专利名称：一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法
技术领域：
本发明涉及植物提取物技术领域，特别涉及一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟 基酪醇的方法。
背景技术：
油橄榄(Olea europaea L.)作为世界著名的木本油料树种，广泛种植于地中海地 区，现如今该地区已成为橄榄的主要生长地区，约占全世界油橄榄树种植面积的98%。油橄榄抗氧化生物活性成分主要是橄榄苦苷(oleuropein)、羟基酪醇 (hydroxytyrosol)、黄酮类(flavonoids)、木酚素类(Lignan)、咖啡酰苯乙醇苷类 (Caffeoyl phenylethanoid glycosides)等，而具有羟基酪醇母体结构的小分子二酚类化 合物最具有抗氧化活性作用，其中羟基酪醇和橄榄苦苷是国内外研究的热点。天然羟基酪醇主要存在于油橄榄果实、叶子和橄榄油的加工废水中，尤其是橄榄 苦苷和羟基酪醇在叶中的含量明显高于果实和树皮。羟基酪醇主要是以酯化物橄榄苦苷的 形式存在油橄榄的各个部位，在干燥的橄榄树叶子中约占6-9% (质量比)。橄榄苦苷不 稳定，极易受空气、阳光、酸、碱、酶、微生物、氧化剂、高温等因素的影响，发生氧化、缩合、螯 合等反应而遭受破坏，尤其是在酸、碱和酶的作用下易降解为羟基酪醇和榄香酸(elenolic acid)。在橄榄油加工过程中，为除去橄榄油中酸涩味道，加入无机酸水解橄榄苦苷可以得 到多酚类化合物，羟基酪醇是这些酚类混合物的主要成分。以化学方法合成羟基酪醇已有报道，Baraldi等人采用3，4_ 二羟基苯乙酸酯为原 料通过LiAlH1或NaBH1催化还原，但制备量仅为实验室儿克的规模，尤其是催化试剂昂贵， 工业化制备难。Juan Carlos采用生物酶法，以Vc为还原剂，酪醇在酪氨酸酶催化下转化为 羟基酪醇，但副产物多，羟基酪醇分离因难。目前的合成方法难实现批量制备羟基酪醇。研究发现羟基酪醇具有很多方面有益于人类健康的生物药理活性，深受生物医学 界的重视。药理研究表明羟基酪醇时一种非常强的自由基消除剂，可有效地消除内源性和 外源性丁基化自由基和氧化物。羟基酪醇的抗氧化性和对自由基的消除能力比其他一些合 成的和天然的抗氧化物质都高，抗氧化能力为羟基酪醇>橄榄苦苷>咖啡酸> VE > Vc > 酪醇> BHT。由于羟基酪醇含有二个酚羟基，更易穿透细胞膜，能改善心脏的冠脉血流、抑制 胶原诱导的血小板凝聚，更有效地保护香烟有毒成分丙烯醛造成的视网膜色素上皮细胞的 氧化损伤和线粒体功能失调。国外对油橄榄资源研究比较深入，特别是对其中的酚类物质的研究。很多研究利 用高分辨技术对橄榄油、果实和叶中酚类物质进行鉴定和定量分析，Bouazizda等在油橄榄 成熟期内，研究油橄榄叶中橄榄苦苷、羟基酪醇等酚类，芦丁、槲皮素等黄酮类的变化规律； Ryan等研究了两个生长期内，不同品种，不同部位，不同年份橄榄中羟基酪醇，橄榄苦苷等 几种酚类物质。国内对油橄榄叶资源还没有深入研究，对羟基酪醇的研究更少。专利号03815986 的中国专利来自橄榄植物液的富含羟基酪醇的组合物及其使用方法，运用酸水解橄榄叶中橄榄苦苷得到羟基酪醇，再进行色谱法的纯化，有些技术存在使用大量有机溶剂，存在溶剂 损耗、容易产生环境污染等问题，专利号200710057290的中国专利从橄榄提取液中提取羟 基酪醇的方法，其中直接利用买的油橄榄植物提取液进行树脂分离，同时运用了先进的分 子蒸馏的方法推动了油橄榄叶资源开发利用的一项技术，但其技术过于笼统，其中对原料 没有进行很好的选择，在分离纯化过程中虽也运用了儿种大孔树脂，但并没给出全面的数 据参数，以进行对比，因而在生产应用中存在不小问题，如何设计一套能贴合生产应用的经 济使用的生产工艺，同时又能保证对油橄榄叶有效成分进行综合利用成为关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，该方 法不仅简单方便，而且经济环保有效，适合大批量的制备。本发明的技术解决方案为一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，由以下步骤组成(1)从10个油橄榄品种叶中筛选高含量羟基酪醇的生产原料；(2)将筛选的新鲜油橄榄叶低温避光干燥，干燥温度低于20°C，破碎成0. 5cm以下 的粉末；(3)用C1-C3的醇或丙酮水溶液提取油橄榄叶粉末，醇或丙酮质量百分浓度 为30-100%，提取溶液与油橄榄叶粉末质量比为1-30 1，提取温度为25-65°C，时间为 10-60min，浸提次数1_5次，过滤，合并提取液；(4)在小于65°C温度下真空浓缩提取液，回收有机溶剂，控制浓缩液中有机溶剂 含量低于1 %，再加水稀释，过滤，经过大孔树脂分离，收集羟基酪醇洗脱部位，用中等极性 有机溶萃取3-5次，合并萃取相，低温真空浓缩，回收有机溶剂，溶缩液真空干燥，制备油橄 榄叶羟基酪醇精制品，羟基酪醇的含量为10% -60% ；(5)采用柱色谱分离橄榄叶羟基酪醇精制品，富集80% -98%羟基酪醇。本专利公开HPLC外标法测定羟基酪醇的纯度。以HPLC峰面积为纵坐 标，羟基酪醇质量(yg)为横坐标，绘制HPLC标准曲线，得HPLC线性回归方程为 Y = 179663. 8X-35982. 8，其相关系数为 r = 0. 9998。HPLC 色谱条件=C18ODS 色谱柱 沙4.6謹\200謹，5“111)，流动相甲醇-水(0.2%醋酸)体积比6 94，波长230nm，流速 lmL/min。精密吸取羟基酪醇标准品溶液10yL，重复进样5次，测定其峰面积，RSD = 0. 93%。精确称取油橄榄叶粉末lg，按实验方法中羟基酪醇溶液的制备方法制备其提取液， 然后将提取液均分为6份，其中一份用作空白样，其余5份分别定量加入0. 67mg/mL的羟基 酪醇标准品溶液，然后进样测定，每个样品进3次，取其峰面积平均值，得其加样回收率为 100. 5%，RSD = 0. 98%。结果表明该方法精密度和重现性良好。本发明采用HPLC方法分析羟基酪醇的含量变化规律，从城固32号、皮瓜尔、科拉 地、果达宁、九峰6号、配多灵、阿斯、小莱星、莱星、鄂植8号等10个油橄榄品种叶中筛选高 含量羟基酪醇的生产原料，结果表明，同一产地同一时期不同品种的油橄榄叶，羟基酪醇质 量分数有差异，10个品种油橄榄叶中羟基酪醇含量范围在0. 3% 0. 8%之间，羟基酪醇含 量大小顺序依次为小莱星>科拉地>阿斯>鄂植8号>九峰6号>果达宁>城固32号>
5莱星 > 皮瓜尔 >配多灵。 表1不同品种油橄榄叶中羟基酪醇的含量
权利要求
一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，由以下步骤组成(1)从10个油橄榄品种叶中筛选高含量羟基酪醇的生产原料；(2)将筛选的新鲜油橄榄叶低温避光干燥，干燥温度低于20℃，破碎成0.5cm以下的粉末；(3)用C1 C3的醇或丙酮水溶液提取油橄榄叶粉末，醇或丙酮质量百分浓度为30 100％，提取溶液与油橄榄叶粉末质量比为1 30∶1，提取温度为25 65℃，时间为10 60min，浸提次数1 5次，过滤，合并提取液；(4)在小于65℃温度下真空浓缩提取液，回收有机溶剂，控制浓缩液中有机溶剂含量低于1％，再加水稀释，过滤，经过大孔树脂分离，收集羟基酪醇洗脱部位，用中等极性有机溶萃取3 5次，合并萃取相，低温真空浓缩，回收有机溶剂，浓缩液真空干燥，制备油橄榄叶羟基酪醇精制品，羟基酪醇的含量为10％ 60％；(5)采用柱色谱分离橄榄叶羟基酪醇精制品，富集80％ 98％羟基酪醇。
2.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征在 于高含量羟基酪醇的生产原料为在每年的5-6月份采集6年以下油橄榄鲜叶，低于20°C避 光通风阴干，或50°C以下真空干燥，制备油橄榄叶干叶，其中含水量在3 % -8%，羟基酪醇 含量大于0.5%。
3.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征 在于羟基酪醇含量分析采用HPLC方法，HPLC色谱条件=C18ODS色谱柱(Φ4. 6mmX200mm, 5 μ m)，流动相甲醇-水(0. 2%醋酸)体积比6 94，波长220_250nm，流速lmL/min。
4.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征在 于10个油橄榄品种为城固32号、皮瓜尔、科拉地、果达宁、九峰6号、配多灵、阿斯、小莱星、 莱星、鄂植8号。
5.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征在 于，步骤(3)中所述油橄榄叶羟基酪醇提取方法为超声波和微波提取。
6.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征在 于，步骤⑷中所述的大孔树脂选择AB-8型或DM130型或DlOl型或X-5型或NKA-II。
7.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征 在于，步骤(4)中所述的大孔树脂分离选择醇-水溶液递度洗脱，醇浓度为0-80%，富集 0-40%醇-水溶液洗脱部分。
8.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征 在于，步骤(4)中所述的有机溶剂为乙酸乙酯和正丁醇中的一种或者两种任何比例的混合 液。
9.根据权利要求1所述一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，其特征在 于，步骤5中柱色谱分离可选择中压柱和高压色谱柱纯化。
10.根据权利要求9所述中压柱纯化羟基酪醇的方法，其特征在于中压柱纯化是将 10%-60%油橄榄叶羟基酪醇提取物与中压柱填料按质量比1 15-50吸附，中压柱填料可 选择200-500目的硅胶和氧化铝中的一种或二种任意比，洗脱剂为洗脱剂为石油醚乙酸 乙酯=10 0. 1-5 (ν/ν)，优选 10 2-3 (ν/ν)。中压柱柱长 20_300cm，柱直径 2_30cm，柱 压为3-20MPa，检测波长220280nm，流速2-200ml/min，富集羟基酪醇部位，室温真空回收溶剂，经HPLC分析，制备得到80%以上羟基酪醇。
11.根据权利要求9所述高压色谱柱纯化羟基酪醇的方法，其特征在于将 10% -60%油橄榄叶羟基酪醇提取物进行高压液相色谱分离制备，制备条件为色谱柱 0DSC18 (Φ IOmmX 250mm, 5 μ m)；流动相甲醇-水(0.2% 醋酸)体积比 6-20 94-80，波 长220-250nm，紫外220-270nm，流速l-3mL/min。富集羟基酪醇部位，室温真空回收溶剂， 经HPLC分析，制备得到90%以上羟基酪醇。
全文摘要
一种从油橄榄叶中高效富集高品质羟基酪醇的方法，通过从10个油橄榄品种叶中筛选高含量羟基酪醇的生产原料，采用超声波或微波提取，大孔树脂吸附和中压柱色谱分离，制备90％以上羟基酪醇提取物。与以往纯化方法相比，此种方法具有简便、快捷、经济，收率高等特点，适合工业化生产。
文档编号C07C39/11GK101973854SQ20101053534
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者原姣姣, 叶建中, 王成章, 董艳鹤 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所