用于预防β-溶血链球菌(BHS)疾病的多组分免疫原性组合物的制作方法

专利名称：：用于预防β-溶血链球菌(BHS)疾病的多组分免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及β-溶血链球菌(BiB)多肽及多核苷酸，特别是化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)多肽及多核苷酸，及它们在预防BHS疾病的多组分免疫原性组合物中的应用。更具体地，本发明涉及定位于表面的化脓链球菌多肽。本发明进一步涉及免疫原性组合物，及用于对抗和降低溶血链球菌感染的免疫方法，其包含两种或多种多肽的组合。
背景技术：
：分类链球菌的传统表型标准包括溶血反应及兰斯菲尔德(Lancefield)血清学分群。但是，随着分类学进步，现在知道β-溶血(定义为在琼脂平板中完全裂解绵羊红细胞)链球菌(BHS)的一些无关物种可以产生相同的兰斯菲尔德抗原，并且在物种水平遗传学相关的菌株可具有异质兰斯菲尔德抗原。尽管链球菌分类学常规规则的这些例外，溶血反应及兰斯菲尔德血清学测试仍可以用于将链球菌分成广义的类别，作为鉴别临床分离株的第一步。Ruoff，K.L，R.A.Whiley,andD.Beighton.1999.Streptococcus.InP.R.Murray,Ε.J.Baron,Μ.A.Pfaller,F.C.Tenover,及R.H.Yolken(eds.),ManualofClinicalMicrobiology.AmericanSocietyofMicrobiologyPress,WashingtonD.C0具有兰斯菲尔德A、C或G组抗原的β-溶血分离株可以再分为两组大菌落(直径>0.5mm)和小菌落(直径<0.5mm)形成组。形成大菌落的A组(化脓链球菌)、C组和G组菌株是“化脓”链球菌，具有各种有效的毒力机制。无乳链球菌(Sti^ptococcusagalactiae)(B组)仍由其产生兰斯菲尔德B组抗原或者其他表型性状而可靠鉴别。BHS物种之间的相似性不仅包括毒力因子，还包括疾病表现。后者包括肺炎、关节炎、脓肿、鼻咽炎、子宫炎、产后脓毒病、新生儿败血症、伤口感染、脑膜炎、腹膜炎、蜂窝织炎、脓皮病、坏死性筋膜炎、中毒性休克综合征、败血症、感染性心内膜炎、心包炎、肾小球肾炎和骨髓炎。化脓链球菌是革兰氏阳性双球菌，定殖在人类的咽和皮肤中，这些位点然后作为这个生物体的主要储库(reservoir)。作为一种专性寄生物，这种细菌通过直接接触呼吸道分泌物或者通过手-口而传播。大多数化脓链球菌感染是相对温和的疾病，如咽炎或脓疱病。目前，在美国有2千万至3千5百万咽炎病例，看医生及其它相关花费约20亿美元。另外，非化脓性后遗症如风湿热、猩红热和肾小球肾炎从化脓链球菌感染产生。全球而言，急性风湿热(ARF)是小儿心脏病的最常见病因(1997.CasedefinitionsforInfectiousConditionsUnderPublicHealthSurveillance.CDC.)。从最初侵入门户咽和皮肤，化脓链球菌可以传播到不常发现细菌的身体其它部分，如血液、深层肌肉和脂肪组织或者肺，并且可以导致侵入性感染。两种最严重但最部常见形式的侵入性化脓链球菌疾病是坏死性筋膜炎和链球菌中毒性休克综合征(STSS)。坏死性筋膜炎(在媒体中被描述为“食肉细菌”)是肌肉和脂肪组织的破坏性感染。STSS是快速进展的感染，导致休克和对内部器官如肾、肝和肺的损伤。这种损害很大程度上是由于毒血症所致而非由于细菌生长导致的局部损害。1995年，侵入性化脓链球菌感染和STSS成为要求报告的(mandatedreportable)疾病。与数百万患咽炎和脓疱病的个体相反，美国疾病控制预防中心(CDC)对于该类要求报告的病例的一份报告表明在1997年，美国有15，000-20,000个侵入性化脓链球菌疾病病例，导致超过2，000例死亡(1997.CasedefinitionsforInfectiousConditionsUnderPublicHealthSurveillance.CDC.)。其它报告估计侵入性疾病高达每年每100，000个个体10-20例(Stevens,D.L.1995.Streptococcaltoxic-shocksyndromespectrumofdisease,pathogenesis,andnewconceptsintreatment.EmergInfectDis.1:69-78)。更具体地，在15，000-20，000个侵入性疾病的病例中，1，100-1，500个是坏死性筋膜炎病例，1，000-1,400是STSS病例，死亡率分别是20%和60%。严重侵入性疾病中还包括肌炎病例，其死亡率为80-100%。另外的10%-15%个体死于其它形式的侵入性A组链球菌疾病。这些数字已经增加，病例报告是在1995年开始的并反映了在过去十年或二十年发生的总趋势。另外，共识是病例定义的严格性导致更低的及因此误导性的数字，以及许多病例由于在满足定义之前的早期诊断和治疗已经成功治愈。尽管化脓链球菌对青霉素及其衍生物保持敏感，但是治疗不是必然根除该微生物。大约5%-20%人群根据季节是携带者Gtevens，D.L.1995.Sti^ptococcaltoxic-shocksyndromespectrumofdisease,pathogenesis,andnewconceptsintreatment.EmergInfectDis.1:69-78)，尽管进行抗生素治疗。原因不完全清楚，可能涉及多种机制。在严重侵入性感染例子中，治疗通常需要积极手术介入。对于涉及STSS或者相关疾病的那些病例，氯林可霉素(一种蛋白质合成抑制剂)是优选的抗生素，因为其很好地穿透组织并且预防外毒素产生。有报道对四环素、磺胺类药物的一些抗性及最近报道对红霉素的一些抗性。明显地，仍需要预防和治疗β-溶血感染的组合物。已鉴别了许多化脓链球菌毒力因子，一些毒力因子是分泌的，一些是定位在表面的。尽管其是有荚膜的，但是荚膜由透明质酸组成并且不适于作为候选抗原而包括在免疫原性组合物中，因为其通常由哺乳动物细胞表达并且是非免疫原性的(Dale，J.B.,R.G.Washburn,Μ.B.Marques,andΜ.R.ffessels.1996.HyaluronatecapsuleandsurfaceMproteininresistancetoopsonizationofgroupAstreptococci.InfectImmun.64:1495-501)。T抗原和组碳水化合物(GroupCarbohydrate)是其它候选物，但是可能也引起针对心脏组织的交叉反应性抗体。脂磷壁酸质(Lipoteichoicacid)存在于化脓链球菌表面上，但是引起与LPS类似的安全性问题。最丰富的表面蛋白质是由于结构相似性被称为M或者“M样”蛋白质的蛋白质家族。尽管这一类的成员具有抑制吞噬作用的相似生物学作用，但是它们各自具有独特的底物结合性质。这一家族鉴定最全的蛋白质是螺旋M蛋白。针对同源M株的抗体已示出是调理性(opsonic)和保护性的(Dale,J.B.，R.W.Baird,H.S.Courtney,D.L.Hasty,andΜ.S.Bronze.1994.PassiveprotectionofmiceagainstgroupAstreptococcalpharyngealinfectionbylipoteichoicacid.JInfectDis.169:319-23,Dale,J.B.,M.Simmons,E.C.Chiang,andE.Y.Chiang.1996.Recombinant,Ellen,R.P.,andR.J.Gibbons.1972.Mprotein-associatedadherenceofStreptococcuspyogenestoepithelialsurfaces-prerequisiteforvirulence.InfectImmun.5:826-830.)。使得M蛋白作为候选抗原的用途复杂化的是已鉴别了M蛋白大约100种不同血清型，还有一些未分型。通常，例如Ml、M3、M6、M12和M18的I类M血清型与咽炎、猩红热和风湿热相关，并且不表达免疫球蛋白结合蛋白。II类M血清型如M2和M49与更通常局部皮肤感染及后遗症肾小球肾炎相关，并且不表达免疫球蛋白结合蛋白(Podbielski，Α.，A.Flosdorff,andJ.ffeber-Heynemann.1995.ThegroupAstreptococcalvirR49genecontrolsexpressionoffourstructuralvirregulongenes.InfectImmun.63:9-20)。重要的是注意抗体对M血清型的异源交叉反应性很小，如果有的话。同样重要的是这些抗体在风湿热中所起的作用。M蛋白的特异区域激发与宿主心脏组织交叉反应的抗体，导致细胞损伤或者至少与细胞损伤相关(Cunningham，Μ.W.，andA.Quinn.1997.ImmunologicalcrossreactivitybetweentheclassIepitopeofstreptococcalMproteinandmyosin.AdvExpMedBiol.418:887-921,Quinn,A.，K.Ward,V.A.Fischetti,M.Hemric,andM.W.Cunningham.1998.ImmunologicalrelationshipbetweentheclassIepitopeofstreptococcalMproteinandmyosin.InfectImmun.66:4418-24.)。M蛋白和M样蛋白属于通过靶向sortase的LPXTG基序限定的表面定位蛋白质大家方矣(Mazmanian,S.K.，G.Liu,H.Ton-That，and0.Schneewind.1999.Staphylococcusaureussortase,anenzymethatanchorssurfaceproteinstothecellwall.Science.285:760-3,Ton-That,H.，G.Liu,S.K.Mazmanian,K.F.Faul1,and0.Schneewind.1999.Purificationandcharacterizationofsortase,thetranspeptidasethatcleavessurfaceproteinsofStaphylococcusaureusattheLPXTGmotif.ProcNatlAcadSciUSA.96:12424-12429)0这个基序位于所述蛋白质羧基末端附近，首先被sortase在LPXTG基序的苏氨酸和甘氨酸残基之间裂解。裂解后，所述蛋白质经苏氨酸的羧基共价附着于肽聚糖中的氨基酸横桥(cross-bridge)的游离酰胺基团，由此将所述蛋白质永久附着于细菌细胞的表面。这一靶向sortase的蛋白质家族中包括月太_(Chen，C.C.，andP.P.Cleary.1989.CloningandexpressionofthestreptococcalC5apeptidasegeneinEscherichiacolilinkagetothetype12Mproteingene.Infect.Immun.57:1740—1745，Chmouryguina，I.，A.Suvorov,P·Ferrieri，andP.P.Cleary.1996.ConservationoftheC5apeptidasegenesingroupAandBstr印tococci.hfect.Immun.64:2387-2390)、纤连蛋白的粘附素(Courtney，H.S.，Y.Li，J.B.Dale，andD.LHasty.1994.Cloning，sequencing，andexpressionofafibronectin/fibrinogen-bindingproteinfromgroupAstreptococci.InfectImmun.62:3937-46,Fogg，G.C.，andM.G.Caparon.1997.ConstitutiveexpressionoffibronectinbindinginStreptococcuspyogenesasaresultofanaerobicactivationofrofA.JBacteriol.179:6172-80,Hanski,E.，andM.Caparon.1992.ProteinF，afibronectin-bindingprotein，isanadhesionofthegroupAstreptococcusStreptococcuspyogenes.ProcNatlAcadSci.，USA.89:6172-76,Hanski,E.，P.A.Horwitz,andM.G.Caparon.1992.ExpressionofproteinF，thefibronectin-bindingproteinofStreptococcuspyogenesJRS4，inheterologousstreptococcalandenterococcalstrainspromotestheiradherencetorespiratoryepithelialcells.InfectImmun.60:5119-5125)、玻连蛋白和IV型胶原蛋白以及结合7纤溶酶原、IgA,IgG和白蛋白的其它M样蛋白(Kihlberg,B.M.，M.Collin,A.Olsen,andL.Bjorck.1999.ProteinH,anantiphagocyticsurfaceproteininStreptococcuspyogenes.InfectImmun.671708-14)。已描述了许多分泌型蛋白质，其中一些被认为是毒素。来自严重侵入性疾病和链球菌中毒性休克综合征(STSQ的病例的大多数化脓链球菌分离株产生链球菌化脓性夕卜毒素(SPE)A禾口C(Cockerill，F.R.,3rd,R.L.Thompson,J.Μ.Musser,P.M.Schlievert,J.Talbot,K.E.Holley,W.S.Harmsen,D.M.Ilstrup,P.C.Kohner,M.H.Kim,B.Frankfort,J.M.Manahan,J.M.Steckelberg,F.Roberson,andW.R.Wilson.1998.Molecular,serological,andclinicalfeaturesof16consecutivecasesofinvasivestreptococcaldisease.SoutheasternMinnesotaStreptococcalWorkingGroup.ClinInfectDis.26=1448-58)0在俄克拉荷马大学完成的、提交到GenBan的登录号为AE004092的基因组化脓链球菌序列中也已经鉴别了其它化脓性外毒素，并且已被鉴定(Proft,T.，S.LouiseMoffatt，C.J.Berkahn,andJ.D.Fraser.1999.IdentificationandCharacterizationofNovelSuperantigensfromStreptococcuspyogenes.JExpMed.189:89-102)。其它毒素如中毒性休克样综合征毒素、链球菌超抗原(Reda，K.B.，V.Kapur,D.Goela,J.G.Lamphear,J.M.Musser,andR.R.Rich.1996.PhylogeneticdistributionofstreptococcalsuperantigenSSAallelicvariantsprovidesevidenceforhorizontaltransferofssawithinStreptococcuspyogenes.InfectImmun.64:1161-5)以及促有丝分裂因子(Yutsudo，Τ.，K.Okumura,Μ.Iwasaki，A.Hara,S.Kamitani，W.Minamide，H.Igarashi，andY.Hinuma.1994.ThegeneencodinganewmitogenicfactorinaStreptococcuspyogenesstrainisdistributedonlyingroupAstreptococci.InfectionandImmunity.62:4000-4004)￠^^43^^!^被很好限定。链球菌溶血素0也可以被认为是可能的候选抗原，因为其导致IL-β释放。另外，也已经鉴别了许多分泌型酶，包括半胱氨酸蛋白酶(Lukomski，S.，C.A.Montgomery,J.Rurangirwa，R.S.Geske,J.P.Barrish，G.J.Adams，andJ.M.Musser.1999.ExtracellularcysteineproteaseproducedbyStreptococcuspyogenesparticipatesinthepathogenesisofinvasiveskininfectionanddisseminationinmice.InfectImmun.67:1779—88，Matsuka,Y.V.,S.Pillai,S.Gubbba，J.M.Musser,andS.B.Olmsted.1999.FibrinogencleavagebytheStreptococcuspyogenesextracellularcysteineproteaseandgenerationofantibodiesthatinhibitenzymeproteolyticactivity.InfectImmun.67:4326-33)、链激酶(Huang，Τ.Τ.，H.Malke,andJ.J.Ferretti.1989.ThestreptokinasegeneofgroupAstreptococcicloning,expressioninEscherichiacoli,andsequenceanalysis.MolMicrobiol.3197-205，Nordstrand，A.，W.Μ.McShan,J.J.Ferretti，S.E.Holm，andM.Norgren.2000.AllelesubstitutionofthestreptokinasegenereducesthenephritogeniccapacityofgroupAstreptococcalstrainNZ131.InfectImmun.68:1019-25)以及透明质酸酶(Hynes，W.L，A.R.Dixon,S.LWalton,andLJ.Aridgides.2000.Theextracellularhyaluronidasegene(hylA)ofStreptococcuspyogenes.FEMSMicrobiolLett.184109—12，Hynes,W.L.，L.Hancock，andJ.J.Ferretti.1995.AnalysisofasecondbacteriophagehyaluronidasegenefromStreptococcuspyogenes:evidenceforathirdhyaluronidaseinvolvedinextracellularenzymaticactivity.InfectImmun.63:3015-20)。鉴于化脓链球菌产生的已知毒力因子的数目，很清楚成功的β-溶血链球菌免疫原性组合物的一个重要特征是其刺激在感染过程早期防止或限制定殖的应答的能力。这种保护性应答会阻断粘附和/或增强细胞通过调理吞噬作用的清除。M蛋白的抗体已示出是调理性的并且提供一种机制克服该蛋白质的抗吞噬性质(Jones，K.F.，andV.A.Fischetti.1988.TheimportanceofthelocationofantibodybindingontheM6proteinforopsonizationandphagocytosisofgroupAM6streptococci.JExpMed.167:1114-),其方式大致相同于抗血清型B荚膜抗体已证实的保护免于流感嗜血菌B导致的疾病的方式(Madore,D.V.1998.CharacterizationofimmuneresponseasanindicatorofHaemophilusinfluenzaetypebvaccineefficacy.PediatrInfectDisJ.17:S207-10)。另外，特异于F蛋白的抗体已示出阻断粘附并由组织培养物细胞内在化(Molinari,G.,S.R.Talay,P.Valentin-ffeigand,Μ.Rohde,andG.S.Chhatwal.1997.Thefibronectin-bindingproteinofStreptococcuspyogenes,SfbI,isinvolvedintheinternalizationofgroupAstreptococcibyepithelialcells.InfectImmun.651357-63)。仍需要开发免疫原性组合物和方法以预防或改善由β-溶血链球菌包括A、B、C和G组导致的感染。还需要提供针对广范围BHS细菌的免疫性的免疫原性组合物。发明概述为满足这些及其它需求并且鉴于其目的，本发明提供了用于保护易感哺乳动物对抗β-溶血链球菌定殖或者感染的免疫原性组合物，所述的β-溶血链球菌包括Α、B、C和/或D组链球菌，其中包括来自化脓链球菌的那些细菌。这些免疫原性组合物包含两种或多种如下充分描述的多肽的混合物。本发明还提供了在易感哺乳动物中预防或者减轻这种定殖的方法，其通过给予有效量的所述免疫原性组合物以产生针对所述免疫原性组合物中所含的多肽的特异性抗体而进行。本发明还提供了化脓链球菌多肽及多核苷酸、重组材料以及它们的产生方法。本发明的另一方面涉及使用这种化脓链球菌多肽及多核苷酸的方法。所述多肽及多核苷酸也可以用于制备用于预防或减轻由溶血链球菌导致的感染的药物。用于本发明的免疫原性组合物中的多肽包括分离的多肽，其包含图2、4、6、8或10任一图的氨基酸序列的至少一种。本发明还包括与任一前述氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列，以及它们的成熟多肽。本发明进一步包括这些多肽的免疫原性片段和生物学等价物。本发明还提供了免疫特异性结合本发明多肽的抗体。本发明的多核苷酸包括分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本发明多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸包括包含图1、3、5、7或9任一附图的核苷酸序列的至少一种，还包括由于遗传密码简并性的结果也编码本发明多肽的其它核苷酸序列。本发明还包括包含与编码本发明多肽的核苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列的分离的多核苷酸，以及包含与任一前述核苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列的分离的多核苷酸。另外，本发明的分离的多核苷酸包括在严格条件下与编码本发明多肽的核苷酸序列杂交的核苷酸序列、在严格条件下与任一前述序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列以及与这些多核苷酸完全互补的核苷酸序列。另外，本发明包括包含这些多核苷酸的表达载体和宿主细胞。本发明还提供了免疫原性组合物，其包含免疫原性量的至少两种或多种组分(选自SCP(图2(SEQIDNO:2)禾口由ORF554(肽基丙基异构酶(图4(SEQIDNO:4))、ORF1218(假设蛋白质(图6(SEQIDN0:6))、0RF1358(推定的粘附蛋白(图8(SEQIDNO8))和ORF2459(表面脂蛋白(图10(SEQIDNO:10))编码的肽)，其中每种均包含有效预防或减轻易感哺乳动物中溶血链球菌定殖或感染的量的本发明的多肽。每种组分可包含所述多肽本身，或者可包含所述多肽和能有助于预防和/或改善β-溶血链球菌定殖或感染的任何其它物质(例如一或多种化学制剂、蛋白质等)。这些免疫原性组合物可以进一步包含所述多肽的至少一部分，任选地缀合或者连接于肽、多肽或蛋白质或者多糖。本发明还包括保护易感哺乳动物抗溶血链球菌定殖或感染的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给予哺乳动物有效量的两种或多种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含免疫原性量的本发明多肽，所述的量有效预防或减轻在易感哺乳动物中β-溶血链球菌的定殖或感染。已发现这种成分的组合对较广群体有效提供保护，并且通常提供比单独给予各个成分更大的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可以通过任何常规途径给予，例如通过皮下或肌肉内注射、口服摄取或者鼻内给予。本发明进一步提供了免疫原性组合物。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含至少一种本发明多肽。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含至少一种本发明多核苷酸。应理解上述一般描述和下述详细描述是举例性的，不是限制本发明。附图简述图1示出编码C5a肽酶的核酸序列(“SCP”；SEQIDNO:1)。图2示出SCP的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图3示出编码肽基丙基异构酶的0RF554的核酸序列(SEQIDNO3)。图4示出肽基丙基异构酶的氨基酸序列(SEQIDNO4)。图5示出编码一种假设蛋白质的0RF1218的核酸序列(SEQIDNO5)。图6示出一种假设蛋白质的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。图7示出编码推定的粘附蛋白的0RF1358的核酸序列(SEQIDNO7)。图8示出推定的粘附蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO8)。图9示出编码表面脂蛋白的0RFM59的核酸序列(SEQIDNO9)。图10示出表面脂蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO10)。图11示出实施例2检测的三种组分(“Trivax”=SCP，肽基丙基异构酶(0RF阳4)，和推定的粘附蛋白(0RF1358))的培养基与一种组分(“554”=肽基丙基异构酶(0RF554))的免疫原性组合物的杀灭百分比的比较。图12-16图示证明实施例3的被动免疫性转移结果。CFU=集落形成单位。发明详述本发明提供了用于预防或改善β-溶血链球菌包括A、B、C和G组所致感染的免疫原性组合物。两或多种本文列举的多肽组合在一起以制备免疫原性组合物。具体地，在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两或多种多肽的混合物，每种多肽由与选自下组的核酸序列具有至少90%相同性的核酸序列编码(a)C5a肽酶(“SCP”)(图1(SEQIDNO:1))；(b)开放读框(“ORF，，)554(图3(SEQIDNO:3))；(c)ORF1218(图5(SEQIDNO:5))；(d)ORF1358(图7(SEQIDNO:7))；禾口(e)ORF2459(图9(SEQIDNO:9))。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含两或多种多肽的混合物，每种多肽具有与选自下组的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列(a)SCP(图2(SEQIDNO:2))；(b)肽基丙基异构酶(图4(SEQIDNO:4))；(c)假设蛋白质(图6(SEQIDNO:6))；(d)推定的粘附蛋白(图8(SEQIDNO:8))；和(e)表面脂蛋白(图10(SEQIDNO:10))。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含下面各项的混合物(a)由与图1的核酸序列(SEQIDNO1)有至少90%相同性的核酸序列编码的SCP多肽；(b)由与图3的核酸序列(SEQIDNO3)有至少90%相同性的核酸序列编码的肽基丙基异构酶多肽；和(c)由与选自⑴图5(SEQIDNO5)；(ii)图7(SEQIDNO7)；和(iii)图9(SEQIDNO9)的核酸序列有至少90%相同性的核酸序列编码的至少一种其它多肽。在另一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含下面各项的混合物(a)与图2的氨基酸序列(SEQIDNO2)有至少90%相同性的SCP多肽；(b)与图4的氨基酸序列(SEQIDNO4)有至少90%相同性的的肽基丙基异构酶多肽；和(c)与选自⑴图6(SEQIDNO6)；(ii)图8(SEQIDNO8)；禾口(iii)图10(SEQIDNO10)的氨基酸序列有至少90%相同性的至少一种其它多肽。术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸片段”在本文可互换使用。这些术语涵盖由磷酸二酯键连接的核苷酸。“多核苷酸”可以是核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，其是单链或双链，任选含有合成的、非天然的或者改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可包含cDNA、基因组DNA、合成DNA的一或多个节段或者其混合物。核苷酸碱基在本文中以单字母代码示出腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶⑶。本文所述链球菌多核苷酸可以用标准克隆和筛选技术获得。这些多核苷酸可以例如得自基因组DNA、得自衍生自mRNA的cDNA文库、得自基因组DNA文库或者可以用公知的和商业可得技术合成，例如通过从cDNA文库进行PCR或者经RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)而合成。本领域技术人员可利用并且公知一些获得全长cDNA或延伸短cDNA的方法，例如基于cDNA末端快速扩增方法(RACE)的那些方法。参见Frohmanetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，8998-9002，1988。该技术的最近修改由例如MARATHON技术(ClontechLaboratorieshe.)例证，其显著简化了对较长cDNA的检索。在MARATHON技术中，从提取自选择的组织的mRNA制备cDNA，并且将“适体”序列连接到每个末端上。然后使用基因特异性和适体特异性寡核苷酸引物进行核酸扩增(PCR)以扩增cDNA的“失去的”5'末端。然后用“嵌套”引物重复PCR反应，“嵌套”引物是设计在扩增产物内退火的引物(典型地，在适体序列中的更远3'退火的适体特异性引物以及在已知基因序列的更远5'退火的基因特异性引物)。这个反应的产物然后可以经DNA测序分析，并且构建全长cDNA，这通过将所述产物与现有cDNA直接连接以获得完整序列而进行，或者通过使用设计5'引物的新信息进行独立的全长PCR而进行。术语“重组”是指例如多核苷酸通过人工组合两个或多个分离的多核苷酸节段而制备，例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操作分离的多核苷酸而进行。“重组DNA构建体”包含与至少一种调节元件可操纵连接的任一种本发明的分离的多核苷酸。链球菌多核苷酸的直向同源物和等位基因变体可以容易地用本领域熟知方法鉴别。多核苷酸的等位基因变体和直向同源物可以包含通常与图1-9中奇数编号附图所示核苷酸序列(SEQIDNO:1-9中的奇数编号)的任一或多个序列或者其片段至少大约90-95%或更高相同性的核苷酸序列。这些多核苷酸的等位基因变体和直向同源物可以编码包含与图2-10中偶数编号附图所示的任一或多个氨基酸序列(SEQIDNO:2-10中的偶数编号)有至少大约90%相同性的氨基酸序列的多肽。这种多核苷酸可以容易地被鉴别为能在严格条件下与任一或多个具有图1-9所示核苷酸序列(SEQIDNO:1-9中的奇数编号)的多核苷酸或其片段杂交。本领域技术人员理解许多序列相同性水平可以用于鉴别相关的多核苷酸和多肽。序列对比和相同性百分比计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc.，Madison,Wis.)的MEGALIGN程序进行。多个序列对比可以使用Clustal对比方法(HigginsandSharp,Gene,73(1):237-44,1988)进行，默认参数例如GAPPENALTY=10及GAPLENGTHPENALTY=10。使用Clustal方法的用于成对对比的默认参数可以是例如KTUPLE1，GAPPENALTY=3，WINDOW=5及DIAGONALSSAVED=5。本发明多肽序列可以与所列举序列相同，即100%相同，或者其可以包括与参考序列相比直至一定整数的氨基酸改变，从而％相同性小于100%。这种改变包括至少一个氨基酸缺失，取代，包括保守和非保守取代，或者插入。改变可以发生在参考多肽序列的氨基末端位置或羧基末端位置，或者可以在这些末端位置之间的任意处，单独散布在参考氨基酸序列中的氨基酸之间，或者散布在参考氨基酸序列内的一或多个连续集合中。因此，本发明还提供了与所列举序列中含有的氨基酸序列有序列相同性的分离的多肽。根据特定序列，序列相同性程度优选大于90%(例如90%，95%，97%，99%或更高)。这些同源蛋白质包括突变体和等位基因变体。如现有技术已知的，“相同性”是通过比较序列而确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在现有技术中，“相同性”也指根据情况通过在序列串之间进行匹配而确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度。“相同性”和“相似性”可以容易地通过已知方法计算，包括但非限于(ComputationalMolecularBiology,Lesk,Α.Μ.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；BiocomputingJnformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,yonHeinje,G.,AcademicPress,1987；andSequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereux,J.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991；andCarillo,H.,andLipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988))描述的那些方法。确定相同性的优选方法设计用于给出测试的序列间的最大匹配。确定相同性和相似性的方法编码在公众可得的计算机程序中。确定两个序列之间的相同性和相似性的优选的计算机程序方法包括但非限于GCG程序包(Devereux,J.，etal.1984)，BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.，etal.，1990)。BLASTX程序可从NCBI和其它来源获得(BLASTManual，Altschul，S.，etal.，NCBINLMNIHBethesda,Md.20894；Altschul,S.,etal.，1990)。也可以使用公知的SmithWaterman算法来确定相同性。例如，对于给定％相同性的氨基酸数的改变可以如下确定用偶数编号的图2-10中(SEQIDNO:2，4，6，8和10)之一的总氨基酸数乘以各自百分比相同性的数字百分比(除以100)然后将该乘积从所述偶数编号的图2-10中(SEQIDNO:2，4，6，8和10)之一的总氨基酸数中减去，或者xa-(xa·y),其中na是氨基酸改变数目，\是偶数编号的图2-10中(SEQIDN0:2，4，6，8和10)之一的总氨基酸数，y是例如0.90(代表90%),0.95(代表95%)，0·97(代表97%)等，并且其中\和y的任何非整数乘积在其从\中减去之前四舍五入至最近的整数。本发明还涉及在溶血链球菌菌株间基本上保守的分离的多肽。另外，本发明还涉及在溶血链球菌菌株间基本上保守的并且在预防或改善溶血链球菌在易感对象中的定殖或感染中有效的分离的多肽。如本文所用，术语“保守的”是指，例如，作为蛋白质中总氨基酸数的百分比的不经历插入、取代和/或缺失的氨基酸数。例如，如果蛋白质是90%保守的并且具有例如263个氨基酸，则所述蛋白质中有237个氨基酸位置的氨基酸不经历取代。类似地，如果蛋白质是95%保守的并且具有例如280个氨基酸，则有14个氨基酸位置的氨基酸可经历取代并且266个(即观0-14个)氨基酸位置的氨基酸不经历取代。根据本发明的一个实施方案，非限制性地，分离的多肽优选在溶血链球菌菌株间是至少大约90%保守的，更优选在菌株间是至少大约95%保守的，还更优选在菌株间是至少大约97%保守的，最优选优选在菌株间是至少大约99%保守的。修饰和变化可以在多肽结构中进行并仍然获得具有β-溶血链球菌和/或化脓链球菌活性和/或抗原性的多肽。例如，在序列中一些氨基酸可以被其它氨基酸取代而没有活性和/或抗原性的可感知的丧失。因为多肽的相互作用能力和性质决定多肽的生物学功能活性，所有可以在多肽序列(当然或者在其基础DNA编码序列)中进行一些氨基酸序列取代，仍然获得具有类似性质的多肽。本发明包括是生物学等价物的任何分离的多肽，其提供本文所述的希望的反应性。术语“希望的反应性”是指本领域技术人员会认识到的作为用于本发明目的的有用结果的反应性。希望的反应性的例子在本文中描述，包括但非限于希望的保护水平、希望的抗体效价、希望的调理吞噬活性和/或希望的交叉反应性，如本领域技术人员会认识到的可用于本发明目的的那些。希望的调理吞噬活性通过杀菌百分比指示，所述杀菌百分比通过相对于阴性对照在OPA中菌落形成单位(CFU)的降低而测量。不限于此，希望的调理吞噬活性优选是至少大约15%、更优选至少大约20%、还更优选至少大约40%、还更优选至少大约50%及最优选至少大约60%。本发明包括是包含偶数编号的图2-10的氨基酸序列(SEQIDNO:2，4，6，8和10)的多肽的变体的多肽。本文所用术语“变体”包括与参考多肽不同但是保留关键性质的多肽。通常，差异是受限的，从而参考多肽和变体的序列在整体上紧密相似，并且在许多区域是相同的(即生物学等价物)。变体和参考多肽可以通过任何组合的一或多个取代、添加或缺失而在氨基酸序列中不同。取代的或插入的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的。多肽变体可以是天然发生的如等位基因变体，或者其可以是不是已知天然发生的变体。非天然发生的多肽变体可以通过直接合成或者通过诱变技术制备。在进行这种变化时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予多肽相互作用性生物学功能中的重要性是现有技术公知的(Kyte&Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可以由具有相似亲水性指数或评分的其它氨基酸取代并且仍然得到具有相似生物学活性的多肽。每个氨基酸已基于其疏水性和电荷特征被赋予亲水性指数。这些指数已列于下述每个氨基酸之后的括号中异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。据信氨基酸残基的相对亲水特征决定了所得多肽的二级和三级结构，所述二级和三级结构又决定了所述多肽与其它分子如酶、底物、受体、抗体等的相互作用。现有技术已知一个氨基酸可以通过具有相似亲水性指数的另一个氨基酸取代并仍然获得功能等价多肽。在这种变化中，亲水性指数在士2之内的氨基酸的取代是优选的，在士1之内的是特别优选的，在士0.5之内的是更特别优选的。相似氨基酸的取代也可以基于疏水性而制备，特别是当由此制备的生物学功能等价多肽或肽用于免疫学方案中时。援引加入本文的美国专利4，554，101中说明，由其邻近氨基酸的疏水性控制的多肽的最大局部平均疏水性与其免疫原性和抗原性相关，即与多肽的生物学性质相关。如援引加入本文的美国专利4，554，101详述，下述疏水性值已被赋予各氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0士1)；谷氨酸(+3.0士1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(_0.5士1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。应理解，一个氨基酸可以由另一个具有相似疏水性值的氨基酸取代并仍然获得生物学等价、特别是免疫学等价多肽。在这种变化中，疏水性值在士2之内的氨基酸的取代是优选的，在士1之内的是特别优选的，在士0.5之内的是更特别优选的。如上所述，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的举例的取代是本领域技术人员公知的并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。如下表1所示，合适的氨基酸取代包括下述表1权利要求1.免疫原性组合物，包含两种或多种多肽的混合物，每种多肽由与选自下组的核酸序列有至少90%相同性的核酸序列编码(a)Cfe肽酶(“SCP”)(图KSEQIDNO:1))；(b)开放读框("ORF")554(图3(SEQIDNO:3))；(c)ORF1218(图5(SEQIDNO:5))；(d)ORF1358(图7(SEQIDNO:7))；禾口(e)ORFM59(图9(SEQIDNO:9))。2.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。3.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。4.权利要求1的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异性识别所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在易感哺乳动物中的定殖或者感染。5.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。6.权利要求1的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。7.权利要求4的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。8.权利要求4的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。9.免疫原性组合物，包含两种或多种多肽的混合物，每种多肽与选自下组的氨基酸序列有至少90%相同性(a)SCP(图2(SEQIDNO:2))；(b)肽基丙基异构酶(图4(SEQIDNO:4))；(c)假设蛋白质(6(SEQIDNO:6))；(d)推定的粘附蛋白(图8(SEQIDNO:8))；和(e)表面脂蛋白(图10(SEQIDNO10))。10.权利要求9的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。11.权利要求9的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。12.权利要求9的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异性识别所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在易感哺乳动物中的定殖或者感染。13.权利要求12的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。14.权利要求12的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。15.权利要求12的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。16.权利要求15的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌。17.保护易感哺乳动物抗溶血链球菌的定殖或感染的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异于所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在所述易感哺乳动物中的定殖或者感染。18.权利要求17的方法，其中所述免疫原性组合物经皮下注射、经肌肉内注射、经口服摄入、经鼻内或其组合而给予。19.权利要求17的方法，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。20.权利要求19的方法，其中溶血链球菌是化脓链球菌。21.权利要求17的方法，其中哺乳动物是人。22.保护易感哺乳动物抗溶血链球菌的定殖或感染的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求9的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异于所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在所述易感哺乳动物中的定殖或者感染。23.权利要求22的方法，其中所述免疫原性组合物经皮下注射、经肌肉内注射、经口服摄入、经鼻内或其组合而给予。24.权利要求22的方法，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。25.权利要求M的方法，其中溶血链球菌是化脓链球菌。26.权利要求22的方法，其中哺乳动物是人。27.免疫原性组合物，包含下面各项的混合物(a)由与图1的核酸序列(SEQIDNO1)有至少90%相同性的核酸序列编码的SCP多肽；(b)由与图3的核酸序列(SEQIDNO3)有至少90%相同性的核酸序列编码的肽基丙基异构酶多肽；和(c)由与选自⑴图5(SEQIDNO5)；(ii)图7(SEQIDNO7)；禾口(iii)图9(SEQIDNO9)的核酸序列有至少90%相同性的核酸序列编码的至少一种其它多肽。28.权利要求27的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。29.权利要求27的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。30.权利要求27的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异性识别所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在易感哺乳动物中的定殖或者感染。31.权利要求30的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。32.权利要求30的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。33.权利要求30的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。34.权利要求33的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌。35.免疫原性组合物，包含下面各项的混合物(a)与图2的氨基酸序列(SEQIDNO2)有至少90%相同性的SCP多肽；(b)与图4的氨基酸序列(SEQIDNO4)有至少90%相同性的的肽基丙基异构酶多肽；和(c)与选自⑴图6(SEQIDNO6)；(ii)图8(SEQIDNO8)；禾口(iii)图10(SEQIDNO10)的氨基酸序列有至少90%相同性的至少一种其它多肽。36.权利要求35的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。37.权利要求36的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。38.权利要求35的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异性识别所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在易感哺乳动物中的定殖或者感染。39.权利要求38的免疫原性组合物，其进一步包含生理学可接受的运载体。40.权利要求38的免疫原性组合物，其进一步包含有效量的佐剂。41.权利要求38的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。42.权利要求41的免疫原性组合物，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌。43.保护易感哺乳动物抗溶血链球菌的定殖或感染的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求27的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异于所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者改善β-溶血链球菌在所述易感哺乳动物中的定殖或者感染。44.权利要求43的方法，其中所述免疫原性组合物经皮下注射、经肌肉内注射、经口服摄入、经鼻内或其组合而给予。45.权利要求43的方法，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。46.权利要求45的方法，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌。47.权利要求43的方法，其中哺乳动物是人。48.保护易感哺乳动物抗溶血链球菌的定殖或感染的方法，包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求35的免疫原性组合物，其中每种多肽能产生特异于所述多肽的抗体，并且其中所述免疫原性组合物的量有效防止或者减轻β-溶血链球菌在所述易感哺乳动物中的定殖或者感染。49.权利要求48的方法，其中所述免疫原性组合物经皮下注射、经肌肉内注射、经口服摄入、经鼻内或其组合而给予。50.权利要求48的方法，其中β-溶血链球菌是A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌或者G组链球菌。51.权利要求50的方法，其中β-溶血链球菌是化脓链球菌。52.权利要求48的方法，其中哺乳动物是人。53.免疫原性组合物，包含如下各项的混合物(a)与图2的氨基酸序列(SEQIDNO2)有至少90%相同性的SCP多肽；(b)与图4的氨基酸序列(SEQIDNO4)有至少90%相同性的肽基丙基异构酶多肽；和(c)与图8的氨基酸序列(SEQIDNO8)有至少90%相同性的推定的粘附多肽。全文摘要本发明描述了多种β-溶血链球菌多核苷酸和多肽，特别是化脓链球菌的多肽和多核苷酸。本发明的两种或多种多肽可以配制用作免疫原性组合物。本发明还公开了对抗和降低由β-溶血链球菌导致的感染的免疫方法。文档编号C07K16/12GK102203122SQ200980144249公开日2011年9月28日申请日期2009年11月4日优先权日2008年11月5日发明者A·S·安德森,I·L·道奇,M·哈根申请人:惠氏有限责任公司