专利名称：一种3′，5′-环腺苷单磷酸的结晶方法
技术领域：
本发明属于结晶技术领域，具体涉及一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法。
背景技术：
3'，5，-环磷酸腺苷(3'，5' -cyclic adenosine monophosphate)是蛋白激酶致活剂，是核苷酸的衍生物。3'，5’-环磷酸腺苷是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性， 改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。目前有关3’，5’ -环腺苷单磷酸结晶的研究鲜有文献报道。在2000年出的版的 《最新生化药物制备技术》中报道，在化学合成的3’，5’ -环腺苷单磷酸结晶工艺，加等体积的95%乙醇，用2mol/L盐酸调pHl 2，即析出白色结晶，过滤，取结晶干燥，得成品cAMP， 母液回收，收率62. 48%。由于化学合成过程中添加了如吡啶、三氯氧磷等毒性较大的试剂， 且反应不完全，副产物多，最终导致后续分离结晶收率很低。另外，在中国专利CN1702076A 中公开了直接用冷冻干燥法对3’，5’ -环腺苷单磷酸浓缩液进行结晶，但由于冷冻干燥法仅能除去溶液中的水分，虽然收率为100%，但产品的纯度并没有进一步提升，且真空冷冻干燥设备投资大，能源消耗成本较高，限制了该技术的工业化应用。
发明内容
3’，5’-环腺苷单磷酸上的磷酸基的解离平衡常数的pK值为3. 3 3. 9，调节溶液的ρΗ即可改变它的存在形式，如下式，当pH > pK时，3’，5’-环腺苷单磷酸上的磷酸基将与碱反应生成对应的3’，5’-环腺苷单磷酸盐，当pH < pK时，3’，5’-环腺苷单磷酸盐将与酸反应生成3’，5’ -环腺苷单磷酸。cAMP · H++NaOH = cAMP · Na++H20cAMP · Na++HCl = cAMP · H++NaCl因此，本发明的目的是提供一种新的高收率的3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法， 采用反应-低温相结合的结晶技术取代溶剂强析方法和冷冻干燥方法，以克服现有3’， 5’ -环腺苷单磷酸结晶技术中产品质量差，收率低的缺点。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。本发明提供一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法，所述方法包括以下步骤1)将3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，生成3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液；幻将步骤1)中反应生成的3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，生成3’，5’ -环腺苷单磷酸；3)于0 15°C，优选为0 10°C，更优选为5 10°C下保存步骤2)中反应生成的3’，5’ -环腺苷单磷酸，即得。优选地，所述步骤1)中3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液pH值为pH 6. 0 10. 0，优选为pH 6. 0 9. 0，更优选为pH 6. 5 8. 0。优选地，所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种，其浓度为2 10M，优选为3 6M，更优选为3 5M。优选地，所述步骤1)中的3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的浓度为15 350g/L，优选为 150 200g/L。优选地，所述步骤2)中的反应温度为10 40°C，优选为15 35°C，更优选为 30 35 。优选地，所述步骤幻中3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，直至溶液pH 值为pH 1. 0 3. 5，优选为pH 1. 5 3. 0，更优选为pH 2. 0 2. 5。优选地，所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种，其浓度为0. 01 10M，优选为0. 05 8M，更优选为2 4M ；优选地，所述步骤幻中的酸以按3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液体积的0.01 0. 5% /min的流速，优选为0. 04 0. 4% /min，更优选为0. 1 0. 4% /min的流速缓慢加入至3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液中。优选地，所述步骤2)中加入酸的过程中还包括以20 250rpm的搅拌速度，优选为90 200rpm，更优选为100 150rpm的搅拌速度进行搅拌。优选地，所述步骤3)中的保存时间为5 25小时，优选为5 20小时，更优选为18 20小时。优选地，所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤幻所得产品的步骤。优选地，所述方法包括以下步骤1)用3 5M氨水或氢氧化钠与浓度为150 200g/L的3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液反应，生成3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液， 溶液PH值为pH 6. 5 8.0 ；2)将步骤1)中生成的3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液于30 35°C下与浓度为2 4M的酸进行反应，直至溶液pH值为pH 2. 0 2. 5 ;3)在5 10°C下保存步骤幻中得到的产物18 20小时，抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后，即得。优选地，所述步骤2)中的酸以0. 1 0. 4ml/min的流速缓慢加入至3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液中； 优选地，所述加入酸的过程中还包括以100 150rpm的搅拌速度进行搅拌的步骤。此外，本发明还提供了一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的制备方法，所述方法包括采用上述的方法使3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液结晶的步骤。本发明还可采用以下技术方案来实现。一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法， 用2 IOM氨水或氢氧化钠与浓度为15 350g/L 3，，5，-环腺苷单磷酸水溶液反应生成 PH在6 10之间的3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在10 40°C，搅拌转速控制在20 250rpm，按水溶液体积的0. 01 0. 5% /min的流速加入浓度为0. OlM 10. OM的酸进行反应结晶，直到水溶液的pH值为1. 0 3. 5为止，停止搅拌，在0 15°C下保存5 25h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥即得纯度高于99%的3’， 5’-环腺苷单磷酸晶体。其中，优选的氨水或氢氧化钠浓度为3 6M。其中，3’，5’_环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液PH控制在6 9之间。其中，优选的是温度保持在15 35°C，搅拌转速控制在90 200rpm。其中，优选的是按3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0. 1 0. 4% /min的流速加入浓度为0. 05M 8. OM的酸。上述酸为硫酸、盐酸或磷酸溶液。其中， 优选的是直到3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液的pH值为1. 5 3. 0为止，停止搅拌。其中，优选的是在0 10°C下保存5 20h。最优选的技术方案如下用3 5M氨水或氢氧化钠与浓度为150 200g/L 3’， 5’-环腺苷单磷酸水溶液反应生成pH为6. 5 8. 0之间的3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在30 35°C，搅拌转速控制在100 150rpm，按初始 3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液体积的0. 1 0. 4% /min的流速加入浓度为2 4M的酸，直到3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2. 0 2. 5为止，停止搅拌，在5 10°C下保存 18 20h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥，即得3’，5’ -环腺苷单磷酸晶体。由此可见，本发明所提供的3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法，在结晶产品收率和质量方面比常规结晶方法具有明显的提高，结晶产品收率稳定在92%以上，产品纯度达到 99%以上。另外，本发明所提供的结晶体系和制备方法操作时间短，减少了结晶过程中3’， 5’ -环腺苷单磷酸的生物降解和色素杂质增加，而且生产过程在常温下进行，无需要特殊的加热和冷却装置，节约投资成本，操作过程更加易于控制，重复性好。可见，采用本发明提供的结晶方法，可以明显改善最终产品质量，结晶收率高，操作简单，重复性好，适合3’， 5’ -环腺苷单磷酸的工业化生产。本发明所提供的3’，5’_环腺苷单磷酸的结晶方法，尤其适用于发酵法合成的3’， 5’ -环腺苷单磷酸，即利用微生物核苷酸代谢途径，以次黄嘌呤为底物，通过一系列生物酶催化反应，最终合成3’，5’ -环腺苷单磷酸，将合成的3’，5’ -环腺苷单磷酸发酵液先经过预处理和离子交换柱层析后，然后经纳滤膜浓缩脱盐，最后进入结晶罐进行结晶。微生物合成法具有成本低，污染性小，杂质少，分离纯化工艺简单等特点，再加上本发明所提供的结晶方法，使其更加适合于该技术的工业化应用。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。在以下各实施例和对比例中，原料3’，5’ -环腺苷单磷酸可以通过以下描述的方法制备，但是不应理解为对本发明的限制，任何通过商购途径获得的3’，5’ -环腺苷单磷酸都可以使用本发明提供的方法进行结晶。1)发酵将节杆菌A302 (分类命名ArthrcAacter sp.，于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 3584)接入种子培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖1 %，蛋白胨1 %，酵母膏0. 5 %，牛肉膏 l%,NaCl 0. 3% )中，初始pH为7. 0，在30°C、240rpm下培养18小时。以10%的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖5%，K2HPO4 1%, KH2PO4 1 %, MgSO4 1%，尿素0.5%，蛋白胨0.5% )的基础上每升培养基添加0. Ig NaF, 0. Ig VBl和5g次黄嘌呤)中，以NaOH控制pH为7.0，溶氧控制为30%，400rpm、30°C下发酵72小时。放罐时，环磷酸腺苷的产量是5. 0 10. Og/L。然后将发酵液通过离心机离心去除菌体，再将离心清液透过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质，可得到浓度范围在5.0 10. Og/L的3’，5’ -环腺苷单磷酸清液。
2)分离纯化用500g阴离子交换树脂(Amberlite IRA900RF Cl类)填充固定床，平衡后将浓度为5. 31g/L的3’，5’ -环腺苷单磷酸清液上柱，8. 098L后吸附饱和，然后用0. 25mol/L的氨水进行洗杂，洗杂完毕后，再用0. 3mol/L的HCl进行洗脱16h，洗脱液的体积为14. 048L，浓度为2. 96g/L，得到的3，，5，-环腺苷单磷酸纯度为95. 0 %，收率为 96. 7%。3)粗结晶洗脱液再经过浓缩后，采用3 5M氨水或氢氧化钠与浓度为150 200g/L 3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液反应，生成pH为6. 5 8.0之间的3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，然后置于结晶罐中，温度保持在30 35°C，搅拌转速控制在100 150rpm,按初始3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液体积的0. 1 0. 4% /min的流速加入浓度为 2 4M的酸，直到3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液的pH值为2. 0 2. 5为止，停止搅拌，在 5 10°C下保存18 20h，再经抽滤、乙醇洗涤、真空干燥，即得3’，5’-环腺苷单磷酸粗结晶，其纯度为97 98%。检测3’，5’ -环腺苷单磷酸的高效液相色谱的最佳条件如下色谱柱汉邦Lichrospher-5-C18色谱柱Q50mmX4. 6mm i. d. ,5ym)；流动相甲醇_6%。(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6. 6)(体积比为25 75)；流速 0. 8mL/min ；检测波长255nm ；柱温为室温；进样体积20 μ L。采用外标一点法定量。在以下各实施例中，结晶收率是通过最终结晶得到的3’，5’ -环腺苷单磷酸质量除以进入结晶罐即投料的3’，5’ -环腺苷单磷酸质量，再乘以100%计算得到；纯度是通过高效液相色谱检测到的3’，5’-环腺苷单磷酸峰面积除以所有峰的总面积，再乘以100%计算得到。实施例1用5Μ氨水与3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐溶液0. 95L，控制pH 8. 0，置于结晶罐中，在30°C下控制搅拌速度150rpm，以初始3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0. 2% /min(即1. 9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液，直至pH值为2. 0时停止加酸，降温至5°C，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’ -环腺苷单磷酸晶体 166. lg，结晶收率为93. 5%，纯度99. 4% ο实施例2用3M氨水与3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为105g/L 3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐溶液1L，控制pH 7. 0，置于结晶罐中，在35°C下控制搅拌速度200rpm，以初始 3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0. 4% /min(即4mL/min)的流速缓慢加入浓度为3M 的硫酸溶液，直至PH值为2. 5时停止加酸，降温至5。C，保存18h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’_环腺苷单磷酸晶体96. 71g，结晶收率为92. 10%，纯度99.4%。实施例3用3M氢氧化钠与3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为185g/L 3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸钠盐溶液1. 5L，控制pH 8. 0，置于结晶罐中，在30°C下控制搅拌速度200rpm， 以初始3’，5’ -环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0. 4% /min(即6mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的硫酸溶液，直至pH值为2. 0时停止加酸，降温至5°C，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’ -环腺苷单磷酸晶体 256. 97g，结晶收率为92. 6%，纯度99. 3%0对比例1用5M氨水与3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸铵盐溶液0. 95L，控制pH 8. 0，置于结晶罐中，在30°C下控制搅拌速度150rpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸铵盐溶液体积的0. 2% /min(即1. 9mL/min)的流速缓慢加入浓度为2M的磷酸溶液，直至pH值为2. 0时停止加酸，在25°C下保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤，用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’-环腺苷单磷酸晶体153. Sg, 结晶收率为86.6%，纯度99. 2%。对比例2用3M氢氧化钠与3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸水溶液反应生成浓度为187g/L 3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸钠盐溶液2L，控制pH 8. 0，置于结晶罐中，在40°C下控制搅拌速度lOOrpm，以初始3’，5’-环腺苷单磷酸钠盐溶液体积的0. 1% /min(即2mL/min)的流速缓慢加入浓度为 3M的盐酸，直至pH值为3. O时停止加酸，降温至5°C，保存20h，结晶完全后将悬浊液抽滤， 用乙醇洗涤所得的白色晶体，真空干燥，可以得到3’，5’_环腺苷单磷酸晶体319. 32g，结晶收率为85. 38%，纯度98. 3%0
权利要求
1.一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的结晶方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)将3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，生成3’，5’ -环腺苷单磷酸盐溶液；2)将步骤1)中反应生成的3’，5 ’ -环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，生成3 ’，5 ’ -环腺苷单磷酸；3)于0 15°C，优选为0 10°C，更优选为5 10°C下保存步骤2)中得到的3’，5’_环腺苷单磷酸，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，直至溶液PH值为pH 6 10，优选为pH 6 9，更优选为pH 6. 5 8. 0 ； 优选地，所述碱选自氨水和氢氧化钠溶液中的一种或几种，其浓度为2 10M，优选为3 6M，更优选为3 5M ；更优选地，所述3’，5’ -环腺苷单磷酸水溶液的浓度为15 350g/L， 优选为150 200g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中3’，5’_环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，直至溶液PH值为pH 1. 0 5. 0，优选为pH 1. 5 4. 0，更优选为pH 2. 0 2. 5 ；优选地，所述酸选自硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种，其浓度为0. 01 10M， 优选为0. 05 8M，更优选为2 4M。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的反应温度为10 40°C，优选为15 35°C，更优选为30 35°C。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中的酸以按3’， 5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0. 01 0. 5% /min的流速，优选为0. 04 0. 4% /min，更优选为0. 1 0. 4% /min的流速缓慢加入至3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液中；优选地，所述加入酸的过程中还包括以20 250rpm的搅拌速度，优选为90 200rpm，更优选为100 150rpm的搅拌速度进行搅拌。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中的保存时间为5 25小时，优选为5 20小时，更优选为18 20小时。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括抽滤、乙醇洗涤和真空干燥步骤幻所得产品的步骤。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1)用3 5M氨水或氢氧化钠与浓度为150 200g/L的3’，5’-环腺苷单磷酸水溶液反应，生成3’，5’ -环腺苷单磷酸铵盐或钠盐溶液，溶液pH值为pH 7. 5 8. 5 ；2)将步骤1)中生成的3，，5，-环腺苷单磷酸盐溶液于30 35°C下与浓度为2 4M 的酸进行反应，直至溶液PH值为pH 2. 0 2. 5 ；3)在5 10°C下保存步骤2)中得到的产物18 20小时，抽滤、乙醇洗涤和真空干燥后，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中的酸以按3’，5’-环腺苷单磷酸盐溶液体积的0. 1 0.4%/min的流速缓慢加入至3’，5’_环腺苷单磷酸盐溶液中； 优选地，所述加入酸的过程中还包括以100 150rpm的搅拌速度进行搅拌的步骤。
10.一种3’，5’ -环腺苷单磷酸的制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求 1至9中任一项所述的方法使3’，5’ -环腺苷单磷酸结晶的步骤。
全文摘要
本发明提供一种3′，5′-环腺苷单磷酸的结晶方法。本发明所提供的方法包括1)将3′，5′-环腺苷单磷酸水溶液与碱进行反应，生成3′，5′-环腺苷单磷酸盐；2)将步骤1)中反应生成的3′，5′-环腺苷单磷酸盐溶液与酸进行反应，生成3′，5′-环腺苷单磷酸；3)于0～15℃下，保存步骤2)中得到的3′，5′-环腺苷单磷酸，即得。本发明所提供的方法可以明显改善最终产品质量，结晶收率高，操作简单，重复性好，适合3′，5′-环腺苷单磷酸的工业化生产。
文档编号C07H19/213GK102268057SQ201010191528
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者应汉杰, 林晓清, 柏建新, 熊健, 钱文斌, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学