组2 (接种后1周)0. 7325
组3 (接种后2周)O·8375
组4 (接种后3周)0.851
组5 (接种后4周)0.8385
组6 (接种后5周)0.7910
这些结果图示于图2中。测试的鸡中对单个30 μ 1剂量的含有细菌唾液酸酶的鼻内疫苗的免疫应答产生比在实施例1中给予双倍剂量的普通疫苗(无裂解病毒和无细菌唾液酸酶)的鸡中观察到的 IgA水平更高的IgA水平。由如利用ELISA测量的升高的粘膜IgA水平指示的免疫应答显示鼻内施用至缺乏特异性免疫力(immunologically na ve)的鸡的含有细菌唾液酸酶的疫苗提供了比使用不含细菌唾液酸酶的鼻内疫苗获得的保护水平更高的保护水平。实施例3
参观已报导和鉴定了 HP H5W禽流感暴发的商业种鸡场。在所有情况下，死亡率已达到令人担忧的水平。疾病的特征在于根据以前的经验将导致100%死亡率的快速传播。通过对一个鼻孔施用30 μ 1 一滴的如上所述制备的本发明的疫苗来鼻内接种每一个群体中的每一只禽类。每一个30 μ 1剂量包含悬浮于0. 5% w/v壳聚糖PH 5.0中的 100个HA单位的灭活的裂解病毒和122个RDE单位的细菌唾液酸酶。1.农场 Α: 禽龄20天
Al接种无
死亡率每天约500只
总群体25，000只
干预时的全部损失约5000只
使用本发明的鼻内疫苗
死亡在3天内停止。2.农场 B 禽龄> 5个月
接种史在第5周时肌内(IM)接种疫苗H5m RE 1(商业疫苗)，在第15周时重复接
种
死亡率约500只禽类/天
在暴发时施用本发明的鼻内疫苗加IM H5m RE 1 (商业疫苗) 死亡继续，20%存活。3.农场 Cl 禽龄6个月
接种史在第6周时肌内施用H5N2(商业疫苗)，在第16周时重复施用死亡率约1000只/天在暴发时施用本发明的鼻内疫苗加IM H5N2(商业疫苗) 死亡继续，无存活者。4.农场 C2:
禽龄< 4个月
接种史在第5 周时IM接种疫苗H5N2 (商业疫苗) 在暴发时只施用本发明的鼻内疫苗死亡在5天内终止。讨论
我们已显示在现有禽流感暴发期间，利用鼻内施用的本发明的疫苗的干预可显著地影响圈养在集约化养殖系统(intensive breeding system)中的所有年龄的家禽的病程。我们还从上述干预中证明鼻内疫苗的使用在2至5天内有效地控制了疾病。·在其中本发明的鼻内疫苗以及商业肌内和皮下疫苗同时使用的情况下，控制失败并且疾病继续。·在其中只进行鼻内疫苗施用的情况下，观察到完全控制并且死亡率在2至5天内终止。结论
家禽中高致病性禽流感病是特急性的。在被感染的群体中，观察到急剧上升的死亡率。 在此类暴发中，一部分禽类被亚临床感染，虽然它们未显示明显的临床疾病。参考上述农场B和C。此处农场主对独立使用的本发明的鼻内疫苗的功效持保留意见并且决定同时用商业肌内或皮下疫苗接种全部禽类，结果该操作将病毒从亚临床感染的禽类传播至整个群体。本发明的鼻内疫苗主要用作产生高水平IgA (从而防止病毒通过天然传染途径进入)的屏障。因此，其在短时间内不能对通过多剂量自动注射器的针头机械引入的病毒具有任何作用。然而，当在农场A和C2中用作单一干预时，不存在通过使用多剂量自动注射器产生的活病毒的意外传播(incidental transmission)，且进一步的天然传播在2至5天内被控制以及死亡完全终止。上述实地经验清楚地证明本发明的鼻内疫苗通过在暴发之前和期间刺激普通粘膜免疫系统以防止活病毒进入易感禽类，阻止病毒进入和诱发粘膜IgA的产生作为一线防御的作用。实施例4
在6，700只产蛋鸡的群体(breed Hi sex)(其形成60，000只禽类的总群体的部分)中， 当发现17只鸡死亡时异常死亡率开始。在观察到该异常死亡率的时间点上，群体中所有鸡为28周龄。17只鸡死亡的原因被鉴定为HP H5W感染(通过快速诊断测试确认的)。观察到随后随着群体的死亡率因感染的传播而增加，群体中鸡的蛋产量开始下降。在首次观察到异常死亡率的当天后第6天，611只鸡死亡。在该天，在实验方法中使用如上所述制备的疫苗接种群体所有存活的鸡。通过对一个鼻孔施用30 μ 1—滴给每一只鸡鼻内施用疫苗。 每一个30 μ 1剂量的鼻内疫苗包含悬浮于0. 5% w/v壳聚糖水溶液(85%脱乙酰化的)pH 5. 0中的100个病毒HA单位和122个单位的来自A型产气荚膜梭菌菌株107的唾液酸酶。 在接种后，死亡率开始下降并且在接种后第5天(在首次观察到异常死亡率后第11天)只有 3只鸡因感染而死亡。随后观察到蛋产量的增加。血清的血细胞凝集抑制(HI)滴度在对鸡施用疫苗后20天增加至峰值。为了阻止疾病至禽类主群体(最初总共60，000只)的传播，用鼻内疫苗(如上所述的疫苗组合物和剂量)接种主群体中的所有剩余的禽类。未观察到因H5m感染引起的死亡。图3分别显示随时间的鸡死亡率、蛋产量和血细胞凝集抑制。图3中显示的结果可部分地由接种后IgA的早期产生来解释。然而我们认为对接种的应答也表明细菌唾液酸酶具有重要的作用。该作用可能由细菌唾液酸酶的作用导致， 该酶以经典的催化酶和底物模式作用于接种的禽类的粘膜上皮上的唾液酸化细胞受体以使这些受体不能被进入的病毒识别，从而阻止病毒附着和随后的内吞作用。A. Gottschalk 禾口P. E. Lind, British Journal of Experimental Pathology,第XXX卷，No. 2, April 1949 和 G. K. Hirst, J. Exp. Med.，1942，August 1; 76(2)，195-209 已报导吸附至鸡 RBC的流感病毒在一段时间后自发洗脱(从而使病毒保持功能完整)，但RBC发生不可逆地改变并且抗进一步的吸附。对于唾液酸酶可发生相同的作用，其中在完成酶/底物后，唾液酸酶被释放以重复其作用。这样的作用可解释在接种后2至5天的时期内观察到的死亡率的逐渐下降。在接种时，一些禽类已被亚临床感染，从而接种不能阻止其死亡。通过胚胎接种和PCR检查，每月从接种的禽类获取的粪便拭子未能分离或显示AI 病毒，从而表示病毒接种后全身清除。实施例5
调查在12日龄时接种的鸡的血清学反应。在所有下列调察中，在实验方法中使用如上所述制备的疫苗组合物进行接种。对每一只鸡(12日龄)鼻内施用一个0.03 ml剂量的水相疫苗组合物，其包含悬浮于0. 5% w/v壳聚糖(85%脱乙酰化的)pH 5. 0中的100个病毒 HA单位和122个单位的来自A型产气荚膜梭菌菌株107的唾液酸酶。通过对每一只禽类的一个鼻孔施用0. 03ml 一滴的疫苗组合物进行接种。调查编号1
在12日龄时接种13只肉鸡，在32日龄时从采自鸡的血清样品测定HI Al滴度。结果示于下面的表1中。表 1
鸡的编号HI滴度(Iog 2)
2 0 2 2 23
65
1 6 HI Al滴度(log 2)的平均值为3. 54 变异系数(CV)为57. 24%。调查编号2
在12日龄时接种6只产蛋鸡，在28日龄时从采自鸡的血清样品测定HI Al滴度。结果示于下面的表2中。表 2
鸡的编号HI滴度(Iog 2)1O
13
44
HI Al滴度(log 2)的平均值为3. 17 % CV 是 50. 59。调查编号3
在12日龄时接种3只产蛋鸡，在21日龄时从采自鸡的血清样品测定HI Al滴度。结果示于下面的表3中。表 3
鸡的编号HI滴度(log 2)
140
1 2
13 8 4
25 4 6 HI Al滴度(log 2)的平均值为2. 37 % CV 为 101. 39。上述表1、2和3中显示的结果表示如通过血细胞凝集抑制测试测量的体液IgG 抗体反应。虽然疫苗的主要活性是分泌型IgA的快速产生和共同粘膜免疫系统(common mucosal immune system,CMIS)的刺激，但上文中报导的调查显示也产生体液抗体。血清转化的禽类的抗体滴度在被0. I. E.(世界动物健康组织)认为是抗体的保护性水平(即 2 log 2)的可接受限度内。观察到免疫记忆的其他证据，其中意外暴露由HPAI引起的自然感染的在12日龄时接种的禽类存活。实地经验确认2至5天内感染的控制(实施例3和4以及图3)是本发明的疫苗组合物的作用的共同特征。分泌型IgA的产生促成有效的阻断作用并且，如实施例5中所证明的，IgG的全身性产生也发生。然而，2至5天的控制不能完全由这些作用解释，尤其因为仅IgG的低全身性产量(如实施例5的表1、2和3中举例说明的)将不足以对暴露的禽类感染的终止具有直接作用。此外，假定在实施例3的农场B和Cl中的禽类(所述禽类已被自然感染或意外感染)中已发生的低产量的IgG不能控制疾病。我们相信，除了粘膜上皮上的受体位点被唾液酸酶占据以外，这些降解的位点一定被淋巴细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞识别，这导致细胞介导的免疫系统的建立成为控制芽生病毒例如正粘病毒HP H5N1的主要因素。已报导在使用本发明的鼻内疫苗接种的12日龄禽类中，接种后花费至少10周达到高循环IgG HI抗体水平(大于64个HI单位)。这是中和已逃避一线粘膜防御但在第一次接触的位点上几乎没有什么用处的病毒所期望的。细胞毒性T细胞是株特异性较低的并且显示可具有中和通常遇到的次典型 (sub-typical)突变体的益处的更广泛的交叉反应。当暴露于来自仅相隔20米的邻近农场的感染时，在已对农场上的家禽使用两次本发明的疫苗的鼻内施用的农场中展示了该保护性细胞介导的免疫的证据。在所述农场上在鼻内接种的家禽中未看到死亡，然而邻近的农场遭受大量禽类损失。实地经验确认如此接近 另一个农场的接触传染将百分之百地肯定到达邻近处所。
权利要求
1.包含甲型流感病毒抗原和细菌唾液酸酶的疫苗组合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述细菌唾液酸酶选自铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、鸣疽梭状芽胞杆菌或败血梭状芽胞杆菌的唾液酸酶。
3.权利要求2的组合物，其中所述细菌唾液酸酶是A型产气荚膜梭菌唾液酸酶。
4.权利要求3的组合物，其中所述细菌唾液酸酶是A型产气荚膜梭菌菌株107唾液酸酶。
5.权利要求1至4的任一项的组合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含灭活的完整病
6.权利要求1至5的任一项的组合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含破裂病毒。
7.权利要求1至4的任一项的组合物，其中所述甲型流感病毒抗原包含纯化的膜糖蛋白。
8.权利要求1至7的任一项的组合物，其中所述甲型流感病毒是甲型流感病毒H5W亚型。
9.权利要求1至8的任一项的组合物，其额外地包含壳聚糖。
10.以水相悬浮液或溶液的形式存在的权利要求1至9的任一项的组合物。
11.权利要求1至10的任一项的适合于粘膜施用的组合物。
12.权利要求11的组合物，其中所述粘膜施用是鼻内施用。
13.在受试者中诱发对甲型流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用包含甲型流感病毒抗原和细菌唾液酸酶的组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者是禽类。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中所述甲型流感病毒是甲型流感病毒H5W亚型。
16.权利要求13至15的任一项的方法，其中所述细菌唾液酸酶是产气荚膜梭菌唾液酸酶。
17.权利要求16的方法，其中所述产气荚膜梭菌是A型107。
18.权利要求13至17的任一项的方法，其中所述组合物额外地包含壳聚糖。
19.权利要求13至18的任一项的方法，其中所述组合物适合于鼻内施用并且将其鼻内施用给受试者。
20.用于在家禽中进行接种的方法，其包括给所述家禽鼻内施用根据权利要求12的组合物。
21.细菌唾液酸酶用以加强包含甲型流感病毒抗原的疫苗组合物的效价的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述疫苗组合物额外地包含壳聚糖。
23.权利要求21或22的用途，其中所述疫苗适合于鼻内施用。
24.权利要求21至23的任一项的用途，其中所述细菌唾液酸酶是来自A型产气荚膜梭菌的唾液酸酶。
25.权利要求21至24的任一项的用途，其中所述甲型流感病毒抗原是来自高致病性 H5N1亚型病毒的抗原。
全文摘要
用于受试者中诱发针对甲型流感病毒具有保护性的免疫应答的疫苗组合物包含甲型流感病毒抗原和细菌唾液酸酶。用于家禽治疗的抗高致病性H5N1亚型病毒的鼻内疫苗优选地包含灭活的H5N1抗原、来自A型产气荚膜梭菌菌株107的唾液酸酶和壳聚糖。还公开了细菌唾液酸酶加强流感病毒抗原疫苗的用途。
文档编号C07K16/10GK102203134SQ200980144032
公开日2011年9月28日 申请日期2009年11月3日 优先权日2008年11月7日
发明者E·E·沃拉尔 申请人:安海达诺生物学有限公司