专利名称：菲律宾蛤仔酶解多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种菲律宾蛤仔酶解多肽，本发明还涉及该多肽的分离方法。
背景技术：
菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)，隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲 (Bivalvia)、帘蛤科(Veneridae)的海洋生物，俗称花蛤，是我国四大养殖贝类之一。花蛤肉组织蛋白含量高，脂肪含量低，并含有丰富的维生素和微量元素，具有良好的营养保健功能。中医认为，蛤肉有滋阴明目、软坚化痰之功效。近代研究证明，菲律宾蛤仔提取物具有提高免疫力、抑制细胞微核形成、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗菌等作用[1_6]。大量研究已证实，机体代谢所产生的超氧化物阴离子(02_)、过氧化氢(H2O2)、过氧化自由基(ROO)和羟自由基(-0H)等自由基可以造成细胞膜、DNA和蛋白活性的损伤，并与动脉硬化、脑卒中、阿尔茨海默病、肥胖、白内障以及肝脏疾病等多种人类疾病相关[7_11]。因此，近些年来，对于抗氧化活性物质的分离提取及作用机理成为研究热点。饮食中的蛋白质在肠道主要以多肽和氨基酸形式被吸收，其中多肽在机体抗氧化过程中起着重要的作用[1°]。截止目前，利用酶解方法从陆地生物蛋白中获取了大量的抗氧化活性肽，而对于酶解海洋生物蛋白得到抗氧化多肽的报道相对较少，其中，对菲律宾蛤仔肉蛋白进行酶解提取抗氧化多肽的研究尚为见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种抗氧化活性高的菲律宾蛤仔酶解多肽。本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种抗氧化活性高的菲律宾蛤仔酶解多肽制备方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Trp Pro His。—种如上述的菲律宾蛤仔酶解多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤①取菲律宾蛤仔的均浆液加水稀释后用胰蛋白酶进行酶解，酶解后离心、过滤，取上层酶解液；②将上层酶解液经过超滤膜，截取3KDa分子量以下的酶解液，用 DEAEkpharoseFF阴离子交换柱进行洗脱，出现前、后两个肽峰，分别用磷酸缓冲液和 0. lmol/L的NaCL进行洗脱，并分别进行收集；③对前肽峰经反相高效液相色谱，出现一主峰，并对该主峰进行收集，然后收集的样品进行氨基酸序列检测，确认为Asp Trp Pro His。作为优选，步骤①中所述的胰蛋白酶pH值为7. 8，酶解问题为37°C，酶解时间为M 小时，90°C灭酶15分钟，4°C下离心。
作为优选，步骤②中所述阴离子交换柱的柱型为2. 6X 50cm，上样体积为3mL，洗脱速度为lml/min，用220nm进行紫外检测。作为优选，步骤③中的所述反相高效液相色谱的色谱条件为C18反相柱，填料 ODS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水为流动相，流速为0. 8ml/min，上样体积为20 μ L，检测波长 220nm。与现有技术相比，本发明的优点在于菲律宾蛤仔酶解多肽抗氧化性高，具体表现在羟自由基清除率、DPPH自由基和还原力均可高于VitC，经过超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱纯化，可分离出目标活性肽，工艺简单可靠。
图1为各种蛋白酶对每克菲律宾蛤仔后可得到氨基氮值的柱状图。图2为各种酶解物对羟自由基清除率的柱状图。图3为DEAE SepharoseFF柱洗脱后的峰值图。图4为RT-HPLC洗脱后的峰值图。图5为目标肽羟自由基清除率坐标图。图6为目标肽DPPH自由基清除能力坐标图。图7为目标肽还原力测定器吸光值坐标图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。酶解工艺流程取-20°C冷藏的菲律宾蛤仔肉组织放入30°C水浴锅中解冻，勻菜，将勻浆液加3倍体积蒸馏水，木瓜白酶pH为5，温度为50°C，加酶量为1200u/g ；胰蛋白酶pH为7. 8，温度为37°C，加酶量为1200u/g ；胃蛋白酶pH为2. 4，温度为37°C，加酶量为1200u/g ；碱性蛋白酶PH为8. 5，温度为45°C，加酶量为1200u/g ；分别保温酶解Mi，90°C灭酶15min，4°C下 8500r/min离心15min，取上清液。水解度测定水解度的测定参照赵新淮等方法(赵志淮，冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定 [J].食品科学，1994，179(11) :65-67.)，并稍作修改。取20ml酶解溶液置于烧杯中，加水 60mL,开动磁力搅拌器，用0. 05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8. 2。加入IOmL甲醛溶液混勻，再用0. 05mol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9. 2，记下消耗氢氧化钠标准的毫升数，同时取水80mL做试剂空白试验。按下列公式计算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量与水解度成正相关。X= (V1-V2) X CX0. 014X100 (5 X V)式中，X为样品中氨基氮的含量(g/100mL) ；Vl为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液(HiL) ；V2为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积 (mL)；V为样品液取用量(mL) ；C为氢氧化钠标准液的浓度(mol/L) ；0. 014为氮的毫摩尔质量(g/mmoL)。
抗氧化活性的测定羟自由基清除率的测定参考金鸣等所述方法(金鸣，蔡亚欣，李金荣，等.邻二氮菲_Fe2+氧化法检测 H202/Fe2+产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展，1996，23 (6) :553-555.)，并做适当调整。取浓度为0. 75mmol/L邻二氮菲ImL于试管于，依次加入pH值为7. 4的磷酸缓冲液2mL，样品液lmL，充分混勻，然后加入浓度为0. 75mol/L的硫酸亚铁lmL，混勻， 加入0. 12% H2021mL，37°C水浴90min，于536nm处测其吸光度，为As ；用ImL蒸馏水代替 lmLH202,为Ab ；用ImL蒸馏水代替ImL样品液，为Ap。清除率(%) = (As-Ap)/(Ab-Ap) X 100%还原力的测定参照 Oyaizu 方法(Song LY, Li TF, Yu RM, et al. Antioxidant activities of hydrolysates of Area subcrenata prepared with three proteases[J]. Mar Drugs, 2008,6(4) =607-619.)并略有改动。取样品溶液2mL加入到2mL0. 2mol/L(PH6. 6)磷酸盐缓冲液和2mL 1 %的铁氰化钾中充分混合，50°C保温20min后加入2mL10%的三氯乙酸混合， 取aiiL，加入2mL蒸馏水和0. 4mL0. 1 %的三氯化铁，反应IOmin后，在700nm处测定吸光值， 吸光值高表明还原力高。同时测定不同浓度Vit C的还原力作为对比。DPPH自由基清除能力的测定取样品液2mL及lX10-4mol/L DPPH溶液2mL加入一具塞试管中摇勻，在室温下闭光反应30min，用纯溶剂作参比，于517nm波长下测定吸光度。根据下列公式计算清除率清除率=[I-(AS-ASB)/AC] X 100%其中AS为加样品液后DPPH溶液的吸光度；ASB为样品液的吸光度；ASB为未加样品液时DPPH溶液的吸光度。测定抗氧化剂Vit C对DPPH自由基的清除率作为对比。抗氧化多肽的制备酶解物按分子量大小分级分离取400g花蛤肉经胰蛋白酶酶解，离心后取上清液，使用超滤杯及截取分子量分别为3KDa和5KDa的超滤膜，在20°C环境中将上清液分别超滤llh，截取获得3KDa以下、3 5KDa和5KDa以上分子量的酶解液，冷冻干燥后分别测抗氧化活性。DEAE SepharoseFF 阴离子交换对抗氧化活性最强的组分用DEAE SepharoseFF阴离子交换柱洗脱，柱型 2. 6 X 50cm,上样体积3mL,分别用磷酸缓冲液、0. Imol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L的NaCL溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为加丨/！^！！，于观此!!!进行紫外监测，自动部分收集器每管4mL进行收集，将不同肽峰分别收集冷冻干燥后贮存备用。反相高效液相色谱(RT-HPLC)RT-HPLC进行纯化。色谱条件C18反相柱，填料0DS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水为流动相，流速为0. 8ml/min,上样体积为20 μ L，检测波长220nm。洗脱条件乙腈浓度为15%，洗脱20min，重复上样。目标肽的氨基酸序列检测数据处理各组实验数据测定均做3个平行实验，结果取其平均值。各组数据之间采用单因素方差分析，用t检验进行组间均数的比较，使用SPSS 13. 0进行数据分析。水解度及抗氧化活性胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶分别对菲利宾蛤仔肉酶解后，每克肉可得到的氨基氮依次为6. 2418mg,6. 3648mg、5. 2637mg、7. 456ang(如图1所示)；当浓度为2. 5mg/mL时，各酶解物对羟自由基的清除率分别为46. 55%,65. 43%、34. 31 %和 57. 27%，而经典抗氧化剂维生素C的羟自由基清除率为72. 04%，各数据间差异显著(P <0.05=(如图2所示)。由于胰蛋白酶酶解物清除羟自由基能力最强，故对其进行分离纯化。抗氧化多肽分离胰蛋白酶酶解液经超滤后，得到3个组分，即3KDa以下(Il)、3 5KDa(I2)、5KDa 以上(13)，冷冻干燥后分别得到3. 9g、2. 8g和3. 2g淡黄色粉末状样品，得率分别为0. 7%, 1.0%和0.8%。测定II、12和13的抗氧化活性，当浓度为lmg/mL时，它们对羟自由基的清除率分别为49. 36%、41. 65%和29. 44%，具有显著性差异(P < 0. 05)。对抗氧化活性较强的Il经DEAE kpharoseFF柱洗脱后，出现2个峰，即峰I(IIl)和峰22 (112)(图3)，分别为缓冲液和0. lmol/L NaCL溶液的洗脱组分，0. 3mol/L和0. 5mol/L的NaCL溶液没有明显的洗脱峰。收集IIl和112，冷冻干燥后分别得到1. 3g和0. 9g干燥样品，得率分别为0. 33% 和 0. 23%o 设置 0. 2mg/mL、0. 4mg/mL、0. 8mg/mL、1. 6mg/mL 和 3. 2mg/mL 共 5 个浓度组测定 III和112的羟自由基清除率(表1)。根据表1分析，IIl与112均有较强清除羟自由基的能力，且随着浓度增加，二者羟自由基清除率也增加。在各个浓度组，IIl对羟自由基的清除率大于Π2。表1
sample concentration(mg/ml)II1 clearance rate of hydroxy 1 radical(%)II2 clearance rate of hydroxy 1 radical(%)0.220.3819.620.432.2122.130.845.0127.761.656.1935.983.272.2553.76RT-HPLC 洗脱结果将IIl经反相高效液相色谱柱洗脱(图4)，在保留时间约为4. 5min时，出现一主峰(峰4)，峰高为1021. 8，峰面积为5190. 1，收集该峰，冷冻干燥后得到0. 37g样品III，得率为0. 1%，该目标肽的氨基酸序列为ASp-Trp-pro-HiS。目标肽抗氧化活性测定将样品设置为0. 5mg/mL、1. Omg/mL、1. 5mg/mL、2. 0mg/mL、2. 5mg/mL 共 5 个浓度梯度所测得的羟自由基清除率依次为42. 16%,55. 26%,63. 05%,69. 85%和79. 41%, DPPH 自由基清除能力为18. 13%,36. 86%,53. 39%,70. 04%和85. 91 %，还原力测定其吸光值分别为0. 129,0. 294,0. 429,0. 601,0. 736(图5，图6，图7)，各数据间具有显著性差异(P< 0. 05)。 本发明研究了菲律宾蛤仔组织蛋白经不同蛋白酶水解后的水解度及羟自由基清除率，其中，碱性蛋白酶酶解物水解度最大，而胰蛋白酶酶解物对羟自由基的清除力最强， 可见，不同蛋白酶对菲律宾蛤仔组织蛋白进行水解时，所得到的酶解多肽的抗氧化活性与其氨基酸组成及其结构有关，而与水解度之间没有必然的关联。用超滤膜截取胰蛋白酶酶解液得到3个不同分子量的组分都具有清除羟自由基活性，但以Il活性最大，由此可推测，酶解物的抗氧化性能除了与其组成及结构有关外，可能还与其分子量大小有关。Il经 DEAE-sepharoseFF阴离子交换和RP-HPLC分离纯化后，最终得到1个抗氧化性能较好的多肽III，该肽对羟自由基的清除率随着浓度增加而增大，IC50约为0. 8mg/mL ；当浓度为 2. 5mg/mL时，与Vit C相比，III的羟自由基清除率、DPPH自由清除率及氧化还原力相对较高，具有开发为食品添加剂及医药品的潜能。但是本研究仅仅考查了酶解多肽的体外抗氧化活性，因此，进一步研究酶解多肽对体内各种自由基的清除能力，对于将其开发成新型抗氧化产品十分必要。
权利要求
1.一种菲律宾蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列 Asp Trp Pro His。
2.一种如权利要求1所述菲律宾蛤仔酶解多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤①取菲律宾蛤仔的均浆液加水稀释后用胰蛋白酶进行酶解，酶解后离心、过滤，取上层酶解液；②将上层酶解液经过超滤膜，截取3KDa分子量以下的酶解液，用DEAEkpharoseFF阴离子交换柱进行洗脱，出现前、后两个肽峰，分别用磷酸缓冲液和0. lmol/L的NaCL进行洗脱，并分别进行收集；③对前肽峰经反相高效液相色谱，出现一主峰，并对该主峰进行收集，然后收集的样品进行氨基酸序列检测，确认为Asp Trp Pro His。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤①中所述的胰蛋白酶pH值为 7. 8，酶解温度为37°C，酶解时间为24小时，90°C灭酶15分钟，4°C下离心。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤②中所述阴离子交换柱的柱型为 2. 6 X 50cm，上样体积为3mL，洗脱速度为lml/min，用220nm进行紫外检测。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤③中的所述反相高效液相色谱的色谱条件为CW反相柱，填料0DS ；柱型10 X 250mm ；乙腈/水为流动相，流速为0. 8ml/ min，上样体积为20 μ L，检测波长220nm。
全文摘要
一种菲律宾蛤仔酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列Asp Trp Pro His。本发明还公开了该多肽的制备方法。与现有技术相比，本发明的优点在于菲律宾蛤仔酶解多肽抗氧化性高，具体表现在羟自由基清除率、DPPH自由基和还原力均可高于VitC，经过超滤、阴离子交换、及反相高效液相色谱纯化，可分离出目标活性肽，工艺简单可靠。
文档编号C07K1/18GK102372765SQ20101025374
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者丁国芳, 庄黛娜, 徐银峰, 杨最素, 杨永芳, 郁迪, 郑玉寅, 闫海强, 黄芳芳 申请人:浙江海洋学院