专利名称：一种制备高纯度辅酶q10的纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属化合物分离纯化技术领域，涉及生物医药产品辅酶QlO的纯化工艺，尤 其涉及从一种来自菌体发酵得到的辅酶Qio粗提物中分离纯化辅酶QlO的工艺。
背景技术：
辅酶QlO (coenzyme Q10)又称泛醌，是一种脂溶性醌类化合物，结构与维生素K相 近。它在自然界中分布广泛，主要存在于酵母、植物叶子、种子及动物的心、肝和肾的细胞 中。美国学者Frederick 1957年首次从牛心肌中分离得到辅酶Q10，它与线粒体内膜 相结合，参与细胞氧化磷酸化及ATP生成过程。最近的研究发现，辅酶QlO还对癌症、心血 管疾病、帕金森氏病及艾滋病等多种疾病具有预防和治疗作用，并具有增强和调节人体免 疫力等作用。辅酶QlO是线粒体呼吸链的重要成员之一。辅酶QlO现有的生产方法分为四种动植物组织提取法，化学合成法，茄尼醇半合 成法和微生物发酵法。其中微生物发酵由于其生产成本较低，被公认为最具潜力及优势的 生产方法。而且，现行的生产技术大多采用微生物发酵方法。制约辅酶QlO成本的一个重 要因素是下游提取纯化。如何以低成本的方法获取高纯度的辅酶Q10，成为纯化分离工作者 的研究重点。现行从发酵液中精制高纯度辅酶QlO的方法分为两步1.辅酶QlO粗提用有机溶剂提取法(特开平11-178595等)，醇碱皂化法(特开 昭56-072694等)粗提法，得到的粗提物产品纯度低，有机溶剂消耗量大且粗提率较低。2.粗提物纯化精制。精制方法有硅胶或者活性氧化铝柱层析(特开昭 56-164791，特开昭55-111793等)。但是现行的方法存在以下不足活性氧化铝成本较高 使其工业化应用成本上升；硅胶重复利用次数低；从而导致工业操作环境恶劣，容易造成 环境污染，使后续成本增加。
发明内容
本发明目的是，克服现有技术存在的缺点，针对发酵液辅酶QlO粗提物，提供一种 操作简单、成本低廉、硅胶与树脂重复利用率高的辅酶QlO纯化工艺。为达到上述目的，采用的技术方案是一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，依次 包括以下步骤(1)用有机溶剂A溶解辅酶QlO粗提物，并以2 3倍柱体积/小时的流速将该溶 液泵入装填有吸附树脂的玻璃柱中，达到漏穿点后，停止进样；(2)用有机溶剂B洗涤步骤(1)中的树脂柱，洗脱5倍柱体积后，改用有机溶剂C 洗脱树脂柱，得到辅酶QlO洗脱液；(3)将步骤(2)的辅酶QlO洗脱液浓缩，用有机溶剂D溶解静置于0°C下结晶12h， 重结晶2次；
(4)进一步对步骤(3)得到的晶体进行纯化精制，以成品质量层析硅胶质量比 为1 25上样，有机溶剂E作为洗脱剂，收集辅酶QlO洗脱液。步骤(1)中所述有机溶剂A是指乙醇，或者丙酮与水的体积比为(8 20) 1的 丙酮与水混合物。步骤(2)中所述有机溶剂B是指乙醇，或者丙酮与水体积比为(6 7) 1的丙 酮与水混合物。步骤(2)中所述有机溶剂C是指丙酮或乙酸乙酯。步骤(3)中所述有机溶剂D是指乙醇、丙酮或乙酸乙酯。步骤⑷中所述有机溶剂E是石油醚乙醚体积比为(15 25) 1或者正己 烷乙酸乙酯体积比为(20 30) 1的混合有机溶剂。步骤(1)中所述吸附树脂是指HZ系列816，818，820，830等非极性吸附树脂。与已有技术相比，本发明具有以下优点(1)选用吸附树脂，对辅酶QlO具有良好的吸附性能，解吸操作简单，稳定性好且 重复利用次数高，从而使工业化生产操作简便，缓解环境压力，溶剂皆可较易回收利用。(2)选用吸附树脂与硅胶层析方法结合，大大降低了硅胶纯化压力，与已有单一依 靠硅胶层析法相比，本发明中硅胶利用率高，不仅所需硅胶量小，而且重复利用10次以上 仍能保持良好的纯化效果(已有技术硅胶重复利用次数仅为3 4次)，从而可以减少硅 胶的废弃量。本发明具有操作简单、成本低廉、硅胶与树脂重复利用率高等优点，所得辅酶 QlO纯度彡98%，总收率彡75%。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，步骤如下(1)用有机溶剂A溶解辅酶QlO粗提物，并以2 3倍柱体积/小时的流速将该 溶液泵入装填有吸附树脂的玻璃柱中，达到漏穿点(流出液辅酶QlO浓度/初始溶液辅酶 QlO浓度=0. 05)后，停止进样；(2)用有机溶剂B洗涤步骤(1)中的树脂柱，洗脱5倍柱体积后，改用有机溶剂C 洗脱树脂柱，得到辅酶QlO洗脱液；(3)将步骤(2)的辅酶QlO洗脱液浓缩，用有机溶剂D溶解静置于0°C下结晶12h， 重结晶2次；(4)进一步对步骤(3)得到的晶体进行纯化精制，以成品层析硅胶质量比 1 25上样，有机溶剂E作为洗脱剂，收集辅酶QlO洗脱液，浓缩所得洗脱液减压干燥。步骤(1)中所述有机溶剂A是指乙醇，或者丙酮与水的混合物。所述丙酮与水的 混合物中，丙酮与水的体积比为(8 20) 1。步骤(2)中所述有机溶剂B是指乙醇，或者丙酮与水体积比为(6 7) 1的丙 酮与水混合物。步骤(2)中所述有机溶剂C是指丙酮或乙酸乙酯。步骤(3)中所述有机溶剂D是指乙醇、丙酮或乙酸乙酯。步骤⑷中所述E有机溶剂是指石油醚乙醚体积比为(15 25) 1或者正己烷乙酸乙酯体积比为(20 30) 1的混合有机溶剂。步骤(1)中所述吸附树脂是指市售HZ系列816，818，820，830等非极性树脂。实施例1称取辅酶QlO粗提物Ig溶于300ml乙醇中，以HZ816树脂填充分离柱，以2倍柱 体积/小时上样，上样结束后用乙醇溶液洗脱5倍柱体积，除去大部分杂质后改用丙酮溶液 洗脱2倍柱体积。将所得洗脱液减压浓缩，用IOOml乙醇将得到浓缩物溶解，在0°C下静置 12小时，重结晶2次可得93. 4%辅酶QlO晶体。将所得辅酶QlO晶体层析硅胶=1 25 上样，以正己烷乙酸乙酯=20 1作为洗脱剂，收集辅酶Q10，所得辅酶QlO溶液减压浓 缩干燥可得纯度> 98%晶体。实施例2称取辅酶QlO粗提物Ig溶于300ml丙酮水=8 1中。以HZ820树脂填充分 离柱，以3倍柱体积/小时上样，上样结束后用丙酮水=6 1溶液洗脱5倍体积，除去 大部分杂质后改用乙酸乙酯溶液洗脱2倍柱体积。将所得洗脱液减压浓缩，用50ml丙酮溶 液将得到浓缩物溶解，在0°C下静置12小时，重结晶2次可得92. 5%辅酶QlO晶体。将所 得辅酶QlO晶体层析硅胶质量比1 25上样，以正己烷乙酸乙酯体积比30 1作为 洗脱剂，收集辅酶Q10，所得辅酶QlO溶液减压浓缩干燥可得纯度> 98%晶体。实施例3称取辅酶QlO粗提物Ig溶于300ml丙酮水体积比为20 1的混合溶液中。以 HZ830树脂填充分离柱，以3倍柱体积/小时上样，上样结束后用丙酮水体积比为7 1 溶液洗脱5倍体积，除去大部分杂质后改用丙酮溶液洗脱2倍柱体积。将所得洗脱液减压 浓缩，用30ml乙酸乙酯将得到浓缩物溶解，在0°C下静置12小时，重结晶2次可得91. 4% 辅酶QlO晶体。将所得辅酶QlO晶体层析硅胶质量比1 25上样，以石油醚乙醚体积 比25 1作为洗脱剂，收集辅酶Q10，所得辅酶QlO溶液减压浓缩干燥可得纯度>98%晶 体。分别作辅酶QlO粗提物、标准样品和硅胶柱层析后辅酶QlO的HPLC图谱。由辅酶 QlO粗提物HPLC图与硅胶柱层析后辅酶QlO的HPLC图比较可明显看出，经过纯化后的辅酶 QlO已除去杂质。对比辅酶QlO标准样品图与硅胶柱层析后辅酶QlO的HPLC图可知，本工 艺纯化后的辅酶QlO成品与标准品图谱一致且纯度可达到>98%，说明本工艺可以达到了 纯化精制辅酶QlO的目的，且本纯化工艺具有纯度高、收率高、成本低、环境友好、操作安全 便捷等优点。
权利要求
一种制备高纯度辅酶Q10的纯化工艺，其特征在于依次包括以下步骤(1)用有机溶剂A溶解辅酶Q10粗提物，并以2～3倍柱体积/小时的流速将该溶液泵入装填有吸附树脂的玻璃树脂柱中，达到漏穿点后，停止进样；(2)用有机溶剂B洗涤步骤(1)中的树脂柱，洗脱5倍柱体积后，改用有机溶剂C 2倍柱体积洗脱树脂柱，得到辅酶Q10洗脱液；(3)将步骤(2)的辅酶Q10洗脱液浓缩，用有机溶剂D溶解静置于0℃下结晶12h，重结晶2次；(4)进一步对步骤(3)得到的晶体进行纯化精制，以成品与层析硅胶质量比为1∶25上样，有机溶剂E作为洗脱剂，收集辅酶Q10洗脱液。
2.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(1)中 所述有机溶剂A是指乙醇，或者丙酮与水体积比为(8 20) 1丙酮与水的混合物。
3.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(2)中 所述有机溶剂B是指乙醇，或者丙酮与水体积比为(6 7) 1的丙酮与水混合物。
4.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(2)中 所述有机溶剂C是指丙酮或乙酸乙酯。
5.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(3)中 所述有机溶剂D是指乙醇、丙酮或乙酸乙酯。
6.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(4)中 所述有机溶剂E是石油醚乙醚体积比为(15 25) 1或者正己烷乙酸乙酯体积比为 (20 30) 1的混合有机溶剂。
7.如权利要求1所述一种制备高纯度辅酶QlO的纯化工艺，其特征在于步骤(1)中 所述吸附树脂是指市售HZ系列816，818，820，830等非极性吸附树脂。
全文摘要
本发明属化合物分离纯化技术领域，涉及一种从来自菌体发酵得到的辅酶Q10粗提物中，制备高纯度辅酶Q10的纯化工艺，其特征在于依次包括下列步骤将辅酶Q10粗提物经吸附树脂吸附、洗脱、浓缩、结晶、重结晶，然后上硅胶柱层析，以石油醚-乙醚或正己烷-乙酸乙酯混合溶剂作为洗脱剂纯化精制。本发明具有以下优点选用吸附树脂，对辅酶Q10具有良好的吸附性能，解吸操作简单，稳定性好且重复利用次数高；选用吸附树脂与硅胶层析方法结合，硅胶利用率高，不仅所需硅胶量小，而且重复利用10次以上仍能保持良好的纯化效果，硅胶废弃量少，溶剂可回收利用，有利环保。生产操作简便，所得辅酶Q10纯度≥98％。
文档编号C07C50/28GK101987815SQ201010293858
公开日2011年3月23日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者刘坐镇, 宁方红, 徐环昕, 江邦和, 洪晨江 申请人:华东理工大学;上海华震科技有限公司