用于检测某些自身免疫疾病的生物标记抗体和诊断装置的制作方法

专利名称：用于检测某些自身免疫疾病的生物标记抗体和诊断装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，即抗原和抗体间相互作用的领域。更具体而言，本发明涉及一种人工合成抗原(TCSP)在检测与美洲锥虫病(Chagas disease)不相关的抗体中的用途，所述用途使得诊断人类患者中的某些自身免疫疾病成为可能，其中所述抗原来源于单细胞寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma Cruzi)的一个蛋白质，所述克氏锥虫能导致所述美洲锥虫病。
背景技术：
众所周知，通过干扰有效的体液免疫反应的正常成熟，以及通过使所诱导的抗体指向自身抗原，传染原能够逃脱宿主的免疫系统。此外，由于某些传染性抗原和自体抗原之间的结构相似性，某些传染原被认为能够引起具有遗传倾向的宿主中的自身免疫反应。美洲锥虫病是拉丁美洲和南美洲的地方性疾病，是在其肆虐的国家中的发病和死亡的主要原因。它在其它大洲中实际上是不存在的。每年大约16至18万人被感染，以及约50，000例患者死于该病。它是由单细胞寄生虫克氏锥虫(T.cruzi)感染引起的，所述克氏锥虫是动质体目锥虫科的成员，所述锥虫科可引发人类中的美洲锥虫病；该原生动物寄生虫是通过大量血液寄生的昆虫，特别是由锥猎蝽亚科(血液寄生的盲蝽)传染的。当寄生虫的传染形式寄生在昆虫的蜇中时，当媒介昆虫的排泄物与宿主的血液或粘膜相接触时，即发生了传染。媒介昆虫因此释放了传染性的终结寄生型的锥虫成虫形式，通过血液循环，其可移生于多种类型的细胞中。该寄生虫复杂的生命周期，使其能够逃脱宿主的免疫反应，而不会导致宿主的死亡。该寄生虫经历了以下阶段媒介昆虫中的短膜虫期阶段、哺乳动物宿主的血液中的锥鞭毛体阶段，以及细胞内的无鞭毛体阶段在该最后的阶段中，该寄生虫通过二分裂繁殖。另一种沾染途径是用受污染的血液进行输血；已开发出大量的筛选方法(参见(例如)专利EP 0976763和US 6458922)。众所周知克氏锥虫感染心脏细胞和骨骼肌细胞、神经胶质细胞以及单核吞噬细胞系统的细胞。在被动侵入宿主细胞后，寄生虫的三鞭毛细胞形式分化成无鞭毛体形式；它主动分裂，然后释放出锥鞭毛体形式，从而导致新的细胞侵染。约有30%的患有这种疾病的患者出现严重的临床心肌病型症状(参见以下文章K. Karratolios等，‘‘hflammatory Cardiomyopathy “，2006 年发表在 Hellenic Journal of Cardiology 的综述，卷 47， 第 54-65 页，以及 J. Burian 等， “Myocarditis :the immunologist ‘ s view on pathogenesis and treatment" , 2005 年发表于 Swiss Medical Weakly 的综述，卷 135,第 359-364页)；上述心肌病可以是急性的或慢性的。在受到人类免疫缺陷病毒(HIV)或美洲锥虫病范围以外的其他传染原感染的患者中，可观察到类似的心脏病。表观健康者也可能在较小程度上存在类似的心脏病；已知这些疾病是由原因不明的自身免疫机制造成的(参见以下文章F.Kierszenbaum，“ Views on the autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis" , 2003
在〃 FEMS Immunology and Medical Microbiology"，卷 1545，第 1-11 页，以及 R. Jahns等, “Pathological autoantibodies in cardiomyopathy “ , 2008 ￥ 9 月胃 ^ Τ" Autoimmunity的综述，卷41 (6)，第454-461页)。事实上，在没有确切起因的、或抗体特异性的，或特别是已知的免疫原相关的特异性的心肌病患者中，能够观察到自体免疫反应。还没有文献描述过一个确定的能导致所述自身免疫的抗原结构，并且更具体而言还没有文献描述过这样一种针对克氏锥虫(TCSP)的抗原。已经描述了针对受体(肾上腺素的或胆碱能的)的抗体，但是没有它们对于TCSP肽的特异性的任何定义；并且也没有任何描述涉及美洲锥虫病固有范围以外的克氏锥虫寄生虫的抗原。如(例如)Hoft 等的文章中所述(〃 Trypanosama cruzi Expresses Diverse Repetitive Protein Antigens" , 1989 年 7 月发表在 Infection and Immunity 的综述， 卷57 (7)，第1959-1967页)，已知克氏锥虫寄生虫生命周期的每一阶段均可表达特异性的抗原蛋白。在该出版物所描述的研究中，作者用人抗血清筛选了克氏锥虫的表达库，并发现了编码具有重复单元的多肽的cDNA，其中所述重复单元包括6-34个氨基酸。TCR70(其与 TCR69同源)的氨基酸序列高度保守，仅有一些偶然性的替换。它们频繁地出现在所有分离的片段中，以及这些重复单元的多样性表明，它们与规避免疫系统的破坏作用有关。由于这些重复单元是免疫系统的有效调制器，因此可以认为其它传染原使用类似的策略，甚至是相同的重复单元。筛选直接针对克氏锥虫的抗体的方法包括间接免疫荧光法(IFA)、间接血凝集法(IHA)和免疫酶分析技术(ELISA)，其中所述方法是在血库使用的(特别是在巴西，这项检查是强制性的)。这些市售可得的分析试剂盒大多使用未经处理的寄生虫提取物或亚细胞片断作为抗原制剂。已经发现寄生虫提取物与患有其它疾病的患者的血清发生反应，所述其它疾病如利什曼病、让氏锥虫(Trypanosoma rangeli)感染、梅毒、类风湿发热。因此， 不同的病原微生物的类似重复单元的使用使得诊断和治疗变得复杂化。此外，美洲锥虫病筛选中的假阳性反应能够导致误诊，这将伴随不必要的和/或无效的治疗。因此，人们迫切需要能够检测不同的病原微生物所使用的重复单元。但是，现有技术中没有任何文献表明或暗示在克氏锥虫中鉴定的多肽基序TCR70，存在于其他与美洲锥虫病不相关的疾病中，或者导致了自身免疫失调。现有技术中也没有表明或暗示这些重复单元能够用于开发诊断和治疗与美洲锥虫病有关或无关的心脏病或自身免疫失调的可靠工具，或有效地预防上述疾病。为此还需要提供一种免疫诊断方法，以检测能够与克氏锥虫所表达的抗原特异性地结合的病原性的抗体，所述方法优选快速的或能够以试剂盒的形式使用的方法。最后，还没有方法能够降低血液中的这些病原性的抗体的浓度。

发明内容
根据本发明，所述的问题可以通过使用与具有以下序列的肽特异性地结合的抗体得以解决Ala-A1a-A1a-Pro-A1a~Lys~Ala~A1a-A 1a-A 1a-Pro-A1a-Lys-Thr-A1a-A 1a-A Ia-P ro-Val(SEQ ID No. 1)，并且所述抗体不是在克氏锥虫感染宿主之后在宿主内诱导产生的。这些抗体本身代表本发明的第一主题。本发明的第二主题是与根据第一主题所述的抗体特异性地结合的抗原，所述抗原不包括与克氏锥虫诱导的抗体结合并且由克氏锥虫寄生虫遗传编码的抗原，即，不包括具有序列SEQ ID No. 1的抗原。本发明的第三主题是一种肽或蛋白质在检测和/或沉淀根据本发明第一主题所述的抗体中的用途，所述肽或蛋白质对于根据本发明第一主题所述的抗体具有特异性的活性，其中所述肽或蛋白质具有以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2)，以及优选为以下序列Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 3)，以及更优选序列SEQ ID No. 1。特别是，所述肽或所述蛋白质可以是TCSP肽或 TCSP肽的变体，所述变体对于根据本发明的第一主题所述的抗体具有特异性的活性。所述抗体能够与传染原的抗原、过敏原和/或自体抗原相结合；所述传染原可以是病原体，并且所述抗体的存在与传染性疾病或自身免疫疾病有关。所述病原体也可选自由朊病毒、病毒、原核生物以及单细胞或多细胞的微真核生物所组成的组。所述传染性疾病或自身免疫疾病选自由心肌病、心肌炎和系统性红斑狼疮所组成的组。本发明的另一主题为一种检测液体样品中的根据第一主题所述的抗体的方法，其包括以下步骤(a)将生物样品与具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体相接触，所述肽或蛋白质对于第一主题所述的抗体具有特异性的活性，其中所述生物样品优选为体液样品和/或细胞培养物的上清液样品(“液体样
口”、
m )；(b)采用一种或多种合适的标记物，确定所述液体样品中的根据权利要求1所述的抗体与所述肽或所述蛋白质的结合，其中所述标记物能够确定所述肽或蛋白质与根据权利要求1所述抗体所形成的复合物。所述标记物可选自由以下物质所组成的组化学发光标记物、凝集标记物、膜标记物、免疫酶标记物和放射性标记物。本发明的另一主题为一种用于实施根据前一主题所述的方法的试剂盒或装置，其包括(a)确定量的一种或多种具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，和/或TCSP肽或TCSP肽的变体，所述肽或蛋白质对于根据本发明第一主题所述的抗体具有特异性的活性；(b) 一种或多种合适的标记物，其中所述标记物能够确定所述肽或蛋白质与根据本发明第一主题所述的抗体所形成的复合物；(c)任选的，固体载体，该固体载体优选用所述肽或蛋白质浸渍过。所述标记物可选自由以下物质所组成的组中化学发光标记物、凝集标记物、膜标记物、免疫酶标记物和放射性标记物。另一主题为一种免疫诊断方法，所述方法包括以下步骤通过采用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，而定性或定量地检测根据第一主题所述的抗体，在所述肽或蛋白质对第一主题所述的抗体具有特异性的活性的情况下。
另一主题为一种降低生物流体样品如血液样品或生物流体流如血流中的根据第一主题所述抗体的浓度的方法，所述方法包括以下步骤通过采用具有序列SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，沉淀所述抗体，所述肽或蛋白质对于根据第一主题所述的抗体具有特异性的活性。使用TCSP肽或其变体，来获得具有相当于NCRA(非克氏锥虫病相关抗体，即不是由克氏锥虫诱导的抗体)的结合活性的抗体或抗体片段，也成为可能；这是本发明的另一个主题。具有肽序列之一 (SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3)的肽或蛋白质，能够用于对诱导NCRA抗体的免疫原进行鉴定甚至是分离。采用高级算法进行的计算机检索序列同源性的方法，可以作为识别免疫原性候选物的工具。所述免疫原性候选物可以是合成的，然后检测它们与被怀疑包含NCRA的生物样品的反应性。本发明的另一主题为具有序列 SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，在鉴定或分离与NCRA特异性地结合的或被NCRA特异性地识别的病原体中的用途，所述肽或所述蛋白质对于根据本发明的第一主题所述的抗体具有特异性的活性。这种相互作用是建立在病原体和TCSP或后者的变体之间的同源性的基础上的。本发明的另一主题为具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，在用于获得具有相当于NCRA的结合活性的抗体或抗体片段中的用途，所述肽或所述蛋白质对于根据本发明第一主题所述的抗体具有特异性的活性。本发明的最后一个主题为一种药物制剂，其包含具有相当于NCRA的结合活性的抗体或抗体片段、药学上可接受的注射液、以及任选地一种或多种载体(如聚山梨酯和/或蔗糖)或添加剂，其中所述抗体或抗体片段是通过根据第三主题所述的用途在有生命的有机体中获得的，从而导致所述有机体针对TCSP肽的免疫，或者是通过采用TCSP对表达特异抗体的噬菌体库进行筛选而获得的。


图1示出了与抗体的存在相关的信号的强度分布，其中所述抗体与TCSP肽特异性地结合，并且与克氏锥虫的感染无关(这些抗体被称为NCRA，非锥虫相关抗体)。该数据来自患者数为N的流行病学试验，其中所述患者分属于以下四组DS =健康献血者[法语dormeurs sains](即，所监测和所选择的献血者，其具有比平均一般人群更好的健康状况)HIV非洲对艾滋病毒筛查具有阳性反应的非洲患者HIV西方对艾滋病毒筛查具有阳性反应的西方患者美洲锥虫病感染了克氏锥虫的患者该表中的数据来自ELISA-型分析。可用表1和2中的数字表示。图2示出了对79例患者进行的流行病学研究的结果，即以NCRA的浓度对在研究中的患者被纳入的时间(年)作图。
具体实施方式
^Ji在本发明的范围中，以下术语具有特定的含义术语“美洲锥虫病”是指由克氏锥虫寄生虫感染所引起的病理状态，所述感染可通过或不通过肠道途径。术语“非美洲锥虫病”是指任何不是由克氏锥虫寄生虫感染所引起的病理状态，其导致针对新抗原的抗体增强的反应性，此处所述的新抗原为TCSP，TSCP的定义如下。术语“氨基酸”是指天然和非天然氨基酸。“天然”氨基酸包括天然来源的蛋白质中发现的L型氨基酸，即丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(F)、半胱氨酸(C)、 谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、 甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y) 和缬氨酸(V)。“非天然”氨基酸包括D型天然氨基酸、某些天然氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸)的同源型(Homo form)氨基酸、和亮氨酸和缬氨酸的正型(nor form)氨基酸。它们也包括其它的合成氨基酸。“肽类化合物”特别包括肽和多肽，其包括通过(例如)糖基化、乙酰化、磷酸化、 或与脂肪酸反应而得到的衍生物。该术语也包括天然来源的蛋白质和多肽。术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体。术语“单克隆抗体”是指具有同质群体的抗体组合物，而不考虑物种、来源和获得所述抗体的方法。此外，术语“抗体”包括至少存在某些免疫球蛋白结构域的人的抗体，如抗体片段和所谓的VHVL域(可变重链和可变轻链)， 和小抗体。术语“NCRA”或“NCRA抗体”(非克氏锥虫相关抗体)是指与TCSP抗原特异性地结合的抗体，以及这些抗体不是在克氏锥虫感染宿主后在宿主内诱导产生的。术语“ TCSP ” (克氏锥虫合成肽)、“ TCSP抗原”、“ TCSP肽”或“ TCSP蛋白质”都是指本发明所定义的新的肽(其具有在蛋白质TCR70和TCR69中也发现了的氨基酸序列，即 SEQ ID No. 1，其定义如下，所述序列可从克氏锥虫中分离得到，并作为NCRA的抗原)以及其所有变体和功能等价物，例如可被如上定义的NCRA识别的线性或非线性抗原决定簇。对应于SEQ ID No. 2的抗原决定簇的最小结构定义如下。术语“自体抗原”是指存在于宿主的内源性分子中的抗原决定簇，其可被所述宿主的免疫系统识别，从而可能引发免疫反应。这种机制可导致“自身免疫疾病”，在此将所述自身免疫疾病定义为由宿主针对自体抗原(也称为自体表位)的不希望发生的免疫反应引起的病理状态。术语“传染原”在此是指能诱发免疫反应的任何有生命或无生命的物质。更具体而言，它是指病原体、过敏原和半抗原。“病原体”特别包括朊病毒、病毒、分离出或未分离出的原核生物和真核微生物。“过敏原”包括能自发引起宿主内的免疫反应的所有物质或分子 (当所述宿主暴露于所述物质或分子的时候)。术语“生物流体”是指有生命的有机体(如人类患者)的体液，即取自患者身上的任何流体，如血清、血浆、全血、尿、脑脊液、唾液或细胞培养物的上清液。发明详述根据本发明，所述技术问题通过使用与新抗原(TCSP)反应的新抗体得以解决，所述新抗原来源于单细胞寄生虫克氏锥虫(T. Cruzi)的一个蛋白质，其中所述克氏锥虫可导致美洲锥虫病。本发明的特征在于与克氏锥虫寄生虫不相关的抗体(称为NCRA抗体)特异性地识别TCSP抗原，因此不被所述抗原诱导。可通过TCSP抗原与其它免疫原(内源性或外源性的、已经免疫个体的和已经诱导NCRA的免疫原)的结构性拟态，解释该异源识别的现象。TCSP抗原的肽序列来源自一个已知的蛋白质，并且在数据库Swissprot、Uniprot 和TrEMBL中记录有所述蛋白质(登记号Q7M3W1)。该蛋白质被称为TCR69 ；它类似于蛋白质 TCR70。根据本发明，用于定义NCRA抗体的蛋白质的肽序列，用三个字母的氨基酸代码表示是Ala-A1a-A 1a-Pro-A1a~Lys~Ala~A1a-A 1a-A 1a-Pro-A1a-Lys-Thr-A1a-A Ia-AIa-P ro-Val(SEQ ID No. 1)。只要它们具有与所述肽同样的抗原性能，所述肽的免疫反应性的变体也包含在本发明的范围内。在保留原序列的生物活性的条件下，(例如)通过其它化学实体替换一个或多个氨基酸，可得到一个肽序列的变体；也可以通过添加化学化合物，如生物素或天然聚合物或合成聚合物(如聚赖氨酸或多糖)，得到所述变体。本发明涵盖了所有保留了原序列的生物活性的这些变体。这些变体可特别由以下序列构成Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2)并且更优选以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(S EQ ID No. 3)该序列可以重复一次或多次，并且在重复中，如SEQ ID No. 1中末端单元(指的是 “C-末端”)的丙氨酸可被苏氨酸单元取代。由这些序列构成的肽也具有相同的生物活性， 并且可在本发明的范围内使用。可以通过将克氏锥虫寄生虫的蛋白提取物进行纯化，而得到TCSP，其中所述纯化通常产生具有序列SEQ ID No. USEQ ID No.2和SEQ ID No. 3的蛋白质TCR69或TCR70 (见上文所引用的Hoft等的文献)。TCSP和它的变体也可通过化学合成获得(例如，根据本领域技术人员公知的Merrifield法)。还可以通过分子克隆技术获得，如重组DNA，其包括 在微生物表达系统中表达蛋白质，其中所述微生物表达系统为插入了编码所述肽序列的核苷酸序列后的微生物表达系统，然后培养、提取以及纯化目的肽。由于会导致假阳性反应，因此TCSP抗原及其变体不能用于甄别美洲锥虫病。本发明人发现TCSP与NCRA可发生特异性的反应。这意味着TCSP具有能够结合NCRA的特定的肽序列。可以通过任何已知的方法检测这种结合，如化学发光法、凝集法、免疫酶或放射性方法。生物标记抗体存在于生物流体中，并且它的存在与患有心肌病的患者中的临床症状有关，例如感染了人类免疫缺陷病毒HIV的患者，所述患者已出现了心脏病并发症。本发明涉及TCSP的肽序列以及任何能够与所述同样的生物标记抗体结合的结构类似物，并且所述TCSP的肽序列以及结构类似物并不一定是由克氏锥虫寄生虫所诱导的(NCRA)。本发明还涉及一种免疫学分析方法，其可用于检测和监测传染病患者或自身免疫炎症患者中的心肌炎和心肌症。本发明的一个实施方案为定性或定量地检测生物样品中NCRA浓度的方法，其包括以下步骤a)得到生物样品，如血清、血浆、全血、尿、脑脊液、唾液、或组织标本样品、或细胞培养物的上清液；b)确定所述生物样品中的NCRA的浓度。所述生物样品可以为液体、凝胶或固体形式。其可来自于患者或体外培养物。本发明还涉及通过确定NCRA的浓度来监测心肌症的治疗。事实上，上述方法也可用于估测，由于孕妇体内存在NCRA，由子宫内心脏骤停所引起的胎儿死亡的概率。事实上， 这些抗体的经胎盘转运能够破坏胚胎发育过程中的心肌细胞。在心脏组织未发育完全的情况下，其效果更为显著。在该方法中，可得到患者即孕妇的生物液体样品，并确定该样品中的NCRA浓度。此外，NCRA分析能够得出对心肌病患者的治疗策略，或者针对这种疾病进行疫苗的研发。目前，能诱导生物标记抗体的免疫原的性质是未知的；然而，本发明中所公开的 TCSP序列能够给所述疾病的病因进行定性，以及用于对在人体(未与克氏锥虫寄生虫接触)中诱导的所述NCRA的传染原或非传染原进行分离，从而有助于研发新的治疗策略。作为一个例子，可以将抗体或抗TCSP抗体片段进行设计，以便其能竞争性抑制 NCRA与它们的生物靶位的结合，从而抑制其致病作用。本发现使得这种竞争性抗体的设计成为可能。此外，NCRA的纵向测量(在同一患者中随着时间的推移进行测量)能够显示出心肌病的变化及其治疗的功效。从血液循环中除去相同的NCRA，即通过免疫吸附技术，能够降低甚至完全抑制其致病作用。本发明是基于从克氏锥虫寄生虫分离的蛋白质在从未接触过该寄生虫的患者中的令人惊讶的抗原特性。事实上，所述TCSP抗原具有与NCRA的特殊的“异种特异性”活性， 所述NCRA在该寄生虫地方性区域之外的有生命的人类患者中广泛存在。它显然与肽的拟态机制有关；这些抗体可引起筛选美洲锥虫病的测试中的假阳性反应。这种机制使得TCSP肽能够与NCRA特异性地结合，所述NCRA直接对应于自体抗原或克氏锥虫以外的传染原。因此，本发明的一个实施方案针对的是TCSP多肽或其免疫反应性变体在检测NCRA中的用途。这些NCRA抗体也能够与自体抗原或传染性微生物的抗原相结合，其具有与TCSP的结合差不多的亲和力和特异性。更具体而言，本发明提供了一种用于识别或分离传染原或非传染原的如上所述的多肽，所述传染原或非传染原可诱导能转而导致自身免疫疾病的抗体。本发明还提供了一种如上所述的多肽，其中所述传染原为在表观健康的人体中分布相对广泛的病毒或微生物，其中特别是在感染了(例如)人类免疫缺陷病毒、支原体和其它随机传染原的患者中分布广泛。本发明也使得使用如上所述的多肽成为可能，其中所述自身免疫疾病选自心脏病症中所述的疾病，如心肌病和心肌炎。此外，本发明提供了一种检测针对TCSP多肽的抗体的方法，所述方法将TCSP或变体与存在于生物流体样品中的NCRA相接触，并且通过本领域技术人员所公知的方法检测所述生物样品中的NCRA的结合。此外，本发明提供了一种检测针对TCSP多肽的抗体的分析方法，其包括通过免疫分析领域的科学家已知的方法，能够检测抗原-抗体结合的试剂或工具。在本发明的另一实施方案中，采用的是TCSP多肽或其变体(该变体对于NCRA具有特异性的活性)，以提高血清学筛查分析美洲锥虫病的特异性。从图1所示的结果可以明确看到，筛查测试中检测到的NCRA不是由克氏锥虫寄生虫感染引起的。因此，TCSP抗原对这些抗体的抑制可以提高美洲锥虫病的诊断测试的特异性。本发明中的免疫反应性测试采用的是本领域技术人员所公知的ELISA(酶联免疫吸附法)技术；然而，本发明也可应用任何能够检测或测量抗原-抗体的结合的其它技术， 特别是为了实施本发明主题之一的新的免疫诊断方法。本发明的另一个主题是TCSP肽或其变体的治疗用途，以获得具有相当于NCRA的结合活性的抗体或抗体片段。在该用途中，首先对有生命的有机体(例如动物)进行针对 TCSP肽的免疫，从而制备抗体或抗体片段。然后制备包含以下物质的药物制剂所述抗体或抗体片段、药学上可接受的注射液、以及任选的佐剂(如聚山梨酯、蔗糖)。然后，对患者施用(例如注射)上述药物制剂，以与病原性的NCRA竞争。从而降低了病原性的NCRA的浓度，以及改善了患者的临床症状。本发明的另一个主题是一种降低生物流体样品(特别是血液样品或血流)中的根据本发明的抗体的浓度的方法，所述方法包括以下步骤通过采用具有序列SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，来沉淀所述抗体，其中所述肽或蛋白质对根据本发明所述的抗体具有特异性的活性。可根据诊断目的、大量生物液体的处理目的或血浆取出法的治疗目的，来实施该方法。上述方法可以静态实施，或在所述生物流体流中实施。优选的是，作为免疫吸附法实施。在一个典型的实施方案中，生物流体与固体载体相接触，在所述固体载体上固定有所述肽，或所述蛋白质，或具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的所述蛋白质，或TCSP肽或所述TCSP肽的变体。所述抗体，如果存在的话，之后就会沉淀在该固体载体上，并被从生物流体中除去。本发明的另一个方面是一种药物制剂，其包含具有相当于NCRA的活性的抗体或抗体片段、药学上可接受的注射液，以及任选的一个或多个佐剂(如聚山梨酯和/或蔗糖)。 该抗体或抗体片段可以以不同的方式获得。在一个实施方案中，可以通过使用TCSP对表达特异性抗体的噬菌体库进行筛选，获得该抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，可以通过以下方法在有生命的有机体中获得该抗体或抗体片段使用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，该肽或蛋白质的使用导致所述有机体针对TCSP肽产生免疫，检测与具有序列SEQ ID No. 1的肽特异性地结合的抗体，但是所述抗体不是在克氏锥虫感染宿主后在宿主内诱导产生的。本发明的另一个方面是TCSP在疫苗组合物中的用途，特别是具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、或SEQ ID No. 3的TCSP，所述用途使得人类针对以下疾病至少部分地产生免疫成为可能美洲锥虫病以外的疾病，特别是自身免疫性心肌病、心肌炎和系统性红斑狼疮。这种疫苗可以进行单剂量或多剂量的注射。在这些组合物中，可以以肽、或以生物素化的形式和/或连接到抗生物素蛋白衍生物，以及特别是通过化学和酶改性而获得的抗生物素蛋白衍生物(称为NeutraLite Avidin)的形式，使用所述TCSP。所述组合物可以包含溶剂、添加剂、缓冲液和药学上可接受的载体，以及视情况而定的其它有效成分。根据本发明的另一个方面，采用的是具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ IDNo. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，所述肽或蛋白质对本发明所述的抗体具有特异性的活性，以鉴定或分离与NCRA特异性地结合的或被NCRA特异性地识别的病原体。 这种新方法使得鉴定能够诱发以下疾病的病原体成为可能，其中所述疾病不包括美洲锥虫病，并且能够诱导NCRA的形成。在根据本发明的TCSP的一些用途中，标记TCSP是有益的，例如可通过发色团或荧光团，或另一种能容易地被检测到的化学实体(酶、放射性同位素、生物素、半抗原等)。实施例以下例子是对本发明的某些主题进行举例说明，而非是对本发明的限定。群组研究的例子实施例1 这些例子对应于数目为N的几个人群的筛选试验。表1和2以及图1示出了这些筛选试验的结果。在此将描述这些试验所使用的ELISA诊断技术，以及所述试验的连续步
马聚οELISA 技术将TCSP肽(用序列SEQ ID No. 1的合成肽代表)以1 μ g/m的浓度吸附在聚苯乙烯微孔板上。然后用免疫中性蛋白(在此为白蛋白)使自由附着位点饱和。用洗涤缓冲液冲洗微孔板，然后干燥备用。在稀释缓冲液中进行1/20稀释后，在微孔中孵育待测样品；洗涤3次除去未固定在抗原表面的抗体。通过针对人IgG的抗体以及用酶示踪标记的抗体， 检测固定在微孔板上的TCSP的特异性抗体。通过测量与生色团在适当的波长范围内(特别是约450nm的波长)的吸收相对应的光密度，所用酶的生色底物用来显示抗-TCSP的吸附。1. TCSP肽与血清中的NCRA的反应，其中所述血清得自于感染了人类免疫缺陷病毒的患者检测感染了人类免疫缺陷病毒的患者的血清样品中是否存在NCRA，所述患者分为以下两个群体非洲患者和西方患者(欧洲和美国来源)。2. TCSP肽与从“健康”献血者中获得的血清(即抗-HIV、抗-HVC、抗-HVB抗体以及梅毒阴性)的反应。在以下假设的基础上针对TCSP的抗体不是由克氏锥虫感染诱导的，采用欧洲血清样品来评价针对TCSP的抗体的普遍存在程度。如上所述，这些血清得自于健康献血者中；这些献血者由此比一般人群(从其中得到这些献血者)具有更好的健康状态。为了完全确定针对TCSP的这些抗体的来源，采用市售可得的试剂盒以随机顺序对所有的样品进行测试，其中所述试剂盒能够检测出克氏锥虫感染；没有发现阳性样品。然而，完全出乎预料的是，发现显著比例的这些样品却含有针对TCSP的抗体。结论是克氏锥虫使用的是高免疫原性基序，其也被其它病原体使用和/或可导致自身免疫性抗体。3. TCSP肽与患者血清中的NCRA的反应通过血清样品和预先吸附了 TCSP的固体表面的相互作用。4. TCSP与感染了克氏锥虫的患者的血清的反应鉴于TCSP抗原来源于克氏锥虫寄生虫的一个蛋白质，因此通过传统技术难以区分克氏锥虫感染所诱导的抗体和自身免疫机制所诱导的抗体(NCRA)。在使用TCSP作为抗原的ELISA试验中，发现两类抗体被混淆在一起；EIA的结果无法辨别。结果记录在表1和2以及图1中。对于有N个患者的各个群体，这些数字表明了试验中所用的NCRA与TCSP肽之间的反应性的分布(由光密度表示)。各个点的分布代表每个群体；矩形(盒)示出了半-四分位差。水平实线示出了每个群体的算术平均数，水平点线界定的是95%的群体。表 权利要求
1.一种抗体，该抗体与具有以下序列的肽特异性地结合Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-V al(SEQ ID No. 1)，并且所述抗体不是在克氏锥虫(T. cruzi)感染宿主之后在宿主体内诱导产生的。
2.一种与根据权利要求1所述的抗体特异性地结合的抗原，该抗原不包括由克氏锥虫寄生虫遗传编码的抗原。
3.一种肽或蛋白质在检测和/或沉淀根据权利要求1所述的抗体中的用途，所述肽或蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性，其中所述肽或蛋白质具有以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2),所述序列优选为以下序列Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID No. 3)，并且更优选为序列SEQ ID No. 1。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述肽或所述蛋白质为TCSP肽或TCSP肽的变体，所述变体对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性。
5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述抗体与传染原的抗原、过敏原和 /或自体抗原相结合。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述传染原为病原体，并且根据权利要求 1所述的抗体的存在与传染性疾病或自身免疫疾病有关。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述病原体选自由朊病毒、病毒、原核生物以及单细胞或多细胞的真核微生物所组成的组。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述传染性疾病或自身免疫疾病选自由心肌病、心肌炎和系统性红斑狼疮所组成的组。
9.一种检测液体样品中的根据权利要求1所述的抗体的方法，其包括以下步骤(c)将生物样品与具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质， 或TCSP肽或TCSP肽的变体相接触，所述肽或蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性，其中所述生物样品优选为体液样品和/或细胞培养物的上清液样品(“液体样品”)；(d)采用一种或多种合适的标记物，来确定所述液体样品中的根据权利要求1所述的抗体与所述肽或所述蛋白质的结合，其中所述标记物能够确定所述肽或蛋白质和根据权利要求1所述的抗体形成的复合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述标记物选自由以下物质所组成的组化学发光标记物、凝集标记物、膜标记物、免疫酶标记物和放射性标记物。
11.一种用于实施根据权利要求10所述的方法的试剂盒或装置，其包括(d)确定量的一种或多种具有序列SEQID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，和/或TCSP肽或TCSP肽的变体，所述肽或蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性；(e)一种或多种合适的标记物，该标记物能够确定所述肽或蛋白质与根据权利要求1 所述的抗体所形成的复合物；(f)任选的，固体载体，该固体载体优选为用所述肽或蛋白质浸渍过。
12.根据权利要求11所述的试剂盒或装置，其特征在于所述标记物选自由以下物质所组成的组化学发光标记物、凝集标记物、膜标记物、免疫酶标记物和放射性标记物。
13.一种免疫诊断方法，包括以下步骤通过采用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，而定性或定量地检测根据权利要求1所述的抗体，所述肽或所述蛋白质对权利要求1所述的抗体具有特异性的活性。
14.一种降低生物流体样品如血液样品或生物流体流如血流中的根据权利要求1所述的抗体的浓度的方法，包括以下步骤通过采用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或TCSP肽的变体，来沉淀所述抗体，所述肽或蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性。
15.具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或 TCSP肽的变体，在用于获得具有相当于NCRA的结合活性的抗体或抗体片段中的用途，所述肽或所述蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性。
16.具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白质，或TCSP肽或 TCSP肽的变体，在鉴定或分离与NCRA特异性地结合的或被NCRA特异性地识别的病原体中的用途，所述肽或所述蛋白质对于根据权利要求1所述的抗体具有特异性的活性。
17.一种药物制剂，其包含具有相当于NCRA的结合活性的抗体或抗体片段、药学上可接受的注射液、以及任选地一种或多种载体(如聚山梨酯和/或蔗糖)或添加剂，其中所述抗体或抗体片段是通过根据权利要求3-8中的任意一项所述的用途在有生命的有机体中获得的，从而导致所述有机体针对TCSP肽的免疫。
全文摘要
本发明涉及一种新抗体，所述抗体与具有以下序列的肽特异性地结合Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID No.1)，并且所述抗体不是在克氏锥虫(T.cruzi)感染宿主之后在宿主内诱导产生的。
文档编号C07K16/20GK102448988SQ201080020080
公开日2012年5月9日 申请日期2010年5月6日 优先权日2009年5月7日
发明者菲利普·范海姆斯, 马安·兹雷恩 申请人:克劳德贝尔纳里昂第一大学, 因菲尼迪生物标志公司, 法国国家科学研究中心, 里昂公民济贫院