专利名称：用于结直肠腺癌的诊断的基于蛋白质的方法和组合物的制作方法
用于结直肠腺癌的诊断的基于蛋白质的方法和组合物发明主题
本发明的涉及用于检测结肠腺癌的造影剂、诊断标记和方法。
背景技术：
大多数癌症是上皮来源的并且通过从正常细胞经发育异常逐步进展至恶性细胞而产生，所述恶性细胞侵入外围组织并且具有转移潜能。结直肠癌(CRC ;也称为结肠癌或大肠癌)是经历这样的肿瘤进展的一个突出类型的癌症。CRC包括结肠、直肠和阑尾中的癌生长。其为最重要的人癌症之一，具有每年全世界约1，000，000例新病例的发病率。因此，CRC是第三大常见癌症和世界上癌相关死亡的第四大原因(西方国家的第二大原因；综述于例如Gryfe, R.等人(1997) Curr. Probl.Cancer 21, 233-300; Petersen, G. M.等人(1999) Cancer 86, 2540-2550 中。
如果在肿瘤发展的早期(即I期)被诊断，CRC是可治愈的。早期CRC的五年生存率超过90%。在该早期中，大多数患者不具有该疾病的表型症状。早期检测可显著增加长期生存的机会，因为处于肿瘤发展的晚期(即IV期)的CRC的五年生存率仅为低于5%。超过95% 的 CRC 病例表现为腺癌(Muto, T.等人(1975) Cancer 36，2251-2270; Fearon, E.R.等人(1990) Cell 61，759 767)。在过去，采取筛查来鉴定牵涉从低风险结直肠腺瘤至高风险腺癌的进展的基因。为此，鉴定其表达在结直肠腺癌中相对于在腺瘤中被上调或下调的基因(参见例如Carvalho 等人(2009) Gut 58，79-89)。目前，结肠镜检查术是在目前应用的技术当中具有最高的检测结直肠肿瘤的灵敏度和特异度的CRC的标准筛查方式。然而，利用结肠镜检查术的筛查可具有不利方面。此类不利方面是(i)当为无症状个体提供CRC筛查时，结肠镜检查术是为限制因素的侵入性技术，(ii)作为结肠镜检查术的结果存在小的但严重的肠穿孔的风险以及(iii)结肠镜检查术不能区分非进行性(低风险)与进行性(高风险)结肠肿瘤损伤。因此，存在对允许CRC的诊断的试剂、组合物、标记和方法的持续需要。本发明的目的和概述
本发明的一个目的是提供允许诊断CRC的方法。本发明的进一步目的是提供可用于诊断CRC的标记。本发明的另一个目的涉及可用于检测CRC的造影剂的提供。这些和其他目的(如根据下文中接下来的描述它们将变得显然)形成了独立权利要求主题。本发明的某些优选实施方案形成了从属权利要求的主题。因此在一个实施方案中，本发明涉及诊断标记，优选用于CRC的诊断标记，其包含由下列多肽组成的组的至少一种多肽
SEQ ID No. : I 的多肽；
SEQ ID No. : 2 的多肽；
SEQ ID No. : 3 的多肽； SEQ ID No. :4 的多肽；
SEQ ID No. :5 的多肽；
SEQ ID No. :6 的多肽；
SEQ ID No. :7 的多肽；
SEQ ID No. :8 的多肽；
SEQ ID No. :9 的多肽；
SEQ ID No. :10 的多肽；
SEQ ID No. :11 的多肽;
SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽;
SEQ ID No. :14 的多肽;
SEQ ID No. :15 的多肽；
SEQ ID No. :16 的多肽；
SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽;
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽;
SEQ ID No. :22 的多肽;
SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽;
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽;
SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽;
SEQ ID No. :31的多肽，和/或;
SEQ ID No. :32 的多肽。本发明在其他实施方案中涉及选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽作为诊断标记，优选用于检测CRC的诊断标记的用途
SEQID No. :I 的多肽；
SEQID No. :2 的多肽；
SEQID No. :3 的多肽；
SEQID No. :4 的多肽；
SEQID No. :5 的多肽；
SEQID No. :6 的多肽；
SEQID No. :7 的多肽；
SEQID No. :8 的多肽； SEQID No. :9 的多肽;
SEQID No. :10 的多肽；
SEQID No. :11 的多肽;
SEQID No. :12 的多肽;
SEQID No. :13 的多肽;
SEQID No. :14 的多肽;
SEQID No. :15 的多肽；
SEQID No. :16 的多肽；
SEQID No. :17 的多肽;
SEQID No. :18 的多肽；
SEQID No. :19 的多肽;
SEQID No. :20 的多肽;
SEQID No. :21 的多肽;
SEQID No. :22 的多肽;
SEQID No. :23 的多肽;
SEQID No. :24 的多肽;
SEQID No. :25 的多肽;
SEQID No. :26 的多肽;
SEQID No. :27 的多肽;
SEQID No. :28 的多肽;
SEQID No. :29 的多肽;
SEQID No. :30 的多肽;
SEQID No. :31的多肽，和/或
SEQID No. :32 的多肽。在一个实施方案中，在人或动物体外进行这样的用途。本发明的另一个方面涉及任选地用于磁共振成像(MRI)和/或磁光子成像(magneticphotonimaging) (MPI)的造影剂,其包含至少一种能够与选自由下列多肽组成的组的多肽相互作用的化合物
SEQID No. :I 的多肽；
SEQID No. :2 的多肽；
SEQID No. :3 的多肽；
SEQID No. :4 的多肽；
SEQID No. :5 的多肽；
SEQID No. :6 的多肽；
SEQID No. :7 的多肽；
SEQID No. :8 的多肽；
SEQID No. :9 的多肽；
SEQID No. :10 的多肽；
SEQID No. :11 的多肽; SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽;
SEQ ID No. :14 的多肽;
SEQ ID No. :15 的多肽；
SEQ ID No. :16 的多肽；
SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽;
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽;
SEQ ID No. :22 的多肽;
SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽;
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽;
SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽;
SEQ ID No. :31 的多肽；和 / 或 SEQ ID No. : 32 的多肽。在优选实施方案中，将此类化合物偶联至优选可被MRI或MPI检测的标记分子。化合物优选地可以是抗体。此类造影剂优选地可用于检测CRC。在其他实施方案中，本发明涉及至少一种能够与选自由下列多肽组成的组的多肽相互作用的抗体作为造影剂(任选地适用于MRI和/或MPI)的用途
SEQ ID No. :I 的多肽；
SEQ ID No. :2 的多肽;
SEQ ID No. :3 的多肽；
SEQ ID No. :4 的多肽；
SEQ ID No. :5 的多肽；
SEQ ID No. :6 的多肽；
SEQ ID No. :7 的多肽；
SEQ ID No. :8 的多肽；
SEQ ID No. :9 的多肽；
SEQ ID No. :10 的多肽；
SEQ ID No. :11 的多肽;
SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽;
SEQ ID No. :14 的多肽; SEQIDNo. :15 的多肽；
SEQIDNo. :16 的多肽；
SEQIDNo. :17 的多肽;
SEQIDNo. :18 的多肽；
SEQIDNo. :19 的多肽;
SEQIDNo. :20 的多肽;
SEQIDNo. :21 的多肽; SEQIDNo. :22 的多肽;
SEQIDNo. :23 的多肽;
SEQIDNo. :24 的多肽;
SEQIDNo. :25 的多肽;
SEQIDNo. :26 的多肽;
SEQIDNo. :27 的多肽;
SEQIDNo. :28 的多肽;
SEQIDNo. :29 的多肽;
SEQIDNo. :30 的多肽;
SEQIDNo. :31的多肽；和/或
SEQIDNo. :32 的多肽，
此类造影剂优选可用于检测CRC。
本发明的另一个实施方案涉及诊断CRC的方法，其包括至少下列步骤
a)从至少一个怀疑遭受正在进行或迫近的CRC发展的人或动物个体获得至少一个样
口 ■
m ,
b)测试所述至少一个样品中至少一种选自由下列多肽组成的组的多肽的表达
SEQIDNo. :I 的多肽；
SEQIDNo. :2 的多肽；
SEQIDNo. :3 的多肽；
SEQIDNo. :4 的多肽；
SEQIDNo. :5 的多肽；
SEQIDNo. :6 的多肽；
SEQIDNo. :7 的多肽；
SEQIDNo. :8 的多肽；
SEQIDNo. :9 的多肽；
SEQIDNo. :10 的多肽；
SEQIDNo. :11 的多肽;
SEQIDNo. :12 的多肽;
SEQIDNo. :13 的多肽;
SEQIDNo. :14 的多肽;
SEQIDNo. :15 的多肽；
SEQIDNo. :16 的多肽； SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽；
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽;
SEQ ID No. :22 的多肽;
SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽;
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽;
SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽;
SEQ ID No. :31的多肽；和/或
SEQ ID No. :32 的多肽;
c)测试获自至少一个未遭受正在进行或迫近的CRC发展的人或动物个体的至少一个对照样品中至少一种选自由下列多肽组成的组的多肽的表达
SEQ ID No. :I 的多肽；
SEQ ID No. :2 的多肽；
SEQ ID No. :3 的多肽；
SEQ ID No. :4 的多肽；
SEQ ID No. :5 的多肽；
SEQ ID No. :6 的多肽；
SEQ ID No. :7 的多肽；
SEQ ID No. :8 的多肽；
SEQ ID No. :9 的多肽；
SEQ ID No. :10 的多肽；
SEQ ID No. :11 的多肽;
SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽；
SEQ ID No. :14 的多肽;
SEQ ID No. :15 的多肽；
SEQ ID No. :16 的多肽；
SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽;
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽; SEQID No. :22 的多肽;
SEQID No. :23 的多肽;
SEQID No. :24 的多肽;
SEQID No. :25 的多肽;
SEQID No. :26 的多肽;
SEQID No. :27 的多肽;
SEQID No. :28 的多肽;
SEQID No. :29 的多肽;
SEQID No. :30 的多肽;
SEQID No. :31的多肽；和/或
SEQID No. :32 的多肽;
d)测定步骤b)和d)的表达的差异；
e)基于步骤d)中获得的结果确定结直肠癌发展的存在或迫近.
在一个实施方案中，在人或动物体外进行该诊断方法的步骤b)、C)、d)和/或e)。本发明的另一个方面涉及诊断结直肠癌的方法，其包括至少下列步骤
a)测试怀疑遭受正在进行或迫近的CRC发展的至少一个人或动物个体中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达
SEQID No. :I 的多肽；
SEQID No. :2 的多肽；
SEQID No. :3 的多肽；
SEQID No. :4 的多肽；
SEQID No. :5 的多肽；
SEQID No. :6 的多肽；
SEQID No. :7 的多肽；
SEQID No. :8 的多肽；
SEQID No. :9 的多肽；
SEQID No. :10 的多肽；
SEQID No. :11 的多肽;
SEQID No. :12 的多肽;
SEQID No. :13 的多肽;
SEQID No. :14 的多肽;
SEQID No. :15 的多肽；
SEQID No. :16 的多肽；
SEQID No. :17 的多肽;
SEQID No. :18 的多肽；
SEQID No. :19 的多肽;
SEQID No. :20 的多肽;
SEQID No. :21 的多肽;
SEQID No. :22 的多肽; SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽；
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽;
SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽;
SEQ ID No. :31的多肽；和/或
SEQ ID No. :32 的多肽;
b)将如步骤a)中测定的表达与如对于未遭受正在进行或迫近的CRC发展的人或动物个体所测定的选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达相比较
SEQ ID No. :I 的多肽；
SEQ ID No. :2 的多肽；
SEQ ID No. :3 的多肽；
SEQ ID No. :4 的多肽；
SEQ ID No. :5 的多肽；
SEQ ID No. :6 的多肽；
SEQ ID No. :7 的多肽；
SEQ ID No. :8 的多肽；
SEQ ID No. :9 的多肽；
SEQ ID No. :10 的多肽；
SEQ ID No. :11 的多肽;
SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽;
SEQ ID No. :14 的多肽;
SEQ ID No. :15 的多肽；
SEQ ID No. :16 的多肽；
SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽;
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽;
SEQ ID No. :22 的多肽;
SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽;
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽; SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽;
SEQ ID No. :31的多肽；和/或
SEQ ID No. :32 的多肽;
c)基于步骤b)中获得的结果确定CRC发展的存在或迫近。
本发明的另一个方面涉及数据获取的方法，其包括至少下列步骤a)测试至少一个怀疑遭受正进行或迫近的CRC发展的人或动物个体中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达
SEQ ID No. :I 的多肽；
SEQ ID No. :2 的多肽；
SEQ ID No. :3 的多肽；
SEQ ID No. :4 的多肽；
SEQ ID No. :5 的多肽；
SEQ ID No. :6 的多肽；
SEQ ID No. :7 的多肽；
SEQ ID No. :8 的多肽;
SEQ ID No. :9 的多肽;
SEQ ID No. :10 的多肽；
SEQ ID No. :11 的多肽;
SEQ ID No. :12 的多肽;
SEQ ID No. :13 的多肽;
SEQ ID No. :14 的多肽;
SEQ ID No. :15 的多肽；
SEQ ID No. :16 的多肽；
SEQ ID No. :17 的多肽;
SEQ ID No. :18 的多肽；
SEQ ID No. :19 的多肽;
SEQ ID No. :20 的多肽;
SEQ ID No. :21 的多肽;
SEQ ID No. :22 的多肽;
SEQ ID No. :23 的多肽;
SEQ ID No. :24 的多肽;
SEQ ID No. :25 的多肽;
SEQ ID No. :26 的多肽;
SEQ ID No. :27 的多肽;
SEQ ID No. :28 的多肽;
SEQ ID No. :29 的多肽;
SEQ ID No. :30 的多肽; SEQID No. :31的多肽；和/或
SEQID No. :32 的多肽;
b)将步骤a)中测定的表达与如对于未遭受正在进行或迫近的CRC发展的人或动物个体测定的选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达相比较
SEQID No. :I 的多肽；
SEQID No. :2 的多肽；
SEQID No. :3 的多肽；
SEQID No. :4 的多肽；
SEQID No. :5 的多肽； SEQID No. :6 的多肽；
SEQID No. :7 的多肽；
SEQID No. :8 的多肽；
SEQID No. :9 的多肽；
SEQID No. :10 的多肽；
SEQID No. :11 的多肽;
SEQID No. :12 的多肽;
SEQID No. :13 的多肽;
SEQID No. :14 的多肽;
SEQID No. :15 的多肽；
SEQID No. :16 的多肽；
SEQID No. :17 的多肽;
SEQID No. :18 的多肽；
SEQID No. :19 的多肽;
SEQID No. :20 的多肽;
SEQID No. :21 的多肽;
SEQID No. :22 的多肽;
SEQID No. :23 的多肽;
SEQID No. :24 的多肽;
SEQID No. :25 的多肽;
SEQID No. :26 的多肽;
SEQID No. :27 的多肽;
SEQID No. :28 的多肽;
SEQID No. :29 的多肽；
SEQID No. :30 的多肽;
SEQID No. :31的多肽；和/或
SEQID No. :32 的多肽;
此外，本发明的实施方案涉及鉴定至少一个适合作为结直肠癌的诊断标记的靶分子的方法，其中所述方法包括至少下列步骤a)从全都患有结直肠癌的不同人个体获得细胞和/或获得结直肠癌细胞系；b)标记所述细胞表面上的多肽；
c)将标记的多肽与非标记的多肽分尚；
d)鉴定步骤C)的来自细胞表面多肽-级分的分离的标记的多肽，
e)在步骤d)的多肽中，选择对于其基因组表达数据显示与从健康个体获得的细胞相比较增加的表达的那些分离的标记的多肽；
f)在于步骤e)中选择的多肽中，进一步选择包含至少一个跨膜结构域和/或至少一个信号肽的那些分离的标记的多肽；
g)在于步骤f)中选择的多肽中，进一步选择具有阳性RSC的那些多肽；
h)在于步骤g)中选择的多肽中，进一步选择在至少70%的来自不同人个体的测试细 胞内发现的那些多肽；
i)在于步骤h)中选择的多肽中，进一步选择组织学分析确认其至质膜的定位的那些多肽。上述诊断标记、造影剂、用途和方法适合用于区分进行性(高风险)CRC(腺癌)与非进行性(低风险)结直肠腺瘤。此外，本发明的诊断标记、造影剂、用途和方法可以特别适合用于非侵入性分子成像,例如利用MRI的成像，用于CRC的诊断。根据下文中的详细描述，本发明的其他实施方案将变得显而易见。附例
图I 描述了结直肠癌细胞系Colo 205、HT-29、Caco2、RKO和HCT116的Neuravidine-纯化的生物素-标记的细胞表面或细胞内级分的SDS-PAGE分析。细胞内级分的两个泳道对应于获自CRC细胞系Colo 205、HT29和Caco2(左泳道)以及RKO和HCTl 16 (右泳道)的级分。图2描述了 PRNP (SEQ ID NO: 6)的组织学分析。图3描述了获自结直肠癌患者的组织培养物中的BCAM (SEQ ID NO: 5)的组织学检测。发明详述
在根据其优选实施方案中的一些详细描述本发明之前，提供了下列一般定义。可适当地在未在本文中明确地公开的任何要素、限制不存在的情况下实施如在下文中举例说明性描述的本发明。通过具体的实施方案和参考某些图描述本发明，但本发明不限定于其但只受权利要求要求的限制。在术语“包含”用于本说明书和权利要求中的情况下，其不排除其他要素。为了本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包括(comprising of)”的优选实施方案。如果在下文中，组被定义为包括至少一定数目的实施方案，那么这也可被理解为公开优选只由这些实施方案组成的组。在使用不定冠词或定冠词(当指单数名词时)例如“一”或“该”的情况下，除非明确地作出其他声明，否则这包括该名词的复数。在本发明的情境中，术语“约”或“大致”表示本领域技术人员将理解仍然确保所述特征的技术效果的精确性的区间。该术语通常表示为±10%的，优选为±5%的与指示的数值的偏差。
在下文中在术语所使用的情境中提供了所述术语的进一步定义。如背景部分中提及的，用于诊断CRC的分子标记(模式)的鉴定已集中在其表达在CRC发展过程被上调或下调的基因的鉴定。虽然该数据提供了有价值的信息，但诊断标记即基因和它们的产物(例如多肽)可能不全都适合于非侵入性分子成像诊断法。本发明的发明者已成功地鉴定了一组多肽，所述多肽可能相对于健康个体在大部分遭受结直肠癌发展的患者中过表达并且对于非侵入性分子成像诊断方法是可使用的。为此，本发明者已设计了筛查策略，其包括至少下列步骤
a)从全都患有结直肠癌的不同人个体获得细胞和/或获得结直肠癌细胞系；
b)标记所述细胞的表面上的多肽；
c)将标记的多肽与非标记的多肽分尚；
d)鉴定步骤C)的来自细胞表面多肽-级分的分离的标记的多肽，
e)在步骤d)的多肽中，选择基因组表达数据对于其显示与从健康个体获得的细胞相比较增加的表达的那些分离的标记的多肽；
f)在于步骤e)中选择的多肽中，进一步选择包含至少一个跨膜结构域和/或至少一个信号肽的那些分离的标记的多肽；
g)在于步骤f)中选择的多肽中，进一步选择具有阳性RSC的那些多肽；
h)在于步骤g)中选择的多肽中，进一步选择在至少70%的来自不同人个体的测试细胞内发现的那些多肽；
i)在于步骤h)中选择的多肽中，进一步选择组织学分析确认其至质膜的定位的那些多肽。从患CRC的人个体获得的步骤a)的细胞通常是已知参与CRC的发展的细胞类型。通常，所述细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞或成人干细胞；祖细胞；血细胞例如B和T-淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞；上皮细胞；成纤维细胞；和神经元细胞。上皮细胞可以是优选的。步骤a)中使用的细胞还可以是已建立的CRC细胞系。此类细胞系可商购获得并且包括特别是 Colo205、HT-29、Caco-2、RKO, HCTl 16、SW1398、LS513、SW480、SW620 和 COLO320。进行标记步骤b)以允许定位至细胞的表面的优先多肽的有效纯化、富集和分离。因此，将使用允许例如利用亲和层析进行有效纯化的标记。此类标记可包括例如生物素、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱苷肽S-转移酶(GST)、组氨酸-标签、Flag-标签、抗体等。可将标记共价或非共价地连接至优先定位在细胞表面上的蛋白质。I.为了进行共价键改性(covalent modification),可使用通常用于此类目的的偶联化学。因此，可使用同和/或异-双和/或多功能交联剂。典型的交联剂包括但不限于双(硫代琥拍酰亚胺)双(重氮基-联苯胺)、己二酰亚胺二甲酯、Dimethyl Pimelimidate,辛二酸亚胺二甲酯、Disuccininnclyl Suberate、戍二醒、in-MaleimidobenzoyI-N-Hydroxysuccinimide、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烧_1_羧酸硫代琥拍酰亚胺酯等。优选标记可以是硫代-NHS-SS-生物素.
随后，通常裂解细胞。这可通过低渗、酶促、超声或机械细胞破碎来实现。随后，可利用标记分离标记的多肽。本领域技术人员了解如何选择适当的分离方法。如果例如使用生物-标记标记多肽，那么可使用如它们可商购获得的基于链霉抗生物素蛋白的层析系统例如链霉抗生物素蛋白标记的或neuravidine-标记的珠粒。对His-标签，可使用可从Qiagen获得的Ni-NTA琼脂糖。对于谷胱苷肽-S-转移酶标记，可使用 GST-sepharose 等。通过将来自例如裂解的细胞的标记的多肽经历这样的层析介质，可实现标记的多肽的纯化。由于标记方法通常优先标记细胞表面多肽，因此保留在层析介质上并且从层析介质洗脱的级分可被称为标记的细胞表面多肽级分。在穿流液中发现的多肽可被称为细胞内多肽级分。此外，可使用如它们是公知的特定制备方案来从裂解的细胞获得主要包含细胞表面结合多肽和细胞内多肽的级分。将此类级分经历如上所述的层析介质可改善标记的细胞表面多肽至层析介质的附着。如果例如已用生物素标记细胞，那么细胞的多肽可优先于细胞质多肽被标记，以 便标记的细胞表面多肽将被优先保留在例如链霉抗生物素-珠粒上而细胞质多肽将主要发现于穿流液或洗涤级分中。本领域技术人员了解如何正确地进行此类分离/纯化方法,例如如何选择适当的洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、PH值等。从而通过将标记的多肽从各自层析介质洗脱来将它们与细胞表面多肽-级分分离。随后，鉴定此类分离的标记的多肽。为此，可使用例如质谱(MS)分析。随后使利用该方法获得的数据与关于基因的基因组表达数据关联，所述基因的表达在CRC中被上调或下调。基因组表达数据可从例如Carvalho等人(2009) Gut 58 (I),79-89 (就其提供其表达在CRC中被上调的基因的信息将其通过引用合并入本文)获得。本发明的情境中的关联意指只选择已鉴定的标记的多肽，对于所述多肽，基因组表达数据显示与获自健康个体的细胞相比较增加的表达。为了增加标记的、分离的和已鉴定的多肽确实定位至细胞的质膜的可能性，应用进一步的选择标准，所述选择标准只选择对于其基于算法的分析显示跨膜(TM)结构域和/或至少一个信号肽的存在的多肽。术语“信号肽”是指指导蛋白质至细胞的质膜的定位的序列特征。此类信号肽序列在本领域内是已知的。可使用通常用于此类方法的程序和算法例如由Stockholm BioinformaticsCenter (Kjill 等人(2004) Journal of Molecular Biology, 338 (5) : 1027-1036)开发的Phobias进行该分析。在选择具有至少一个跨膜结构域或至少一个信号肽的多肽后，应用进一步选择来减少假阳性的数目。为此，只选择具有阳性相对计数(RSC)值的这类蛋白质。在这样的分析中，确定当与细胞内多肽级分相比较时哪种标记的多肽富集在细胞表面多肽级分中(即优先保留在层析介质上)。随后进行从谱图计数(RSC)分析测量的log2比率。原则上，该分析依赖于基于图谱计数的非标记定量法并且适合于计算样品之间的相对蛋白质丰度。详细描述可见于Old等人(2005) Molecular & Cellular Proteomics4(10) : 1487-1502，就关于RSC值的测定而言将其通过引用并入本文。通过使用该分析，随后只选择具有阳性RSC值的蛋白质。随后通过鉴定在至少70%的步骤a)中测试的细胞内发现的那些多肽来进一步分析通过该系列不同步骤鉴定的多肽。如上文中所指出的，细胞可获自不同的人个体或可以是已建立的CRC细胞系。通常，将分析至少5种不同的细胞，这意味着分析例如至少来自全都患有CRC的5个不同人个体的细胞或至少5种不同CRC细胞系。在最后的选择步骤中，选择组织学分析确认其至少定位至质膜的多肽。这样的组织学分析可利用例如特异于所选择的多肽的抗体来进行。.
通常，组织学分析包括获自患CRC的个体或已建立的CRC细胞系的细胞的免疫荧光分析。用于这样的组织学分析的具体方案通常视分析的具体多肽而定。然而，本领域技术人员能够依靠通常可获得的知识进行例如多肽的免疫荧光检测和定位。基本上，此类方法将包括细胞在固体载体例如透明显微盖玻片上的固定。随后，在用例如抗体标记之前裂解和固定细胞。此类方法尤其是描述于Carvalho等人(2009) Gut 58 (I), 79-89中。
本发明的发明者依靠于步骤a)至步骤h)已成功地鉴定了一组32种蛋白质，所述蛋白质满足上述标准。此外，PRNP (SEQ ID NO: 6)和BCAM (SEQ ID NO: 5)的组织学分析确认这两种蛋白质确实至少定位至质膜(分别地，参见图2和图3)。这32种蛋白质的性质的概述可获自表I。
权利要求
1.包含由下列多肽组成的组的至少一种多肽的诊断标记 SEQIDNo.:I 的多肽； SEQIDNo.:2 的多肽； SEQIDNo.:3 的多肽； SEQIDNo.:4 的多肽； SEQIDNo.:5 的多肽； SEQIDNo.:6 的多肽； SEQIDNo.:7 的多肽； SEQIDNo.:8 的多肽； SEQIDNo.:9 的多肽； SEQIDNo.:10 的多肽； SEQIDNo.:11 的多肽; SEQIDNo.:12 的多肽; SEQIDNo.:13 的多肽； SEQIDNo.:14 的多肽; SEQIDNo.:15 的多肽； SEQIDNo.:16 的多肽； SEQIDNo.:17 的多肽; SEQIDNo.:18 的多肽； SEQIDNo.:19 的多肽; SEQIDNo.:20 的多肽; SEQIDNo.:21 的多肽; SEQIDNo.:22 的多肽; SEQIDNo.:23 的多肽; SEQIDNo.:24 的多肽; SEQIDNo.:25 的多肽； SEQIDNo.:26 的多肽; SEQIDNo.:27 的多肽; SEQIDNo.:28 的多肽; SEQIDNo.:29 的多肽; SEQIDNo.:30 的多肽; SEQIDNo.:31的多肽；和/或 SEQIDNo.:32 的多肽。
2.权利要求I的诊断标记，其包含至少下列多肽 SEQIDNo.:I 的多肽； SEQIDNo.:2的多肽；和/或 SEQIDNo.:3 的多肽。
3.选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽作为诊断标记的用途 SEQIDNo.:I 的多肽； SEQIDNo. :2 的多肽；SEQIDNo. :3 的多肽；SEQIDNo. :4 的多肽；SEQIDNo. :5 的多肽；SEQIDNo. :6 的多肽；SEQIDNo. :7 的多肽；SEQIDNo. :8 的多肽；SEQIDNo. :9 的多肽； SEQIDNo. :10 的多肽；SEQIDNo. :11 的多肽;SEQIDNo. :12 的多肽;SEQIDNo. :13 的多肽;SEQIDNo. :14 的多肽;SEQIDNo. :15 的多肽； SEQIDNo. :16 的多肽；SEQIDNo. :17 的多肽;SEQIDNo. :18 的多肽；SEQIDNo. :19 的多肽;SEQIDNo. :20 的多肽;SEQIDNo. :21 的多肽;SEQIDNo. :22 的多肽;SEQIDNo. :23 的多肽;SEQIDNo. :24 的多肽;SEQIDNo. :25 的多肽;SEQIDNo. :26 的多肽;SEQIDNo. :27 的多肽;SEQIDNo. :28 的多肽;SEQIDNo. :29 的多肽;SEQIDNo. :30 的多肽;SEQIDNo. :31的多肽；和/或SEQIDNo. :32 的多肽。
4.权利要求3的用途，其中使用至少下列多肽SEQIDNo. :I 的多肽；SEQIDNo. :2的多肽；和SEQIDNo. :3 的多肽。
5.任选地用于MRI和/或MPI的造影剂，其包括至少一种能够与选自由下列多肽组成的组的多肽相互作用的化合物SEQIDNo. :I 的多肽；SEQIDNo. :2 的多肽； SEQID No. :3 的多肽；SEQID No. :4 的多肽；SEQID No. :5 的多肽；SEQID No. :6 的多肽；SEQID No. :7 的多肽；SEQID No. :8 的多肽；SEQID No. :9 的多肽； SEQID No. :10 的多肽； SEQID No. :11 的多肽;SEQID No. :12 的多肽;SEQID No. :13 的多肽;SEQID No. :14 的多肽;SEQID No. :15 的多肽；SEQID No. :16 的多肽；SEQID No. :17 的多肽;SEQID No. :18 的多肽；SEQID No. :19 的多肽;SEQID No. :20 的多肽;SEQID No. :21 的多肽;SEQID No. :22 的多肽;SEQID No. :23 的多肽;SEQID No. :24 的多肽;SEQID No. :25 的多肽;SEQID No. :26 的多肽;SEQID No. :27 的多肽;SEQID No. :28 的多肽;SEQID No. :29 的多肽;SEQID No. :30 的多肽;SEQID No. :31的多肽；和/或 SEQID No. :32 的多肽。
6.权利要求5的造影剂，其中所述造影剂包含至少与下列多肽相互作用的单种或复数种化合物SEQID No. :I 的多肽；SEQID No. :2的多肽；和 SEQID No. :3 的多肽。
7.权利要求5或6的造影剂，其中所述化合物选自与SEQID No. I至32的至少一种多肽特异性相互作用的抗体。
8.权利要求5至7的任一项的造影剂，其中所述化合物被偶联至可检测的标记分子。
9.至少一种能够与选自由下列多肽组成的组的多肽相互作用的抗体作为任选用于MRI和/或MPI的造影剂的用途 SEQ ID No. : I 的多肽； SEQ ID No. : 2 的多肽; SEQ ID No. : 3 的多肽； SEQ ID No. : 4 的多肽； SEQ ID No. : 5 的多肽； SEQ ID No. : 6 的多肽； SEQ ID No. : 7 的多肽； SEQ ID No. : 8 的多肽； SEQ ID No. : 9 的多肽； SEQ ID No. : 10 的多肽； SEQ ID No. : 11 的多肽; SEQ ID No. : 12 的多肽; SEQ ID No. : 13 的多肽; SEQ ID No. : 14 的多肽; SEQ ID No. : 15 的多肽； SEQ ID No. : 16 的多肽； SEQ ID No. : 17 的多肽; SEQ ID No. : 18 的多肽； SEQ ID No. : 19 的多肽; SEQ ID No. : 20 的多肽; SEQ ID No. : 21 的多肽; SEQ ID No. : 22 的多肽； SEQ ID No. : 23 的多肽; SEQ ID No. : 24 的多肽; SEQ ID No. : 25 的多肽; SEQ ID No. : 26 的多肽; SEQ ID No. : 27 的多肽; SEQ ID No. : 28 的多肽； SEQ ID No. : 29 的多肽； SEQ ID No. : 30 的多肽;SEQ ID No. : 31的多肽；和/或 SEQ ID No. : 32 的多肽。
10.权利要求9的用途，其中所述抗体选自与所述多肽相互作用的商购可得的抗体。
11.权利要求9或10的用途，其中所述抗体被偶联至可检测的标记分子。
12.诊断结直肠癌(CRC)的方法，其包括至少下列步骤 a)从怀疑遭受正在进行或迫近的CRC发展的至少一个人或动物个体获得至少一个样品。
b)测试所述至少一个样品中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达 SEQ ID No. :I 的多肽；SEQ ID No. :2 的多肽；SEQ ID No. :3 的多肽；SEQ ID No. :4 的多肽；SEQ ID No. :5 的多肽；SEQ ID No. :6 的多肽；SEQ ID No. :7 的多肽；SEQ ID No. :8 的多肽；SEQ ID No. :9 的多肽；SEQ ID No. :10 的多肽；SEQ ID No. :11 的多肽;SEQ ID No. :12 的多肽;SEQ ID No. :13 的多肽;SEQ ID No. :14 的多肽;SEQ ID No. :15 的多肽；SEQ ID No. :16 的多肽；SEQ ID No. :17 的多肽;SEQ ID No. :18 的多肽；SEQ ID No. :19 的多肽;SEQ ID No. :20 的多肽;SEQ ID No. :21 的多肽;SEQ ID No. :22 的多肽;SEQ ID No. :23 的多肽;SEQ ID No. :24 的多肽;SEQ ID No. :25 的多肽； SEQ ID No. :26 的多肽;SEQ ID No. :27 的多肽;SEQ ID No. :28 的多肽;SEQ ID No. :29 的多肽;SEQ ID No. :30 的多肽;SEQ ID No. :31的多肽；和/或SEQ ID No. :32 的多肽; c)测试获自未遭受正在进行或迫近的CRC发展的至少一个人或动物个体的至少一个对照样品中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达SEQ ID No. :I 的多肽；SEQ ID No. :2 的多肽；SEQ ID No. :3 的多肽；SEQ ID No. :4 的多肽；SEQ ID No. :5 的多肽； SEQ ID No. :6 的多肽；SEQ ID No. :7 的多肽；SEQ ID No. :8 的多肽；SEQ ID No. :9 的多肽；SEQ ID No. :10 的多肽；SEQ ID No. :11 的多肽;SEQ ID No. :12 的多肽;SEQ ID No. :13 的多肽; SEQ ID No. :14 的多肽;SEQ ID No. :15 的多肽；SEQ ID No. :16 的多肽；SEQ ID No. :17 的多肽;SEQ ID No. :18 的多肽；SEQ ID No. :19 的多肽;SEQ ID No. :20 的多肽;SEQ ID No. :21 的多肽;SEQ ID No. :22 的多肽;SEQ ID No. :23 的多肽;SEQ ID No. :24 的多肽;SEQ ID No. :25 的多肽;SEQ ID No. :26 的多肽;SEQ ID No. :27 的多肽;SEQ ID No. :28 的多肽;SEQ ID No. :29 的多肽;SEQ ID No. :30 的多肽;SEQ ID No. :31的多肽；和/或SEQ ID No. :32 的多肽; d)测定步骤b)和d)的表达的差异； e)基于步骤d)中获得的结果确定CRC发展的存在或迫近。
13.诊断CRC的方法，其包括至少下列步骤 a)测试怀疑遭受正在进行或迫近的CRC发展的至少一个人或动物个体中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达SEQ ID No. :I 的多肽；SEQ ID No. :2 的多肽；SEQ ID No. :3 的多肽；SEQ ID No. :4 的多肽；SEQ ID No. :5 的多肽；SEQ ID No. :6 的多肽；SEQ ID No. :7 的多肽； SEQ ID No.:8 的多肽；SEQ ID No.:9 的多肽；SEQ ID No.:10 的多肽；SEQ ID No.:11 的多肽;SEQ ID No.:12 的多肽;SEQ ID No.:13 的多肽; SEQ ID No.:14 的多肽;SEQ ID No.:15 的多肽；SEQ ID No.:16 的多肽；SEQ ID No.:17 的多肽;SEQ ID No.:18 的多肽；SEQ ID No.:19 的多肽;SEQ ID No.:20 的多肽;SEQ ID No.:21 的多肽;SEQ ID No.:22 的多肽;SEQ ID No.:23 的多肽;SEQ ID No.:24 的多肽;SEQ ID No.:25 的多肽;SEQ ID No.:26 的多肽;SEQ ID No.:27 的多肽;SEQ ID No.:28 的多肽;SEQ ID No.:29 的多肽;SEQ ID No.:30 的多肽;SEQ ID No.:31的多肽；和/或SEQ ID No.:32 的多肽; b)将步骤a)中测定的表达与如对于未遭受正在进行或迫近的结直肠癌发展的人或动物个体测定的选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达相比较SEQ ID No.:I 的多肽；SEQ ID No.:2 的多肽；SEQ ID No.:3 的多肽；SEQ ID No.:4 的多肽；SEQ ID No.:5 的多肽；SEQ ID No.:6 的多肽；SEQ ID No.:7 的多肽；SEQ ID No.:8 的多肽；SEQ ID No.:9 的多肽；SEQ ID No.:10 的多肽;SEQ ID No.:11 的多肽;SEQ ID No.:12 的多肽; SEQID No. :13 的多肽;SEQID No. :14 的多肽;SEQID No. :15 的多肽；SEQID No. :16 的多肽；SEQID No. :17 的多肽;SEQID No. :18 的多肽；SEQID No. :19 的多肽;SEQID No. :20 的多肽; SEQID No. :21 的多肽;SEQID No. :22 的多肽;SEQID No. :23 的多肽;SEQID No. :24 的多肽;SEQID No. :25 的多肽;SEQID No. :26 的多肽;SEQID No. :27 的多肽; SEQID No. :28 的多肽；SEQID No. :29 的多肽;SEQID No. :30 的多肽;SEQID No. :31的多肽；和/或SEQID No. :32 的多肽; c)基于步骤b)中获得的结果确定CRC发展的存在或迫近。
14.数据获取的方法，其包括至少下列步骤 a)测试怀疑遭受正在进行或迫近的CRC发展的至少一个人或动物个体中选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达SEQID No. :I 的多肽；SEQID No. :2 的多肽;SEQID No. :3 的多肽；SEQID No. :4 的多肽；SEQID No. :5 的多肽；SEQID No. :6 的多肽；SEQID No. :7 的多肽；SEQID No. :8 的多肽；SEQID No. :9 的多肽；SEQID No. :10 的多肽；SEQID No. :11 的多肽;SEQID No. :12 的多肽;SEQID No. :13 的多肽;SEQID No. :14 的多肽;SEQID No. :15 的多肽； SEQ ID No. :16 的多肽；SEQ ID No. :17 的多肽;SEQ ID No. :18 的多肽；SEQ ID No. :19 的多肽；SEQ ID No. :20 的多肽;SEQ ID No. :21 的多肽;SEQ ID No. :22 的多肽;SEQ ID No. :23 的多肽; SEQ ID No. :24 的多肽；SEQ ID No. :25 的多肽;SEQ ID No. :26 的多肽;SEQ ID No. :27 的多肽;SEQ ID No. :28 的多肽;SEQ ID No. :29 的多肽;SEQ ID No. :30 的多肽;SEQ ID No. :31的多肽；和/或SEQ ID No. :32 的多肽; b)将步骤a)中测定的表达与如对于未遭受正在进行或迫近的CRC发展的人或动物个体所测定的选自由下列多肽组成的组的至少一种多肽的表达相比较SEQ ID No. :I 的多肽；SEQ ID No. :2 的多肽；SEQ ID No. :3 的多肽；SEQ ID No. :4 的多肽；SEQ ID No. :5 的多肽；SEQ ID No. :6 的多肽；SEQ ID No. :7 的多肽；SEQ ID No. :8 的多肽；SEQ ID No. :9 的多肽；SEQ ID No. :10 的多肽；SEQ ID No. :11 的多肽;SEQ ID No. :12 的多肽;SEQ ID No. :13 的多肽;SEQ ID No. :14 的多肽;SEQ ID No. :15 的多肽；SEQ ID No. :16 的多肽；SEQ ID No. :17 的多肽;SEQ ID No. :18 的多肽；SEQ ID No. :19 的多肽;SEQ ID No. :20 的多肽; SEQIDNo. :21 的多肽;SEQIDNo. :22 的多肽;SEQIDNo. :23 的多肽;SEQIDNo. :24 的多肽;SEQIDNo. :25 的多肽;SEQIDNo. :26 的多肽;SEQIDNo. :27 的多肽；SEQIDNo. :28 的多肽;SEQIDNo. :29 的多肽;SEQIDNo. :30 的多肽;SEQIDNo. :31的多肽；和/或SEQIDNo. :32 的多肽。
15.权利要求I或2的任一项的诊断标记和/或权利要求5至8的任一项的造影剂用于区分进行性(高风险)CRC(腺癌)与非进行性(低风险)结直肠腺瘤的用途。
全文摘要
本发明公开了用于结直肠腺癌的诊断的基于蛋白质的方法和组合物。公开了用于鉴定细胞表面蛋白的方法，所述细胞表面蛋白是跨膜蛋白或具有信号肽的蛋白并且在结直肠癌(CRC)中过表达。公开了用这种方法发现的生物标记，使用它们和用于磁共振成像(MRI)和/或磁光子成像(MPI)的针对它们的造影剂的诊断方法。本方法和生物标记允许将进行性(高风险)CRC(腺癌)与非进行性(低风险)结直肠腺瘤区分开。
文档编号C07K14/00GK102803967SQ201080025187
公开日2012年11月28日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年4月7日
发明者M.德维特, R.J.A.菲尼曼, C.R.吉梅尼茨, G.A.梅杰 申请人:基督教高等教育科学研究及病人护理协会