专利名称：拟南芥花青素pap1纯化蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种拟南芥色素调控蛋白基因的克隆、原核 表达与蛋白纯化，拟南芥花青素papl纯化蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
花色苷是广泛分布于植物中的次生代谢物，它是来源于苯丙氨酸的一类类黄酮， 它是水溶性的，在细胞质中合成，最终定位到液泡；它提供了从橘色/红色到紫色/蓝色一 系列的颜色。另外花色苷可能对于氧化胁迫所导致大脑皮层的紊乱有治疗作用，还可以提 高由于卵巢切除而导致雌激素缺乏的小鼠的学习和记忆能力。近年来许多研究表明花色苷 具有包括抗氧化、抗炎症、抗菌、抗癌和降低冠心病的发病率一系列的生理活性。部分myb 类转录因子在转录水平上调节花色苷的生物合成，拟南芥Pap基因就属于调节花色苷生物 合成的myb类基因。到目前为止，所有的高等植物的花色苷途径都是由包括Myb、bHLH和 WD40的一套转录因子调控的；与其它植物不同，在拟南芥中PAPl (Myb)/bHLH/WD40复合物 能够作用于整个苯基丙酸类合成途径；但是，拟南芥的Myb类调节因子还未完全鉴定清楚， 并且对TTGl-依赖型转录复合物调节的花色苷途径还知之甚少。papl在转录水平上调节花 色苷的生物合成，因此许多学者对papl进行了大量研究，包括基因的克隆、papl转拟南芥、 番茄、烟草愈伤组织等，但是现有技术尚没有对于AtPAPl蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的在于获得纯化PAPl蛋白，用于制作PAPl多克隆抗体。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案拟南芥花青素papl纯化蛋白，由下述方法制备而得(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1. 3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘( 5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATC AAATTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的 原核表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥 紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进 行扩增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒， 通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行 双酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h， 获得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在 IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。拟南芥花青素papl纯化蛋白的制备方法，包括下述步骤(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1. 3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘( 5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATC AAATTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的 原核表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥 紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进 行扩增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体上，采用碱裂解法提取质粒， 通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行 双酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h， 获得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在 IPTG诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。拟南芥花青素papl纯化蛋白在制备Myb抗体中的应用。拟南芥花青素papl纯化蛋白在Myb蛋白表达检测中的应用。本发明利用RT-PCR技术从拟南芥紫红色叶片中克隆papl全长cDNA，然后再利 用原核表达系统将该基因在大肠杆菌BL21中进行表达，然后采用镍柱法纯化，获得拟南芥 PAPl的纯化蛋白。本发明papl基因的克隆、原核表达和纯化根据NCBI已报道序列(NM_104M1.3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5 ‘ (5CC ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATCAAA TTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核 表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点。以拟南芥紫红 色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶(Promega公司)合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和 PAP1-T3'进行扩增。回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体(宝生物工程有限公司，Takara) 上，采用碱裂解法提取质粒，通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl。构建原核表达载体使用NcoI和XhoI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行双酶切分别获得papl 基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获得原核表达载体
pET32已一papl0PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在IPTG诱导下摸索最佳表 达条件，在最适条件下进行大量表达。PAPl蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。
图1 为总 RNA ；图2为pap 1基因的扩增；图3为papl的大量扩增；图4为papl胶回收；图5为papl菌液的PCR检测；图6为NcoI禾口 XhoI双酶切；图 7 为 pET32a_papl 质粒；图 8 为 3h_paplPCR 检测；图9为NcoI和XhoI双酶切检测；图 10 中 M :protein marker-0431 ；1 对照，IPTG 未诱导的总蛋白；2、3、4、5 =ImM IPTG分别诱导2、4、6、8h的总蛋白；图11为原核表达载体pET3h_papl的构建。
具体实施例方式下面结合附图，用本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此 来限定本发明。实施例1 试剂与仪器试剂主要为分子生物学实验试剂。各种限制性内切酶、Long-taq聚合酶、Taq聚 合酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连，Takara)产品，反转录酶为 ftOmaga公司的，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzol Reagent RNA提 取试剂盒购自irwitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器设备。所有引物序列合成和基因测序均在上海生工(上海，Sangon)进行。本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。本发明papl基因的克隆、原核表达和纯化方法基本步骤根据NCBI已报道序列 (NM_104541. 3)的完整阅读框架，设计引物 PAP1-T5‘ (5CCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3‘，划 线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3' (5' CTCGAGCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线 处为酶切位点》ιοΙ)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核表达研究，分别在PAP1-T5'和 PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点。以拟南芥紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV 反转录酶(Promega公司)合成cDNA后使用PAP1-T5'和PAP1-T3'进行扩增。回收papl全长片段，并将其连接到pMD18_T载体(宝生物工程有限公司，Takara) 上，采用碱裂解法提取质粒，通过酶切检测获得重组质粒pMD18-papl。构建原核表达载体使用NcoI和BioI对质粒pMD18_papl和pET3h_xyk进行双酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获得原核表达载体
pET32已一papl0PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在IPTG诱导下摸索最佳表 达条件，在最适条件下进行大量表达。PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。纯化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。具体地，RNA的提取试验材料为花期拟南芥的紫红色叶片，叶片总RNA的提取采用异硫氰酸胍法，提 取的RNA于-20°C保存备用。拟南芥papl基因的克隆根据已有序列(NM_104M1. 3)的完整阅读框架设计引物PAP1-T5' (5CCATGGAGGG TTCGTCCAAAGGG3‘，划线处为酶切位点，下同)和 PAP1-T3‘ (5' CTCGAGCTAATCAAATTTCAC AGTCTCTCCATC3 ‘)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核表达研究，分别在PAP1-T5 ‘和 PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点。以拟南芥紫红色叶片总RNA为模板，用M-MLV 反转录酶(Promega公司)合成cDNA后使用PAP1-T5'和PAP1-T3'进行扩增。扩增产物 在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。PCR产物回收后与pMDIS-T 载体连接(目的片段 DNA0. 1-0. 2pmol ;T-载体 50μ g/ml、0. 5μ 1 ligation Solution I 3μ 1，16°C连接8-12h)，转化Ε. coliDH5a，得到重组子pMD-papl (将感受态大肠杆菌 E. co 1 i DH5 α 100 μ 1加入质粒体系6 μ 1中；混合液冰浴20min，42 °C热刺激45s，冰浴 2min ；加入 900 μ 1 SOC, 37°C摇床 200rpm 60min ；培养结束后，IOOOOrpm 离心 Imin ；在超净 台上吸去上清，剩余约0. Iml时，用枪混勻，接入带有抗性的LB平板上，用无菌三角玻璃棒 涂布均勻；37°C过夜培养；挑取阳性菌落进行验证)并送至上海生工生物工程公司测序。测 序后与NCBI中进行序列同源性分析。原核表达载体的构建及诱导表达提取质粒pMD-papl后用NcoI和B10I双酶切并回收papl片段。将该片段连接至 经同样酶切的质粒pET-3h (+)上形成重组载体pET-pap 1，转化至表达宿主菌BL21，挑取阳 性菌落，筛选鉴定后进行诱导表达。将含有pET-papl重组菌株于LB液体培养基中37°C振 荡培养过夜，按1 100的比例接种于相同的LB培养基上培养至OD6tltl为0. 6-0. 8，加IPTG 至终浓度为ImM，分别培养0、2、4、6、》!后收集菌液用于分析总蛋白。4 °C、12000rpm离心 lmin，弃上清液，沉淀用IOOyL SDS凝胶加样缓冲液(Tri s_HCl 50mM, pH 6. 8 ；SDS 2% ； DTT IOOmM ；溴酚蓝0. 1%;甘油10%)重悬，煮沸5min，12000rpm离心lmin，取20 μ L上清 液进行SDS-PAGE检测。用考马斯亮蓝R-250染色(0. 1 %考马斯亮蓝R-250，40%甲醇，10% 冰乙酸)，脱色(25%甲醇，6%冰乙酸)后记录结果。重组蛋白的可溶性分析PAPl蛋白的纯化大量诱导表达后的菌体经超声波裂解菌体，40C 12000rpm离心20min，分别保留上 清和沉淀。上清部分使用Ni柱进行纯化，先上低盐缓冲液平衡柱材，然后上清液上柱，重悬柱材，冰浴30min，弃去流出液，15倍柱体积低盐缓冲液洗脱，10倍柱体积高盐缓冲液洗脱， 5倍柱体积低盐缓冲液洗脱，2倍柱体积洗脱液洗脱，收集样品液。SDS-PAGE检测对比上清、 沉淀及纯化结果。
权利要求
1.拟南芥花青素papl纯化蛋白，由下述方法制备而得(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1.3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5' (5CC ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATCAAA TTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核 表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥紫红 色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进行扩 增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到PMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒，通过 酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和BioI对质粒pMD18-papl和pET3h_xyk进行双 酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获 得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在IPTG 诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白，纯 化后的蛋白用于制作Myb抗体和Myb蛋白表达检测。
2.拟南芥花青素papl纯化蛋白的制备方法，包括下述步骤(1)根据NCBI已报道序列(NM_104M1.3)的完整阅读框架，设计引物PAP1-T5' (5CC ATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG3 ‘，划线处为酶切位点 NcoI)和 PAP1-T3 ‘ (5' CTCGAGCTAATCAAA TTTCACAGTCTCTCCATC3 ‘，划线处为酶切位点)(hoI)进行cDNA全长扩增，为方便后续的原核 表达研究，分别在PAP1-T5'和PAP1-T3'的5'端引入NcoI和XhoI位点；以拟南芥紫红 色叶片总RNA为模板，用M-MLV反转录酶合成cDNA后使用PAP1-T5 ‘和PAP1-T3 ‘进行扩 增；(2)回收papl全长片段，并将其连接到PMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒，通过 酶切检测获得重组质粒pMD18-papl ；(3)构建原核表达载体使用NcoI和BioI对质粒pMD18-papl和pET3h_xyk进行双 酶切分别获得papl基因和pET3h载体，跑电泳后分别进行回收，然后在16°C连接16h，获 得原核表达载体pET3h-papl ；(4)PAPl蛋白原核表达使用热刺激法将pET3h-papl转入大肠杆菌BL21中，在IPTG 诱导下摸索最佳表达条件，在最适条件下进行大量表达；(5)PAPl蛋白纯化收集菌体，进行超声破碎，过镍柱进行纯化，收集纯化后的蛋白。
3.权利要求1所述拟南芥花青素papl纯化蛋白在制备Myb抗体中的应用。
4.权利要求1所述拟南芥花青素papl纯化蛋白在Myb蛋白表达检测中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种拟南芥色素调控蛋白基因的克隆、原核表达与蛋白纯化，拟南芥花青素pap1纯化蛋白及其制备方法和应用。本发明利用RT-PCR技术从拟南芥紫红色叶片中克隆pap1全长cDNA，然后再利用原核表达系统将该基因在大肠杆菌BL21中进行表达，然后采用镍柱法纯化，获得拟南芥PAP1的纯化蛋白。拟南芥花青素pap1纯化蛋白在制备Myb抗体中的应用和拟南芥花青素pap1纯化蛋白在Myb蛋白表达检测中的应用。
文档编号C07K16/16GK102120762SQ20101017250
公开日2011年7月13日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者张晓东, 李昆志, 梅岩, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学