专利名称：一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法
技术领域：
本发明涉及双向电泳蛋白质样品的制备方法，具体涉及一种双向电泳乌贼墨囊全 蛋白样品的制备方法。
背景技术：
蛋白质组分析是研究墨囊中蛋白质的自身变化及周围环境刺激相应的重要技术 手段，有利于深入了解其对墨囊发育及功能完善的作用，达到控制墨囊发生的目的。要顺 利开展墨囊蛋白质组学研究，关键技术之一是墨囊组织中蛋白质样品的制备。公开号为 CN101260146，名称为一种苹果属植物蛋白质双向电泳方法的发明专利申请，公开了将苹果 材料在液氮中研碎，加入_20°C预冷的含10%的三氯乙酸和0. 07%的β巯基乙醇的丙酮溶 液中勻浆，-20°C下放置1小时，然后离心，重复6次将沉淀物中加入4倍体积的含有0. 07% 的β巯基乙醇的丙酮溶液，-20°C下放置1小时，离心，最后得到蛋白质样品，对蛋白质样品 进行等电聚焦电泳和垂直凝胶电泳的双向电泳分析。由于乌贼墨囊中杂质成份复杂，如色 素、多糖和核酸等都可干扰双向电泳过程，因此目前还没有制备双向电泳乌贼墨囊全蛋白 样品的研究报道，所以未发现乌贼墨囊全蛋白的双向电泳分析的研究，从而导致乌贼墨囊 相关的蛋白质组研究滞后。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方 法，该方法可以有效去除乌贼墨囊中色素、多糖和核酸等干扰双向电泳过程的杂质，为乌贼 墨囊全蛋白双向电泳创造了条件，为乌贼墨囊相关的蛋白质研究打下了基础。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样 品的制备方法，包括下述步骤1)将液氮研磨的墨囊粉末溶于_20°C预冷的含质量百分浓度为10%的三氯乙 酸和0. 02%的二硫苏糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末与所述丙酮溶液的质量体积比为 1 10-20，在-20°C条件下静置1小时，然后在4°C，IOOOOg条件下离心，得到首次沉淀物；2)上述首次沉淀物用质量浓度为75%的酒精清洗后，在4°C，IOOOOg条件下再次 离心，得到再次沉淀物；3)将上述再次沉淀物在4°C条件下干燥，然后加入裂解液，所述裂解液含有浓度 为7mo 1 /L的尿素，2mo 1 /L硫脲，40mmo 1 /L三羟甲基氨基甲烷，6mmo 1 /L 二硫苏糖醇，Immo 1 /L 的苯甲基黄酰氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二钠，40g/L的3_[3_(胆酰胺丙基)二甲氨基] 丙磺酸内盐，750ug/L的亮肽素，5ml/L的两性电解质，所述裂解液与所述墨囊粉末的体积 质量比为2-4 1，在4°C条件下静置1小时，然后在4°C，10000g条件下离心4小时，收集 上清液得到乌贼墨囊全蛋白粗提液；4)在上述乌贼墨囊全蛋白粗提液中加入水化上样缓冲液，所述水化上样缓冲液含 有浓度为7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫苏糖醇，40g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，5ml/L的两性电解质，10g/L的溴酚蓝，混合均勻得到乌贼墨囊全蛋 白双向电泳样品液，其中每300u 1乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液中含有300-350ug乌贼
墨囊全蛋白。与现有技术相比，本发明的优点在于一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方 法，通过丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等杂质使墨囊粉末全蛋白沉淀分离，用酒精清洗掉 丙酮，然后用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上样缓冲液稀释，得到乌贼墨囊全蛋白双向 电泳样品液，且每300ul乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液中含有300-350ug乌贼墨囊全蛋 白；该方法可以有效去除乌贼墨囊中色素、多糖和核酸等干扰双向电泳过程的杂质，为乌贼 墨囊全蛋白双向电泳创造了条件，为乌贼墨囊相关的蛋白质研究打下了基础，且该方法简 单易行，快速，具有较大的实际应用价值。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法，称取液氮研磨的墨囊粉末Ig溶 于IOml经-20°c预冷的含质量百分浓度为10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫苏糖醇的丙酮 溶液中，在-20°C条件下静置1小时，然后在4°C，IOOOOg条件下离心，得到首次沉淀物；将 上述首次沉淀物用质量浓度为75%的酒精清洗后，在4°C，IOOOOg条件下再次离心，得到再 次沉淀物；将上述再次沉淀物在4°C条件下干燥，然后加入2ml裂解液，裂解液中含有浓度 为7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羟甲基氨基甲烷，6mmol/L 二硫苏糖醇，lmmol/ L的苯甲基黄酰氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二钠，40g/L的3_[3_(胆酰胺丙基)二甲氨 基]丙磺酸内盐，750ug/L的亮肽素，5ml/L的两性电解质，在4°C条件下静置1小时，然后 在4°C，IOOOOg条件下离心4小时，收集上清液得到乌贼墨囊全蛋白粗提液；在上述乌贼 墨囊全蛋白粗提液中加入水化上样缓冲液，水化上样缓冲液中含有浓度为7mol/L的尿素， 2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫苏糖醇，40g/L的3_[3_(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐， 5ml/L的两性电解质，10g/L的溴酚蓝，混合均勻得到乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液，其 中每300ul乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液中含有300-350ug乌贼墨囊全蛋白。实施例2一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法，与实施例1基本相同，所不同的 只是-20°C预冷的含质量百分浓度为10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫苏糖醇的丙酮溶液 为20ml，裂解液为4ml。实施例3一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法，与实施例1基本相同，所不同的 只是-20°C预冷的含质量百分浓度为10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫苏糖醇的丙酮溶液 为15ml，裂解液为3ml。
权利要求
一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)将液氮研磨的墨囊粉末溶于-20℃预冷的含质量百分浓度为10％的三氯乙酸和0.02％的二硫苏糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末与所述丙酮溶液的质量体积比为1∶10-20，在-20℃条件下静置1小时，然后在4℃，10000g条件下离心，得到首次沉淀物；2)上述首次沉淀物用质量浓度为75％的酒精清洗后，在4℃，10000g条件下再次离心，得到再次沉淀物；3)将上述再次沉淀物在4℃条件下干燥，然后加入裂解液，所述裂解液含有浓度为7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羟甲基氨基甲烷，6mmol/L二硫苏糖醇，1mmol/L的苯甲基黄酰氟，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，40g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，750ug/L的亮肽素，5ml/L的两性电解质，所述裂解液与所述墨囊粉末的体积质量比为2-4∶1，在4℃条件下静置1小时，然后在4℃，10000g条件下离心4小时，收集上清液得到乌贼墨囊全蛋白粗提液；4)在上述乌贼墨囊全蛋白粗提液中加入水化上样缓冲液，所述水化上样缓冲液含有浓度为7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L二硫苏糖醇，40g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐，10g/L的溴酚蓝，5ml/L的两性电解质，混合均匀得到乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液，其中每300ul乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液中含有300-350ug乌贼墨囊全蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种双向电泳乌贼墨囊全蛋白样品的制备方法，通过丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等杂质让墨囊粉末全蛋白沉淀分离，用酒精清洗掉丙酮，然后用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上样缓冲液稀释，得到乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液，且每300ul乌贼墨囊全蛋白双向电泳样品液中含有300-350ug乌贼墨囊全蛋白；该方法可以有效去除乌贼墨囊中色素、多糖和核酸等干扰双向电泳过程的杂质，为乌贼墨囊全蛋白双向电泳创造了条件，为乌贼墨囊相关的蛋白质研究打下了基础，且该方法简单易行，快速，具有较大的实际应用价值。
文档编号C07K14/435GK101886991SQ20101019629
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者宋微微, 母昌考, 王春琳, 詹萍萍 申请人:宁波大学