Plac8活性抑制剂用于调控脂肪生成的用途的制作方法

专利名称：Plac8活性抑制剂用于调控脂肪生成的用途的制作方法
PIac8活性抑制剂用于调控脂肪生成的用途本发明关注PlacS，即一种牵涉脂肪生成调控的新型靶物以及用于鉴定此靶物活性的调控剂的筛选测试。此外，本发明涉及PlacS活性的调控剂及其调控脂肪生成并且如此治疗肥胖及相关病症的用途，尤其在药物组合物中。肥胖是许多病症的一项主要风险因素，所述病症包括高血压、冠状动脉疾病、血脂异常(dyslipidemia)、胰岛素抗性和2型糖尿病。由于肥胖流行的重要性，大量的调查已经集中于脂肪细胞生物学，包括产生新脂肪细胞的发育途径。脂肪生成是未分化的间充质前体细胞变为成熟的脂肪细胞的过程。在整个过去的十年期间，已经在阐明脂肪细胞分化的分子机制方面做出了相当大的进展，所述脂肪细胞分化的分子机制牵涉序贯激活来自数个家族的转录因子诸如CCAAT/增强子结合蛋白(C/ΕΒΡα、α、和γ)和核激素受体过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPARy) (Rosen, Ε. D.等，2002)。PPARy被描述为脂肪生成的一种“主要调节剂”，因为在体外和在体内都已经显示了它对于脂肪生成既是足够的也是必要的。最近，已经描述了新的转录因子参与脂肪生成，诸如KLF家族(KLF2、5和KLF15) (Baner jee, S. S.等，2003 ；Gray, S. Μ.等，2002)、Ebf 家族(Jimenez,Μ. Α.等，2007)及 Krox 20 (Chen, Ζ.等，2005)，这提示了脂肪生成过程中发生的转录级联比先前所想的复杂得多。 此外，还已经描述了信号传导分子和/或受体诸如分泌性蛋白质的Wnt家族(Kang S.等， 2007)、Shh蛋白(sonic hedgehog protein)、Notch受体牵涉导致脂肪细胞形成的分子事件。有趣的是，注意到胞外和胞内事件以某种方式偶联以调节脂肪生成。所有这些信号传导途径会聚于受到紧密调节的转录级联，其需要更为完整的了解以潜在地控制脂肪细胞发育，并预防肥胖。脂肪组织中的脂肪贮存是有限的，并且超过此容量导致脂质在其它组织中，特别在肌肉、肝、和内分泌胰腺中积累，而且导致脂肪细胞分泌各种脂肪因子(adipokine)。脂肪组织由位于不同解剖部位的数种沉积物组成，所述位于不同解剖部位的沉积物可以源自独特的前体，而且具有不同的生理学功能和病理生理学作用。与皮下脂肪库(adipose depot) 形成对比，内脏脂肪库可以更多地促成与代谢综合征有关的缺陷。已经在葡萄糖代谢和2型糖尿病中发挥至关重要作用的所有器官，即脂肪组织、 胃肠道、肝、骨骼肌和胰腺中鉴定出大麻素1受体。已经显示了利莫那班(Rimonabant)(临床使用的第一种选择性大麻素受体I(CBlR)拮抗剂)降低食物摄取和体重，如此改善葡萄糖代谢调节。然而，仍需要用于治疗肥胖的新型治疗靶物。已知胎盘8蛋白(PlacS)是一种胞质信号传导分子，尽管已经报告了它具有推定的信号肽(Rogulski，K.等，2005)。最近，生成了 PlacS敲除小鼠，并且其展现出对细菌感染的免疫应答受损(Ledford，J.G.等，2007)。PlacS在免疫细胞中，及在其它细胞类型中的作用和功能仍未知。发明人现在已经发现了，PlacS在脂肪细胞分化中发挥至关重要的作用。如此，认为PlacS是用于调控脂肪生成及用于治疗肥胖及相关病症的一种新型相关靶物。还可以使用对PlacS的抑制来降低脂肪生成以降低皮下和内脏脂肪积累。
发明详述本发明被吸引到用于调节脂肪生成和脂肪细胞中的代谢功能的方法。本发明在于PlacS活性抑制剂用于调控脂肪生成，特别是用于治疗肥胖及相关病症的用途。本发明还关注含有脂肪生成及相关病症的此类调控剂的药物组合物和用于此类调控剂的筛选测试。发明人已经鉴定出PlacS在脂肪生成调控中的作用。经由转录物组学 (transcriptomic)方法，他们鉴定出其表达与喂养高脂肪饮食的C57BI/6小鼠分组中的体重增加相关联的基因。然后，他们进行第二项分析以评估通过用利莫那班处理高脂肪饮食喂养小鼠诱导的基因表达变化。保留如下的基因，其先前尚未在脂肪细胞生物学中描述过， 但是其可以牵涉重要的生物学过程诸如信号传导、修饰胞外基质蛋白、和基因转录。这些基因对于脂肪生成而言可以是重要的，特别是因为它们可能牵涉利莫那班降低小鼠中的脂肪质量的机制。在此背景中，PlacS鉴定为牵涉脂肪细胞代谢，特别是新的信号传导途径。更一般地，此基因表现为在脂肪生成和控制肥胖中的脂肪组织发育方面发挥作用。本发明在于鉴定PlacS活性的调控剂。此类调控剂可以是能够调控PlacS活性的任何化合物或分子，特别是小分子、脂质和siRNA。可以通过检测药剂调控PlacS活性的能力来鉴定PlacS活性调控剂。PlacS的抑制剂是能够完全或部分降低或抑制PlacS活性的任何化合物。PlacS的抑制剂包括但不限于干扰PlacS与其天然配体在胞内区室中的相互作用的药剂、在转录和翻译水平降低PlacS 表达的药剂、及抑制牵涉PlacS的胞内信号的药剂。在一个实施方案中，可以使用完全或部分抑制PlacS转录的小分子来降低PlacS 活性。可以使用本领域技术人员公知的方法来鉴定此类调控剂，像报告系统，其在于与报告基因以符合读码框方式连接且在合适的细胞系中表达的PlacS启动子；报告基因产物的活性可以定量测量。如此，通过例如抑制激活转录因子来抑制报告基因表达的化合物可以认为是潜在的候选物。可以在此类报告系统中使用的报告基因是众多的，而且是本领域中公知的。例如， 此类报告基因可以是容许绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、β-半乳糖苷酶等表达的基因。因此，本发明的一个方面提供了一种用于筛选PlacS活性抑制剂的方法，其包括下列步骤a)用包含与报告基因连接的PlacS启动子的报告构建体转染细胞系；b)在容许所述报告基因表达的条件中培养所述细胞系；c)将候选化合物添加入所述细胞培养物中，并d)将抑制剂化合物鉴定为是那些具有降低或抑制所述报告基因表达的能力的化合物。要在上文所描述的用于PlacS转录调控剂的筛选测试中使用的预测的PlacS启动子对应于SEQ ID NO. 23。在另一个实施方案中，使用小干扰RNA(SiRNA)或小发夹RNA(shRNA)经由RNA 干扰来调控PlacS表达。因此，在一个方面，本发明涉及双链核酸分子，包括小核酸分子，诸如能够介导针对PlacS基因表达的RNA干扰(RNAi)的短干扰核酸(siNA)、短干扰 RNA (siRNA)、双链RNA (dsRNA)、微小RNA (miRNA)、和短发夹RNA (shRNA)分子，包括此类小核酸分子的混合物及此类小核酸分子的合适的配制剂。已经在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)系统中首次描述了 RNAi介导的基因沉默现象，其中报告了长双链RNA分子的显微注射。RNA介导的基因失活机制在迄今已经调查的各种生物体中似乎略有不同。然而，在所有系统中，RNA介导的基因沉默基于由内切核酸酶Argonauts诱导的对靶mRNA的转录后降解，所述内切核酸酶Argonauts是所谓的RISC复合物的一部分。降解的序列特异性是由加载入RISC复合物中的特异性反义RNA 链的核苷酸序列决定的。将SiRNA化合物导入细胞中产生如下的细胞，其具有降低水平的靶mRNA，和如此降低水平的相应多肽及并发地降低水平的相应酶活性。可以使用如本文中所描述的对PlacS特异性的SiRNA作为PlacS活性的调控剂， 以降低PlacSmRNA的翻译。更具体地，可以使用对PlacS特异性的siRNA来降低脂肪生成并如此治疗肥胖及相关疾病。在一个实施方案中，本发明的特征在于一种双链核酸分子，诸如siRNA分子，其中一条链包含与靶PlacS核酸分子中预先确定的PlacS核苷酸序列具有互补性的核苷酸序列或其部分。可以使用经修饰的或未修饰的RNA分子。修饰的一个例子是掺入三环 (tricylo)-DNA以容许寡核苷酸的血清稳定性改善。在一个实施方案中，确定的PlacS核苷酸序列是本文中所描述的PlacS核苷酸靶序列(SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 3)。由于不同生物体或不同受试者间基因组的序列变异性的潜力，广泛治疗性应用的 siRNA分子的选择有可能牵涉基因的保守区。如此，在一个实施方案中，本发明涉及如下的 siRNA分子，其靶向基因组的保守区或不同靶物间保守的区域。设计为靶向各种靶物的保守区的siRNA分子在多种多样的患者群体中实现对PlacS基因表达的有效抑制。在一个实施方案中，本发明的特征在于一种双链短干扰核酸分子，其下调靶PlacS 基因的表达或指导对靶RNA的切割，其中所述siRNA分子包含约15至约28个碱基对，优选地约19个碱基对。本发明的siRNA或RNAi抑制剂可以化学合成、自载体表达或酶促合成。在一个具体的实施方案中，对Plac8特异性的siRNA是具有序列SEQ IDN0. 5或SEQ ID NO. 6或SEQ ID N0. 7的shRNA。在一个优选的实施方案中，对Plac8特异性的siRNA是具有序列SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 7的shRNA，而在一个更优选的实施方案中，对Plac8 特异性的siRNA是具有序列SEQ IDN0. 6的shRNA。依照本发明的siRNA的使用导致mRNA水平从相应野生型细胞的mRNA水平降低 5%至20%，优选地5%至15%，更优选地5%至10%。野生型细胞是导入编码siRNA化合物的核酸前的细胞，其中靶定的mRNA不被siRNA化合物降解。PlacS活性抑制剂可以通过任何合适的路径局部或系统施用，这取决于分子的性质和期望的效果。依照本领域中所使用的方案，在双链分子的情况中可以直接在靶定组织中局部施用siRNA，或者在shRNA的情况中可以经由载体施用siRNA。在一个实施方案中，使用shRNA分子来获得RNAi。shRNA构建体编码茎-环RNA。 导入细胞中后，此茎-环RNA被加工成双链RNA化合物，其序列对应于初始RNA分子的茎。 此类双链RNA可以依照本领域中已知的任何方法来制备，包括体外和体内方法，如但不限于记载于 Sahber 等(1987)，Bhattacharyya 等，(1990)或 US 5，795，715 的。对于体内施用，可以将shRNA导入质粒中。质粒衍生的shRNA呈现如下的优点，即提供与报告基因或选择标志的组合和经由病毒或非病毒载体投递的选项。将shRNA导入载体中，然后导入细胞中，这确保shRNA得到持续表达。载体通常传给子细胞，容许基因沉默进行遗传。本发明还提供了包含用于表达本发明的shRNA的多核苷酸的载体。例如，这些载体是AAV载体、逆转录病毒载体特别是慢病毒载体、腺病毒载体，其可以通过不同的合适路径来施用，包括静脉内路径、肌肉内路径、直接注射入皮下组织或依照通常的实践选择的其它靶定组织中。siRNA的施用路径从局部直接投递变化至系统静脉内施用。局部投递的优点是功效需要的siRNA剂量实质性较低，因为分子被注射到靶组织中或者靶组织附近。局部施用还容许siRNA的聚焦投递。对于此类直接投递，可以使用裸siRNA。“裸siRNA”指投递在盐水或其它简单赋形剂诸如5%右旋糖中的siRNA(未修饰的或经修饰的)。容易配制和施用此类分子使这成为一种有吸引力的治疗方法。裸DNA也可以配制入脂质，特别是脂质体中。siRNA的系统应用经常是侵入性较小的，而且更重要的是，不限于可自外部足够接近的组织。对于系统投递，可以用胆固醇偶联物、脂质体或基于聚合物的纳米颗粒配制 siRNA。传统地使用脂质体以提供升高的药动学特性和/或降低的毒性谱。它们容许显著的且重复的成功体内投递。目前，使用基于脂质的siRNA系统投递配制剂(特别是向肝细胞)似乎代表最有希望的用于开发RNAi治疗剂的近期机会之一。用聚合物诸如动力学多偶联物(dynamic polyconjugate)(例如与用于肝细胞靶向的N-乙酰葡糖胺偶联的)和基于环糊精的纳米颗粒配制容许靶向性投递和内体逃脱机制两者。其它聚合物诸如 Atelocollagen和壳聚糖容许对皮下肿瘤异种移植物及对骨转移的治疗性影响。siRNA也可以直接与设计为帮助靶向性投递的分子实体偶联。鉴于siRNA双链体的性质，无活性或有义链的存在促成理想的偶联位点。偶联物的例子是亲脂性偶联物诸如胆固醇、或基于适体的偶联物。还使用阳离子肽和蛋白质来与siRNA双链体的带负电荷的磷酸酯主链形成复合物。可以使用这些不同的投递方法来将PlacSsiRNA靶向到相关组织，特别是脂肪组织中。对于此类靶向，可以将siRNA偶联至与前脂肪细胞和脂肪细胞相互作用的不同分子， 如例如与脂质转运体相互作用的配体、受体、胰岛素受体或本领域中已知的任何分子。本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含作为活性成分的依照本发明的 PlacS的调控剂。这些药物组合物包含有效剂量的至少一种依照本发明的调控剂和至少一种药学可接受赋形剂。依照想要的药学形式和施用路径在本领域技术人员已知的惯常赋形剂中选择所述赋形剂。本发明还在于一种用于调控脂肪生成的方法。可以使用所述方法来治疗肥胖或相关疾病。还可以使用所述方法以便以美容目的降低脂肪积累。PlacS活性调控剂可用于调控脂肪生成的治疗学，特别可用于治疗和预防肥胖相关病症，特别是2型糖尿病、血脂异常、血压升高、胰岛素抗性、心血管病症和更一般地代谢综合征。
依照本发明的另一个方面，其涉及一种用于治疗上述病理学的方法，其包括对患者在体内施用有效剂量的依照本发明的PlacS调控剂。合适的单位剂量形式包括口服形式，诸如片剂、硬或软明胶胶囊、粉剂、粒剂和口服溶液或悬浮液、舌下、含服、气管内、眼内、鼻内形式、通过吸入、表面、经皮、皮下、肌肉内或静脉内形式、直肠形式和植入物。对于表面应用，本发明的化合物可以作为乳剂、凝胶剂、 软膏剂或洗剂使用。依照通常的实践，适合于每名患者的剂量由内科医生依照施用路径、患者的重量和响应来决定。PlacS抑制剂也可用于美容应用，以降低有失体面的脂肪积累。对于美容应用，可以在适合于表面使用的配制剂中掺入PlacS抑制剂。PlacS抑制剂可以是小分子或siRNA， 如先前所描述的。本发明现在通过参照以下实施例进行描述，所述实施例仅是例示性的，而并不意图限制本发明。实施例附图简述

图1 至关重要的脂肪组织调节基因的选择。维恩图(Verm diagram)显示了基于下列标准选择基因。A)高脂肪饲养在皮下(SCAT或Sq)和内脏(VAT)中的相似调节。选择151种基因(对于SCAT为48种，而对于VAT为88种)。B)那151种基因中，通过利莫那班处理调节的基因的选择(对于SCAT为14种，而对于VAT为M种)。这导致在这两种组织中通过高脂肪饮食和利莫那班调节的34种基因的选择。那些基因中，16种具有与L、M 和H组重量相关的表达水平(肥胖有联系的)，而18种在每个亚组中以相同水平受HFD调节(肥胖无联系的)。图2 在多种组织和细胞类型中的Plac8表达。A)Plac8的Northern印迹，其显示了多种小鼠组织中的mRNA表达脾、肌肉(腓肠肌)、心、肺、肾、肝、褐色脂肪组织(BAT)、皮下(SCAT)和内脏(VAT)脂肪组织。作为对照，用亚甲蓝对膜染色。在右侧显示了 PlacSmRNA 的大小。B至E 通过RT-PCR测量的Plac8的mRNA水平。B)在野生型和0b/0b小鼠(n = 5) *ρ < 0. 05的SCAT和VAT中，数据以均值士 sd显示，并以相对于设置于1的对照SCAT的倍数增加表示。C)在小鼠的基质血管级分(stromal vascular fraction, SVF)和分离的脂肪细胞中(n =为每次提取而合并的5只小鼠，将实验重复3次，显示了一项代表性的实验)。数据以相对于SCAT SVF表达的倍数增加表示。D)在人全组织SCAT和VAT、分离的脂肪细胞、分离的前脂肪细胞和体外分化的脂肪细胞中。数据以相对于任意设置于1的全组织SCAT表达的水平表示。E)在DMI处理前第-2天和DMI处理后直至第7天的3T3-L1细胞中。N=2_3组细胞。数据以相对于第0天的表达的水平表示。图3 =ShRNA对Plac8表达和活性的敲低。A)将shRNA转染入细胞中。将含有针对Plac8的shRNA序列的pSIREN逆转录病毒质粒与pCMVSPORT表达质粒共转染。作为shRNA构建体的对照，我们使用针对萤火虫萤光素酶蛋白的shRNA (shRNA萤光素酶)。在 Plac8方面测试3种shRNA。B)用含有针对萤光素酶(shLuc)或Plac8 (shPlac8)的shRNA 的逆转录病毒转导3T3-L1细胞。分化前通过RT-PCR来测量mRNA水平。C)在第9天的分化的3T3-L1的油红0照片。D)在第9天与在C)中相同的细胞中通过RT-PCR测量的aP2 (分化标志物)mRNA 表达。结果以均值士 sd 表示，*，P < 0. 05,**, P < 0. 01 ；*#，P < 0.005。 η = 3。图4 :Plac8cDNA在3T3-L1细胞系中的过表达。A)用表达Plac8的鼠cDNA的逆转录病毒或空逆转录病毒作为对照转导的3T3-L1。在第0天通过RT-PCR测量的PlacSmRNA 表达。B)用含有PlacScDNA的构建体或空构建体逆转录病毒(对照)转导的分化的3T3-L1 的皿在第4天和第9天的油红0照片。C)在第9天在相同细胞中通过RT-PCR测量的 PPARy 2(分化标志物)mRNA表达。结果以均值士sd表示，*，P < 0. 05，**，P < 0. 01。η =3。材料和方法动物处理给C57BL/6J小鼠(其是有肥胖倾向的(Collins等2004))喂养高脂肪饮食(HFD) 达6个月。6个月的HFD后，小鼠展现出离散的体重，具有不同程度的葡萄糖不耐性(通过葡萄糖耐受性测试所测量的)。将HFD小鼠分成3组，它们展现出相同水平的葡萄糖不耐性，但是具有低(L)、中等(M)或高(H)体重，并用媒介物(vehicle)或利莫那班(10mg. kg—1. 天_0处理它们及正常食物(chow) (NC)喂养小鼠达一个月以正常化(normalize)它们的体重。RNA制备、标记和cDNA微阵列上的杂交使用peqGOLD Trifast (peqlab)和氯仿-异戊醇Q4 1)提取从内脏和皮下脂肪组织提取来自每组5只不同小鼠的RNA。用异丙醇沉淀RNA，并通过在RNeasy柱 (Qiagen)上流过来纯化。在用Bioanalyzer 2100 (Agilent)扩增前和后检查RNA质量。将 RNA进行逆转录，并用MessageAmp 试剂盒(Ambion)来扩增RNA。类似地扩增小鼠通用参照物(Clontech)，并依照发表的方案(De Fourmestraux等，2004)通过用Cy5和Cy3的间接技术来标记脂肪组织和参照RNA两者。将经标记的RNA与在洛桑大学(University of Lausanne) DNA阵列工厂制备的含有17664种cDNA的微阵列杂交。进行扫描、图像、和质量控制分析，如先前所发表的(de Fourmestraux 等，J.Biol. Chem. 2004 279 =50743-53) 将数据以10 强度比率(Cy5/Cy3)表示，用打印尖端(print tip)局部加权线性回归(Lowess) 方法来标准化(normalize)，并基于点质量(spot quality)和不完全注释来过滤。用在综合R档案网络(Comprehensive R Archive Network) (cran.us.r-project.org/)可获得的用于统计学计算的R软件来进行所有分析。细胞培养将3T3-L1 细胞在具有 10% FBS(Gibco)的 DMEM(Gibco)中于 5% CO2 培养。逆转录病毒感染(参见下文)后，容许细胞在100-mm或60-mm皿中在具有10% FBS的DMEM中生长至汇合。一旦达到汇合，将细胞暴露于含有地塞米松(dexamethasone) (ΙμΜ)、胰岛素 (5μ g/ml)、和异丁基甲基黄嘌呤(0. 5μΜ) (DMI)的分化培养基。2天后，将细胞在含有胰岛素(5yg/ml)的培养基中维持，直至准备好于在第7天收获。油红0染色分化7至10天后，将细胞在PBS中清洗一次，并用甲醛(Formalde-Fresh ；Fisher) 固定15分钟。如下制备染色溶液，即将0. 5g油红0在IOOml异丙醇中溶解；混合60ml此溶液与40ml蒸馏水。于室温1小时后，将染色溶液过滤，并添加至皿达4小时。然后，除去染色溶液，并用蒸馏水清洗细胞两次。shRNA 构建体使用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (Clontech)来构建 shRNA。通过询问 Whitehead siRNA 算法(http ://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/)及来自 Clontech 的 siRNA 设计者软件(http ://bioinfo. clontech. com/rnaidesigner/)来设计 Plac8 的靴序列；使用EcoRI和BamHl限制性位点将由这两种算法呈现的至少两种序列亚克隆入pSIREN 载体(Clontech)中。选择三种下列的 Plac8 靴序列SEQ ID NO. 5 (shPlac8_l)、SEQ ID NO. 6 (shPlac8-2)和SEQ ID NO. 7 (shPlac8_3)；作为阴性对照，使用针对萤光素酶的siRNA 序列，其具有序列SEQ ID NO. 8 (shLuc)。shRNA构建体的转染在293T HEK细胞中测试shRNA的特异性，所述293T HEK细胞使用记载于Jordan， Μ.，等Q004)的磷酸钙方法用含有Plac8cDNA(SEQ ID NO. 21)的表达载体和表达针对萤光素酶(对照 shLUC)或 Plac8(shPlac8)的 shRNA 的 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen 载体共转染。转染后M小时对细胞RNA提取物进行RT-PCR分析。逆转录病毒构建体的生成和逆转录病毒感染在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (pSIREN Clontech)或 pMSCV 嘌呤霉素质粒(pMSCV，Clontech)中构建逆转录病毒。使用记载于Jordan，M.，等Q004)的磷酸钙方法与编码gag-pol和VSV-G蛋白的构建体一起将病毒构建体转染入^3HEK包装细胞中。在存在3μπι曲古抑菌素(Trichostatin)A(Sigma)的情况中在48小时后收获上清液，并立即使用或快速冷冻，并于_80°C贮存，供以后使用。在存在PolybreneQy g/ml)的情况中将病毒上清液添加至细胞达6小时，并用新鲜的培养基稀释两倍，再持续15小时。过表达构建体使用表达GFP标志物的经修饰的pMSCV嘌呤霉素逆转录病毒载体(来自 Clontech)来使Plac8cDNA进入细胞中过表达。将cDNA(SEQ ID NO. 21)以钝端插入来自 pMSCV的多克隆位点的hpal限制性位点中。对所得的集落测试正确的取向，并通过酶切割来选择。选择正确的克隆，将其扩增，并用于逆转录病毒感染3T3-L1细胞。自脂肪组织分离脂肪细胞和基质血管级分(SVF)通过(X)2吸入来对8周龄雄性C57BL/6J小鼠(n = 6-8)实施安乐死，收集附睾(内脏)和皮下脂肪组织，并在含有10mg/ml脂肪酸不多的BSA(Sigma-Aldrich Jt. Louis,MI) 的DMEM培养基中放置。将组织切碎成细块，然后在0. 12个单位/mL I型胶原酶(Sigma) 中于37°C在摇动水浴(80Hz)中消化1小时。然后，将样品过滤通过无菌250μπι尼龙网孔(Scrynel NY250HC, Milian)以除去未消化的碎片。将所得的悬浮液于1100RPM离心 10分钟以分开SVF与脂肪细胞。取出脂肪细胞，并用DMEM缓冲液清洗。然后，将它们在 peqGOUyTriFast试剂(Axonlab)中悬浮，并依照制造商的指令来分离RNA。将SVF级分在红细胞裂解缓冲液(0. 154mM NH4CiaOmM KHCO3,0. ImM EDTA)中温育2分钟。然后，将细胞于1100RPM离心10分钟，并在500 μ 1 peqGOLD iTriFast试剂(Axonlab)中重悬浮，用于 RNA分离。RNA提取和实时PCR使用peqGOLD Trii^ast试剂依照制造商的指令(Axonlab)从培养的细胞分离总RNA0 使用随机引物和 Superscript II(Invitrogen)来从 0. 5 μ g 总 RNA 合成第一链 cDNA。 使用Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem)来进行实时PCR。对小鼠基因使用下列引物SEQ ID NO. 9(Plac8-正向)、SEQ ID NO. 10 (Plac8_反向)、SEQ ID NO. 11 (PPAR γ 2_F)、 SEQ ID NO. 12(PPPARy 2-R) , SEQID NO. 13 (Ap2_F)、SEQ ID NO. 14 (Ap2_R)、SEQ ID NO. 15(亲环蛋白A-F)、SEQ ID NO. 16 (亲环蛋白A-R)。对人基因使用下列引物SEQ ID NO. 17 (hPlac8-F)、SEQ ID NO. 18 (hPlac8_R)、SEQ ID NO. 19 (h 亲环蛋白 A-F)和 SEQID NO. 20 (h亲环蛋白A-R)。Northern 印迹使用peqGOLD TriFast试剂依照制造商的指令(Axonlab)来分离来自各种小鼠组织的总RNA。将总RNA(8 μ g)在1，2%琼脂糖/甲醛凝胶上分开，并过夜转染至尼龙膜。为了作为RNA数量加载的对照，用亚甲蓝对膜染色，之后进行随后的杂交。对于检测PlacS信号， 使用来自全长cDNA小鼠质粒的探针(Open Biosystem)。通过用[α -32p] dCTP (Amersham) 进行随机启动来标记探针。使用Quiclchib方法依照制造商的指令(Stratagene)来实施杂交和清洗。将印迹于_80°C暴露于Hyperfilm ECL(Amersham)达1天或数天，这取决于信号强度。结果实施例1 微阵列结果对微阵列数据进行生物信息学分析以鉴定满足下列三项标准的基因(i)受到高脂肪饮食的调节，(ii)在内脏和皮下脂肪两者中的表达受到高脂肪饮食相似的调节和 (iii)其表达通过利莫那班处理实现相似的正常化(图1)。在所使用的CDNA微阵列上存在的约17，000种基因靶物中，34种基因满足这些标准，其列于表1中。显著地，先前已知这些基因中的 10 种，即 Cavl、Fgfl、Fndc3b、Kif5b、Mest、Npr3、Pik3ca、Sparc、Vldlr、和 Wwtrl是脂肪组织发育和功能的重要调节剂。这些基因中有一些具有与体重增加相关的表达水平(在表1中以灰色显示)，这提示在肥胖期间在脂肪组织的增生和/或肥大中的潜在作用。这些结果证实用于为肥胖的治疗性处理鉴定可能的新型靶物的办法。最重要的是，表1中所引用的许多基因尚未在脂肪组织发育或生物学背景中进行过研究。这些基因属于下列种类的功能胞外基质/细胞相互作用、细胞骨架、胞内信号传导、酶、和转录因子/辅因子。它们有可能牵涉组织重建，且特别是脂肪细胞发育。这些基因之一，即PlacS基因及其在脂肪细胞生物学中的作用在本文中呈现，而且构成本发明的一个方面。如本发明中所使用的Plac8的小鼠和人序列分别对应于SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 3。
权利要求
1.用于调控脂肪生成的PlacS活性抑制剂。
2.依照权利要求1的抑制剂，其降低脂肪生成。
3.依照权利要求1或2的抑制剂，其用于治疗肥胖及相关病症。
4.依照权利要求1或2的抑制剂，其用于降低内脏和/或皮下脂肪积累。
5.依照前述权利要求中任一项的抑制剂，其中所述抑制剂是小分子。
6.依照前述权利要求中任一项的抑制剂，其中所述抑制剂是小干扰RNA。
7.依照权利要求7的抑制剂，其中所述siRNA是具有与SEQID NO. 5或SEQID NO. 6或 SEQ ID NO. 7对应的序列的ShRNA0
8.PlacS活性抑制剂用于制备用于调控脂肪生成的药物的用途。
9.具有序列SEQID NO. 6或SEQ ID NO. 7的核酸。
10.作为对Plac8转录抑制特异性的siRNA的核酸。
11.用于筛选PlacS活性抑制剂的方法，包括a)用包含与报告基因连接的PlacS启动子的报告构建体转染细胞系；b)在容许所述报告基因表达的条件中培养所述细胞系；c)将候选化合物添加入所述细胞培养物中，并d)将抑制剂化合物鉴定为是那些具有降低或抑制所述报告基因表达的能力的化合物。
12.包含PlacS活性抑制剂和至少一种药学可接受赋形剂的组合物。
13.依照权利要求12的组合物，其用于治疗肥胖及相关疾病。
14.依照权利要求12的组合物，其用于降低内脏和/或皮下脂肪积累。
15.调控脂肪生成的方法，其在于对有所需要的患者施用PlacS抑制剂以调控脂肪生
全文摘要
本发明关注Plac8，即一种牵涉脂肪生成调控的新型靶物。使用siRNA方法，发明人证明了前脂肪细胞和脂肪组织中Plac8活性的降低诱导脂肪生成的降低。如此，本发明涉及Plac8活性的调控剂以及用于鉴定此靶物活性的调控剂的筛选测试，及其调控脂肪生成并且如此治疗肥胖及相关病症的用途，尤其在药物组合物中。
文档编号C07K14/47GK102203128SQ200980144014
公开日2011年9月28日 申请日期2009年11月5日 优先权日2008年11月7日
发明者伯纳德·索伦斯, 卡林·波辛, 玛丽亚·吉门内兹, 迪亚纳·霍尔 申请人:赛诺菲-安万特