能中和流感病毒h3n2的人结合分子及其应用的制作方法

专利名称：能中和流感病毒h3n2的人结合分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域。本发明特别涉及能中和各种甲型流感病毒亚型的人结合分子，包括针对包含H3亚型的HA的流感病毒如流感病毒H3N2的中和结合分子。本发明特别涉及包含H3亚型的HA的流感病毒、特别是流感病毒H3N2的感染的诊断、预防和/或治疗。
背景技术：
流感病毒是RNA正粘病毒，由甲、乙和丙三种类型组成。乙型和丙型流感病毒是主要的人病原体，甲型流感病毒感染各种鸟类和哺乳动物，包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动物中，大多数甲型流感病毒导致呼吸道和肠道的轻度局部感染。然而，也存在高致病性甲型流感病毒亚型如H5m，其导致家禽全身感染，死亡率可达到100%。甲型流感病毒的一些亚型在人类也导致严重疾病。甲型流感病毒基于编码表面糖蛋白的两个基因的抗原性区域中的等位基因变化而可以分成亚型，所述表面糖蛋白即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其是病毒粘附和细胞释放所必需的。其它主要的病毒蛋白包括核蛋白、核壳结构蛋白、膜蛋白(Ml和M2)、聚合酶(PA、PB和PB2)以及非结构蛋白(NSl和NS2)。目前已知甲型流感病毒的16个HA亚型 (H1-H16)和9个NA抗原变体(N1-N9)。流感病毒亚型根据其系统发生类群(phylogenetic group)可被进一步分类。系统发生分析(Fouchier et al. ,2005)已经证实分成两个主要类群的HA亚型(Air，1981)系统发生类群1中的HI、H2、H5和H9亚型及系统发生类群2 中的H3、H4和H7亚型(

图1)。仅有一些甲型流感病毒亚型(即H1N1、H1N2和H3N》在人群中传播，但是16个HA 和9个NA亚型的所有组合均已经在禽类动物中鉴别。感染甲型流感病毒的动物通常作为流感病毒的贮主，且一些亚型已经示出通过物种屏障进入人类，如高致病性甲型流感病毒株 H5N1。流感病毒感染是已知人类最常见的疾病之一，导致在世界范围内每年3-5百万的严重病例以及250，000-500, 000的死亡人数。流感在季节性流行中迅速传播，影响5-15% 的人口，加重卫生保健成本以及丧失生产力(世界卫生组织(WHO))。住院治疗和死亡病例主要发生在高危人群(老人，慢性病人)中。每年的流感流行是在病毒表面蛋白HA和NA的抗原性质改变时发生。改变的抗原性的机制是双重的抗原性转变，由于宿主细胞的双重感染后在人与动物病毒之间的遗传重排导致，这可以导致大流行；以及抗原性漂移，由于病毒表面上的HA和NA蛋白中的小变化导致，这可导致流感流行。通过这两种机制浮现出的变体病毒毒株是导致流感流行的原因。在上世纪爆发三次，甲型流感病毒经历了主要在其HA成分中的主要遗传改变，导致全球大流行，发病率和死亡率均高发。最严重的大流行是“西班牙流感”，由流感病毒Hmi导致，其影响了大部分世界人口，认为其在1918-1919年间导致至少4千万人死亡。近年来发生了两起其它甲型流感大流行，即在1957年(亚洲流感，由流感病毒H2N2导致)和1968 年(香港流感，由流感病毒H3N2导致)，致全球重大的发病率和死亡率。与当前的季节性流感流行相反，这些大流行也与涉及一般年轻人的严重后果相关。
目前处理每年流感流行的方法包括每年进行接种，优选产生异型交叉保护作用。 然而，如上所述，对在人群中传播的流感病毒进行永久抗原性改变需要每年改变流感疫苗配制物以保证流感疫苗株与正在传播的流感毒株之间最密切的可能匹配。尽管每年接种流感疫苗是防止流感的最佳方式，但是抗病毒药物如奥司他韦 (Tamiflu 可有效地预防和治疗流感。然而，示出对这种奥司他韦具有抗性的流感病毒的数目越来越多。另一种方法是开发基于抗体的预防或者治疗方式以中和各种季节性流感病毒。起免于流感病毒感染的保护作用的中和抗体的主要靶是病毒HA蛋白的球状头部(HAl部分)， 其含有受体结合位点，但是其在抗体结合位点中随着氨基酸取代而进行持续遗传进化(抗原性漂移)。近来已经鉴别了识别系统发生类群1(如Hl和Η5)的甲型流感病毒的HA的更保守干区的交叉中和抗体(例如W02008/(^8946)。然而，在鉴别中和系统发生类群2如H3 病毒的一或多种甲型流感病毒亚型的抗体中获得的成功有限，其中和范围窄且效力低。已经描述了特异性识别H3N2流感病毒毒株的抗体。因此，能结合及中和 1968-1980年间的一些H3N2流感病毒毒株的人单克隆抗体C28已经由0stberg和 Pursch (1983)描述。Wang et al. (2010)描述了中和几十年间的H3病毒的抗-HA2鼠抗体， 但是示出其不中和任何非H3亚型病毒。识别H3亚型以及H4亚型和H7亚型的HA以及能在体外降低H3和H4流感病毒的流感病毒复制的交叉反应性抗-HA2鼠抗体已经由Stropkovskdet al. , (2009)描述。证实在天然病毒中HA2表位对这些抗体可及性低，且所述抗体在胰蛋白酶裂解和pH5处理后与HA具有较高的反应性(VareSkovd et al.，2003a)，这可以解释在体外抑制病毒复制 (Vareckovaetal. ,2003b)以及在体内这些抗体效力相对低(Gocniket al. ,2007)的观测结果。在W02009/115972中揭示了人单克隆抗体Fal^8，其识别HA干区上的表位并展示针对Hmi的中和活性，但是对于H3N2的中和活性较低。鉴于由某些甲型流感病毒导致的呼吸系统疾病的严重性及总是存在潜在大流行的危胁以及季节性流行的高度经济影响，因此继续需要有效的方式预防和治疗各种甲型流感病毒亚型。因此需要结合分子，优选广泛中和性人结合分子，其能中和季节性流感病毒亚型，包括包含H3亚型的HA的流感病毒，优选H3N2，且其没有或者较少本领域已知的抗体的缺点。本发明提供了这些结合分子，其可用于医学领域，特别用于诊断、预防和/或治疗包含H3亚型的HA的流感病毒的感染、优选H3N2感染。本发明的一些结合分子在其在H3亚型内的中和活性的范围方面是独特的。因此，本发明鉴别的一些结合分子能中和H3N2亚型中的一些包括至少一或多种近来的毒株且可以用作季节性流感的普遍预防和/或治疗剂， 不论致病性流感H3N2毒株如何。至少一些结合分子能防止HA前体分子HAO由胰蛋白酶在体外裂解。此外，本发明的至少一些结合分子能防止认为参与流感病毒膜与感染的细胞的内体膜的膜融合的HA蛋白的构象改变。此外，本发明的至少一些结合分子是独特的，在于其也能交叉中和至少一种其它亚型的流感病毒，包括包含H7和/或HlO亚型的HA的流感病毒，及因此可用作流感病毒的普遍预防、诊断和/或治疗剂，甚至不考虑致病的流感病毒亚型。
附图描述ai示出了在亚型水平的氨基酸序列的系统发生树。图中表明了类群亚型分支。 包含Hl亚型的Hl进化枝及包含H9亚型的H9进化枝组成系统发生类群1，包含H7亚型的 H7进化枝和包含H3亚型的H3进化枝组成系统发生类群2。Ml是示出在用胰蛋白酶(条纹条)、ρΗ4·9缓冲的介质(实心白色条)及DTT (交叉形条)相继处理后，通过FACS分析测量的IgGl与表面表达的H3rHA结合的条形图，以与未处理的rHA(实心黑色条)的结合百分比表示。Ml示出体外蛋白酶易感性测定的结果。将样品在于1XM0PS缓冲液中的4-12% BisTris凝胶上运行。通过胶体蓝染色观察蛋白条带。Mi是在感染期间HA蛋白的不同构象的示意图。@是示出在用胰蛋白酶(条纹条)、ΡΗ4·9缓冲的介质(实心白色条)及DTT (交叉形条)相继处理后，通过FACS分析测量的在不同处理后H3mAb与HA表达细胞的结合的条形图，以与未处理的rHA(实心黑色条)的结合百分比表示。图6示出在实施例11中描述的时程实验结果，以确定HA与胰蛋白酶的保温时间以实现H3HA的裂解。Ml示出用mAb预保温的H3HA样品的胰蛋白酶消化结果，如实施例11所述。M8是证实CR8043抑制pH诱导的H3HA构象变化的条形图。M9示出CR8020和CR8041也能阻断pH诱导的HA构象改变A，在胰蛋白酶裂解之前加入mAb ；B，在胰蛋白酶裂解之后加入mAb ；C，在所有处理之后加入mAb。图10示出Kaplan-Meier存活概率曲线。在攻击前一天经静脉内施用抗体，使用的剂量范围是30-lmg/kg。施用30mg/kg对照Ab(灰色)，随后在第0天用25LD50A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)致死攻击。CR8020 (A)在与 CR8041 (B)和 CR8043 (C)分开的研究中检测，后二者在一个实验中评估。因此，对于B和C使用同一对照抗体组。图11示出相对于第0天的平均体重变化)。在攻击前一天经静脉内施用抗体，使用剂量范围是30-lmg/kg。施用30mg/kg对照Ab (灰色)，随后在第0天用25LD50A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)致死攻击。条图表示平均值的95% CI。如果小鼠在继续研究期间死亡/安乐死，则最后观测的体重结转(carry forward)。CR8020 (A)在与CR8041 (B)和 CR8043(C)分开的研究中检测，后二者在一个实验中评估。因此，对于B和C使用同一对照抗体组。_示出中位数临床评分。在攻击前一天经静脉内施用抗体，使用剂量范围是 30-lmg/kg。施用 30mg/kg 对照 Ab (灰色)，随后在第 0 天用 25LD50A/HK/1/68-MA20 (H3N2) 致死攻击。条图表示四分位数间距范围。CR8020(A)在与CR8041(B)和CR8043 (C)分开的研究中检测，后二者在一个实验中评估。因此，对于B和C使用同一对照抗体组。临床评分说明0 =无临床迹象；1 =皮毛粗糙(rough coat) ；2 =皮毛粗糙，反应性较差，在处理期间被动状态；3 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在处理期间被动状态；4 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下。在同一天对观测到临床评分为4的小鼠行安乐死。图13证实在用流感病毒A/HK/1 /68-MA20 (H3N2)的小鼠致死攻击模型中mAb CR8020的治疗效力。在U9Xl/SvJ小鼠(n = 10只/组)中在攻击前一天或者在攻击后
7第1、2、3、4、5或6天经静脉内施用一剂mAb CR8020 (15mg/kg)。在攻击后第1天施用对照 mAb(15mg/kg)。在第 0 天用 25LD50A/HK/1/68-MA20 (H3N2)攻击小鼠并监测 21 天。A 组: Kaplan-Meier存活概率曲线。B组相对于第0天的平均体重改变(％ )。条图表示平均值的95% Cl。如果小鼠在继续研究期间死亡/安乐死，最后观测的体重结转。C组中位数临床评分。条图表示四分位数间距范围。0 =无临床迹象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反应性较差，在处理期间被动；3 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在处理期间被动；4 =皮毛粗糙， 蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下。在同一天对观测到临床评分为4的小鼠行安乐死。图14示出在用小鼠适应的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻击模型中mAb CR8020的预防效力。A组=Kaplan-Meier存活概率曲线。B组相对于第0天的平均体重改变(<%)。条图表示平均值的95% Cl。如果小鼠在继续研究期间死亡/安乐死，最后观测的体重结转。C组中位数临床评分。条图表示四分位数间距范围。0=无临床迹象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反应性较差，在处理期间被动；3 =皮毛粗糙，蜷缩， 呼吸困难，在处理期间被动；4 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下。在同一天对观测到临床评分为4的小鼠行安乐死。图15示出在用小鼠适应的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻击模型中mAb CR8020、CR8041和CR8043的预防效力。在雌性Balb/c小鼠(n = 8只/组) 中在攻击前一天经静脉内施用mAb，使用的剂量范围是10-lmg/kg(CR8020)或者30_lmg/ kg(CR8041和CR8043)。在前一天施用30mg/kg对照mAb (灰色)。在第0天，通过鼻内接种用25LD50小鼠适应的A/CH/NL/621557/03 (H7N7)致死攻击，随后监测小鼠21天。A组: Kaplan-Meier存活概率曲线。B组相对于第0天的平均体重改变(％ )。条图表示平均值的95% Cl。如果小鼠在继续研究期间死亡/安乐死，最后观测的体重结转。C组中位数临床评分。条图表示四分位数间距范围。0 =无临床迹象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反应性较差，在处理期间被动；3 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在处理期间被动；4 =皮毛粗糙， 蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下。在同一天对观测到临床评分为4的小鼠行安乐死。图16示出在用小鼠适应的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻击模型中mAb CR8020的治疗效力。在雌性Balb/c小鼠(n = 8只/组)中在攻击前一天或者在攻击后第1、2、3、4、5或6天经静脉内施用一剂mAb CR8020 (15mg/kg)。在攻击后第一天施用对照mAb (15mg/kg)。在第0天用25LD5(1小鼠适应的A/CH/NL/621557/03 (H7N7)攻击小鼠并监测小鼠21天。A组=Kaplan-Meier存活概率曲线。B组相对于第0天的平均体重改变(％)。条图表示平均值的95% Cl。如果小鼠在继续研究期间死亡/安乐死，最后观测的体重结转。C组中位数临床评分。条图表示四分位数间距范围。0=无临床迹象； 1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反应性较差，在处理期间被动；3 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难， 在处理期间被动；4 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下。在同一天对观测到临床评分为4的小鼠行安乐死。发明描述本发明中所用术语的定义在下文给出。如本文所用，术语“包括”被认为后接词语“不限于”。
如本文所用，术语“结合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体，如嵌合的、人源化的或者人单克隆抗体，或者是指包含免疫球蛋白片段的抗原结合结构域和/或可变结构域，其与完整免疫球蛋白竞争特异性结合所述免疫球蛋白的结合配偶体，如H3。无论结构如何，抗原结合片段均结合由所述完整免疫球蛋白识别的同一抗原。抗原结合片段可包含肽或者多肽，所述肽或者多肽包含所述结合分子氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200 或者 250 个连续氨基酸残基的氨基酸序列。如本文所用，术语“结合分子”包括本领域已知的所有免疫球蛋白类别和亚类。 根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，结合分子可以分成五种主要类别的完整抗体IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、 IgG3 禾口 IgG4。抗原结合片段包括Fab、F(ab' )、F(ab' ) 2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、 单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体、(多)肽等，其至少含有足以赋予所述多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段。上述片段可以合成产生或者通过酶或化学裂解完整免疫球蛋白产生或者可以通过重组DNA技术遗传工程化产生。所述产生方法为本领域熟知，在例如Antibodies :A Laboratory Manual, Edited by:E. Harlow and D,Lane(1988), Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New ^rk中描述，所述文献援引加入本文。结合分子或者其抗原结合片段可具有一或多个结合位点。如果有一个以上结合位点，则所述结合位点可以与另一结合位点相同或者可以不同。所述结合分子可以是裸的或者未缀合的结合分子，但是也可以是免疫缀合物的一部分。裸的或者未缀合的结合分子是指这样的结合分子，其是未缀合的，可操作地连接或者另外与效应部分或者标记如毒性物质、放射性物质、脂质体、酶物理性地或功能性地相关联。应理解裸的或者未缀合的结合分子不排除已经稳定化、多聚体化、人源化或者以除了附着效应部分或者标记之外任何其它方式操作的结合分子。因此，所有翻译后修饰的裸的和未缀合的结合分子均包含在内，包括其中所述修饰是在天然结合分子产生细胞环境中产生、通过重组结合分子产生细胞产生及在开始结合分子制备之后人工导入。当然，术语裸的或者未缀合的结合分子不排除在施用给机体之后所述结合分子与效应细胞和/或分子形成功能性关联的能力，因为一些这样的相互作用是发挥生物学效应必需的。相关联的效应基团或者标记的缺少因此用于定义在体外而不是在体内的裸的或者未缀合的结合分子。如本文所用，术语“生物学样品”涵盖了多种样品类型，包括血液及生物来源的其它液体样品、固体组织样品如生物活检样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞及其后代。该术语还包括在获得后已经以任何方式操作过的样品，如用试剂处理、溶解或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。该术语涵盖得自任何物种的各种临床样品，也包括培养细胞、细胞上清和细胞裂解物。如本文所用，术语“互补决定区(CDR) ”是指结合分子如免疫球蛋白可变区内的序列，其在很大程度上通常促成抗原结合位点，其与在抗原上被识别的表位在形态和电荷分布上互补。CDR区可以特异于蛋白质或者蛋白质片段的线性表位、不连续表位或者构象表位，其以其天然构象存在于蛋白质上或者在某些情况中以变性形式存在于蛋白质上，例如通过在SDS中溶解而变性。表位也可以由蛋白质的翻译后修饰组成。如本文所用，术语“缺失”是指氨基酸或者核苷酸序列中的改变，其中与参考分子通常为天然发生的分子相比分别缺少一或多个氨基酸或者核苷酸残基。如本文所用，术语“表达调节核酸序列”是指为可操作地连接的编码序列在特定宿主生物体中表达所需和/或影响所述表达的多核苷酸序列。所述表达调节核酸序列如合适的转录起始序列、终止序列、启动子、增强子序列、阻抑物或者激活物序列、有效RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号、稳定胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)、增强蛋白质稳定性的序列，以及当需要时增强蛋白质分泌的序列，这些序列可以是在选择的宿主生物体中示出活性的任何核酸序列及可以衍生自与所述宿主生物体同源或者异源的基因编码蛋白质。表达调节序列的鉴别和应用为本领域技术人员熟知。如本文所用，术语“功能变体”是指这样的结合分子，其包含与参考结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比有一或多个核苷酸和/或氨基酸改变的核苷酸和/或氨基酸序列且仍能与参考结合分子竞争结合所述结合配偶体例如H3N2。换句话说，参考结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不明显影响或者改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶。功能变体可具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，如定向诱变和随机PCR介导的诱变，及可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员清楚也可以应用除了上述之外的其它类别氨基酸残基家族。此外，变体可具有非保守氨基酸取代，例如一个氨基酸由具有不同结构或者化学性质的氨基酸残基置换。相似的微小变化也可包括氨基酸缺失或者插入或者这二者。确定哪个氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫活性的指导可通过使用本领域熟知的计算机程序发现。核苷酸序列中的突变可以是在一个基因座进行的单一改变(点突变)，如转换或者颠换突变，或者在一个基因座可以插入、缺失或者改变多个核苷酸。此外，可以在核苷酸序列中任何数目的基因座进行一或多个改变。所述突变可以通过本领域已知的任何合适方法进行。如本文所用，术语“流感病毒亚型”是指甲型流感病毒变体，其特征在于血凝素(H) 与神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的各种组合。根据本发明，流感病毒亚型可以其H数目命名，例如“包含Η3亚型的HA的流感病毒”或者“Η3流感病毒”，或者以组合H数目与N数目命名，例如“流感病毒亚型Η3Ν2”或者“Η3Ν2”。术语“亚型”特别包括每个亚型中所有个体 “毒株”，其通常得自突变并示出不同的病原图谱。这种毒株也可以称作各种病毒亚型的“分离株”。因此，如本文所用，术语“毒株”和“分离株”可互换使用。目前对于人流感病毒毒株或者分离株的命名法包括第一次分离的地理位置，毒株编号和分离年份，通常在括号内给出HA和NA的抗原性描述，例如A/Moscow/10/00 (H3N2)。非人毒株命名法中还包括起源宿主。流感病毒亚型可根据其系统发生类群进一步分类。系统发生分析(Fouchier et al.，2005)证实HA被再分为两个主要类别(Air，1981)系统发生类群1中的H1、H2、H5和 H9亚型以及系统发生类群2中的H3、H4和H7亚型(图1)。如本文所用，关于本发明结合分子所用术语“中和”是指结合分子抑制流感病毒重复感染靶细胞，无论通过何种机制实现中和。因此，中和可例如通过抑制病毒与细胞表面的吸附或者粘附而实现，或者通过在病毒与靶细胞吸附后抑制病毒与细胞膜的融合而实现等寸。如本文所用，关于本发明结合分子的术语“交叉中和”是指本发明的结合分子中和不同亚型甲型流感病毒例如包含H3、H7和/或HlO亚型的HA的流感病毒的能力。如本文所用，术语“宿主”是指其中已经导入了载体如克隆载体或者表达载体的生物体或者细胞。所述生物体或者细胞可以是原核或者真核生物或细胞。优选所述宿主分离的宿主细胞，如培养的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅是指被修饰以(过)表达本发明的结合分子的细胞，包括起初表达这些结合分子以及细胞已经通过永生化、扩增、增强表达等方式被修饰为过表达所述接合分子的B细胞。应理解术语宿主不仅是指特定的对象生物体或者细胞，也包括这种生物体或细胞的后代。由于在随后的世代中由于突变或者环境影响而可以发生某些修饰，这种后代事实上与亲代生物体或者细胞可以不同，但是仍包括在本发明所用术语“宿主”的范围内。术语“人”当用于本文所述的结合分子时是指直接衍生自人或者基于人序列的分子。当结合分子衍生自或者基于人序列及随后被修饰时，在本说明书中仍认为其是人结合分子。换句话说，术语人当用于结合分子时是指包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区或者基于在人或者人淋巴细胞中出现的可变区或者恒定区以及以一些方式被修饰的结合分子。因此，人结合分子可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，包含取代和/或缺失(例如通过在体外随机或者位点特异性诱变或者在体内通过体细胞突变导入的突变)。如本文所用，“基于”是指核酸序列可精确拷贝自模板的情况，或者具有微小突变，如通过易错PCR方法或者合成产生精确匹配模板或者具有微小修饰。基于人序列的半合成分子在本文也被认为是人结合分子。术语“插入”，也称作“添加”，是指氨基酸或者核苷酸序列中的改变，导致与亲代序列相比分别添加一或多个氨基酸或者核苷酸残基。术语“分离的”当用于本文所述结合分子时是指基本上没有其他蛋白质或者多肽的结合分子，特别是没有具有不同抗原特异性的其它结合分子，以及也基本上没有其它细胞材料和/或化学物。例如，当所述结合分子是重组产生的时，其优选基本上没有培养基成分；当所述结合分子是通过化学合成产生的时，其优选基本上没有化学物前体或者其它化学物，即其与参与该蛋白质合成的化学物前体或者其它化学物是分开的。术语“分离的”当用于编码本文所述结合分子的核酸分子时是指其中编码所述结合分子的核苷酸序列没有其它核苷酸序列、特别是编码结合H5m之外的结合配偶体的结合分子的核苷酸序列的核酸分子。此外，术语“分离的”是指与在其天然宿主中天然伴随天然核酸分子的其它细胞成
11分(例如与其天然结合的核糖体、聚合酶或者基因组序列)基本上分开的核酸分子。此外， “分离的”核酸分子如cDNA分子可以基本上没有其它细胞材料，或者当通过重组技术产生时基本上没有培养基，或者当通过化学合成时基本上没有化学物前体或者其它化学物。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一特异性的抗体分子的制备。单克隆抗体展示了对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指展示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自或者基于人种系免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成序列的可变区和恒定区。制备单克隆抗体的方法与结合特异性无关。如本文所用，术语“天然发生的”当用于一个对象时是指该对象可以在自然界发现。例如，可以分离自自然来源且未通过在实验室中人为有意修饰的存在于生物体中的多肽或者多核苷酸序列是天然发生的。如本文所用，术语“核酸分子”是指聚合形式的核苷酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA 的有义和反义链，以及其合成形式和混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或者任一类型核苷酸的修饰形式。该术语还包括单链和双链形式的DNA。此外，多核苷酸可包括通过天然发生的和/或非天然发生的核苷酸键连接在一起的天然发生的和修饰的核苷酸之一或二者。所述核酸分子可以被化学或者生物化学修饰或者可以含有非天然或者衍生化的核苷酸碱基，这些为本领域技术人员熟知。这种修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一或多个天然发生的核苷酸、核苷酸内修饰如不带电荷的键(如例如甲基磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)、带电荷的键(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)、侧基(pendent moiety)(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶，补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂以及修饰的键(如α异头核酸等等)。上述术语也是指包括任何拓扑构象，包括单链、双链， 部分双链、三链、发夹、环形和扣锁构象。还包括合成分子，其模拟多核苷酸通过氢键及其它化学相互作用结合指定序列的能力。这种分子为本领域已知，且包括例如所述分子主链中其中肽键取代磷酸键的那些。除非特别指出，则核酸序列涵盖其互补序列。因此，具有特定序列的核酸分子应被理解为涵盖其互补链，及其互补序列。互补链例如对于反义治疗、杂交探针和PCR引物也是有用的。术语“可操作地连接”是指通常经物理连接的且彼此存在功能关系的两或多个核酸序列元件。例如，如果启动子能起始或者调节编码序列的转录或者表达，则该启动子与所述编码序列是可操作地连接的，在这种情况中，所述编码序列应被理解为是在所述启动子的“控制下”。“药物可接受的赋形剂”是指与或活性分子如药物、制剂或者结合分子组合以制备合适的或者常规剂型的任何惰性物质。所述“药物可接受的赋形剂”是对于受体而言在应用的剂量和浓度下是非毒性的赋形剂，且与包含所述药物、制剂或者结合分子的配制物的其它成分相容。药物可接受的赋形剂广泛用于本领域中。如本文所用，关于结合分子如抗体与其结合配偶体如抗原之间的相互作用所用术语“特异性结合”是指该相互作用依赖于特定结构的存在，例如所述结合配偶体上抗原决定簇或者表位的存在。换句话说，所述抗体优先结合或者识别所述结合配偶体，即使当所述结合配偶体存在于其它分子或者生物体的混合物中时。所述结合可以通过共价或者非共价相互作用或者组合这二者而介导。再换句话说，术语“特异性结合”是指与抗原决定簇或者表位的免疫特异性结合以及与其它抗原决定簇或者表位不免疫特异性结合。与抗原免疫特异
12性结合的结合分子可以较低亲和性结合其它肽或者多肽，通过例如放射性免疫测定(RIA)、 酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIAC0RE或者本领域已知的其它测定方法确定。与抗原免疫特异性结合的结合分子或者其片段可以与携带相同表位的相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性结合抗原的结合分子或者其片段与其它抗原不交叉反应。如本文所用，“取代”是指一或多个氨基酸或者核苷酸分别由不同氨基酸或者核苷酸的置换。术语“治疗有效量”是指本文所述结合分子有效预防、改善和/或治疗得自H3亚型流感病毒感染的病症的量。如本文所用，“改善”是指可见或者可感受的疾病症状、病毒血症或者流感病毒感染的任何其它可测表现的减轻。术语“治疗”是指治疗性处理以及预防措施以治愈或者停止或者至少延迟疾病进展。需要治疗的那些对象包括已经患有得自包含H3亚型的HA的流感病毒感染的病症的那些对象以及其中包含H3亚型的HA的流感病毒感染被预防的那些对象。部分或者全部从H3 流感病毒感染中恢复的对象可能也需要治疗。预防包括抑制或者降低包含H3亚型的HA的流感病毒的传播或者抑制或者降低与H3流感病毒感染相关的一或多个症状的发生、发展或者进展。术语“载体”是指其中可以插入第二种核酸分子的核酸分子，用于导入其将在其中复制及在一些情况中表达的宿主中。换句话说，载体能将转运与其连接的核酸分子。如本文所用，克隆以及表达载体涵盖在术语“载体”中。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及衍生自噬菌体或者植物或者动物(包括人)病毒的载体。载体包含由提议的宿主识别的复制起点以及在表达载体的情况中包含启动子及由宿主识别的其它调节区。含有第二种核酸分子的载体通过转化、转染或者通过使用病毒进入机制而被导入细胞中。某些载体能在其被导入的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起点的载体可以在细菌内复制)。其它载体在导入宿主中时可以整合进宿主的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。发明概述本发明提供了人结合分子，其能特异性结合包含H3亚型的HA的流感病毒株包括 H3N2且呈现出针对这种流感病毒的中和活性。在一个实施方案中，本发明的结合分子是独特的，其能高效中和一些、包括至少一或多种近年来发现的、优选所有已知的流感病毒亚型 H3(在人中最常见的流行亚型)的毒株。在一个实施方案中，所述结合分子结合H3HA蛋白质干区中的保守表位。在一个实施方案中，所述结合分子具有血细胞凝集抑制活性。在一个实施方案中，所述结合分子能防止HA前体分子HAO的体外裂解。在一个实施方案中，本发明的结合分子能防止流感病毒膜与感染的细胞的内体膜融合所需的HA蛋白的构象改变。本发明还提供了结合血凝素蛋白中表位的结合分子，所述表位是H3亚型所属系统发生类群2中的流感病毒亚型之间所共有的，及因此本发明涉及在基于H3-、H7-和/或 HlO的流感病毒亚型以及含有具有这些特定表位的HA蛋白的其它流感病毒亚型、优选系统发生类群2的所有亚型之间交叉反应的结合分子。本发明的一些结合分子因此是独特的， 其具有针对一或多种其它甲型流感病毒亚型如包含H7和/或HlO亚型的HA的流感病毒的交叉中和活性。优选地，本发明的结合分子能交叉中和系统发生类群2的所有流感病毒亚型，包括H3、H7和HlO亚型，及因此可用作属于系统发生类群2的流感病毒的普遍预防、诊断和/或治疗剂，甚至无论是该系统发生类群中的哪个致病流感病毒亚型。推测本发明的结合分子结合迄今为止还未知的保守表位，其不具有抗原性漂移或抗原性转变的倾向或者倾向较低。因此本发明还涵盖了使用本发明的结合分子鉴别和/或鉴定这些表位。本发明还涉及编码至少人结合分子的结合区的核酸分子。本发明进一步提供了本发明的人结合分子在预防和/或治疗患有或者处于发生H3流感病毒感染如H3N2流感病毒感染危险中的对象中的应用。此外，本发明涉及本发明的人结合分子在诊断/检测这种流感病毒感染中的应用。详细描述第一方面，本发明涵盖了能与甲型流感病毒、特别是包含H3亚型的HA的甲型流感病毒、特别是H3N2特异性结合且具有中和活性的结合分子。优选地，所述结合分子是人结合分子。在一个实施方案中，本发明的结合分子与一些流感病毒H3N2毒株、优选两或更多种不同的H3N2毒株、更优选三或更多种、更优选四或更多种、更优选五或更多种不同H3N2毒株能特异性结合和/或具有中和活性。所述毒株可得自人或者非人动物， 如鸟类。在一个实施方案中，所述结合分子结合及中和至少一或多种近来的H3N2毒株， 所述毒株选自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99 和 A/ Johannesburg/33/940在另一实施方案中，所述结合分子也结合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。更优选地，所述结合分子结合从1968年至2005年期间的所有流感病毒H3N2 毒株并具有中和活性。优选地，所述结合分子对于2010年1月20日之前已知的流感病毒 H3N2的至少所有天然发生的分离株具有中和活性。本发明的结合分子能特异性结合HA蛋白的HAO、HAl和/或HA2亚基。它们能特异性结合HA蛋白的HA0、HA1和/或HA2亚基上的线性或结构和/或构象表位。所述HA分子可纯化自病毒或者重组产生，及任选在使用之前分离。或者，HA可以在细胞表面上表达。 优选地，本发明的结合分子结合这样的表位，其包含在H3HA蛋白的HA2多肽的第19、25、27、 33和34位的一或多个氨基酸。在一个实施方案中，当所述第19位氨基酸是天冬氨酸(D)、 第25位氨基酸是谷氨酰胺(Q)、第27位氨基酸是甘氨酸(G)、第33位氨基酸是甘氨酸(G) 和/或第34位氨基酸是谷氨酰胺(HA2的编号从在组成HAl与HA2之间裂解位点的精氨酸残基随后第1位开始)时，所述结合分子结合HA2上所述表位。在一个实施方案中，当一或多个所述氨基酸被改变时，所述结合分子不结合HA2上所述表位。另一方面，本发明涵盖了结合分子，其至少在体外能防止H3HA前体分子HAO被胰蛋白酶裂解为HAl和HA2。另一方面，本发明涵盖了结合分子，其至少在体外能防止流感病毒膜与感染细胞的内体膜的膜融合所需的H3HA蛋白的构象改变。另一方面，所述结合分子具有一些或者全部上述性质，即交叉中和活性、结合HA2 的干区上的保守表位、抑制HAO的体外胰蛋白酶裂解，和/或抑制构象改变。在一个实施方案中，本发明的结合分子具有全部或者一些上述性质，且另外不能结合和/或中和包含Hl亚型的HA的甲型流感病毒如Hmi。本发明的机会分子能特异性结合如流感病毒H3N2，所述流感病毒是活的、存活的和/或感染性的或者是失活/减毒形式。失活/减毒病毒如流感病毒H3N2的方法为本领域熟知，包括但不限于用福尔马林、β-丙酸内酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外光处理。
本发明的结合分子也能特异性结合流感病毒的一或多个片段，如衍生自亚型H3N2 的一或多种蛋白质和/或(多)肽或者H3N2的一或多种重组产生的蛋白质和/或多肽的制备物。对于治疗和/或预防H3N2感染的方法，所述结合分子优选能特异性结合H3N2的表面可接近的蛋白质，如表面糖蛋白、血凝素(HA)，这是为病毒吸附和细胞释放所需的。各种H3N2毒株蛋白质的核苷酸和/或氨基酸序列可见于GenBank-数据库、 NCBI流感病毒序列数据库、流感病毒序列数据库(Influenza Sequence Database, ISD)、 EMBL-数据库和/或其它数据库。本领域技术人员可以在各自的数据库中发现这种序列。在另一实施方案中，本发明的结合分子能特异性结合上述蛋白质和/或多肽的片段，其中所述片段至少包含由本发明的结合分子识别的表位。如本文所用，“表位”是能以足够高的亲和力结合本发明结合分子以形成可检测的抗原-结合分子复合物的部分。本发明的结合分子可以能或不能特异性结合HA的细胞外部分(在本文也称作可溶 HA(sHA))。本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，如多克隆或者单克隆抗体，或者所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab' )、F(ab' )2、Fv、dAb、Fd、 互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体和(多)肽，其含有至少足以赋予与流感病毒H3N2毒株或者其片段的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段。在优选的实施方案中，本发明的结合分子是人单克隆抗体。本发明的结合分子可以非分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独使用或者在包含至少一种本发明结合分子(或者其变体或片段)的混合物中使用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含本发明的两或更多种结合分子、 其变体或者片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以在单一治疗中组合以实现希望的预防、治疗或者诊断作用，但是或者具有相同活性的结合分子也可以在单一治疗中组合以实现希望的预防、治疗或者诊断作用。任选地，所述混合物进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂如M2抑制剂(例如金刚胺、金刚乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦、奥司他韦)可用于预防和/或治疗流感病毒H3N2感染。典型地，本发明的结合分子可结合其结合配偶体，即流感病毒H3N2或者其片段，结合亲和性常数(Kd-值)低于0. 2χ10"4Μ,1. 0χ1(Γ5Μ、1. OxlO^6MU. 0χ10_7Μ，优选低于 1. 0x10、，更优选低于1. 0x101，更优选低于1. ΟχΙΟ,Μ，甚至更优选低于1. OxKT11M,特别低于1.0χ10~Μ。亲和性常数对于抗体同种型而可以有所变化。例如，对于IgM同种型的亲和性结合是指结合亲和性为至少大约1.0χ1(ΓΜ。亲和性常数可例如通过使用表面等离子共振测量，如使用 BIAC0RE 系统(Wiarmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)测量。典型地，本发明的结合分子具有10μ g/ml或更低的中和活性，优选5μ g/ml或更低，更优选2 μ g/ml或更低，甚至更优选1 μ g/ml或更低，如在实施例6中描述的体外病毒中和测定(VNA)中确定。本发明的结合分子可以结合可溶形式如在样品中或者在悬浮液中的流感病毒 H3N2或者其片段或者可以结合与载体或者基质例如微滴定平板、膜和珠等结合或者附着的流感病毒H3N2或者其片段。载体或者基质可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、 硝化纤维或者Teflon等制成。这种支持物的表面可以是固体或者有孔材料及可以是任何常规形状。此外，所述结合分子可以结合纯化的/分离的或者非纯化的/非分离形式的流感病毒H3N2。本发明的结合分子呈现出中和活性。中和活性可例如如本文所述测量。测量中和活性的其他测定在例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva :fforld Health Organisation, 2005, version 2002. 5 中描述。本发明涉及分离的人结合分子，其能识别及结合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，特征在于所述结合分子对包含H3亚型的HA的甲型流感病毒具有中和活性。含有H3亚型的HA的流感病毒亚型的一个实例是H3N2。特别优选的是中和H3N2流感病毒亚型的结合分子。在一个实施方案中，所述结合分子中和至少一或多种近来出现的 H3N2毒株。在一个实施方案中，所述结合分子因此至少结合及中和一或多种H3N2毒株， 所述毒株选自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99 和 A/ Johannesburg/33/940在另一实施方案中，所述结合分子也结合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。最优选地，所述结合分子结合自1968年至2005年出现的所有流感病毒H3N2 毒株、优选所述流感病毒亚型的所有已知毒株且具有中和活性。在另一实施方案中，本发明的结合分子还具有对于其它甲型流感病毒、优选至少包含H7亚型的HA的流感病毒如A/Mallard/Netherlands/12/2000株和/或包含HlO亚型的HA的流感病毒如A/chick/Germany/N/49株的中和活性。因此已经示出一些本发明的结合分子交叉中和这些流感病毒亚型。本发明因此还提供了结合血凝素蛋白中流感病毒亚型之间共有及保守的表位的结合分子，及因此涉及在基于H3-、H7-和/或HlO流感病毒亚型及含有具有这些特定表位的HA蛋白的其它流感病毒亚型、优选系统发生类群2的所有流感病毒之间交叉反应的结合分子。所述交叉中和结合分子优选结合并中和H3-、H7和/或 HlO-亚型的一些毒株。在一个实施方案中，这些交叉中和结合分子结合并中和至少一或多种近来出现的 H3N2 毒株，所述毒株选自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/ Johannesburg/33/94和A/Panama/2007/99。在另一实施方案中，所述结合分子还结合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。最优选地，所述结合分子结合自1968年至2005年出现的所有流感病毒H3N2毒株、优选所有已知以及甚至更优选未来的H3N2毒株并具有中和活性。 在进一步的实施方案中，所述结合分子基本上中和所述其它流感病毒亚型的所有分离株。在一个实施方案中，所述结合分子结合并中和系统发生类群2的所有流感病毒亚型。基于本文揭示，技术人员可以确定一种抗体是否确实与不同亚型的HA蛋白交叉反应及也可以确定它们是否能在体内中和不同亚型的流感病毒。流感病毒通过结合靶细胞的细胞表面上的唾液酸残基及随后转移进内体，通过其膜与内体膜的融合并释放基因组-转录酶复合物进入细胞中从而感染细胞。受体结合及膜融合过程均由HA糖蛋白介导。甲型流感病毒的HA包含两个结构不同的区域，即球形头区以及干区，球形头区含有负责病毒附着于靶细胞的受体结合位点及参与HA的血细胞凝集活性，干区含有为病毒包膜与细胞的内体膜之间膜融合所必需的融合肽。所述HA蛋白是三聚体，其中每个单体由两个二硫化物连接的糖多肽HAl和HA2组成，其是在感染期间由于前体(HAO)的蛋白酶解而产生的。裂解是病毒感染性必需的，因为其是激发HA进行膜融合必需的，使得构象改变。激发的分子的活化在内体中在PH5至pH6的低pH下发生，且需要在 HA结构中广泛改变。融合前未裂解的(I)、融合前裂解的(II)以及融合后HA(III)构象的
16三维结构在图4中示出。参与膜融合过程的HA的激发和活化中的每个阶段存在不同的抑制靶位，例如通过单克隆抗体进行。在本发明的一个实施方案中，所述结合分子至少能防止HA前体分子HAO在体外测定中裂解，例如在下文实施例中描述的测定。如上所述，HA前体分子HAO通过宿主蛋白酶被裂解为HAl和HA2是激活病毒感染性必需的。通过本发明的结合分子阻止HA前体分子 HAO裂解因此可以预防流感病毒感染。在一个实施方案中，所述结合分子结合包含在H3HA蛋白质的HA2多肽的第19、25、 27,33和/或34位的氨基酸的表位。在一个实施方案中，当第19位的氨基酸是天冬氨酸 (D)、在第25位的氨基酸是谷氨酰胺(Q)、在第27位的氨基酸是甘氨酸(G)、在第33位的氨基酸是甘氨酸(G)和/或在第34位的氨基酸是谷氨酰胺时，所述结合分子结合HA2上所述表位。优选地，当一或多个所述氨基酸改变时，所述结合分子不结合HA2上所述表位。氨基酸的编号基于来自Uniprot数据库编号Q91MA7 (SEQ ID NO 193)的血凝素序列。Q91MA7提供了来自A/Hong Kong/1/1968的未成熟HA的全长序列。所述HA2序列在未裂解的HA未成熟蛋白质的G346开始。在上述编号中，G346是HA2序列中的Gl。优选本发明的结合分子选自下组a)包含 SEQ ID NO 81 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 82 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 83所示重链⑶R3区的结合分子；b)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区的结合分子；c)包含 SEQ ID NO 103 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 104 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 105所示重链⑶R3区的结合分子；d)包含 SEQ ID NO 109 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 110 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 111所示重链⑶R3区的结合分子；e)包含 SEQ ID NO :115 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 116 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 117所示重链⑶R3区的结合分子；f)包含 SEQ ID NO :121 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 122 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 123所示重链⑶R3区的结合分子；g)包含 SEQ ID NO :1 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 127 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 128所示重链⑶R3区的结合分子；ti)包含 SEQ ID NO 132 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 133 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 134所示重链⑶R3区的结合分子；i)包含 SEQ ID NO :138 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 139 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 140所示重链⑶R3区的结合分子；j)包含 SEQ ID NO :144 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 145 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 146所示重链⑶R3区的结合分子；k)包含 SEQ ID NO :150 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 151 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 152所示重链⑶R3区的结合分子；1)包含 SEQ ID NO :156 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 157 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 158所示重链⑶R3区的结合分子；
m)包含 SEQ ID NO 162 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 163 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 164所示重链⑶R3区的结合分子；η)包含 SEQ ID NO 168 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 169 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 170所示重链⑶R3区的结合分子；ο)包含 SEQ ID NO 173 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 174 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 175所示重链⑶R3区的结合分子；及ρ)包含 SEQ ID NO :179 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 180 所示重链 CDR2 区及 SEQ ID NO 181所示重链⑶R3区的结合分子。在优选的实施方案中，本发明的结合分子用作药物，优选用于诊断、治疗和/或预防流感病毒感染。优选地，导致流感病毒感染及可以由本发明的结合分子治疗的流感病毒是流感病毒亚型H3N2。本发明还涉及包含本发明结合分子及药物可接受的赋形剂的药物组合物。在再一个实施方案中，本发明涉及本发明的结合分子在制备用于诊断、预防和/ 或治疗流感病毒感染的药物中的应用。这种感染可以在小范围群体中发生，但是也可以是季节性流行病在世界范围内传播，或者更严重地在全球大流行，其中数百万人处于危险中。 本发明提供了结合分子，其可以中和导致这种季节性流行病以及潜在大流行的流感病毒毒株感染。重要的是，可以展望使用本发明的结合分子预防和治疗多种流感病毒亚型，因为已经揭示了本发明的结合分子能交叉中和系统发生类群2的不同流感病毒亚型，包括亚型 H3、H7 禾口 HlO0在一个优选的实施方案中，本发明的人结合分子特征在于所述人结合分子选自下组a)包含 SEQ ID NO 81 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 82 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO 83所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 84所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :85所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :86所示氨基酸序列的轻链⑶R3 区的结合分子；b)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 90所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :91所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :92所示氨基酸序列的轻链⑶R3 区的结合分子；c)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 93所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :94所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :95所示氨基酸序列的轻链⑶R3 区的结合分子；d)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 96所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :97所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :98所示氨基酸序列的轻链⑶R3 区的结合分子；e)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 99所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQID NO 100所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :101所示氨基酸序列的轻链 CDR3区的结合分子；f)包含 SEQ ID NO 87 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO 88 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO :89所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO 102所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :85所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :86所示氨基酸序列的轻链⑶R3 区的结合分子；g)包含SEQ ID NO :103所示重链CDRl区、SEQ ID NO :104所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :105所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :106所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 107所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :108所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；ti)包含 SEQ ID NO :109 所示重链 CDRl 区、SEQ ID NO :110 所示重链 CDR2 区和 SEQ ID NO :111所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :112所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 113所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :114所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；i)包含SEQ ID NO :115所示重链CDRl区、SEQ ID NO :116所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :117所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :118所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 119所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :120所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；j)包含SEQ ID NO :121所示重链CDRl区、SEQ ID NO 122所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :123所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :1 所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 119所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :125所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；k)包含SEQ ID NO :1 所示重链CDRl区、SEQ ID NO 127所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :1 所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :1 所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :130所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO 131所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；1)包含SEQ ID NO :132所示重链CDRl区、SEQ ID NO 133所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :134所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :135所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 136所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :137所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；m)包含SEQ ID NO :138所示重链CDRl区、SEQ ID NO 139所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :140所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :141所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 142所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :143所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；η)包含SEQ ID NO :144所示重链CDRl区、SEQ ID NO 145所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :146所示重链CDR3区、具有SEQ ID NO :147所示氨基酸序列的轻链CDRl区、具有SEQ ID NO 148所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :149所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；ο)包含SEQ ID NO :150所示重链CDRl区、SEQ ID NO :151所示重链CDR2区和SEQ ID NO :152所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :153所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 154所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :155所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；ρ)包含SEQ ID NO :156所示重链CDRl区、SEQ ID NO 157所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :158所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :159所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :160所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO 161所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；q)包含SEQ ID NO :162所示重链CDRl区、SEQ ID NO 163所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :164所示重链CDR3区、具有SEQ ID NO :165所示氨基酸序列的轻链CDRl区、具有SEQ ID NO 166所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :167所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；r)包含SEQ ID NO :168所示重链CDRl区、SEQ ID NO 169所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :170所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :171所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 172所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :137所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子；s)包含SEQ ID NO :173所示重链CDRl区、SEQ ID NO :174所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :175所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :176所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 177所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :178所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子 ’及t)包含SEQ ID NO :179所示重链CDRl区、SEQ ID NO 180所示重链CDR2区和 SEQ ID NO :181所示重链⑶R3区、具有SEQ ID NO :182所示氨基酸序列的轻链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 183所示氨基酸序列的轻链⑶R2区和具有SEQ ID NO :184所示氨基酸序列的轻链CDR3区的结合分子。在一特定实施方案中，本发明的结合分子选自下组包含具有SEQ ID NO 81所示氨基酸序列的重链⑶Rl区、具有SEQ ID NO 82所示氨基酸序列的重链⑶R2区和具有SEQ ID NO J3所示氨基酸序列的重链⑶R3区的结合分子；包含具有SEQ ID NO :109所示氨基酸序列的重链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :110所示氨基酸序列的重链⑶R2区和具有SEQ IDNO 111所示氨基酸序列的重链⑶R3区的结合分子；包含具有SEQ ID NO 138所示氨基酸序列的重链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :139所示氨基酸序列的重链⑶R2区和具有SEQ ID NO :140 所示氨基酸序列的重链CDR3区的结合分子；包含具有SEQ ID NO :144所示氨基酸序列的重链CDRl区、具有SEQ ID NO :145所示氨基酸序列的重链CDR2区和具有SEQ ID NO :146所示氨基酸序列的重链CDR3区的结合分子；以及包含具有SEQ ID NO :173所示氨基酸序列的重链⑶Rl区、具有SEQ ID NO :174所示氨基酸序列的重链⑶R2区和具有SEQ ID NO :175 所示氨基酸序列的重链CDR3区的结合分子。本发明结合分子的⑶R区在表1中示出。⑶R区是根据Kabat et al. (1991)在 Sequences of Proteins of Immunological Interest 巾白勺 $。明白勺巾， 结合分子可包含如本文揭示的1、2、3、4、5或者所有6个⑶R区。优选地，本发明的结合分子包含至少2个如本文揭示的⑶R。在再一个实施方案中，本发明的结合分子包含这样的重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO18,SEQ ID NO22,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO30,SEQ ID NO34,SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 74 和 SEQ ID NO :78。在进一步的实施方案中，本发明的结合分子包含这样的轻链可变区，该轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、 SEQ ID NO :72、SEQ ID NO 76 和 SEQ ID NO :80。本发明另一方面包括本文定义的结合分子的功能变体。如果所述某分子能与“亲代”或者“参考”结合分子竞争特异性结合流感病毒H3N2或者其片段，则认为所述分子是本发明结合分子的功能变体。换句话说，即当所述功能变体仍能结合流感病毒H3N2或者其片段的相同或者重叠表位时。对于本申请，“亲代”和“参考”用作同义词，是指所述参考或者亲代分子或者物理分子自身的信息可构成变异的基础。优选地，所述功能变体能竞争特异性结合由所述参考结合分子特异性结合的至少两种(或更多种)不同的流感病毒H3N2毒株或者其片段。此外，如果某分子对所述亲代结合分子呈现出中和活性的流感病毒H3N2、优选对至少两种(或更多种)流感病毒H3N2毒株具有中和活性，则认为所述分子是本发明结合分子的功能变体。功能变体包括但不限于一级结构序列基本上相似的衍生物，包括在Fc 受体或者参与效应功能的其它区具有修饰的那些，和/或其含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或者体内化学和/或生物化学修饰。这种修饰包括乙酰化、酰化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等等。或者，功能变体可以是在本发明中定义的结合分子，其包含与亲代结合分子的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其组合的氨基酸序列。此外，功能变体可在氨基或者羧基末端任一端或者这两端包含氨基酸序列的截短。本发明的功能变体与亲代结合分子相比可具有相同或者不同的(较高或者较低)结合亲和性，但是仍能结合流感病毒H3N2或者其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合分子相比对于流感病毒 H3N2或者其片段可具有增加或者降低的结合亲和性。优选地，可变区的氨基酸序列包括但不限于构架区、超变区、特别是CDR3区被修饰。通常，轻链和重链可变区包含包括三个CDR 的三个超变区及更保守的区域，所谓构架区(F 。超变区包含来自CDR的氨基酸残基和来自超变环的氨基酸残基。符合本发明范围的功能变体与本文定义的亲代结合分子具有至少大约50 %至大约99 %、优选至少大约60 %至大约99 %、更优选至少大约70 %至大约99 %、 甚至更优选至少大约80%至大约99%、最优选至少大约90%至大约99%、特别是至少大约 95%至大约99%、特别是至少大约97%至大约99%氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于优化排列对比被比较的氨基酸序列及确定相似或者相同的氨基酸残基。功能变体可以通过本领域已知的一般分子生物学方法通过改变亲代结合分子或者其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸定向诱变、定点诱变和重链和/或轻链改组。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于流感病毒H3N2 具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以是相同的或者是较高或者较低的。此后，当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含至少一个本文定义的结合分子及进一步包含至少一个标记如可检测部分/物质的分子。本发明还涵盖了本发明的免疫缀合物的混合物或者至少一种本发明的免疫缀合物与另一分子如治疗剂或者另一结合分子或者免疫缀合物的混合物。在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记彼此可以相同或者不同，可以与所述结合分子非共价连接/缀合。所述标记也可以通过共价键与人结合分子直接连接/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合分子连接/缀合。使标记与结合分子缀合的技术为本领域技术人员熟知。本发明免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但是其也可以是可检测部分/物质。适于治疗和/或预防的标记可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或者免疫刺激作用的其它结合分子。包含可检测物质的免疫缀合物可诊断性地用于例如评定对象是否感染了流感病毒H3N2毒株或者作为临床检验的一部分监测流感病毒H3N2感染的发生或进展以例如确定给予的治疗方案的效力。然而，其也可用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属及非放射性顺磁性金属离子。所述标记用于标记所述结合分子以根据使用的特异性检测/分析/诊断技术和/或方法进行检测和/或分析和/或诊断目的，所述技术和方法如(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞计量术检测、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定).Western印迹应用等。本领域熟知的用于检测/分析/诊断技术和/或方法的合适标记为技术人员熟知。此外，本发明的人结合分子或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物，其特别用于流感病毒H3N2或者其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是有孔或者无孔的、平面或者非平面的。本发明的结合分子可以与标记序列如肽融合以促进纯化。例子包括但不限于6-组氨酸标记、血凝素(HA)标记、myc标记或者flag标记。或者，一个抗体可以与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。另一方面，本发明的结合分子可以与一或多种抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由施用所述结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。所述抗原彼此可以相同，但也可以不同。使抗原与结合分子附着的缀合方法为本领域熟知，包括但不限于使用交联剂。本发明的结合分子结合流感病毒H3N2，且附着于结合分子的抗原将引起对缀合物有力的T-细胞攻击，最终导致流感病毒H3N2破坏。在通过化学方式直接或者通过如接头间接缀合产生免疫缀合物之后，所述免疫缀合物可以作为包含本发明的结合分子及合适标记的融合蛋白产生。融合蛋白可以通过本领域已知的方法产生，例如通过构建包含编码所述结合分子的核苷酸序列与符合读框地编码合适标记的核苷酸序列的核酸分子及随后表达所述核酸分子而重组产生。本发明另一方面提供了至少编码本发明结合分子、功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可用作中间物以进行克隆，如在如上所述的亲和性成熟过程中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离的或纯化的。本领域技术人员意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码被直接翻译以提供与从亲代核酸分子翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。优选地，所述核酸分子编码包含上述⑶R区的结合分子。在进一步的实施方案中， 所述核酸分子编码包含本发明结合分子的2、3、4、5或者甚至6个⑶R区的结合分子。在另一实施方案中，所述核酸分子编码包含重链的结合分子，所述重链包含上述可变重链序列。在另一实施方案中，所述核酸分子编码包含轻链的结合分子，所述轻链包含上述可变轻链序列。本发明结合分子的重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列在下文给出。本发明另一方面提供了载体，即核酸构建体，其包含本发明的一或多种核酸分子。 载体可以衍生自质粒，如F、RU RPU Col、pBR322、T0L、Ti等；粘粒；噬菌体，如lambda、 lambdoid、M13、Mu、Pl、P22、Q3、T-even、T-odd、T2、T4、T7 等；植物病毒。载体可用于克隆和/或表达本发明的结合分子且甚至可用于基因治疗目的。与一或多种表达调节核酸分子可操作地连接的包含本发明一或多种核酸分子的载体也涵盖在本发明中。载体的选择依赖于随后的重组程序和使用的宿主。载体导入宿主细胞中可以通过磷酸钙转染、病毒感染、 DEAE-葡聚糖介导的转染、脂染或者电穿孔实现。载体可以是自主复制或者可以与其已经整合进其中的染色体一起复制。优选地，所述载体含有一或多个选择标记。标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，尽管如本领域技术人员熟知这对于本发明不是关键的。所述标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。本发明还涵盖这样的载体，其包含编码如上述人结合分子的一或多种核酸分子，其与编码可用于分离人结合分子的蛋白质或者肽的一或多种核酸分子可操作地连接。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合聚组氨酸、绿色荧光蛋白、荧光素酶和半乳糖苷酶。含有上述载体的一或多个拷贝的宿主是本发明的另一主题。优选地，所述宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或者细菌来源的细胞。细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阳性细菌或者革兰氏阴性细菌的细胞，如埃希氏菌属如大肠杆菌和假单胞菌属的一些物种。在真菌细胞中，优选使用酵母细胞。在酵母中表达可以通过使用酵母株如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)实现。此外，昆虫细胞如果蝇和 Sf9细胞可用作宿主细胞。除此之外，宿主细胞可以是植物细胞，如农作物如林业植物的细胞，或者来自提供食物和原材料如谷类植物的植物或者药用植物的细胞，或者装饰用植物的细胞，或者球根花卉作物细胞。转化的(转基因)植物或者植物细胞通过已知方法产生，例如农杆菌介导的基因转移、叶片转化、通过聚乙二醇诱导的DNA转移进行的原生质体转化、电穿孔、超声、显微注射或者bolistic基因转移。此外，合适的表达系统可以是杆状病毒系统。本发明优选使用哺乳动物细胞的表达系统，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或者Bowes黑素瘤细胞。哺乳动物细胞提供具有翻译后修饰的表达的蛋白质，其与哺乳动物来源的天然分子最相似。由于本发明涉及可能施用给人的分子，因此特别优选完全人表达系统。因此，更优选地，宿主细胞是人细胞。举例的人细胞是HeLa、 911、AT1080、A549、293和HEK293T细胞。在优选的实施方案中，人生产细胞包含可表达形式的编码腺病毒El区的核酸序列的至少功能部分。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞衍生自人视网膜并用包含腺病毒El序列的核酸永生化，如911细胞或者在1996年2月四日以编号 9602四40在European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain保藏以及以商标PER. C6 销售的细胞系(PER. C6是 Crucell Holland B. V.的注册商标)。对于本申请，“PER. C6细胞”是指以编号9602^40 保藏的细胞或者保藏细胞的祖先细胞、上游或下游传代细胞以及祖先细胞的后代细胞以及任何前述细胞的衍生物。在宿主细胞中生产重组蛋白可以根据本领域熟知的方法进行。以商标PER. C6 销售的细胞作为感兴趣蛋白质生产平台的应用在WO 00/63403中描述，所述文献在此以其全部内容援引加入本文。结合分子可以通过各种方式制备。产生本发明结合分子的方法是本发明的另一部分。所述方法包括步骤a)在有助于结合分子表达的条件下培养本发明的宿主，及b)任选地，回收所述表达的结合分子。所述表达的结合分子可以从无细胞提取物中回收，但是优选从培养基中回收。上述生产方法也可用于产生本发明结合分子的功能变体和/或免疫缀合物。从无细胞提取物或者培养基中回收蛋白质如结合分子的方法为本领域技术人员熟知。 通过上述方法可获得的结合分子、其功能变体和/或免疫缀合物也是本发明的一部分。或者，在宿主如在宿主细胞中表达之后，本发明的结合分子和免疫缀合物可以通过常规肽合成仪或者在无细胞翻译系统中使用衍生自本发明DNA分子的RNA核酸合成产生。通过上述合成产生方法或者无细胞翻译系统可获得的结合分子和免疫缀合物也是本发明的一部分。在再一个实施方案中，本发明的结合分子也可以在转基因非人哺乳动物如兔、山羊或者牛中产生，并且分泌进例如其乳汁中。在另一个实施方案中，本发明的结合分子优选特异性结合流感病毒H3N2或者其片段的人结合分子可以由表达人免疫球蛋白基因的转基因非人哺乳动物如转基因小鼠或者兔产生。优选地，转基因非人哺乳动物具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组， 所述转基因编码上述人结合分子的全部或者一部分。转基因非人哺乳动物可以用纯化的或者富集的流感病毒H3N2或者其片段的制备物免疫。免疫非人哺乳动物的方案为本领域熟知。见 Using Antibodies :A Laboratory Manual, Edited by :E. Harlow, D. Lane(1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 禾口 Current Protocols in Immunology, Edited byJ. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, Ε.M. Shevach, W. Strober(2001),John Wiley & Sons Inc.，New York所述，所述文献援引加入本文。免疫方案通常包括多次免疫，有或无佐剂如Freund' s完全佐剂和Freund' s非完全佐剂，但是也可包括裸DNA免疫。在另一实施方案中，人结合分子由衍生自转基因动物的B-细胞、 浆细胞和/或记忆细胞产生。在再一个实施方案中 ，人结合分子由杂交瘤产生，所述杂交瘤是通过将得自上述转基因非人哺乳动物的B-细胞与永生化细胞融合而制备。可得自上述转基因非人哺乳动物的B-细胞、浆细胞和杂交瘤和可得自上述转基因非人哺乳动物、B-细胞、浆细胞和/或记忆细胞及杂交瘤的人结合分子也是本发明的一部分。另一方面，本发明提供了鉴别特异性结合流感病毒H3N2的结合分子如人结合分子例如人单克隆抗体或者其片段或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，所述方法包括步骤(a)将在可复制遗传包装表面上的结合分子集合与流感病毒H3N2或者其片段在有助于结合的条件下接触，(b)对结合流感病毒H3N2或者其片段的可复制遗传包装至少选择一次，(c)从不结合流感病毒H3N2或者其片段的可复制遗传包装中分离并回收结合流感病毒H3N2或者其片段的可复制遗传包装。如本文所用，可复制遗传包装可以是原核或者真核的， 包括细胞、孢子、酵母、细菌、病毒、噬菌体、核糖体和多核糖体。优选的可复制遗传包装是噬菌体。所述结合分子如单链Fv被展示在所述可复制遗传包装上，即其附着于位于所述可复制遗传包装外表面的基团或者分子。所述可复制遗传包装是包含被筛选的结合分子的可筛选单位，其与编码所述结合分子的核酸分子连接。所述核酸分子应可以在体内(例如作为载体)或者体外(例如通过PCR，转录和翻译)复制。体内复制可以是自主复制(如对于细胞而言)，借助于宿主因子(如对于病毒而言)或者借助于宿主和辅助病毒二者(如对于噬菌粒而言)。展示结合分子集合的可复制遗传包装通过将编码被展示的外源结合分子的核酸分子导入可复制遗传包装的基因组中以与通常从可复制遗传包装外表面表达的内源蛋白质形成融合蛋白而形成。融合蛋白表达、转运至外表面及装配导致外源结合分子在可复制遗传包装外表面的展示。本发明方法中的选择步骤可以用活的且仍具有感染性或者失活的流感病毒H3N2 进行。流感病毒H3N2的失活可以通过本领域技术人员熟知的病毒失活方法进行，如用福尔马林、β-丙酸内酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外光处理。检测流感病毒Η3Ν2是否仍是活的、 感染性和/或可存活的或者部分或者完全失活的方法为本领域技术人员熟知。用于上述方法中的流感病毒Η3Ν2不需要是纯化形式，例如可以存在于感染个体的血清和/或血液中。 使用的流感病毒Η3Ν2也可以分离自在合适培养基中的细胞培养物。在一个实施方案中，当流感病毒Η3Ν2与可复制遗传包装接触时是悬浮状态。或者，当其发生接触时也可以与载体缀合。在一个实施方案中，可以针对一个流感病毒Η3Ν2 毒株进行第一次和进一步选择。或者，可以针对不同的流感病毒Η3Ν2毒株进行第一次和进一步选择。或者，选择步骤可以在存在流感病毒Η3Ν2的片段如细胞膜制备物、重组Η3Ν2 蛋白质或多肽、包含Η3Ν2蛋白质或多肽的融合蛋白、表达重组Η3Ν2蛋白质或者多肽的细胞等的情况下进行。这些蛋白质或者多肽的细胞外暴露部分也可以用作选择材料。流感病毒 Η3Ν2的片段在使用之前可以固定在合适材料上或者可以悬浮状态使用。在一个实施方案中，所述选择可以对流感病毒Η3Ν2的不同片段或者对不同流感病毒Η3Ν2毒株的片段进行。 发现合适的选择组合为技术人员熟知。选择可以通过ELISA或者FACS进行。再一方面，本发明提供了获得特异性结合流感病毒Η3Ν2毒株或者其片段或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，所述方法步骤步骤a)进行上述鉴别结合分子的方法，及b)从回收的可复制遗传包装中分离所述结合分子和/或编码所述结合分子的核酸分子。可复制遗传包装表面上的结合分子集合可以是scFv或者Fab的集合。一旦使用上述鉴别结合分子或者编码结合分子的核酸分子的方法确定或者鉴别出新的scFv或者FabJlJ 可以将编码所述scFv或Fab的DNA与细菌或者噬菌体分离并与标准分子生物学技术组合产生编码具有希望特异性的scFv、二价scFv、Fab或者完整人免疫球蛋白(例如IgG、IgA 或者IgM)的构建体。这些构建体可以转染进合适的细胞系中，最终产生完整的人单克隆抗体(见 Huls et al.，1999 ；Boel et al.，2000)。如前所述，优选的可复制遗传包装是噬菌体。鉴别和获得(人)结合分子如 (人)单克隆抗体的噬菌体展示方法是迄今为止本领域技术人员已知的熟知方法。所述方法在例如美国专利 5，696，108 ；Burton and Barbas, 1994 ；de Kruif et al.，1995b 和 Phage Display :A Laboratory Manual. Edited by :CF Barbas, DR Burton, JK Scott andGJ Silverman(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New ^rk中描述。所有这些诶参考文献均以其全部内容援引加入本文。对于构建噬菌体展示文库，使人单克隆抗体重链和轻链可变区基因的集合在噬菌体表面上表达，优选丝状噬菌体、 颗粒，如单链Fv(ScFv)或者Fab形式(见Kruif et al. , 1995b) 0表达抗体片段的噬菌体的较大文库典型含有超过1. OxlO9抗体特异性且可以从在免疫或者未免疫的个体的B-淋巴细胞中表达的免疫球蛋白V区中装配。在本发明一个特定实施方案中，结合分子的噬菌体文库、优选scFv噬菌体文库是从自得自已经针对流感病毒接种、近期针对不相关病原体接种、近期患有流感病毒H3N2感染的对象或者得自健康个体的细胞分离的RNA制备的。RNA 可以分离自骨髓或者外周血液，优选外周血淋巴细胞或者分离的B细胞或者甚至B细胞亚群如记忆B细胞，其被鉴别为⑶M+/⑶27+B细胞。对象可以是动物，优选人。在一个优选实施方案中，所述文库可以从由经鉴别为IgM+/⑶M+/⑶27+细胞的IgM记忆B细胞表达的免疫球蛋白V区装配。或者，噬菌体展示文库可以从已经在体外部分装配的免疫球蛋白可变区构建，以在文库(半合成文库)中导入另外的抗体多样性。例如，在体外装配的可变区在对于抗体特异性重要的那些分子区域如CDR区中含有合成产生的、随机化或者部分随机化的DNA序列。特异于流感病毒H3N2的噬菌体抗体可以从文库中选择，通过将所述病毒或者其片段暴露于噬菌体文库以使得表达特异于所述病毒或者其片段的抗体片段的噬菌体结合。未结合的噬菌体通过洗涤除去，结合的噬菌体洗脱以感染大肠杆菌及随后增殖。通常需要多轮选择和增殖循环以充分富集特异性结合所述病毒或者其片段的噬菌体。如果需要，在噬菌体文库暴露于所述病毒或者其片段之前，可以通过将所述噬菌体文库暴露于非靶材料如不同毒株的病毒或者其片段即非H3N2流感病毒而首先对噬菌体文库进行扣减。这些扣减病毒或者其片段可以结合固相或者是悬浮状态。噬菌体也可以针对与复合抗原的结合而选择， 如任选补加其它材料的H3N2蛋白质或者(多)肽的复合混合物。表达流感病毒H3N2的一或多种蛋白质或者(多)肽的宿主细胞也可以用于选择目的。使用这些宿主细胞的噬菌体展示方法可以通过在筛选期间加入过量的不包含靶分子或者包含与靶分子相似但不同的非靶分子的宿主细胞扣减不相关结合物而扩展和改良，从而显著增强发现相关结合分子的机会。当然，在用病毒或者其片段筛选之前、期间或者之后可以进行扣减。所述方法被称作默851肌01逸方法(默8511^0^是01^611 Holland B. V.的注册商标，也见援引加入本文的美国专利6，265，150所述)。再一方面，本发明提供了获得潜在具有针对流感病毒H3N2的中和活性的结合分子的方法，所述方法包括步骤(a)进行如上述获得特异性结合流感病毒H3N2或者其片段的结合分子或者编码这种结合分子的核酸分子的方法，及(b)核实所述分离的结合分子对于所述病毒、优选针对选自下组的至少一或多种流感病毒H3N2毒株是否具有中和活性A/ Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2007/99、A/ffisconsin/67/2005 禾口 A/Hiroshima/52/2005,优选所有H3N2毒株，特别是所有已知和未来的H3N2毒株。核实结合分子是否具有中和活性的测定为本领域熟知(见WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva :World Health Organisation,2005 version 2002. 5)。另一方面，本发明涉及通过上述方法之一可获得的人结合分子，其至少对于包含H3亚型的HA的甲型流感病毒具有中和活性。再一方面，本发明提供了组合物，其包含至少本发明的结合分子优选人单克隆抗体、至少其功能变体、至少本发明的免疫缀合物和/或其组合。除此之外，所述组合物可包含稳定分子，如白蛋白或者聚乙二醇，或者盐。优选地，所使用的盐是保留希望的结合分子的生物学活性及不赋予任何不希望的毒理学作用的盐。如果需要，本发明的人结合分子可以包被在一种材料之中或之上以保护其免于酸或者其他可以使所述结合分子失活的天然或者非天然条件的作用。再一方面，本发明提供了组合物，其至少包含本发明定义的核酸分子。所述组合物可包含水溶液如含有盐(例如NaCl或者如上述的盐)、去污剂(例如SDS)和/或其它合适成分的水溶液。此外，本发明涉及药物组合物，其包含至少本发明结合分子如人单克隆抗体(或者其功能片段或者变体)、至少本发明的免疫缀合物、至少本发明的组合物或者其组合。本发明的药物组合物进一步包含至少一种药物可接受的赋形剂。药物可接受的赋形剂为本领域技术人员熟知。本发明的药物组合物可进一步包含至少一种其它治疗剂。合适的治疗剂也为本领域技术人员熟知。在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种另外的结合分子，即所述药物组合物可以是结合分子的混合剂(cocktail)或者混合物。所述药物组合物可包含至少两种本发明的结合分子，或者至少一种本发明的结合分子和至少一种另外的流感病毒结合和/或中和分子。在另一实施方案中，所述另外的结合分子可以配制为同时分开施用或者相继施用。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含两或多种结合分子，其具有针对包含 H3亚型的HA的甲型流感病毒如H3N2的中和活性。在一个实施方案中，所述结合分子当组合使用时呈现出协同中和活性。换句话说，所述组合物可包含具有中和活性的至少两种结合分子，特征在于所述结合分子在中和流感病毒H3N2中起协同作用。如本文所用，术语“协同”是指当所述结合分子组合使用时的组合效应高于当单独使用时的加性效应。协同作用的结合分子可以结合流感病毒H3N2的相同或者不同片段上的不同结构。一种计算协同作用的方式是通过组合指数。组合指数(Cl)的概念由Chou and Talalay(1984)描述。所述组合物可例如包含具有中和活性的一种结合分子以及一种非中和H3N2特异性结合分子。 所述非中和和中和H3N2特异性结合分子在中和流感病毒H3N2中也可以协同作用。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含至少两种流感病毒中和结合分子，其中至少一种结合分子能中和系统发生类群1的一或多种流感病毒亚型，其中至少一种结合分子能中和系统发生类群2的一或多种流感病毒亚型。在一个实施方案中，所述药物组合物可包含至少一种本发明的结合分子及至少一种其他流感病毒中和结合分子。在另一实施方案中，所述其他流感病毒中和结合分子优选能结合并中和不同亚型的流感病毒，优选包含Hl的HA的流感病毒，如HlNUP /或包含H5亚型的HA的流感病毒， 如H5m，如WO 2008/028946中揭示的结合分子。更优选地，所述其他结合分子是针对系统发生类群1包括H1、H2、H5、H9的(所有)流感病毒亚型的交叉中和结合分子。在一个优选的实施方案中，所述其他结合分子是在WO 2008/028946中被鉴别为CR6261的结合分子，其包含包含SEQ ID N0:186所示氨基酸序列的第1-121位氨基酸的重链可变区或者其功能变体和/或包含SEQ ID NO 188的第1-112位氨基酸的轻链可变区。在再一个实施方案中， 所述结合分子包含分别包含SEQ ID NO :186和SEQ ID NO :188所示氨基酸序列的重链和轻链。药物组合物中的结合分子因此优选能与不同亚型的流感病毒反应。所述结合分子应是高亲和性的且应具有广泛特异性。优选地，两个结合分子均是交叉中和分子，其均中和不同亚型的流感病毒。此外，优选其中和尽可能多的每种不同流感病毒亚型的毒株。本发明的药物组合物可进一步包含至少一种其它治疗剂、预防剂和/或诊断剂。 优选地，所述药物组合物包含至少一种其它预防和/或治疗剂。优选地，所述其他的治疗剂和/或预防剂是能预防和/或治疗流感病毒H3N2感染和/或得自这种感染的病症的物质。 治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗病毒剂。这种抗病毒剂可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用于治疗流感病毒H3N2感染患者的其它物质是M2抑制剂(例如金刚烷胺、金刚乙胺)和/或神经氨酸酶抑制剂(例如扎那米韦、 奥司他韦)。这些物质可与本发明的结合分子组合使用。“组合”在本文是指作为单独的配制物或者作为一个组合配制物同时施用，或者作为单独的配制物根据相继施用方案以任意顺序施用。在实验阶段的能预防和/或治疗流感病毒H3N2感染和/或得自这种感染的病症的物质也可用作在本发明中有用的其它治疗剂和/或预防剂。本发明的结合分子或者药物组合物在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检验。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、雪貂和猴。典型地，药物组合物在生产和贮存条件下必须是无菌及稳定的。本发明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或者组合物可以是粉末形式以在递送之前或递送时在适当的药物可接受的赋形剂中重建。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末加上任何另外需要的成分。或者，本发明的结合分子、免疫缀合物、核酸分子或者组合物可以是在溶液中以及在递送之前或者在递送时可以加入和/或混合适当的药物可接受的赋形剂以提供单位剂量注射形式。优选地，本发明中使用的药物可接受的赋形剂适合高药物浓度，可以保持适当流动性，且如果需要时可以延缓吸收。施用所述药物组合物的最佳途径的选择受一些因素的影响，包括组合物内活性分子的理化性质、临床状况的紧急度以及活性分子的血浆浓度与希望的治疗作用之间的关系。例如，如果需要，本发明的结合分子可以用载体制备，这将保护其免于快速释放，如控制释放配制物，包括植入体、经皮贴剂及微囊输送系统。可以使用生物可降解的、生物相容聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。此外，可能需要用防止所述人结合分子失活的材料或化合物包被所述结合分子或者与所述结合分子一起施用。例如，所述结合分子可以在合适的载体如脂质体或者稀释剂中施用给对象。施用途径可分为两种主要方式口服和胃肠外施用。优选的施用途径是静脉内或者通过吸入。口服剂型可以配制为片剂、含片(troche)、锭剂(lozenge)、水性或者油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳状液、硬胶囊、软凝胶胶囊、糖浆或者酏剂、丸剂、糖衣片、液体、凝胶或者膏剂。这些配制物可含有药物赋形剂，包括但不限于惰性稀释剂、粒化和崩解剂、结合齐IJ、润滑剂、防腐剂、着色剂、调味剂或者增甜剂、植物油或者矿物质油、增湿剂以及增稠剂。本发明的药物组合物也可以配制为胃肠外施用。胃肠外施用的配制物可以是水性或者非水性等渗无菌无毒注射或灌注溶液或者悬浮液的形式。所述溶液或悬浮液可包含在所用剂量和浓度对于受体无毒性的物质，如1，3-丁二醇、Ringer’ s溶液、Hank’ s溶液、等渗氯化钠溶液、油、脂肪酸、局麻剂、防腐剂、缓冲液、增稠剂或者增溶剂、水溶性抗氧化剂、 油溶性抗氧化剂以及金属螯合剂。再一方面，本发明的结合分子如人单克隆抗体(其功能片段和变体)、免疫缀合物、组合物或者药物组合物可用作药物。因此，使用本发明的结合分子、免疫缀合物、组合物或者药物组合物诊断、治疗和/或预防流感病毒H3N2感染的方法是本发明的另一部分。上述分子可用于流感病毒H3N2感染的诊断、预防、治疗或其组合。其适用于治疗仍未治疗的患有流感病毒H3N2感染的患者以及已经或者正针对流感病毒H3N2感染进行治疗的患者。上述分子或者组合物可与用于诊断、预防和/或治疗的其它分子联合使用。其可在体外、离体或者体内使用。例如，本发明的结合分子如人单克隆抗体(或者其功能变体)、 免疫缀合物、组合物或者药物组合物可以与流感病毒H3N2的疫苗(如果可获得)一起施用。或者，所述疫苗也可以在施用本发明的分子之前或者之后施用。代替疫苗，抗病毒剂也可以与本发明的结合分子联合使用。合适的抗病毒剂如上文所述。所述分子典型以治疗或者诊断有效量在本发明组合物和药物组合物中配制。或者，其可以单独配制和施用。例如，可以全身性应用其它分子如抗病毒剂，同时静脉内应用本发明的结合分子。治疗可以针对H3N2感染易感的患者群。这种患者群包括但不限于例如老年人(例如彡50岁，彡60岁及优选彡65岁)、幼儿(例如彡5岁，彡1岁)、住院患者以及已经用抗病毒化合物治疗但是抗病毒应答不充分的患者。可以调整给药方案以提供最佳的希望的应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0. Ι-lOOmg/kg体重、优选l-50mg/kg体重、优选0. 5_15mg/kg体重。此外，例如可以在一定时间施用一次推注、几次分开的剂量，或者根据治疗情况的需要按比例降低或者增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域熟知。可用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以与本发明结合分子相似的给药方案施用。如果单独施用其它分子，其可以在施用本发明的一或多种人结合分子或者药物组合物之前(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、 6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、 3天、4天、5天、7天、2周、4周或者6周之前)、同时或者随后(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或者6 周后)施用给患者。精确的给药方案通常在病人临床试验期间整理。人结合分子及包含所述人结合分子的药物组合物当作为体内治疗剂施用给人时是特别有益且通常是优选的，因为受体对于施用的抗体的免疫应答通常基本上低于施用单克隆鼠结合分子、嵌合结合分子或者人源化结合分子引起的。另一方面，本发明涉及本发明的结合分子如中和人单克隆抗体(其功能片段和变体)、免疫缀合物、核酸分子、组合物或者药物组合物在制备用于流感病毒H3N2感染的诊断、预防、治疗或其组合的药物中的应用。接下来，试剂盒也是本发明的一部分，所述试剂盒包含至少本发明的结合分子如中和人单克隆抗体(其功能片段和变体)、至少本发明的免疫缀合物、至少本发明的核酸分子、至少本发明的组合物、至少本发明的药物组合物、至少本发明的载体、至少本发明的宿主或其组合。任选地，上述本发明试剂盒的成分包装在合适的容器中，并标示用于指定病症的诊断、预防和/或治疗。上述成分可以水溶液优选无菌溶液或者作为冻干的优选无菌的用于重建的配制物形式贮存在单位或者多剂量容器中。所述容器可以由各种材料如玻璃或者塑料制成，可具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述容器可还包含包含药物可接受缓冲液的更多个容器。其还可以包括从商业和用户立场所需的材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、用于一或多种合适的宿主的培养基，以及可能地，甚至至少一种其他的治疗剂、预防剂或诊断剂。与所述试剂盒相关的可以是按惯例包含在治疗、预防或诊断产品的商业包装中的说明书，其含有关于例如这种治疗、预防或者诊断产品使用相关的适应症、用法、剂量、生产、施用、禁忌症和/或注意事项的信息。本发明的结合分子也可以在体外方法中有利地用作诊断剂以检测系统发生类群2 亚型流感病毒。本发明因此进一步涉及检测样品中流感病毒系统发生类群2亚型流感病毒的方法，所述方法包括步骤(a)将样品与诊断有效量的本发明结合分子(其功能片段和变体)或者免疫缀合物接触，及(b)确定所述结合分子或者免疫缀合物是否特异性结合所述样品的分子。所述样品可以是生物学样品，包括但不限于血液、血清、粪便、痰液、鼻咽部抽吸物、支气管灌洗液、尿液、组织或者来自(潜在)感染的对象的其它生物学材料，或者非生物学样品如水、饮料等。(潜在)感染的对象可以是人，但也可以是怀疑是流感病毒系统发生类群2亚型的载体的动物进行检测所述病毒的存在情况，使用本发明的人结合分子或者免疫缀合物进行。首先对样品进行操作以使其更适合检测方法。所述操作是指对怀疑含有和/或含有病毒的样品进行处理，由此所述病毒分解成抗原性成分如蛋白质、(多)肽或者其它抗原性片段。优选地，将本发明的人结合分子或者免疫缀合物与样品在使得所述人结合分子与样品中可能存在的病毒或者其抗原性成分之间形成免疫复合物的条件下接触。然后通过合适方式检测及测量表示样品中存在病毒的免疫复合物的形成(如果有的话)。这种方法包括同源和异源结合免疫测定，如放射性免疫测定(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS, BIAC0RE和Western印迹分析。优选的测定技术、特别是针对大规模临床筛选患者血清和血液及血液衍生制品的测定技术是ELISA和Western印迹技术。特别优选ELISA检测。对于在这些测定中用作试剂，本发明的结合分子或免疫缀合物与微滴定孔的内表面方便地结合。本发明的结合分子或者免疫缀合物可直接与微滴定孔结合。然而，本发明的结合分子或者免疫缀合物与所述孔的最大结合可以通过在孔中加入所述结合分子或者免疫缀合物之前用聚赖氨酸对所述孔进行预处理而实现。此外，本发明的结合分子或者免疫缀合物可以通过已知方式与所述孔共价附着。尽管也可以使用较高以及较低的量，但通常使用0. 01-100 μ g/ml的所述结合分子或者免疫缀合物进行包被。然后将样品加入用本发明的结合分子或者免疫缀合物包被的孔中。
此外，本发明的结合分子可用于鉴别流感病毒H3N2的特异性结合结构。所述结合结构可以是蛋白质和/或多肽上的表位。其可以是线性的，但是也可以是结构和/或构象的。在一个实施方案中，所述结合结构可以通过PEPSCAN分析进行分析(见WO 84/03564， WO 93/09872，Slootstra et al.，1996)。或者，可以对包含来自流感病毒H3N2的蛋白质的肽的随机肽文库筛选能结合本发明结合分子的肽。发现的所述结合结构/肽/表位可用作疫苗及用于诊断流感病毒H3N2感染。在除了蛋白质和/或多肽之外的片段由所述结合分子结合的情况中，结合结构可以通过质谱分析、高效液相层析及核磁共振鉴别。另一方面，本发明提供了筛选特异性结合与由本发明的人结合分子结合的表位相同的流感病毒H3N2的表位的结合分子(或者其功能片段或者变体)的方法，所述方法包括步骤(a)将待筛选的结合分子、本发明的结合分子与流感病毒H3N2或者其片段接触，(b) 测量待筛选的结合分子是否能与本发明的结合分子竞争特异性结合流感病毒H3N2或者其片段。在进一步的步骤中可以确定能竞争特异性结合流感病毒H3N2或者其片段的筛选的结合分子是否具有中和活性。能与本发明的结合分子竞争特异性结合流感病毒H3N2或者其片段的结合分子是本发明的另一部分。在上述筛选方法中，“特异性结合相同表位”也涵盖了特异性结合与由本发明的结合分子结合的表位基本上或者实质上相同的表位。阻断或者竞争本发明结合分子与流感病毒H3N2的结合的能力典型示出待筛选的结合分子结合流感病毒H3N2上的表位或者结合位点，所述表位或者结合位点在结构上与由本发明的结合分子免疫特异性识别的流感病毒H3N2上的结合位点重叠。或者，这可以表示待筛选的结合分子结合与由本发明的结合分子免疫特异性识别的结合位点足够接近的表位或者结合位点，在空间上或者另外地抑制本发明结合分子与流感病毒H3N2的结合。通常，竞争性抑制是通过这样的测定测量，其中将抗原组合物即包含流感病毒 H3N2或者其片段的组合物与参考结合分子即本发明的结合分子以及待筛选的结合分子混合。通常，所述待筛选的结合分子是过量存在的。基于ELISA和Western印迹的方案适用于这种简单竞争研究。通过使用物种或者同种型二抗，仅能检测结合的参考结合分子，其结合由于待筛选的基本上识别相同表位的结合分子的存在而降低。在进行参考结合分子与任何待筛选的结合分子(无论物种或者同种型如何)之间的结合分子竞争性研究中，可以首先对所述参考结合分子用可检测标记如生物素、酶、放射性标记或者其它标记物进行标记以使得随后可以进行鉴别。通过这些竞争性测定鉴别的结合分子(竞争性结合分子或者交叉反应性结合分子)包括但不限于结合由所述参考结合分子即本发明的结合分子结合的表位或者结合位点的抗体、抗体片段及其它结合剂，以及结合与由所述参考结合分子结合的表位足以接近的表位或者结合位点的抗体、抗体片段及其它结合剂，在待筛选的结合分子与参考结合分子之间发生竞争性结合。优选地，本发明的竞争性接合分子当过量存在时抑制参考结合分子与选择的靶物种的特异性结合，抑制程度为至少10%、优选至少25%、 更优选至少50%、最优选至少75% -90%或者更高。结合与本发明的结合分子结合的表位大致、基本上、实质上相同或者相同表位的一或多种竞争性结合分子的鉴别是一种简单易行的技术。与参考结合分子即本发明的结合分子相比鉴别竞争性结合分子，应理解实际上确定所述参考结合分子和竞争性结合分子结合的表位在任何方式上不是鉴别与所述参考结合分子结合相同或者基本上相同的表位的竞争性结合分子必需的。本发明在如下的实施例和附图中进一步阐述。所述实施例不以任何方式意图限制本发明的范围。实施例实施例1 使用从记忆B细胞提取的RNA构建scFv噬菌体展示文库从正常健康供体通过在EDTA抗凝取样管中静脉穿刺收集外周血。scFv噬菌体展示文库如WO 2008/028946所述获得，所述文献援弓I加入本文。将记忆B细胞(⑶M+/⑶27+) 与天然B细胞(⑶M+/⑶27-)和记忆T细胞(⑶M-/⑶27+)分离，在接下来的步骤中，使用 IgM表达将IgM记忆B细胞(IgM+)与转换(switch)记忆B细胞(IgM-)分离。从IgM记忆 B细胞分离RNA及制备cDNA。进行两轮PCR扩增，使用表1和2中列出的引物，以从各自供体全部组成成分中分离免疫球蛋白VH和VL区。使用表1中列出的引物组对各个cDNA进行第一轮扩增针对各自的VH、Vkappa和 Vlambda区产生大约650碱基对的7、6和9个产物。对于IgM记忆B细胞VH区扩增，OCM恒定引物与0H1-0H7组合使用。第一轮扩增的热循环程序是2分钟96°C (变性步骤)；30个如下循环30秒96°C /30秒55°C /60秒72°C ； 10分钟72°C最终延伸以及4°C冷却。将产物加样并分离自琼脂糖凝胶，使用凝胶提取柱Oliagen)进行，并在50μ1 ImM Tris-HCl PH 8.0中洗脱。将10%的第一轮产物(5μ1)进行第二轮扩增，使用表2列出的引物进行。 这些引物用限制位点扩展，使得各自的VL和VH区定向克隆进噬菌体展示载体PDV-C06中。 第二轮扩增的PCR程序如下2分钟96°C (变性步骤)；30个如下循环30秒96°C /30秒 60°C/60秒72°C ；10分钟72°C最终延伸以及4°C冷却。首先根据在免疫球蛋白基因产物中发现的J节段的自然发生情况集合第二轮产物( 350个碱基对)，针对VH、Vkappa和 Vlambda可变区分别获得7、6和9个集合(见表3和4)。为了获得免疫球蛋白序列在免疫文库中的标准化分布，根据表3中所述百分比混合所述6个Vkappa和9个Vlambda轻链集合。将这个单一最终VL集合(3yg)用限制酶MlI和NotI消化过夜，加样并分离自1.5% 琼脂糖凝胶( 350个碱基对)，使用Qiagen凝胶提取柱进行，并如下所述在MlI-NotI切割PDV-C06载体( 5000碱基对)中连接10 μ 1 PDV-C06载体(50ng/ μ 1),7 μ 1 VL插入体(lOng/ μ 1),5 μ 1 IOX 连接缓冲液(NEB)，2. 5 Τ4 DNA 连接酶(400U/ μ 1) (NEB)，25. 5 μ 1 超纯水(载体与插入体比率为1 2)。在16°C水浴中连接过夜。接下来，将该体积用水加倍，用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(75 24 1) (Irwitrogen)提取，随后用氯仿(Merck) 提取，及用 Ιμ Pellet Paint (Novogen)、10 μ 1 乙酸钠(3M ρΗ 5.0)和 100 μ 1 异丙醇在-20°C沉淀2小时。获得的样品随后在4°C以20. OOOxg离心30分钟。将获得的沉淀用 70%乙醇洗涤及在室温以20. OOOxg离心10分钟。通过真空抽吸除去乙醇，将所得沉淀风干几分钟，然后溶解在含有IOmM Tris-HCl, pH 8. 0的50 μ 1缓冲液中。将1 μ 1连接混合物用于在冷却的0. Icm电穿孔杯(Biorad)中转化40 μ 1 TG-I电感受态细胞(Stratagene)， 使用 Gen印ulser II 设备(Biorad)，设定为 1. 7kV、2000hm、25 μ F (时间常数 4，5msec)。 紧接在脉冲后，将细菌用含有5% (w/v)葡萄糖(Sigma)的1000 μ 1 SOC介质(Invitrogen) 在37°C从所述杯中冲洗出，移至15ml圆底培养管中。另外500 μ 1 SOC/葡萄糖用于从电穿孔杯中冲洗剩余的细菌并加入所述培养管中。通过在摇床培养箱中在37°C以220rpm培养精确1小时回收细菌。将转化的细菌铺板在大MOmm方形培养皿(NUNC)中，所述培养皿含有200ml 2TY琼脂(16g/l细菌用胰蛋白胨，10g/l细菌用酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l琼脂，pH 7.0)，补加了 50 μ g/ml氨苄青霉素和5% (w/v)葡萄糖(Sigma)。将1-1000稀释液铺板在含有相同介质的15cm培养皿上进行计数。重复进行20次这个转化程序，将完整的文库铺板在总共30个大方形培养皿上，在37°C培养器中生长过夜。典型地，使用上述方案获得大约lxl07cfU。通过轻微刮取细菌置于IOml 2TY培养基/平板中而从所述平板收获中间体VL轻链文库。通过0D600测量确定细胞团块，将两倍的5000D细菌用于maxi质粒 DNA制备物，使用两个P500 maxipr印柱^jiagen)根据厂商指导进行。与VL可变区相似，首先将第二轮VH-JH产物混合在一起，获得标准J节段使用分布(见表4)，获得称作PH1-PH7的7个VH亚集合。将该集合使用表4所述百分比混合以获得标准化的序列分布，获得一个VH部分，将其用SfiI和B10I限制酶消化并连接进如上述获得的SfiI-XhoI切割PDV-VL中间文库中。TGl的连接设置、纯化方法、随后的转化以及细菌的收获如针对VL中间文库所述(见上述)。使用集落PCR检测最终文库(大约^ClO6Cfu) 的插入频率，使用在插入的VH-VL区两侧的引物组进行。95%以上的集落示出适当长度的插入物(见表幻。所述集落PCR产物用于随后的DNA序列分析以检测序列变异及评估示出完整ORF的集落百分比。这典型为70%以上(见表5)。也分析了 V基因中的突变频率。在 50个序列中，47个序列(94%)不是表示成熟过程的种系构型及与用作文库RNA来源的B 细胞的记忆表型一致。最终，通过使用CT辅助噬菌体拯救文库及扩增(见WO 02/103012) 并通过如下文所述淘选方法用于噬菌体抗体选择。实施例2 携带针对甲型流感病毒亚型H3和H7及乙型流感病毒的单链Fv片段的噬菌体的选择使用基本如上述构建的抗体噬菌体展示文库及一般的噬菌体展示技术和基本如美国专利6，沈5，150和WO 98/15833(均援引加入本文)所述的MABSTRACT 技术选择抗体片段。此外，如WO 02/103012(援引加入本文)所述方法和辅助噬菌体用于本发明中。针对甲型流感病毒亚型H3(A/Wisconsin/67/2005)和 H7 (A/ Netherlands/219/2003)或者乙型流感病毒(B/0hio/01/2005)的重组血凝素(HA)进行选择。将 HA 抗原在 PBS(5. 0μ g/ml)中稀释，加入 MaxiSorp Nunc-Immuno Tubes (Nunc)中， 在4°C在旋转盘上保温过夜。倒空所述immimotubes，用封闭缓冲液(在PBS中2%脱脂奶粉(ELK))洗涤三次。随后将该immimotubes用封闭缓冲液完全充填，在室温保温1_2小时。将等份的噬菌体展示文库(500-1000 μ 1，0. ^dO13-IxIO13Cfu，使用CT辅助噬菌体扩增 (见WO 02/103012))在补加10%非加热失活的胎牛血清和2%小鼠血清的封闭缓冲液中在室温封闭1-2小时。将封闭的噬菌体文库加入immimotubes中，在室温保温2小时，用洗涤缓冲液(在PBS中0.05% (v/v)Tween-20)洗涤以除去未结合的噬菌体。结合的噬菌体从各自的抗原中洗脱，通过与Iml的IOOmM三乙胺(TEA)在室温保温10分钟进行。随后， 将洗脱的噬菌体与0.5ml的IM Tris-HCl pH7. 5混合以中和pH。这个混合物用于感染已经在37°C生长至OD 600nm为大约0. 3的5ml的XLl-Blue大肠杆菌培养物。使所述噬菌体在37°C感染XLl-Blue细菌30分钟。然后，将该混合物在室温以3000xg离心10分钟， 将细菌沉淀重悬于0. 5ml 2-胰蛋白胨酵母提取物OTY)培养基中。将获得的细菌悬浮液分成两个补加了四环素、氨苄青霉素和葡萄糖的2TY琼脂平板中。在将平板在37°C保温过夜后，从平板中刮取集落，用于制备富集的噬菌体文库，基本如De Kruif et al. (1995a)和 WO 02/103012所述进行。简而言之，刮取的细菌用于接种含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖
33的2TY培养基，在37°C生长至OD 600nm为 0. 3。加入CT辅助噬菌体，并使其感染细菌， 之后将培养基改变为含有氨苄青霉素、四环素和卡那霉素的2TY培养基。在30°C保温过夜。 第二天，通过离心从所述2TY培养基除去细菌，之后培养基中的噬菌体通过使用聚乙二醇 (PEG)6000/NaCl沉淀。最后，将噬菌体溶解于具有牛血清白蛋白(BSA)的^il PBS中， 过滤灭菌，并用于下一轮选择。对相同HA亚型或者对不同亚型的HA进行第二轮选择。进行两轮连续选择，之后分离单独的单链噬菌体抗体。在第二轮选择后，单独的大肠杆菌集落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上，将单独的集落在96孔平板中生长至对数期，用VCS-M13辅助噬菌体感染，之后使得噬菌体抗体产生进行过夜。将含有噬菌体抗体的上清直接用于ELISA中以结合HA抗原。或者，将噬菌体抗体进行PEG/NaCl-沉淀并过滤灭菌，以进行ELISA和流式细胞计量术分析。实施例3 =HA特异性单链噬菌体抗体的确认将含有在上述筛选中获得的单链噬菌体抗体的选择的上清在ELISA中确认特异性，即与不同HA抗原的结合。为此，用杆状病毒表达的重组H3(A/WisConsin/67/2005)、 H7(A/Netherlands/219/2003)和 B(B/0hio/01/2005)HA，s(Protein Sciences,CT,USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被后，将平板用含有0. 1 % v/v Tween-20的PBS洗涤3次及在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室温封闭1小时。将选择的单链噬菌体抗体在含有 4% ELK的等体积的PBS中保温1小时以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗涤3次，将封闭的单链噬菌体抗体加入孔中。保温1小时，将平板用PBS/0. 1% Tween-20洗涤并使用与过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测(使用0D492nm测量)结合的噬菌体抗体。作为对照，同时不使用单链噬菌体抗体及使用不相关阴性对照单链噬菌体抗体进行该方法。从用IgM记忆B细胞文库对不同HA抗原进行的选择中，获得特异于重组H3HA 和 H7HA 的 6 个独特的单链噬菌体抗体(SC08-001、SC08-003、SC08-006、SC08-014、SC08-017 和SC08-018)。此外，分离了特异于重组H3HA(SC08-015和SC08-016)的2个独特的单链噬菌体抗体及特异于重组 H7HA(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011 和 SC08-013)的 5 个独特的单链噬菌体抗体。见表6。或者，使用PEG/NaCl-沉淀的及过滤灭菌的噬菌体抗体确认ELISA结合及特异性。为此，将杆状病毒表达的重组甲型流感病毒Hl (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/ Wisconsin/67/2005)、H5 (A/Vietnam/1203/2004)、H7 (A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/0hio/01/2005, B/Malaysia/2506/2004, B/Jilin/219/2003) HA，s (Protein Sciences, CT, USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被之后，将平板用含有0. 1 % ν/ν Tween-20的PBS洗涤3次并在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室温封闭1小时。将选择的单链噬菌体抗体在等体积的含有4% ELK的PBS中保温1小时以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗涤3次，将封闭的单链噬菌体抗体加入孔中。继续保温1小时，将该平板用PBS/0. 1% Tween-20洗涤，结合的噬菌体抗体用与过氧化物酶缀合的抗-M13抗体检测(使用OD 492nm测量)。作为对照，不用单链噬菌体抗体及使用阴性对照单链噬菌体抗体同时进行该程序。从使用IgM记忆B细胞文库对不同HA 抗原的选择中，获得特异于重组HI、H3和H7HA的2个独特的单链噬菌体抗体(SC08-001 和SC08-014)。此外，分离了特异于重组H3HA的6个独特的单链噬菌体抗体(SC08-003、 SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017 和 SC08-018)及 5 个特异于重组 H7HA 的独特单链噬菌体抗体(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011 和 SC08-013)。见表 7。或者，使用PEG/NaCl-沉淀的和过滤灭菌的噬菌体抗体通过FACS分析确认结合和特异性。为此，使全长重组甲型流感病毒亚型Hl (A/New Caledonia/20/1999), H3(A/ ffisonsin/67/2005)、H5 (TV)、H7 (A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/0hio/ ol/2005)HA在PER. C6细胞表面上表达。将该细胞与单链噬菌体抗体保温1小时，随后用 PBS+0. 1 % BSA洗涤3次。结合的噬菌体用FITC缀合的M13-抗体检测。从使用IgM记忆 B细胞文库对不同HA抗原的选择中，分离了特异于甲型流感病毒亚型HI、H3和H7HA的一个单链噬菌体抗体(SC08-001)。此外，分离了特异于H3HA的6个独特的单链噬菌体抗体 (SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017 和 SC08-018)、特异于 H7HA 的 4 个独特的单链噬菌体抗体(SC08-007、SC08-010、SC08-011和SC08-013)。见表8。其中6个噬菌体抗体(SC08-001、SC08-003、SC08-015、SC08-016、SC08-017、SC08-018)用于构建完全人免疫球蛋白以进一步鉴定(见实施例5)。实施例4 甲型流感病毒(H3N2) HA特异性永生化B细胞克隆的选择和确认除了噬菌体展示之外，本发明的结合分子也可以通过其它方法分离，例如使用永生化B细胞，如WO 2007067046所述。将衍生自接种的供体的的永生化IgM记忆细胞 (⑶19+/⑶27+，IgD+)用APC标记的H3HA染色，并将淘选的单细胞进行限制性稀释培养。在回收及细胞扩展后，通过固相ELISA测量H3HA淘选的细胞的上清的HI、H3和H7免疫反应性。随后，鉴定靶特异性B细胞的结合活性和中和作用。将B细胞通过限制稀释克隆， 产生单一克隆。将这些克隆种植在培养平板中，培养细胞14天。筛选克隆上清的抗-HA单克隆抗体的产生情况，所述抗-HA单克隆抗体结合表达Hl、H3、H5和H7衍生的HA的HA转染的293细胞。作为特异性或者背景染色的对照，使用未转染的293细胞。为了确定在上述筛选中获得的含有IgM或IgG抗体的选择的B细胞克隆上清是否能阻断甲型流感病毒(H3N2)感染，进行体外病毒中和测定(VNA)。在MDCK细胞(ATCC CCL-34)上进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基(MEM培养基，补加抗生素、20mM Hepes 和0. 15% (w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基)，补加10% (ν/ν)胎牛血清)中培养。将在测定中使用的毒株 H3N2(A/Wisconsin/67/2005)稀释至 5. 7X 103TCID50/ml 效价(50%组织培养物感染剂量/ml)，效价根据Spearman和Karber方法计算。在一式四份孔中将IgG 或者IgM制备物在完全MEM培养基中进行2-倍系列稀释(1 2-1 64)。将25 μ 1各个 IgG稀释液与25 μ 1病毒悬浮液(100TCID50/25l·! 1)混合，在37°C保温1小时。然后将此悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中，所述孔中含有在50 μ 1完全MEM培养基中铺满的MDCK 培养物。在使用前，将MDCK细胞以3χ104个细胞/孔种植在MDCK细胞培养基中，生长直至细胞达到铺满，用300-350 μ 1 PBS、pH 7. 4洗涤，最后将50 μ 1完全MEM培养基加入每个孔中。接种的细胞在37°C培养3-4天，每天观测致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照进行对比。在检测的187个IgG上清中，发现43个中和这个测定中使用的H3N2 (A/ Wisconsin/67/2005)毒株。其中14个用于构建人IgG免疫球蛋白，如实施例5所述。实实例5 从选择的单链Fv和B细胞克隆构建完全人免疫球蛋白分子(人单克隆抗体)
从选择的特异性单链噬菌体抗体(scFv)克隆中获得质粒DNA，根据标准技术确定核苷酸和氨基酸序列。通过限制性消化直接克隆scFv的重链和轻链可变区，以在IgG表达载体 pIg-C911-HCgammal (见 SEQ ID No :189)、pIG_C909_Ckappa (见 SEQ ID NO :190)或者pIg-C910-Clambda (见SEQ ID No :191)中表达。将B细胞克隆的重链和轻链可变区通过PCR扩增并通过限制性消化直接克隆以在IgG表达载体pIg-C911-HCgammal (见SEQ ID No :190)、pIG-C909-Ckappa (见 SEQ ID NO :191)或者 pIg-C910_Clambda (见 SEQ ID No: 192)中表达。确定 scFv 的 VH和 VL基因相同性(见 iTomlinson IM et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom :MRC Centre for Protein Engineering(1997)) (见表9)。根据本领域技术人员已知的标准技术证实所有构建体的核苷酸序列。所得的编码人IgGl重链和轻链的表达构建体在细胞中组合瞬时表达，使用标准纯化方法获得并产生含有人IgGl抗体的上清。将人IgGl抗体在10-0. 003 μ g/ml浓度范围对H3、H7或B 抗原进行滴定(数据未示出)。不相关抗体作为对照抗体。选择的免疫球蛋白分子的重链和轻链的CDR的氨基酸序列在表9中给出。重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列在下文给出。所述免疫球蛋白包含的重链和轻链恒定区，如下文示出。实实例6 通过H3N2结合IgG(病毒中和测定)对流感病毒的体外中和为了确定选择的IgG是否能阻断甲型流感病毒(H3N2)感染，进行体外病毒中和测定(VNA)。对MDCK细胞(ATCC CCL-34)进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基中培养 (MEM培养基，补加了抗生素、20mM !fepes和0. 15% (w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基)，补加10% (ν/ν)胎牛血清)。将用于该测定中的H3N2(A/WiSCOnsin/67/2005)毒株稀释至 5，7xl03TCID50/ml效价(50%组织培养物感染剂量/ml)，效价根据Spearman和Karber所述方法计算。将IgG制备物ΟΟΟμ g/ml)在一式四份孔中在完全MEM培养基中2-倍系列稀释(1 2-1 512)。将25μ 1各个IgG稀释液与25μ 1病毒悬浮液(100TCID50/25y 1) 混合，在37°C保温1小时。然后将该悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中，孔中含有在 50 μ 1完全MEM培养基中铺满的MDCK培养物。在使用之前，将MDCK细胞以3χ104个细胞/ 孔种植在MDCK细胞培养基中，生长直至细胞达到铺满，用300-350 μ 1 PBS pH 7. 4洗涤，最后向每个孔中加入50μ 1完全MEM培养基。将接种的细胞在37°C培养3-4天，每天观测致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照进行对比。对实施例5的人抗-H3HA和/或抗-H7HA抗体进行上述VNA。在这些抗体中，除了 CR8040、CR8052 和 CR8069 之外的所有抗体均中和 A/Wi sconsin/67/2005H3N2 毒株。这些抗体保护MDCK培养物免于CPE的浓度(μ g/ml)在表11中示出。实施例7 抗-H3N2 IgG的交叉结合反应性在ELISA中确认上述H3N2中和IgG抗体的结合特异性，即与不同HA抗原的结合。 为此，杆状病毒表达的重组 Hl (A/New Caledonia/20/1999)、H3 (A/ffisconsin/67/2005, A/ New York/55/2004, A/ffyoming/3/2003)和 H7 (A/Netherlands/219/2003) HA，s (Protein Sciences, CT, USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被之后，将平板用含有0. 1 % ν/ν Tween-20的PBS洗涤3次并在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室温封闭1小时。倒空平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗涤3次，将所述IgG抗体加入孔中。继续保温1小时，将平板用PBS/0. 1% Tween-20洗涤，使用与过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体检测结合的抗体(使用OD 492nm测量)。作为对照，使用不相关的IgG CR4098。从选择的H3N2中和抗体中，CR8001示出与所有检测的重组HA的异源亚型 (heterosubtypic)交叉结合，CR8020、CR8021、CR8041、CR8043 和 CR8057 示出与所有三个检测的 H3HA 以及 H7HA 的异源亚型交叉结合。CR8003、CR8015、CR8016、CR8017、CR8018、 CR8038、CR8039、CR8040、CR8049、CR8050、CR8052 和 CR8069 示出与所有 3 个检测的 H3HA 的交叉结合。一个抗体CR8019示出仅结合2个H3HA。见表12。此外，选择的H3N2中和抗体用于通过FACS分析检测异源亚型结合。为此，使全长重组甲型流感病毒亚型 Hl (A/New Caledonia/20/1999)、H3 (A/ffisonsin/67/2005)和 H7 (A/Netherlands/219/2003)HA在PER. C6细胞表面上表达。将细胞与IgG抗体保温1小时，随后用PBS+0. 1%BSA洗涤3次。结合的抗体用PE缀合的抗人抗体检测。作为对照，使用未转染的PER. C6细胞。从H3N2中和抗体中，CR8001示出对甲型流感病毒亚型H1、H3和H7HA的交叉结合活性而野生型PER. C6细胞没有。此外，CR8020和CR8041示出与H3和H7HA均强力结合。 CR8043和CR8057示出与H3HA强力结合，与H7HA弱结合。CR8055示出在PER. C6细胞上低水平背景染色。剩余的13种抗体示出仅与H3转染的细胞结合。见表12。实施例8 抗-H3N2 IgG的交叉中和活性为了确定选择的IgG是否能阻断多个甲型流感病毒毒株，进行另外的体外病毒中和测定(VNA)。对MDCK细胞(ATCC CCL-34)进行VNA。将MDCK细胞在MDCK细胞培养基中培养(MEM培养基，补加了抗生素、20mM Hepes和0. 15 % (w/v)碳酸氢钠(完全MEM培养基)，补加10% (ν/ν)胎牛血清)。将该测定中使用的Hmi (A/New Caledonia/20/1999 A/Brisbane/59/2007 和 A/Solomon Islands/IVR-145)、H3N2 (A/ Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2000/1999, A/Hiroshima/52/2005 和 A/Wisconsin/67/2005)、H7N3 (A/Mallard/Netherlands/12/2000)以及 HlO (A/Chick/ Germany/N/49)毒株均稀释至5，7xl03TCID50/ml效价(50%组织培养物感染剂量/ml)，效价根据Spearman和Karber所述方法计算。将IgG制备物(80 μ g/ml)在一式四份孔中用完全MEM培养基2-倍系列稀释(1 2-1 512)。将25 μ 1各个IgG稀释液与25 μ 1病毒悬浮液(100TCID50/25y 1)混合，在37°C保温1小时。然后将悬浮液移至96孔平板的一式四份孔中，所述孔中含有在50 μ 1完全MEM培养基中的铺满MDCK培养物。在使用之前，将MDCK细胞以3χ104个细胞/孔种植在MDCK细胞培养物中，生长直至细胞达到铺满，用 300-350 μ 1 PBS，ρΗ 7. 4洗涤，最后在每个孔中加入50 μ 1完全MEM培养基。将接种的细胞在37°C培养3-4天，每天观察致细胞病变作用(CPE)的发生。将CPE与阳性对照对比。从一组H3N2中和抗体中，CR8020和CR8041示出对所有检测的甲型流感病毒亚型 H3、H7和HlO病毒的异源亚型交叉中和活性，但是对Hl病毒没有。此外，CR8043示出对所有检测的H3和HlO病毒毒株的交叉中和作用。CR8039、CR8041、CR8043和CR8057示出对所有检测的H3病毒毒株的交叉中和作用。另外的13种抗体示出对1种以上检测的H3病毒毒株的交叉中和作用。见表13。实施例9 抗-H3N2抗体结合HA的融合前构象为了确定选择的IgG是否能结合HA分子的融合前或者融合后构象，进行体外ρΗ转移实验。为此，使全长重组甲型流感病毒亚型H3 (A/ffisonsin/67/2005) HA在PER. C6细胞表面上表达。为了测定在不同结构HA构象的特异性反应性，将3X IO5个细胞用在DMEM中的 10 μ g/ml胰蛋白酶-EDTA在室温处理30分钟，洗涤及在酸化PBS(pH 4.9)中保温5分钟，洗涤，然后在存在20mM DTT条件下在室温保温20分钟。使细胞在每个步骤均分裂，未处理的粘附细胞重悬于0.05% EDTA中。将每次处理的细胞级分与抗-H3N2 IgG CR8001、CR8020、 CR8041、CR8043和CR8057保温30分钟。然后将细胞与藻红蛋白缀合的抗-IgG(Southern Biotech)保温 30 分钟。使用 FACS Calibur 用 CELLQuest Pro 软件(Becton Dickinson) 分析染色的细胞。在用胰蛋白酶(条纹条)、pH 4. 9缓冲的介质(实心白条)以及DTT (交叉条)相继处理后测量IgGl与表面表达的H3rHA的FACS结合并以与未处理的rHA(实心黑条)的结合百分比表示。见图2。抗体CR8001、CR8020、CR8041和CR8043均示出在pH转移后结合显著降低，表明对于表位的特异性仅存在于低PH诱导的HA分子构象改变之前。抗体CR8057示出仅在DTT 处理后结合降低，表明仅当存在HAl时才能获得对于构象非依赖性表位的特异性。实施例10 抗-H3N2抗体CR8041阻止HAO裂解为确定选择的IgG是否能保护HA分子免于蛋白酶裂解，进行体外蛋白酶易感性测定。为此，对7. 5yg重组可溶甲型流感病毒亚型H3 (A/ffisonsin/67/2005) HA(Protein Sciences,CT,USA)在 37°C进行 1 小时不同 ρΗ(4. 9、5· 3 和 8. 0)处理。在保温后，中和反应。将样品在存在和不存在7. 5 μ g CR8041或CR8057Fab片段的条件下用0. 5 μ g 胰蛋白酶消化过夜。通过加入SDS加样缓冲液猝灭反应。在每个样品中加入3μ1 Nupage 还原剂(Invitrogen)。将样品在Ix MOPS缓冲液中4-12% Bis1Tris凝胶上运行。蛋白质条带通过胶体蓝染色观测(见图3)。在不存在Fab条件下，Η3ΗΑ分子在pH 4. 9或5. 3易于被转变为其蛋白酶易感的融合后形式，但是在PH 8.0则否。在存在Fab片段CR8057条件下，Η3ΗΑ的降解及因此在ρΗ4. 9的构象变化不被抑制。相反，Fab CR8041的存在不仅防止在低PH条件下Η3ΗΑ的构象变化和降解，而且还防止HAO的pH非依赖性裂解为HAl和ΗΑ2。 这些结果表明CR8041的表位在裂解位点上或者在其附近。用抗-Η3Ν2抗体进行的竞争实验(结果未示出)表明CR8001、CR8020和CR8043抗体的重叠表位和相似工作机制。实施例11 本发明结合分子的作用机制HA糖蛋白是三聚体，其中每个单体由两个二硫键连接的糖多肽(称作HAl和ΗΑ2) 组成，其是在感染期间由于前体(HAO)的蛋白酶解而产生的。裂解是病毒感染性必需的，因为其需要引发HA的膜融合，使得构象改变。引发的分子的活化在内体中在ρΗ5_ρΗ6之间的低pH条件下发生，且需要HA结构的广泛改变。融合前未裂解的(I)、融合前裂解的(II)以及融合后HA(III)构象的三维结构在图4中示出。在体外，HA分子的构象改变可以使用HA表面表达哺乳动物细胞模拟。首先，可以通过向细胞中加入胰蛋白酶而触发蛋白酶解。其次，融合前至融合后的构象改变可以通过降低PH实现。此外，所述分子的HAl部分可以通过加入还原剂如DTT而除去。以此方式及通过在特定阶段加入抗体，可以检验所述抗体在哪个阶段干扰感染进程。为此，将PER. C6 细胞用携带来自A/Wisonsin/67/2005的HA的H3HA表达构建体转染并进行如实施例10所述的不同处理。对于这个实验，首先将细胞与抗_H3mAb在胰蛋白酶裂解之前保温，随后如上述进行处理(见图5)。抗-H3mAb的结合通过使用PE缀合的抗人抗体根据标准方案进行检测。荧光信号通过FACS分析测量。“仅细胞”是指在mAb与未处理的细胞结合后获得的信号，设定为 100%。从图5可以看出，在不同处理后所述mAb仍结合HA。因为在实施例10中表明H3mAb CR8020、CR8041和CR8043仅结合融合前状态(即在由于降低pH而导致构象改变之前)，由此推断抗体的结合实际上至少在体外抑制胰蛋白酶裂解(也见实施例10)，且因此也抑制随后的导致构象改变和融合的步骤。结合在受体附着位点附近的HA分子的HAl部分的抗体CR8057在构象改变之后能结合HA，以及正如所期望的HAl部分在当通过DTT处理使得 HAl与HA2结构域之间的二硫键破坏之后被除去时丧失。胰蛋白酶裂解的抑制随后在不同的体外实验中证实。首先，进行时程实验以确定应将H3HA与胰蛋白酶保温多长时间以实现HAO适当地裂解为HAl和HA2。为此，将重组可溶 H3HA(A/Wisconsin/67/2005 ；Protein Sciences, CT, USA)在含有 6· 7 μ g/ml 胰蛋白酶和1 % N-dodecyl-β -demaltosid的4mM Tris. HCl缓冲液pH8. 0中保温。在不同时间点通过加入BSA终止胰蛋白酶消化。根据标准方法使样品在SDS-page凝胶(还原的) 上运行和印迹。HAO、HAl和HA2条带使用兔抗-H3HA多克隆抗体(Protein Sciences, CT, USA)检测。图6示出2小时保温足以几乎完全裂解，通过还原凝胶上HAl和HA2条带的显现而证实。接下来，将重组可溶H3HA与CR8020、CR8041、CR8043或CR8057任一保温，随后在pH8. 0进行胰蛋白酶裂解。胰蛋白酶消化再次在不同时间点通过加入BSA终止。将样品在SDS-page凝胶(还原的)上运行及印迹。HA0、HA1和HA2条带使用抗-H3多克隆抗体进行检测。结果示出所有这三种mAb CR8020、CR8041和CR8043均阻止体外胰蛋白酶裂解，因为与抗体结合的H3HA与胰蛋白酶保温导致凝胶上HA的HAO形式被保护(图7)。相反，H3HA与对照mAb (CR8057)在相同条件下保温导致HAO条带消失。这个实验证实在实施例10中针对CR8041揭示的数据，并将这个观测结果扩展至CR8020和CR8043抗体。本发明的结合分子因此至少在体外防止HAO分子的胰蛋白酶裂解。然而，应注意这不排除另外的抑制作用也由CR8020、CR8041和CR8043mAb介导，其在感染过程的更下游且导致干扰pH 诱导的构象改变和/或融合过程。为研究是否可能存在这种情况，重复上述实验，但是仅在胰蛋白酶裂解之后，将抗体CR8043或作为对照的抗体CR8057加入表达H3HA的细胞中。在保温之后，随后将细胞如实施例10所述在低PH条件下保温及用DTT处理。如果作用机制限于胰蛋白酶裂解抑制， 期望所述mAb CR8043在pH处理后丧失结合，因为我们在实施例10中已经确定所述抗体不结合HA的融合后构象。相反，从图8中可以看出，mAb CR8043结合在暴露于低pH及随后 DTT处理后仍被检测到，表明pH诱导的构象改变至少在体外也由CR8043抑制。已经示出结合HA的HAl区的CR8057正如期望地起作用，而且当HAl部分在DTT处理后丧失时不再可检测到。为了检验抗体CR8020和CR8041是否也能阻断HA的pH诱导的构象改变，重复上述实验。现在在上述所有处理之后、在低PH保温之前或者在胰蛋白酶裂解之前，将抗体CR8020、CR8041 和 CR8043 或者作为对照的抗体 CR8057 加入表达 A/Hong Kong/1/1968、A/ Hong Kong/24/1985 或者 A/Wisconsin/67/2005 亚型 H3HA 的细胞中。如先前对于A/Wisconsin/67/2005 H3HA 所示，CR8020、CR8041 和 CR8043 抗体识别仅在低PH处理之前存在的表位。这个表位在用于这个实验中的三个HA中是保守的，从图9c中可以看出。如果作用机制限于胰蛋白酶裂解的抑制，预期mAb CR8020、CR8041和 CR8043在pH处理后丧失与已经裂解的HA的结合，因为我们在实施例10中已经确定所述抗体不结合HA的融合后构象。相反，从图9b可以看出三种不同的H3HA在暴露于低pH及随后的DTT处理之后仍可检测到mAb结合，表明pH诱导的构象改变至少在体外也被CR8020、 CR8041和CR8043抑制。已经示出结合HA的高可变HAl区的CR8057示出不结合A/Hong kong/1/1968 和 A/Hong Kong/24/1985HA。实施例12 体外产生的逃逸突变体表明所述表位的位置与H3HA中保守序列一致为了研究CR8020、CR8041和CR8043结合HA中的哪个区域，尝试在体外培养物中产生逃逸突变体。将A/Hong Kong/1/1968病毒在存在限制量的单克隆抗体的条件下在 MDCK细胞培养物中传代。首先，在用100TCID50单位的混合不同量单克隆抗体的MDCK细胞接种及保温3天之后，确定导致病毒感染降低31og的抗体浓度。将这个浓度的抗体加入系列传代的接种物中，在每次传代后，在不存在和存在不同量抗体的条件下对病毒进行噬斑滴定以确定该病毒是否仍对抗体介导的中和作用敏感。对每一个mAb CR8020、CR8041和 CR8043进行这个程序。从每个培养物中可以通过噬斑测定分离逃逸病毒，从每个病毒的两个分离株中提取病毒RNA并用于确定HA序列。观测到的突变的氨基酸如下CR8020 :D19N和Q27L，在分析的两个噬斑中；CR8041 :G33E，在两个噬斑中；CR8043 :R25M，在一个噬斑中；Q!34R，在另一噬斑中。所有三个单克隆抗体均示出在与融合肽相邻的HA干区的HA2部分中相似结构域中的逃逸突变。存在于NCBI流感病毒数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/ FLU/Database/select. cgi)中H3N2病毒的这个区域的氨基酸序列对比显示出该序列的一个明显保守。表14示出HA2区中W14与K39氨基酸之间的序列变异，标明了观测到的逃逸突变。N=具有特定序列的毒株数目。此外，也示出了分离年份以及在用H3抗体的中和试验中检测阳性的毒株(Pa = A/Panama/2000/1999 ；Wis = A/Wisconsin/67/2005 ；Hs = A/Hiroshima/52/2005 ；HK = A/HongKong/1/1968)。在含有所述 HA2 序列的数据库中存在的1363个H3病毒中，大部分(81% )具有示出被中和的病毒毒株中存在的序列。在剩下的序列中，大多数具有可以认为是保守改变的氨基酸。对于其它突变，需要功能性中和试验以确定所述改变是否影响抗体的功能性。重要的是在逃逸病毒实验发生的三个氨基酸改变 (R25、G33和Q34)在天然流感病毒序列中不出现，另两个突变仅组合出现(D19和Q27)，这是在天然序列中也不存在的一个组合。这可能意味着所述突变对于病毒适合度具有负面影响。总之，推断所述抗体与HA2上在H3亚型病毒之间高度保守的表位相互作用，证实所述单克隆抗体的广泛中和能力。实施例13 进行体内实验的单克隆抗体的制备为了能鉴定及随后确认IgG作为潜在的体内治疗抗体，需要以足够数量生产及纯化其。使IgG在PER.C6 细胞中在25L Wave-bag中产生并收获培养物。从澄清的收获物中，使用A蛋白亲和性层析及缓冲液交换步骤纯化IgG。纯化的缓冲液交换的IgG的单体含量在0. 2 μ m灭菌过滤之前和之后均是 99%。此外，用如上述获得的不同抗体制备物进行体外病毒中和测定(VNA)。结果在表15中示出。实施例14 人IgG单克隆抗体对于体内致死性H3N2攻击的预防活性在雌性U9Xl/SvJ 小鼠(Jackson Labs)中用流感病毒 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)病毒的小鼠致死性攻击模型检测mAb CR8020、CR8041和CR8043的预防效力(MA =小鼠适应白勺)。Α/ Κ/1/68_ΜΑ20^|_ | 自 E. G. Brown ^gjUniversity of Ottawa, Ottawa, Ontario, Canada ；Brown, Ε. G. et al. (2001)。将该病毒在含胚鸡蛋中传代一次，之后用于所述小鼠实验。使所有小鼠适应环境并维持至少4天，之后再开始实验。在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)中通过静脉内注射给予30、10、3和 lmg/kg的mAb，假定小鼠平均体重为18g/小鼠，给予固定剂量体积为0. 2mL。然后对小鼠 (n = 8只/组)在第0天通过鼻内接种用25LD50A/HK/l/68-MA20(H3N2)病毒攻击。施用的病毒的实际剂量通过滴定在完成动物接种后剩余的接种物的少量复制样品估计。所述接种物的病毒效价(TCID50/mL)在MDCK细胞上确定。结果示出在所述接种物的制备或者施用期间没有无意病毒失活发生。从攻击前一天开始每天确定临床迹象和体重直至在第21 天结束研究。用评分系统对临床迹象打分(0 =无临床征象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙， 反应性较低，在操作期间被动状态；3 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，在操作期间被动状态；4 =皮毛粗糙，蜷缩，呼吸困难，当背部向下躺时不滚回至腹部向下)。对得分为4的动物行安乐死。为了分析在第0天的mAb血浆水平及在第21天确定血凝抑制(HI)抗体的存在，在 D0、攻击之前以及在感染后D21从所有小鼠中抽取血样。在2个单独实验中检测mAb。在每个实验中，阴性对照抗体(CR3014)组给予30mg/ kg。在第一个实验中检测mAb CR8020，在第二个实验中检测mAb CR8041和CR8043。在适应环境期间，所有小鼠均是活性的且表现为无疾病迹象的健康状态。图10示出在施用mAb之后小鼠的存活率。观测到明显的剂量应答关系，给予30、10或者;3mg/kg的 CR8020、CR8041或者CR8043的所有组示出100%存活率，而在lmg/kg CR8020组中25%的小鼠存活，lmg/kg CR8041和CR8043组中无小鼠存活。两个对照mAb组示出0%存活率。在第一个实验中，与对照组相比(P < 0. 005 ；Log Rank Test)，施用mAb CR8020在检测的所有四个浓度均导致存活时间存在统计学显著差异。在第二个实验中，与对照组相比(对于两个mAb均ρ < 0. 001 ；Log Rank iTest)，施用mAb CR8041和CR8043在检测的所有四个浓度均导致存活时间存在统计学显著差异。在图11中，示出在施用mAb之后的21天研究期间小鼠的平均体重改变。与存活率一样，在体重下降与使用的抗体剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时，体重降低下降给予30、10或者:3mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043组中的小鼠示出从第0_21 天平均体重增加大约10-15%，与年龄相关的体重增加一致，而在lmg/kg组及对照mAb组中小鼠的平均体重在研究期间降低。使用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重改变。对于这个分析，如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死，则最后观测的体重结转至第21天。简而言之，第0天的体重/小鼠作为基线值，确定相对于基线的从0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。使用多重比较Durmet’ s调整方差分析，将给予mAb组的平均AUC值与各自的对照组进行对比(表16)。分析示出3、10和30mg/kg的CR8020、CR8041和CR8043组的平均AUC与相应对照组相比存在统计学显著差异(P < 0. 001)(表16)。对于lmg/kg CR8041-和CR8043组， 当与对照组相比时发现统计学显著差异(分别为ρ = 0. 004及ρ < 0. 001)。然而，由于在 CR8020 lmg/kg剂量组中两只小鼠存活，观测到体重变化增加及因此当与对照组相比时无统计学显著差异可被证实。使用多重比较Tukey’ s调整方差分析，通过对比每个抗体的每个抗体浓度的平均AUC值进行另外的分析以研究体重降低下降的剂量应答(表16)。对于mAb CR8020和 CR8041, lmg/kg组的体重下降统计学上明显高于各自的:3mg/kg组(ρ < 0. 001)，而3、10和 30mg/kg组之间无统计学显著差异(ρ > 0. 05)。对于mAb CR8043, lmg/kg组的体重下降统计学上显著高于:3mg/kg组的(ρ <0.001) ；:3mg/kg组的体重下降明显高于10mg/kg组的(ρ < 0. 001)。CR8043 的 10 和 30mg/kg 组的平均 AUC 无明显差异(p = 0. 997)。小鼠的中位数临床得分在图12中示出。给予30和10mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043的小鼠未示出任何临床迹象，通过在2项研究的第0-21天研究期间的中位数临床得分表明。mAb 8020在;3mg/kg剂量组中也示出无临床得分，而在mAb 8041和8043的 3mg/kg剂量组中观测到临床得分的中位数得分分别为1分和3分。在所有三种mAb的Img/ kg剂量组中，临床得分增加达到在所有组中的中位数得分为4分。在同一天对临床得分为4 分的小鼠行安乐死。在CR8020 lmg/kg剂量组中2只存活的小鼠在研究的第7天发病并示出分别为1分和3分的最大临床得分。这两只小鼠均完全康复。在CR8041和CR8043 3mg/ kg剂量组中，体重降低谱示出与临床得分谱相似的模式。这些结果示出本文鉴别和揭示的至少三种人抗-H3N2抗体(CR8020、CR8041和 CR8043)均能单独提供针对致死剂量流感病毒H3N2的体内保护作用。观测到在施用的每种抗体的量与存活率之间的明确剂量应答关系。结果示出当在感染前一天以10mg/kg或更高的剂量施用时，抗-H3N2 IgG抗体CR8041和8043能预防小鼠中H3N2感染的临床表现。当在感染前一天以3mg/kg或更高剂量施用时，mAb CR8020能预防小鼠中H3N2感染的临床表现。实施例15 人IgG单克隆抗体对体内致死性1 H3N2攻击的保护和治疗活性进行研究以检测本文揭示的单克隆抗体如CR8020在感染后模型中对于致死性 H3N2 A/HK/1/68-MA20流感病毒体内攻击的治疗作用。在攻击前一天(第1组；预防阳性对照)或者在攻击后第1、2、3、4、5或者第6天 (2-7组)在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予小鼠(n = 10只/组)15mg/kg的mAb CR8020，假定小鼠平均体重为18g/小鼠，给予固定剂量体积0.2mL。第8组在攻击后第1 天接受阴性对照mAb CR3014(15mg/kg)。将小鼠在第0天用25LD5(K2. 81og TCID50)A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)病毒通过鼻内接种进行攻击。病毒批次和类型以及鼠龄与实施例14 所用相同。从攻击前一天开始直至在第21天研究结束，每日确定临床迹象和体重。图13A示出在静脉内施用mAb CR8020 (15mg/kg,所有组)或者对照mAb (15mg/kg) 之后小鼠的存活率。当在攻击前1天或者攻击后1或2天施用15mg/kg mAb CR8020时，所有动物在病毒攻击下均存活，而在对照mAb组中存活率为0 %。当在攻击后3或4天施用 15mg/kg mAb CR8020时，观测到分别为50%和10%的存活率。这些组的每一组存活时间与对照组相比存在统计学显著差异(第3天组p < 0. 001，第4天组p = 0. 002 ；Log Rank Test)。用15mg/kg CR8020处理的组在第5或6天示出存活率为0%。在第5或6天处理组与对照组相比存活时间无统计学显著差异(分别为P = O. 648和ρ = 0. 342 ；Log Rank Test).在图13B中，示出在21天研究期间相对于第0天的小鼠平均体重改变。与存活率一样，体重降低与施用15mg/kg mAb CR8020的时间存在明确关系当在较晚的时间点施用 15mg/kg mAb CR8020处理时，体重降低增加。使用曲线下面积(AUC)分析，对体重改变进行更详细的统计学分析(表17)。对于曲线下面积分析，如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死，则最后观测的体重结转至第 21天。简而言之，在第0天的体重/小鼠作为基线值，确定相对于基线的从第0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。小鼠的中位数临床得分示于图13C。在攻击前一天用15mg/kg CR8020处理的小鼠在观测期间全部存活，无一示出任何临床迹象。在攻击后第1天用15mg/kg CR8020处理的小鼠示出100%存活，然而10只小鼠中的4只示出临床迹象，达到在1-3之间的最大临床得分。在攻击后第2天用15mg/kg CR8020处理的动物全部存活。然而，10只小鼠中有9只示出临床迹象，达到2或3分的最大临床得分。在攻击后第3天用15mg/kg CR8020处理的动物示出50%存活率。在存活的小鼠中(n = 5)，所有小鼠均示出临床迹象，最大临床得分3 分。在攻击后第4天用15mg/kg CR8020处理的动物除了一只之外全部死亡。存活的小鼠示出临床迹象，达到最大临床得分2分。经处理存活的所有小鼠在21天均无症状。使用GENMOD程序(SAS)分析临床得分以对于用小鼠作为对象的重复测量和在分类量表上测量的数据拟合模型(表18)。由于该曲线具有不同模式，因此在这个模型中输入可变的“天数”作为类别变量(class variable) 0在其中100%动物存活的、攻击前1天和攻击后第1和2天用15mg/kg mAb CR8020处理组中，在最多21天的研究期间其中位数临床得分与对照mAb组明显不同(三组均ρ彡0. 001)。在攻击后第3或4天用15mg/kg mAb CR8020处理组中(其中分别具有50%和10%的小鼠存活)，其在最多21天研究期间的中位数临床得分与对照mAb组也显著不同(两组均ρ < 0. 05)。在攻击后第5或6天用 15mg/kg mAb CR8020处理组中，中位数临床得分与对照mAb组仅在第3天具有显著不同 (p ( 0. 001)。这种差异尽管具有统计学显著性，但不认为是相关的。综上所述，在致死性H3N2小鼠模型中，在直至攻击后第2天用15mg/kg的mAb CR8020治疗提供100%保护作用。当在攻击后第3天或第4天施用15mg/kg mAb CR8020 治疗时提供部分保护作用。当在攻击后第5或第6天施用时，在致死性H3N2小鼠模型中观测到15mg/kg mAb CR8020无保护作用。这些结果示出在感染后用本文揭示的针对H3N2流感病毒的单克隆抗体如抗体 CR8020进行治疗，在致死剂量H3N2流感病毒攻击后可以挽救哺乳动物对象如本文小鼠所示。即使在晚期，即在感染后第4天，所述抗体也能部分保护小鼠免于流感病毒H3N2致死感染。引人注目地，在感染后第21天，所有存活的经抗体治疗的动物均达到正常体重水平且不示出任何残余临床迹象。实施例16 人IgG单克隆抗体针对体内致死性H7N7攻击的预防活性进行研究以检测本文所述单克隆抗体如CR8020针对体内流感病毒H7N7的致死性攻击的预防作用。在小鼠致死攻击模型中检测mAb CR8020的预防效力，使用小鼠适 1 ^^^! A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7) __ (Central Veterinary Institute(CVI)，Lelystad, The Netherlands)。使 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)病毒在肺-肺传代3次之后以适应小鼠。在CVI实验室中将小鼠适应的H7N7 3代病毒在含胚鸡卵中增殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周龄，n = 8只/组)适应环境并维持至少4天，之后再开始实验。在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予30、10、3或者lmg/ kg的mAb CR8020，假定小鼠平均体重为18g/小鼠，给予固定剂量体积0.2mL。对照组给予 30mg/kg 阴性对照 mAb CR3014。然后将小鼠在第 0 天用 25LD5(1A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 病毒通过鼻内接种进行攻击。施用的病毒的实际剂量通过滴定在完成动物接种后剩余的接种物的少量复制样品估计。接种物的病毒效价(TCID5ciAiL)在MDCK细胞上确定。从攻击前一天开始直至在第21天结束，以如实施例14所述相同方式每日确定临床迹象和体重。为了分析在第0天的mAb血浆水平以及确定在第21天血凝抑制(HI)抗体的存在，在DO、就在攻击之前以及在感染后D21从所有小鼠中抽取血样。所有小鼠在适应环境期间均是活性且表现为无疾病迹象的健康状态。图14A示出在施用HiAb之后小鼠的存活率。给予lmg/kg或更多的mAb CR8020的小鼠示出存活率为 100%，而在对照mAb组中存活率为0%。图14B示出了在施用mAb之后的21天研究期间小鼠的平均体重变化。在mAb CR8020的3、10和30mg/kg组中，小鼠在21天研究期间未示出体重降低，而在mAb CR8020 lmg/kg以及对照mAb组中观测到体重降低，在mAb CR8020 lmg/kg组中小鼠平均体重在第21天恢复至基线水平。使用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重变化(表19)。对于曲线下面积分析，如果小鼠在研究继续期间死亡/行安乐死，则最后观测的体重结转至第21天。简而言之，在第0天的体重/小鼠作为基线值，确定相对于基线的从第0-21天的体重改变。AUC被定义为基线上面积和基线下面积的总和。在体重降低与抗体使用剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时，体重降低下降。与对照HiAb组相比，mAb CR8020的1、3、10和30mg/kg组中体重降低的平均差异分别是47. 44,79. 75,86. 71和80. 48g*天。所有差异均是统计学显著的(ρ < 0. 001)。小鼠的中位数临床得分在图14C中示出。除了一或两只外，每个组内的所有动物在攻击后第1天均示出临床迹象(得分=1)。这可能与病毒攻击不相关，因为该研究中的未攻击组在第1天也示出相似作用(数据未示出)。在攻击前1天用3、10或者30mg/kg mAb CR8020处理的小鼠中，在观测期间所有小鼠均存活且无一动物示出任何临床迹象(从感染后第2天至第21天)。在攻击前1天用 lmg/kg mAb CR8020处理的小鼠示出100%存活率，但是8只小鼠中的8只示出临床迹象， 达到最大临床得分3分。这些结果示出本文鉴别和揭示的人抗-H3N2抗体CR8020 (CR8020)能提供针对体内致死剂量流感病毒H7N7的异源亚型保护作用。当在感染前一天以:3mg/kg或更高剂量施用时，mAb CR8020在小鼠中能完全预防H7N7感染的临床表现。在感染前一天以lmg/kg CR8020剂量施用时，所有小鼠在致死攻击下均存活，在21天研究期间结束时观测到体重降低和临床迹象完全消失。进行另外研究以评估和对比mAb CR8020、CR8041和CR8043在H7N7小鼠模型中的预防效力。在小鼠致死性攻击模型中，检测mAb CR8020、CR8041和CR8043 (在PER. C6 细胞中产生)的预防效力，使用小鼠适应的流感病毒A/Chicken/ Netherlands/621557/2003 (H7N7) ^ (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands。简而言之，使所有小鼠(Balb/c，雌性，6_8周龄，η = 8只/组)适应环境并维持至少4天，之后开始实验。在攻击前一天在尾静脉(vena coccygeus)静脉内给予 10、3或lmg/kg的mAbCR8020，假定小鼠平均体重为18g/小鼠，固定剂量体积0. 2mL。以相同方式给予30、10、3或者lmg/kg的mAb CR8041和CR8043。对照组给予30mg/kg阴性对照 mAb CR3014。在施用 mAb 后，在第 0 天用 25LD5(1 小鼠适应的 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)通过鼻内接种攻击小鼠。从攻击前一天直至第21天研究结束，每日确定临床迹象和体重。图15示出了在预防性施用所述mAb之后小鼠的存活率、体重改变百分比以及临床得分。如图15A示出，在接受3或10mg/kg CR8020U0或30mg/kg CR8041以及接受30mg/ kg CR8043的组中观测到100%存活率。在对照mAb组中，存活率为0%。预防性施用所有这三个剂量水平的CR8020以及所有4个剂量水平的CR8041与对照mAb组相比均提供了统计学显著的存活时间改善(log-rank，ρ < 0. 002)。预防性施用lmg/kg的CR8043与对照 mAb组相比未导致存活时间统计学显著改善(log-rank，ρ = 0. 692)。将CR8043剂量增加至:3mg/kg或更多导致与对照mAb组相比存活时间统计学显著改善(log-rank，ρ ^ 0. 034)。在事后分析中，对比mAb CR8020、CR8041和CR8043最低剂量组的存活时间。预防性施用lmg/kg CR8020导致与施用lmg/kg的CR8041和lmg/kg的CR8043相比其存活时间统计学显著改善(log-rank,分别为ρ = 0. 029和ρ < 0. 001)。此外，预防性施用Img/ kg CR8041导致当与施用lmg/kg CR8043相比时存活时间统计学显著改善(log-rank，p = 0. 004)。图15B示出在预防性施用所述mAb之后，在21天研究期间小鼠的平均体重改变。 在mAb CR8020和mAb CR8041的lmg/kg组中，观测到与对照mAb组相当的体重降低。在较高剂量mAb CR8020和CR8041组中，在21天研究期间体重降低有限或者不降低。在给予mAb CR8043的组中，在所有组都观测到严重的体重降低，给予30mg/kg组的平均体重在第21天几乎恢复到基线水平。用曲线下面积(AUC)分析更详细地分析体重变化(表21)。在体重降低与抗体使用剂量之间存在明确的反比关系。当抗体浓度增加时，体重降低下降。使用 lmg/kg的CR8020与对照组相比体重降低无统计学显著下降(p = 0. 356)。剂量增加至3 或10mg/kg导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(在两种情况中均ρ < 0. 001)。使用lmg/kg的CR8041，与对照组相比体重降低无统计学显著下降(p = 1)。剂量增加至3、10或者30mg/kg CR8041导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(在三种情况中均P < 0. 001)。使用1、3或者10mg/kg的CR8043与对照组相比体重降低无统计学显著下降(分别为P = 0. 997,0. 510和0. 992)。剂量增加至30mg/kg导致与对照组相比体重降低统计学显著下降(P < 0. 001)。在另外的体重变化数据平均AUC分析中，使用单变量方差分析对比mAb CR8020、CR8041和CR8043，模型中包含抗体和剂量作为固定因子。由于该研究中不包含30mg/kg的CR8020剂量，因此对比限于1、3和10mg/kg抗体剂量。通过使用多重比较Sidak调整边际均数估计抗体之间的差异。在这三个抗体剂量中，用CR8020处理与CR8041和CR8043相比导致体重降低统计学显著下降(边际均数中平均差异分别为23. 73和68. 29g*day，p = 0. 013和ρ < 0. 001)。此外，用CR8041处理导致与CR8043相比体重降低统计学显著下降(边际均数中差异为44. 56g*day，ρ < 0. 001)。
小鼠的中位数临床得分在图15C中示出。除了在第0天有一只C3mg/kgCR8020组) 之外，所有小鼠在第0-3天均示出临床迹象(得分=1，皮毛粗糙))。这个增加在适应环境期间和攻击前一天未观测到。导致这个临床得分增加的原因还未十分明确。在攻击前一天用3或10mg/kg mAb CR8020处理组中，中位数临床得分在攻击后第9天恢复至0分；而在对照组中，中位数临床得分在第8天为4分，所有小鼠在第9天均死亡或行安乐死。lmg/kg CR8020处理组示出在第4-13天中位数临床得分为3分，在第15天恢复至0分。在攻击前一天用3、10或30mg/kg mAb CR8041处理组中，中位数临床得分分别在攻击后第9、10或 12天恢复至0分。lmg/kg CR8041组在攻击后第10天中位数临床得分达到4分。在用1、 3或10mg/kg CR8043处理组中，中位数临床得分分别在第9、9或12天达到4分；而30mg/ kg CR8043组的中位数临床得分在第6-13天达到3分及在第14天恢复至0分。上述结果清晰示出人抗-H3N2抗体CR8020、CR8041和CR8043能提供针对体内致死剂量流感病毒H7N7攻击的异源亚型保护作用。基于存活时间和体重改变事后分析结果，发现mAb CR8020在这三种mAb中最强力对抗小鼠适应的流感病毒A/CH/ NL/621557/03(H7N7)。在感染前一天施用3或10mg/kg剂量的mAb CR8020，100 %的小鼠在致死攻击下均存活且H7N7感染的临床表现明显降低。在感染前一天施用lmg/kg剂量的 CR8020，75%的小鼠在这个实验中在致死攻击下存活且存活小鼠的临床迹象在21天研究期间的第15天完全消失。实施例17 人IgG单克隆抗体针对体内致死性H7N7攻击的治疗活性进行这项研究以在H7N7模型中评估mAb CR8020的治疗效力和窗口。在小鼠致死攻击模型中检测mAb CR8020(在PER.C6 细胞中产生)的治疗效力，使用小鼠适应的胃 _ _ A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7) ^f _ (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands)。简而言之，使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8 周龄，η = 8只/组)适应环境并维持至少4天，之后开始实验。在攻击前一天(第1组，预防性阳性对照)或者在攻击后第1、2、3、4、5或6天(第2-7组)在尾静脉(vena coccygeus) 静脉内给予15mg/kg的mAb CR8020，假定平均体重为18g/小鼠，固定剂量体积0. 2mL。第8 组在攻击后第1天接受对照mAb CR3014(15mg/kg)。在第0天用25LD5(1小鼠适应的A/CH/ NL/621557/03(H7N7)通过鼻内接种攻击小鼠。从攻击前一天直至第21天研究结束，每日确定临床迹象和体重。图16A示出在静脉内施用mAb CR8020 (所有组15mg/kg)或者对照mAb (15mg/kg) 之后小鼠的存活率。当在攻击前一天或者在攻击后第1或3天施用15mg/kg mAb CR8020 时，所有动物在病毒攻击下均存活，而在对照mAb组中小鼠存活率为0%。当在第2天和第 4天施用15mg/kg mAb CR8020时，观测到分别为87. 5%和50%的存活率。这些组的存活时间与对照mAb组相比具有统计学显著差异(分别为p = 0. 002和ρ = 0. 014)。在第5天和第6天15mg/kg CR8020处理组的存活率为0%，这些组中存活时间与对照mAb组相比无统计学显著差异(分别为P = 0. 837和ρ = 0. 876)。图16B示出在21天研究期间相对于第0天小鼠平均体重变化。通常，当在攻击后较晚时间点施用mAb CR8020时，小鼠平均体重降低增加。然而，在第2天和第3天mAb CR8020处理组的平均体重曲线与第10天交叉，由于在第2天处理组中无存活小鼠所致。体重变化的曲线下面积分析示出在第-1天至第3天之间处理与在第4-6天处理相比平均体重降低的显著转变(表22)。用15mg/kg的CR8020在攻击前1天或者在攻击后第1、2或3 天处理导致与对照组相比体重降低的统计学显著下降(四组均ρ <0.001)。在第4、5或6 天用15mg/kg的CR8020处理与对照组相比不导致体重降低的统计学显著下降(分别为ρ =0. 566、ρ = 0. 979 和 ρ = 0. 858)。小鼠的中位数临床得分在图16C中示出。在攻击前一天用15mg/kg CR8020处理的动物中，所有动物在观测期间均存活且无一动物示出任何临床迹象。在攻击后第1天处理的动物示出100%存活率，然而8只动物中有7只示出临床迹象，最大临床得分1分。第 8只动物最大临床得分达到3分。在攻击后第2天处理的动物中，除了一只之外所有动物均存活。存活的动物(8只中的7只)示出临床迹象，最大临床得分1分(n = 4)或者3分(η =3)。在攻击后第3天处理的动物示出100%存活，所有动物示出临床迹象，最大临床得分 3分。在攻击后第4天处理的动物中，50%的动物在致死攻击下存活。存活动物示出临床迹象，最大临床得分达到3分。在攻击后第5或6天处理的动物未存活。使用GENMOD程序 (SAS)分析临床得分以对于以小鼠作为对象的重复测量和在分类量表上测量的数据拟合模型(表23)。在攻击前1天和攻击后第1、2、3或4天用15mg/kg mAb CR8020处理组中，在大部分21天研究期间其中位数临床得分与对照mAb组存在统计学显著差异(第8-21天， 四组均p< 0.038)。在攻击后第5天用15mg/kg mAb CR8020处理组中，仅在第8天其中位数临床得分与对照mAb组显著不同(p ( 0. 001)。这种差异尽管具有统计学显著性，但不认为是相关的。在第6天15mg/kg mAb CR8020处理组的中位数临床得分与对照组无统计学显著差异。这项研究明确表明在致死性H7N7小鼠模型中，用15mg/kg的mAb CR8020治疗当在直至攻击后第3天施用时也提供87. 5-100%的保护作用。当在攻击后第4天施用时，用 15mg/kg mAb CR8020治疗提供部分保护作用。当在攻击后第5或6天施用时，观测到15mg/ kg mAb CR8020在致死性H7N7小鼠模型中无保护作用。换句话说，当在死亡之前4天或者更多天施用时，CR8020在这个致死性小鼠模型中提供保护作用。实施例18 有效中和来自系统发生类群1和2的多种流感病毒亚型的单克隆抗体的混合物每年的季节性流感疫苗由诱导针对甲型流感病毒毒株免疫性的两种不同的制备物组成，一个代表循环Hl亚型，一个代表循环H3毒株。其根本原因在于Hl和H3亚型的流感病毒毒株太不相同，以至于从任一型中制备的疫苗均不诱导针对另一亚型的保护作用。 理想的是治疗流感的广泛保护性单克隆抗体制备物可有效抗来自两个系统发生类群1 (Hl) 和2(H3)的流感病毒毒株。然而，再次由于HA分子之间的序列差异，难以发现这种单一抗体。例如，WO 2009/115972中描述的？&1^8抗体结合并中和Hl亚型优于与H3亚型病毒，可能是由于类群1与类群2病毒之间的表位保守性与一个系统发生类群中的病毒相比较低。 为了实现一种产品可有效抗来自两个系统发生类群的多种流感病毒亚型的目标，因此可将两或多种不同抗体组合在一种混合物中。为了成功，这种制备物应由彼此不相干扰的抗体组成。有效中和HI、H5和H9亚型病毒的抗体已经在W02008/(^8946中描述，典型以 CR6261和CR6323为例。的结合区(表位)已经详细阐明，使用Hl或H5HA分子与 CR6261的共结晶阐明(也见PDB数据库条目3GBM和3GBM，http //www. pdb. org和Ekiertet al.，2009)。为了研究本发明的单克隆抗体是否可以与先前描述的CR6261抗体组合使用，检测所述抗体是否能结合系统发生类群1和2的亚型。至此，如实施例7所述进行 ELISA和FACS结合试验，使用Hl和H5亚型以及H3和H7亚型的HA分子及CR6^1、CR6323、 CR8001、CR8020、CR8041和CR8043进行。结果概括在表20中，示出广泛中和系统发生类群 1的病毒的抗体不结合系统发生类群2的病毒，反之亦然。由于所述抗体不彼此干扰，预期所述抗体针对各个亚型的中和潜力得以保持，使得可以有效中和类群1和2的亚型。因此，一方面包含CR6261和/或CR6323及另一方面包含CR8020、CR8041和/或 CR8043的混合物对于至少Hl和H3亚型的病毒具有活性。因此，使用一种制备物有效防护系统发生类群1和2的流感病毒亚型是可能的。实施例19 结合分子的结合动力学使用Octet RED系统和来自R)rteBi0的链霉抗生物素蛋白生物传感器测量CR8020和CR8043的木瓜蛋白酶裂解的Fab片段的亲和性。将H3亚型A/ Wisconsin/67/2005 (Protein Science)禾口 A/Brisbane/10/2007 (Protein Science)、流感病毒血凝素抗原生物素酰化以固定在链霉抗生物素蛋白生物传感器(ForteBio)上。使用浓度范围分别在2. 3-150nM和0. 16_30nM之间的CR8020和CR8043,在动力学缓冲液 (ForteBio, 18. 5032)中重复进行5次Fab结合实验。在Octet上的亲和性测量实验设置如下将所述生物素酰化的血凝素固定至链霉抗生物素蛋白生物传感器上1800秒，随后结合系列稀释的Fab CR8020和CR8043 1200秒，及随后在动力学缓冲液中解离1800秒。结合数据使用Octet分析软件使用1 1模型分析。H3亚型HA的结合分子的亲和性常数(Kd-值)在表M中示出。表1 第一轮 Vkappa，Vlambda 和 VH 扩增
权利要求
1.一种分离的人结合分子，其能特异性识别及结合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，具有针对包含H3亚型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性及至少具有针对包含H7亚型的HA的流感病毒和/或包含HlO亚型的HA的流感病毒的交叉中和活性。
2.权利要求1的分离的结合分子，其能特异性识别及结合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，具有针对包含H3亚型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性，特征在于所述结合分子具有至少针对选自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Panama/2007/99 和 A/Johannesburg/33/94的一或多种H3N2毒株的中和活性。
3.权利要求2的结合分子，其中所述结合分子进一步具有针对H3N2毒株A/Hong Kong/1/68的中和活性。
4.权利要求2或3的结合分子，其中所述结合分子具有针对在2010年1月20日之前已知的所有天然发生的流感病毒H3N2分离株的中和活性。
5.权利要求1-4任一项的结合分子，其中所述结合分子结合包含在H3HA蛋白的HA2多肽的第19、25、27、33和/或34位氨基酸的表位。
6.权利要求5的结合分子，其中当第19位的氨基酸是天冬氨酸(D)、第25位的氨基酸是谷氨酰胺(Q)、第27位的氨基酸是甘氨酸(G)、第33位的氨基酸是甘氨酸(G)和/或第 34位氨基酸是谷氨酰胺时，所述结合分子结合HA2上所述表位。
7.权利要求6的结合分子，其中当一或多个所述氨基酸改变时，所述结合分子不结合 HA2上所述表位。
8.权利要求1-7任一项的结合分子，其中所述结合分子能在体外阻止胰蛋白酶使H3HA 前体分子HAO裂解为HAl和HA2。
9.权利要求1-8任一项的结合分子，其中所述结合分子能阻止病毒膜与感染的细胞的内体膜融合所需的H3HA蛋白的构象改变。
10.权利要求1-9任一项的结合分子，其中所述结合分子不能结合及中和包含Hl亚型的HA的甲型流感病毒如Hmi。
11.权利要求1-10任一项的结合分子，其中所述结合分子具有针对至少一种包含H7亚型的HA的流感病毒和/或包含HlO亚型的HA的流感病毒的交叉中和活性。
12.权利要求1-11任一项的结合分子，其中所述结合分子具有针对系统发生类群2的所有流感病毒亚型的交叉中和活性。
13.权利要求1-12任一项的结合分子，其中所述结合分子选自下组a)包含SEQID NO 81所示重链CDRl区、SEQ ID NO 82所示重链CDR2区及SEQ ID NO 83所示重链⑶R3区的结合分子；b)包含SEQID NO 87所示重链CDRl区、SEQ ID NO 88所示重链CDR2区及SEQ ID NO 89所示重链⑶R3区的结合分子；c)包含SEQID NO 103所示重链CDRl区、SEQ ID NO :104所示重链CDR2区及SEQ ID NO 105所示重链⑶R3区的结合分子；d)包含SEQID NO 109所示重链CDRl区、SEQ ID NO :110所示重链CDR2区及SEQ ID NO 111所示重链⑶R3区的结合分子；e)包含SEQID NO :115所示重链CDRl区、SEQ ID NO :116所示重链CDR2区及SEQ ID NO 117所示重链⑶R3区的结合分子；f)包含SEQID NO 121所示重链CDRl区、SEQ ID NO :122所示重链CDR2区及SEQ ID NO 123所示重链⑶R3区的结合分子；g)包含SEQID NO 126所示重链CDRl区、SEQ ID NO :127所示重链CDR2区及SEQ ID NO 128所示重链⑶R3区的结合分子；h)包含SEQID NO 132所示重链CDRl区、SEQ ID NO :133所示重链CDR2区及SEQ ID NO 134所示重链⑶R3区的结合分子；i)包含SEQID NO 138所示重链CDRl区、SEQ ID NO :139所示重链CDR2区及SEQ ID NO 140所示重链⑶R3区的结合分子；j)包含SEQ ID NO 144所示重链CDRl区、SEQ ID NO :145所示重链CDR2区及SEQ ID NO 146所示重链⑶R3区的结合分子；k)包含SEQ ID NO 150所示重链CDRl区、SEQ ID NO :151所示重链CDR2区及SEQ ID NO 152所示重链⑶R3区的结合分子；1)包含SEQ ID NO 156所示重链CDRl区、SEQ ID NO :157所示重链CDR2区及SEQ ID NO 158所示重链⑶R3区的结合分子；m)包含SEQ ID NO :162所示重链CDRl区、SEQ ID NO :163所示重链CDR2区及SEQ ID NO 164所示重链⑶R3区的结合分子；η)包含SEQ ID NO :168所示重链CDRl区、SEQ ID NO :169所示重链CDR2区及SEQ ID NO 170所示重链⑶R3区的结合分子；ο)包含SEQ ID NO 173所示重链CDRl区、SEQ ID NO :174所示重链CDR2区及SEQ ID NO 175所示重链⑶R3区的结合分子；以及P)包含SEQ ID NO 179所示重链CDRl区、SEQ ID NO :180所示重链CDR2区及SEQ ID NO 181所示重链⑶R3区的结合分子。
14.权利要求1-13任一项的结合分子，其中所述结合分子选自下组a)包含SEQID NO 81所示重链CDRl区、SEQ ID NO 82所示重链CDR2区及SEQ ID NO 83所示重链⑶R3区的结合分子；b)包含SEQID NO 109所示重链CDRl区、SEQ ID NO :110所示重链CDR2区及SEQ ID NO 111所示重链⑶R3区的结合分子；c)包含SEQID NO 138所示重链CDRl区、SEQ ID NO :139所示重链CDR2区及SEQ ID NO 140所示重链⑶R3区的结合分子；d)包含SEQID NO 144所示重链CDRl区、SEQ ID NO :145所示重链CDR2区及SEQ ID NO 146所示重链⑶R3区的结合分子；以及e)包含SEQID NO :173所示重链CDRl区、SEQ ID NO :174所示重链CDR2区及SEQ ID NO 175所示重链⑶R3区的结合分子。
15.权利要求1-14任一项的结合分子，其中所述结合分子是人单克隆抗体。
16.权利要求1-15任一项的结合分子，其用作药物。
17.权利要求1-16任一项的结合分子，其用作由包含H3亚型的HA的流感病毒如H3N2 所致流感病毒感染的诊断、治疗和/或预防处理中的药物。
18.权利要求1-17任一项的结合分子的功能变体，特征在于所述功能变体具有针对包含H3亚型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性。
19.包含权利要求1-17任一项的结合分子或者权利要求18的功能变体的免疫缀合物， 所述免疫缀合物进一步包含至少一个标记。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-17任一项的结合分子、和/或权利要求18的功能变体、和/或权利要求19的免疫缀合物以及药物可接受的赋形剂。
21.权利要求1-17任一项的结合分子和/或权利要求18的功能变体和/或权利要求 19的免疫缀合物在制备用于流感病毒感染的诊断、预防和/或治疗的药物中的应用。
22.权利要求21的应用，特征在于所述流感病毒感染是由包含H3亚型H3的HA的流感病毒如H3N2引起的。
23.权利要求20的药物组合物，其包含至少一种额外的结合分子。
24.权利要求23的药物组合物，特征在于所述额外的结合分子能中和包含Hl和H5亚型的HA的流感病毒如Hmi和H5W或者其功能变体。
25.一种药物组合物，其包含至少两种流感病毒中和性结合分子，特征在于至少一种结合分子能中和系统发生类群1的一或多种流感病毒亚型以及至少一种结合分子能中和系统发生类群2的一或多种流感病毒亚型。
26.—种药物组合物，其包含至少两种流感病毒中和性结合分子，特征在于至少一种结合分子能中和包含Hl和/或H5亚型的HA的流感病毒，以及至少一种结合分子能中和包含 H3、H7和/或HlO亚型的HA的流感病毒。
27.一种核酸分子，其编码权利要求1-17任一项的结合分子或者权利要求18的功能变体。
28.—种载体，其包含至少一种权利要求27的核酸分子。
29.一种宿主，其包含至少一种权利要求观的载体。
30.权利要求四的宿主，其中所述宿主是人细胞。
31.一种产生权利要求1-17任一项的结合分子或者权利要求18的功能变体的方法，其中所述方法包括步骤a)在有助于所述结合分子或者功能变体表达的条件下培养权利要求四或30的宿主， 及任选地b)回收所述表达的结合分子或者功能变体。
全文摘要
本发明涉及结合分子，如人单克隆抗体，其结合包含H3亚型的HA的流感病毒，如H3N2，且具有针对这种流感病毒的广泛中和活性。本发明提供了编码所述抗体的核酸分子、其序列及包含所述抗体的组合物，以及鉴别或者产生所述抗体的方法。所述抗体可用于诊断、预防和/或治疗流感病毒H3N2感染。在优选的实施方案中，所述抗体提供了交叉-亚型保护作用，由此基于H3、H7和/或H10的流感亚型的感染得以预防和/或治疗。
文档编号C07K16/10GK102448986SQ201080021000
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月6日 优先权日2009年5月11日
发明者M·A·C·容格尼伦, M·思罗斯比, R·H·E·弗里森, T·H·J·克瓦克斯 申请人:克鲁塞尔荷兰公司