脱毒大肠杆菌免疫原的制作方法

专利名称：脱毒大肠杆菌免疫原的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对病原性大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的免疫。
背景技术：
通常将大肠杆菌菌株分类为共生性或致病性，并将致病性菌株再细分为肠部或肠外菌株。致病性大肠杆菌在參考文献I中有详细讨论，其分成多种不同致病型，即用ー组共同的毒力因子导致共同疾病的一组大肠杆菌菌株。菌株的致病性分型是常规技术，可用基 因分型或表型分型进行。近期一项基于基因分型的致病性分型法[2]采用DNA微阵列肠部菌株中，已知至少6种充分描述的致病型肠致病性(EPEC)、肠出血性(EHEC)、肠凝聚性(EAEC)、肠侵染性(EIEC)、肠产毒性(ETEC)和扩散粘附性(DAEC)。大肠杆菌的肠外致病性菌株(或‘ExPEC’菌株[3，4])包括尿致病性(UPEC)菌株、新生儿脑膜炎(NMEC)菌株和败血症相关菌株(SEPEC)。ExPEC是尿路感染的最常见病因，也是人类新生儿脑膜炎和新生儿败血症的主要原因之一，可引起严重并发症和死亡。其他类型的肠外感染包括骨髄炎，肺部、腹内、软组织和血管内的器械相关感染。人以外的另ーExPEC致病型是禽致病性(APEC)，导致家禽肠外感染。以前的ExPEC疫苗大多数基于细胞裂解物或细胞结构。S0LC0UR0VAC 包括10种不同的热灭活细菌，包括6种ExPEC菌株。UR0-VAX0M 是ロ服片剂疫苗，包含18种选定大肠杆菌菌株的冻干细菌裂解物。百特疫苗公司(Baxter Vaccines)开发了基于来自6_10种不同菌株菌毛的UTI疫苗。米迪缪尼公司(MedImmune)基于FimH粘附素复合物开发了名为MEDI 516的产品。相反，參考文献5和6公开了来自ExPEC菌株的具体免疫原，可用作针对NMEC和UPEC菌株的明确疫苗的基础。本发明的目的是提供用于免疫以抵御致病型大肠杆菌菌株的进ー步且更好的抗原，更具体地，抵御肠致病型(如，EAEC, EIEC、EPEC和ETEC菌株)以及ExPEC致病型的抗原，特别是经脱毒从而能用作免疫接种的组分或者经截短但不降低其所引起的免疫应答以改善表达与纯化的抗原。

发明内容
參考文献5公开的许多抗原中，其一标注为辅助定居因子D( “AcfD”)前体(orf3526)(该文献中的SEQ ID NO :7051和7052，本文的SEQ ID NO 1) 參考文献5公开了来自NMEC菌株IHE3034的序列，本发明是基于在其他致病型包括APEC、UPEC, EAEC,EIEC、EPEC和ETEC菌株中鉴定的ExPEC ‘AcfD前体’(orf3526)变体。与參考文献5的公开不同，这些变体可对治疗肠致病型特别有用。因此，本发明提供这些变体，及其在免疫患者抵御大肠杆菌感染中的用途。此外，本公开包括所有大肠杆菌致病型的AcfD (orf3526)蛋白的片段和突变体，其中所述片段比全长蛋白的溶解度有提高，而在对象中引起的免疫应答与全长蛋白所引起的基本相似。本公开还包括所有大肠杆菌致病型的AcfD(orf3526)蛋白的片段和突变体，其中所述片段比全长蛋白的毒性有减弱，而在对象中引起的免疫应答与全长蛋白所引起的基本相似。此外，本公开包括所有大肠杆菌致病型的AcfD(orf3526)蛋白的片段和突变体，其中所述片段在对象中引起的免疫应答与全长蛋白所引起的基本相似，而就大肠杆菌中表达时的纯化而言具有改进的特性。本发明所用多肽本发明提供含大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽，所述多肽相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白具有突变，该突变使所述免疫原性多肽的毒性相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有减弱，且所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白可具有选自SEQ ID NO :1_19的氨基酸序列。 减弱毒性的示范性突变包括缺失部分或全部锌素金属蛋白酶(zincinmetalloprotease)结构域和锌素金属蛋白酶结构域内降低蛋白酶活性的点突变。在某些情况下，所述点突变是锌结合残基的突变或催化残基的突变。优选的点突变是基于与SEQ ID NO :I比对的1305号氨基酸的取代。示范性缺失包括下述去除大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少100个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少300个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少400个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少600个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少758个氨基酸；或不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少100个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少300个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少400个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少600个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少760个氨基酸。本发明提供包含大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽，其中所述免疫原性多肽包含的某氨基酸序列含有(a)选自SEQ ID NO 20-76的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO :20_76中任ー项的序列相同性至少a% ;或(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和/或(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO :20-76中任ー项比对时，每个从N-末端向C-末端移动的X个氨基酸的窗ロ(使得在p(p>X)个氨基酸上比对时，存在P-X+1个这种窗ロ )具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中:x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93,0. 94、0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;且如果x y不是整数，则四舍五入至整数，其中所述免疫原性多肽相对大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有突变，该突变使所述免疫原性多肽的毒性相对大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白有减弱，且其中所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch 全局比对算法[139],使用默认參数(如缺ロ开放罚分=10. 0，缺ロ延伸罚分=0. 5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[8]。这些多肽包括SEQ ID NO 20_76的其他脱毒变体，包括等位基因变体、多态性形式、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。a 值可选自 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87. 5%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高。前述免疫原性多肽还可相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白含有缺失，该缺失使所述免疫原性多肽的溶解度相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有提高，而所述免疫原性多肽仍在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。提高溶解度的示范性缺失包括去除直至gly-ser区的几乎全部N-末端氨基酸，去除N-末端富脯氨酸重复的全部或部分，或两者都去除。如权利要求8所述的免疫原性多肽，其中所述缺失是下述去除与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少30个氨基酸,与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少38个氨基酸，与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少40个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少50个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少60个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少70个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少80个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少90个氨基酸或与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少94个氨基酸。本发明还提供大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽片段，其中所述免疫原性多肽片段包含的某氨基酸序列含有(a)选自SEQ ID NO 77-95的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO :77_95中任ー项的序列相同性至少a% ;或(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和/或(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO :77_95中任ー项比对时，每个从N-末端向C-末端移动的X个氨基酸的窗ロ(使得在p(p>X)个氨基酸上比对时，存在P-X+1个这种窗ロ )具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中:x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.91,0.92,0.93,0.94、0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;且如果x y不是整数，则四舍五入至整数，其中所述免疫原性多肽片段的毒性低于大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白，且其中所述免疫原性多肽片段在对象中引起与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[7],使用默认參数(如缺ロ开放罚分=10. 0，缺ロ延伸罚分=0. 5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[8]。这些多肽包括SEQ ID NO 77_95的其他脱毒变体，包括等位基因变体、多态性形式、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。a 值可选自 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87. 5%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高。在某些实施方式中，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少10个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少20个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少25个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少30个氨基酸,或大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少33个
氨基酸。
在某些实施方式(其可与前述实施方式组合)中，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少125个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少150个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少175个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少210个氨基酸或不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少217个氨基酸。本发明还提供包含大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽片段，其中所述免疫原性多肽包含的某氨基酸序列含有(a)选自SEQ ID NO 20-76的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO :20_76中任ー项的序列相同性至少a% ;或(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和/或(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO :20-76中任ー项比对时，每个从N-末端向C-末端移动的X个氨基酸的窗ロ(使得在p(p>X)个氨基酸上比对时，存在P-X+1个这种窗ロ )具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中:x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0.75,0.80,0.85,0.90,0.91,0.92,0.93,0.94、0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;且如果x y不是整数，则四舍五入至整数，其中所述免疫原性多肽片段在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[7],使用默认參数(如缺ロ开放罚分=10. 0，缺ロ延伸罚分=0. 5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[8]。这些多肽包括SEQ ID NO 20_76的其他变体，包括等位基因变体、多态性形式、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。a 值可选自 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87. 5%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高。示范性片段将不含有大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少100个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少300个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少400个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少500个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少600个氨基酸，大肠杆菌Acf D (orf3526)蛋白最C-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少758个氨基酸；或不含有大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少100个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少300个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少400个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少600个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少760个氨基酸。前述免疫原性多肽相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白还可含有缺失，该缺失使所 述免疫原性多肽的溶解度相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有提高，而所述免疫原性多肽仍在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。提高溶解度的示范性缺失包括去除直至gly-ser区的几乎全部N-末端氨基酸，去除N-末端富脯氨酸重复的全部或部分，或两者都去除。如权利要求8所述的免疫原性多肽，其中所述缺失是下述去除与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸,与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少30个氨基酸，与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少38个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少40个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少50个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少60个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少70个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少80个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少90个氨基酸或与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少94个氨基酸。大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白可具有选自SEQ ID NO :1_19的氨基酸序列。本发明还提供大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽片段，其中所述免疫原性多肽片段包含的某氨基酸序列含有(a)选自SEQ ID NO : 77-95的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO :77-95中任ー项的序列相同性至少a% ;或(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和/或(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO :77_95中任ー项比对时，每个从N-末端向C-末端移动的X个氨基酸的窗ロ(使得在p(p>X)个氨基酸上比对时，存在P-X+1个这种窗ロ )具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中:x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200 ;y 选自 0.50,0.60,0.70,0. 75,0. 80,0. 85,0. 90,0. 91,0. 92,0. 93,0. 94、
0.95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 ;且如果x y不是整数，则四舍五入至整数，其中所述免疫原性多肽片段在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[7],使用默认參数(如缺ロ开放罚分=10. 0，缺ロ延伸罚分=0. 5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[8]。这些多肽包括SEQ ID NO 77_95的其他变体，包括等位基因变体、多态性形式、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。a 值可选自 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87. 5%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高。在某些实施方式中，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少10个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少20个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少25个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋 白最N-末端的至少30个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少33个氨基酸。在某些实施方式(其可与前述实施方式组合)中，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少125个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少150个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少175个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少210个氨基酸或不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少217个氨基酸。本发明还提供含大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽片段的免疫原性组合物，其中所述免疫原性多肽片段包含与SEQ ID NO :77-95中任ー项的序列相同性至少为a%的氨基酸序列，其中所述免疫原性多肽片段在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答，且其中所述免疫原性多肽片段不含有大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少125个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少150个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少175个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少210个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少217个氨基酸。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[7],使用默认參数(如缺ロ开放罚分=10. 0，缺ロ延伸罚分=0. 5，使用EBL0SUM62积分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[8]。这些多肽包括SEQ ID NO 77_95的其他变体，包括等位基因变体、多态性形式、同源物、直向同源物、旁系同源物、突变体等。a 值可选自 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、87. 5%、90%、91%、92%、93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高。在某些实施方式中，所述免疫原性组合物中的免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少10个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少20个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少25个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少30个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少33个氨基酸。所述免疫原性组合物还可包含佐剂，在某些实施方式中，所述佐剂含1-12%体积的可代谢油和0. 2% -2. 5%重量的乳化剂，其中所述可代谢油和乳化剂以含油滴的水包油乳剂形式存在，几乎所有油滴的直径都小于I微米；4-5%体积的角鲨烯，和(b)约1%包含聚氧こ烯去水山梨糖醇单油酸酯和去水山梨糖醇三油酸酯的乳化剂，其中所述角鲨烯和乳化剂以含油滴的水包油乳剂形式存在，几乎所有油滴的直径都小于I微米；或者MF59(TM)。前述脱毒免疫原性多肽和免疫原性多肽片段优选保留SEQ ID NO 1-19的至少ー个表位或免疫原性片段。片段内的表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。这类表位可凭经验确定(如利用PEPSCAN[9，10]或相似方法)，或它们可被预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[11]、基于矩阵的方法[12]、MAPIT0PE[13]、TEPIT0PE[14，15]、神经网络[16]、OptiMer 和 EpiMer[17，18]、ADEPT[19]、T 位点(Tsites) [20]、亲水性[21]、抗原性指数或參考文献23-27公开的方法等)。表位是抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并 结合的抗原的某部分，它们也称作“抗原决定簇”。前述脱毒免疫原性多肽和免疫原性多肽片段包括但不限干用在合适组合物中给予对象时分别诱发识别衍生所述免疫原性多肽的SEQ ID NO 1-19的分离全长多肽的抗体或T细胞介导免疫应答的免疫原性多肽，所述组合物可包含佐剂(包括但不限于下文“免疫原性组合物与药物”部分中所列或讨论的任何佐剂)或与所述多肽偶联的适当载体。前述脱毒免疫原性多肽和免疫原性多肽片段包括但不限干用在合适组合物中给予对象时分别诱发识别衍生所述免疫原性片段的SEQ ID NO 1-19的分离全长多肽的抗体或T细胞介导免疫应答的免疫原性多肽，所述组合物可包含佐剂(包括但不限于下文“免疫原性组合物与药物”部分中所列或讨论的任何佐剂)或与所述多肽偶联的适当载体。前述脱毒免疫原性多肽和免疫原性多肽片段包括但不限干用在合适组合物中给予对象时分别诱发识别衍生所述免疫原性片段的SEQ ID NO 1-19的分离全长多肽的抗体或T细胞介导免疫应答的免疫原性多肽，所述组合物可包含佐剂(包括但不限于下文“免疫原性组合物与药物”部分中所列或讨论的任何佐剂)或与所述多肽偶联的适当载体。与SEQ ID NO 1_19中任ー项相比，本发明的脱毒多肽可包含ー个或多个(例如，
1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)氨基酸取代，如保守取代(即某一氨基酸被具有相关侧链的另ー氨基酸取代)。遗传编码的氨基酸通常分为四类(I)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的替换不会对生物活性产生重要影响。相对SEQ ID NO 1-19中任ー项，脱毒多肽可包括ー个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)单氨基酸缺失。类似地，相对SEQ ID NO 1_19中任ー项，多肽可包括ー个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)插入(例如，各插入1、2、3、4或5个氨基酸)。通常，当本发明的脱毒多肽或免疫原性多肽片段包含的某序列与SEQ IDNO 1-19其一的完全序列不相同时(例如，当它包含的某序列与后者的序列相同性< 100%，或当它包含后者的片段时)，优选所述多肽能引起识别完整SEQ ID序列所组成多肽的抗体，即所述抗体结合所述SEQ ID NO 1-19中的ー个或多个。这种抗体能分别特异性结合SEQ ID NO1-19,而与其他非AcfD (orf3526)蛋白结合亲和性不会显著高于所述抗体与人血清白蛋白间亲和性，人血清白蛋白为非特异性结合标准參比。本发明所用多肽可采取各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蘧酰化多肽、非肉豆蘧酰化多肽、単体、多聚体、颗粒、变性多肽等)。例如，本发明的多肽可含有脂化的N-末端半胱氨酸(例如，SEQ ID NO 1-19 的 Cys-24)。本发明所用多肽可通过各种方式(如重组表达、由细胞培养物纯化、化学合成等)制备。优选重组表达的蛋白。本发明所用多肽优选以纯化或基本纯化，即基本不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)、特别是不含其它大肠杆菌或宿主细胞多肽的形式提供，本发明多肽的纯度通常为 至少约50重量％，通常至少约90%，即组成中少于约50%，更优选少于约10% (如5% )是其它表达的多肽。因此，组合物中的抗原是与表达该分子的完整生物体分离的。本发明所用多肽优选是大肠杆菌多肽。此类多肽可进一步选自NMEC、APEC、UPEC、EAEC、EIEC、EPEC和ETEC大肠杆菌多肽。术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支链聚合物，可包含修饰的氨基酸，可被非氨基酸打断。该术语也包括天然方式或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，ニ硫键形成、糖基化、脂化、こ酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以以单链或结合链的形式产生。本发明提供含有序列-P-Q-或-Q-P-的多肽，其中-P-是上述氨基酸序列，-Q-不是上述序列，即本发明提供融合蛋白。-P-的N-末端密码子不是ATG且此密码子未出现在多肽的N末端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而，当该密码子位于多肽N末端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的例子包括但不限于组氨酸标签(即Hisn，其中n = 3、4、5、6、7、8、9、10或更高)、麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。本发明还提供含本发明多肽的寡聚蛋白。所述寡聚体可以是ニ聚体、三聚体、四聚体等。所述寡聚体可以是均寡聚体或异寡聚体。寡聚体中的多肽可共价或非共价结合。可由本领域技术人员可用的任何方法比较该多肽在对象中引起的免疫应答与全长蛋白所引起免疫应答。下文实施例中所用的一种简单方法涉及免疫模型对象如小鼠然后用致死剂量的大肠杆菌攻击。为了恰当的比较，本领域技术人员自然会选择相同佐剂如完全弗氏佐剂。在此类测试中，例如，当所述多肽提供的保护是全长蛋白所提供保护的至少70%、全长蛋白所提供保护的至少80%、全长蛋白所提供保护的至少85%、全长蛋白所提供保护的至少90%、全长蛋白所提供保护的至少95%、全长蛋白所提供保护的至少97%、全长蛋白所提供保护的至少98%或全长蛋白所提供保护的至少99%时，本发明的免疫原性多肽片段在对象中引起基本相似的免疫应答(即，将提供基本相同的保护以抵御致死攻击)。将与所述免疫原性多肽片段进行比较(就溶解度、毒性和所引起的免疫应答而言)的全长AcfD (orf3526)蛋白可以是任何代表性大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白，包括但不限于SEQ ID NO 1-19。在优选实施方式中，所述AcfD(orf3526)蛋白是获得所述免疫原性多肽的相应全长蛋白。
本发明还提供产生本发明多肽的方法，该方法包括在诱导多肽表达的条件下培养用本发明核酸转化的宿主细胞的步骤。然后可纯化所述多肽，例如从培养上清液中纯化。本发明提供大肠杆菌细胞，其含有本发明多肽的编码质粒。所述大肠杆菌细胞的染色体可包含AcfD(orf3526)的同源物，或可以没有此类同源物，但两种情况下本发明的多肽都可从质粒表达。质粒可包括标记编码基因等。下文给出合适质粒的这些及其它细节。虽然可以在大肠杆菌(E.coli)菌株中表达本发明多肽，但本发明通常使用异源宿主进行表达。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。合适的宿主包括但不限于枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisserialactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria (如结核分支杆菌(M. tuberculosis))、酵母等。本发明提供一种产生本发明多肽的方法，所述方法包括通过化学方式合成所述多肽的至少一部分的步骤。前述蛋白、多肽、杂合多肽、表位和免疫原性片段中的任ー项及全部可以是多种形式中的任ー种，包括但不限于重组、分离或基本纯化的(和天然状态下与此类蛋白、多肽、杂合多肽、表位及免疫原性片段共存的材料相分离)。核酸本发明也提供编码本发明多肽和杂合多肽的核酸。还提供包含编码ー种或多种本发明多肽或杂合多肽的核苷酸序列的核酸。本发明也提供所含核苷酸序列与这些核苷酸序列有序列相同性的核酸。序列之间的相同性优选通过Smith-Waterman同源性搜索算法(如上所述)确定。这类核酸包括使用替代密码子编码相同氨基酸的核酸。本发明也提供可与这些核酸杂交的核酸。可以在不同“严谨性”的条件下进行杂交反应。提高杂交反应严谨性的条件是本领域众所周知的，且已公开过[如參考文献211的第7. 52页]。相关条件的例子包括(按严谨性提高的顺序)培育温度25°C、37°C、50°C、55°C和 68°C ;缓冲液浓度 IOx SSC、6x SSCUx SSC,0. Ix SSC(其中 SSCiO. 15M NaCl 和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其它缓冲液体系的等同条件；甲酰胺浓度50%和75% ;培育时间5分钟-24小时；1个、2个或多个洗涤步骤；洗涤培育时间1、2或15分钟；洗涤溶液6x SSCUx SSC、0. Ix SSC或去离子水。杂交技术和其优化方法是本领域众所周知的[例如，參见參考文献28，29，211，213等]。在一些实施方式中，本发明核酸与本发明靶标在低严谨条件下杂交；在其它实施方式中，它们在中等严谨条件下杂交；在优选实施方式中，它们在高严谨条件下杂交。ー组示范性的低严谨杂交条件是50°C和IOx SSC0 一组示范性的中等严谨杂交条件是55°C和Ix SSC0 一组示范性的高严谨杂交条件是68°C和0. Ix SSC0本发明包括含有这些序列的互补序列的核酸(例如，用于反义或检测，或用作引物)。本发明核酸可用于杂交反应(如Northern或Southern印迹,或核酸微阵列或‘基因芯片’)和扩增反应(如PCR、SDA、SSSR、LCR、TMA, NASBA等)和其它核酸技术。本发明核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记形式等)。本发明核酸可以是环状或分枝状核酸，但通常是线性核酸。除非另有说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方式可利用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式的每条链。引物、探针以及反义核酸通常是单链。本发明核酸优选以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它大肠杆菌或宿主细胞核酸，通常其纯度至少为约50重量％，通常至少为约90%。本发明核酸优选为大肠杆菌核酸。可以多种方式制备本发明中的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库制备等。本发明核酸可连接于固体支持物(如珠、平板、滤纸、膜、玻片、微阵列支持物、树脂等)。可用，例如放射性或荧光标记、或生物素标记标记本发明核酸。在准备将核酸用于检测技术时，例如核酸是引物或探针时，这特别有用。术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有修饰主链(如肽核酸(PM)或硫代磷酸酷)或修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA, cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。本发明核酸采取RNA形式时，它可能具有或不具有5'帽。本发明核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染ー种或多种细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、増殖和复制插入的核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”，或具有ー种以上载体类型的属性的“穿梭载体”。优选载体是质粒,如上所述。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，它可能是或已经是外源核酸的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，这些后代与原始亲本细胞不一定完全相同(形态或总DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明核酸体内或体外转染或感染的细胞。应理解，核酸是DNA时，RNA序列中的“U，，被DNA中的“T”所替代。相似地，应理解，核酸是RNA吋，DNA中的“ T ”被RNA序列中的“ U ”所替代。涉及核酸的术语“互补”或“互补的”指沃森克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也能使用如1(嘌呤肌苷)等碱基，例如与嘧啶(C或T)互补。例如，可使用本发明核酸产生多肽；作为检测生物样品中的核酸的杂交探针；产生额外的核酸拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链体的寡核苷酸。本发明提供产生本发明核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化学方式合成。本发明提供包含本发明核苷酸序列的载体(如克隆或表达载体)和用这种载体转化的宿主细胞。本发明核酸扩增可以是定量扩增和/或实时扩增。在本发明的某些实施方式中，核酸的长度优选为至少7个核苷酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300 个核苷酸或更长)。在本发明的某些实施方式中，核酸长度优选至多为500个核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15 个核苷酸
或更短)。本发明的引物和探针，以及用于杂交的其它核酸的长度优选为10-30个核苷酸(如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸)。免疫原性组合物和药物
本发明的多肽能用作免疫原性组合物中的活性成分(免疫原)，且此类组合物能用作疫苗。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但ー般是预防性疫苗。免疫原性组合物将是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含ー种或多种药物载体、赋形剂和/或佐剂。药学上可接受的载体与赋形剂的详细讨论见參考文献208。疫苗佐剂的详细讨论见參考文献30和31。组合物通常以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非水性形式。例如，虽然ー些疫苗制备成水性形式后以水性形式填装、分销和给药，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可以是干燥制剂，例如冻干制剂。该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧こ醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于g/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。为了提高热稳定性，组合物可包含温度保护剂。为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是l-20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸ニ氢钾、无水磷酸
氢ニ钠、氯化镁、氯化钙等。组合物的渗透压通常为200m0sm/kg-400m0sm/kg,优选为240-360m0sm/kg,更优选为 290-310m0sm/kg。组合物可含有ー种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。组合物的pH通常为5. 0-8. I，更一般为6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有< 1EU(内毒素単位，标准量度)，优选每剂量< 0. IEU0该组合物优选不含谷蛋白。该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剤。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。人疫苗的给药剂量体积一般为约0. 5ml，但可将一半剂量(即约0. 25ml)给予儿童。
本发明免疫原性组合物也可包含ー种或多种免疫调节剂。优选地，ー种或多种免疫调节剂包括ー种或多种佐剂。佐剂可包括THl佐剂和/或TH2佐剂，详述见下。可以用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含矿物质的组合物本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(如參考文献32公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等，所述盐可采用任何合适形式(例如凝胶、結晶、非晶态形式等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[33]。可采用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为使用方便，因为其均不是出现的实际化合物的准确描述(例如參见參考文献30第9章)。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟 基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的Pl通常约11，即在生理PH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在姆mg A1+++1. 8-2. 6mg蛋白质之间。磷酸铝佐剂的P04/A1摩尔比通常为0. 3-1. 2，优选0. 8-1. 2，更优选0. 95±0. I。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是P04/A1摩尔比为0. 84-0. 92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3Vml0磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20 (如约5-10 ym)。据报道，PH 7. 4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0. 7-1. 5毫克蛋白质/毫克Al+++。磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更強)改变PZC0本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4. 0-7. 0，更优选为5. 0-6. 5，例如约为5. 7。用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定，含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为I. 0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2 1，例如彡5 I、彡6 I、彡7 I、彡8 I、彡9 I等。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml,例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、< 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml等。优选范围是0. 3-lmg/ml。优选最大值是0. 85毫克/齐U。B.油乳剂适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59 [參考文献30的第10章；也參见參考文献34] (5%鲨烯、0. 5%吐温80和0. 5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。已知各种水包油乳剂，它们通常包括至少ー种油和至少ー种表面活性剤，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5 ym，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剤。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。所述乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黒麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2_丙ニ醇的6-10碳脂肪酸酷，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程在本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鯨油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊ニ烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22- 二十四碳六烯，其为本文特别优选。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通 过本领域已知的方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可以使用油的混合物。表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于聚氧こ烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酷80 ；以商品名D0WFAXTM出售的环氧こ烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/P0嵌段共聚物；重复的こ氧基(氧-1，2-こニ基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇)；(辛基苯氧基)聚こ氧基こ醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚こ醇酷，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧こ烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剤)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30);以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酷。优选非离子型表面活性剤。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80 (聚氧こ烯去水山梨糖醇单油酸酷)、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧こ烯去水山梨糖醇酯如聚氧こ烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇(曲通X-100)的组合也适合。另ー种有用的组合包含月桂醇聚醚_9和聚氧こ烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。优选的表面活性剂的含量(重量％ )为聚氧こ烯去水山梨糖醇酯(如吐温80) 0. 01-1%,特别是约0. I %;辛基-或壬基苯氧基聚氧こ醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0. 001-0. 1%，特别是0. 005-0. 02%;聚氧こ烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,优选0. 1-10%，特别是0. 1-1%或约0. 5%。优选乳液佐剂的平均液滴大小为< lym，例如彡750nm、彡500nm、彡400nm、^ 300nm、< 250nm、< 220nm、< 200nm或更小。可通过某些技术如微流化等方便地获得这
些液滴尺寸。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于 角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%司盘85。以重量计，这些比例为4. 3%鲨烯、0. 5%聚山梨酷80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’ [35-37]，參考文献38的第10章和參考文献39的第12章更详细地描述了该佐剂。所述MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如IOmM柠檬酸钠缓冲液。 鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1%)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10%角鲨烯、2-10%生育酚和0. 3-3%吐温80，角鲨烯生育酚的重量比优选彡1，因为这可提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可约为5 2。可通过下述方法制备ー该乳液将吐温80溶解于PBS得到2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL- a -生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后微流体化该混合物。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d_MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75 11 10(如750iig/ml聚山梨酯80、110iig/ml曲通X-100和100 u g/ml琥珀酸a -生育酚)，且这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。 鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401 ( “普流罗尼克 L121”)的乳液。所述乳液可用pH 7. 4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是ー种有用的胞壁酰ニ肽递送载体，已与苏氨酰 基-MDP—起用于“SAF-I”佐剂(0. 05-1% Thr-MDP、5%鲨烯、2. 5%普流罗尼克(Pluronic)L121和0.2%聚山梨酸酯80)中[40]。也可不与Thr-MDP—起使用，例如用“AF”佐剂(5%鲨烯、I. 25%普流罗尼克L121和0. 2%聚山梨酸酯80) [41]。优选微流体化。 含有鲨烯、水性溶剂、聚氧こ烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧こ烯
(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或ニ缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)小于200nm[42]。该乳液也可含有以下一种或多种物质糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烧基麦芽苷和/或鹿糖)；和/或烧基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。这类乳液可冻干。 角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[43]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼多元醇)和2% Abil-Care 85 (双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16 ニ甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。 含有0.5-50%油、0. 1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如參考文献44所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰こ醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。 不可代谢油(如轻质矿物油)和至少ー种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如參考文献58所述)、ニ甲基ニ-十八烷基溴化铵和/或N，N-ニ-十八烷基-N，N-双(2-羟こ基)丙ニ胺。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[46]。 包含矿物油、非离子亲脂性こ氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[47]。 包含矿物油、非离子亲脂水性こ氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[47]。在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可単独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最終制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此所述组合物以液体佐剂形式包装。所述抗原通常是水性形式,从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如 5:1-1: 5)，但通常约为I : I。上述对具体乳液的说明给出组分浓度吋，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此与抗原溶液混合后浓度降低。当组合物包含生育酚时，可采用a、0、Y、S、e或る生育酚中的任何ー种，但优选a-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、こ酸盐、烟酸盐等。可同时采用D-a-生育酚和DL-a-生育酚。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[48]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚，此种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内能与TNF相关配体协作。C.皂苷制剂[參考文献30的第22章]皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的留醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的阜苷。阜苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括037、0317、0318、0321、011-4、011-8和职-(。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法參见參考文献50。皂苷制剂也可以包含留醇，如胆固醇[51]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献30的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰こ醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可以用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的ー种或多种。參考文献51-53中进ー步描述了 ISC0M。任选地，ISCOM可以不含另外的去污剂[54]。关于开发基于皂苷的佐剂的综述可以參见參考文献55和56。D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含ー种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不能复制，且通常不含任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括来自流感病毒(例如HA或NA)、こ肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、ロ蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Q^-噬菌体(如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty (如反转录转座子Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文献57_62中有进ー步描述。病毒体在例如參考文献63中有进ー步描述。E.细菌或微生物衍生物 适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A (MPL)和3_0_脱酰基MPL (3dMPL)。3dMPL是3脱-0-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-0-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见參考文献64中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0. 22 ii m膜[64]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529 [65，66]。脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli),如0M-174的脂质A衍生物。例如參考文献67和68中描述了 0M-174。适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。CpG可以包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献69、70和71公开了可能的类似物取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。參考文献72-77中进ー步讨论了 CpG寡核苷酸的佐剂作用。所述CpG序列可以导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[78]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，如CpG-A 0DN,或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN0參考文献79-81 中讨论了 CpG-A 和 CpG-B ODN。优选 CpG 为 CpG-A ODN。CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。參见例如，參考文献78和82-84。有用的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune (科雷制药集团公司(ColeyPharmaceutical Group, Inc.))。另一种是CpG1826。作为替代或补充，为了使用CpG序列，可使用TpG序列[85]，这些寡核苷酸可不含非甲基化CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有ー个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如，參考文献85所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有> 25%胸腺嘧啶(例如> 35%、> 40%、>50%、>60%、>80%等)。例如，它可能含有ー个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文献85所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有> 25%胞嘧啶(例如> 35%、>
这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。其可包含少于100个核苷酸。基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31 [86]。因此，本发明使用的佐剂可以包含⑴和(ii)的混合物(i)含有至少ー个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少ー个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5' -(IC)13-3/ (SEQ ID NO 110)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO :111)的肽。细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选该蛋白获自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)菌。參考文献87中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，參考文88中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚单位。A亚单位优选含有脱毒突变亚单位优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文献89-96中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72用作佐剂。ー种有用的CT突变体是CT-E29H[97]。优选根据參考文献98中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的比对来对氨基酸取代进行编号，特别通过引用将该文献全文納入本文用于其中比对和氨基酸编号的目的。F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 [99]等)[100]，干扰素(如干扰素I)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。G.生物粘着剂和粘膜粘着剂生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酷化透明质酸微球[101]或粘膜粘着剤，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[102]。H.微粒微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径 IOOnm至 150 ii m,更优选 200nm至 30 V- m,最优选 500nm至 10 y m的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(a-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酷、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酷-こ交酯共聚物)，并任选经处理而具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。I.脂质体(參考文献30的第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见參考文献103-105所述。J.聚氧こ烯醚和聚氧こ烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧こ烯醚和聚氧こ烯酯[106]。该类制剂还包括聚氧こ烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合[107]，以及聚氧こ烯烷基醚或酯表面活性剂和至少ー种另外的非离子表面活性剂如辛苯糖醇的组合[108]。优选的聚氧こ烯醚选自下组 .聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧こ烯-8-硬脂醚、聚氧こ烯-4-月桂醚、聚氧こ烯-35-月桂醚和聚氧こ烯-23-月桂醚。K.磷腈可使用磷腈，如參考文献109和110中所述的聚[ニ(羧基苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene], “PCPP，、L.胞壁酰肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-こ酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-こ酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(正-MDP)和N-こ酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - ニ棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-こ胺MTP-PE)。M.咪唑并喹诺酮化合物。适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特("R-837")[111，112]、瑞喹莫德(“R-848”)[113]，以及它们的类似物和盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可參见參考文献114-118。N取代的脲用作佐剂的取代的脲包括式I、II或III的化合物，或其盐
权利要求
1.含大肠杆菌AcfD(orf3526)多肽的免疫原性多肽，所述多肽相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白具有突变，该突变使所述免疫原性多肽的毒性相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有减弱，且所述免疫原性多肽在对象中弓I起与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。
2.如权利要求I所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有选自SEQ ID NO 1-19的氨基酸序列。
3.如权利要求I或权利要求2所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述突变选自锌素金属蛋白酶结构域的全部或部分缺失和锌素金属蛋白酶结构域内降低蛋白酶活性的点突变。
4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述点突变是锌结合残基的突变或催化残基的突变。
5.如权利要求1-4中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述锌结合残基是基于与SEQ ID NO 1比对的1305号氨基酸。
6.如权利要求1-5中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽不含有大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白的至少100个C-末端氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少200个C-末端氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白的至少300个C-末端氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少400个C-末端氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少500个C-末端氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白的至少600个C-末端氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少700个C-末端氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少750个C-末端氨基酸或大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白的至少758个C-末端氨基酸；或不含有大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少100个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少300个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少400个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少600个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少700个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少760个氨基酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽片段包含的某氨基酸序列含有 (a)选自SEQID NO 20-76的氨基酸序列； (b)与SEQID NO 20-76相比有1-10个单氨基酸改变； (c)与SEQID NO 20-76中任ー项的序列相同性为至少85% ;或 (d)采用逐对比对算法与SEQID NO 20-76中任ー项比对时，从N末端向C末端移动的各X个氨基酸的窗口中具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中X为30而y为0. 75， 其中所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。
8.如权利要求1-7中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白还含有缺失，该缺失使所述免疫原性多肽的溶解度相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有提高。
9.如权利要求8所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述缺失是去除N-末端氨基酸至gly-ser区的几乎全部，去除N-末端富脯氨酸重复的全部或部分，或两者都去除。
10.如权利要求8所述的免疫原性多肽，其中所述缺失是去除与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸，与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少30个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少38个氨基酸,与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少40个氨基酸，与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少50个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少60个氨基酸,与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少70个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少80个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少90个氨基酸或与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少94个氨基酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分离、纯化或重组的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的免疫原性多肽，其特征在于，还包括佐剂。
13.编码权利要求1-9中任一项所述免疫原性多肽的多核苷酸。
14.ー种大肠杆菌细胞，其含有编码权利要求1-9中任一项所述免疫原性多肽的质粒。
15.ー种疫苗组分,其含有权利要求11所述的免疫原性多肽。
16.—种含有权利要求15所述疫苗组分的疫苗。
17.如权利要求16所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。
18.如权利要求16或权利要求17所述的疫苗，其还包含选自下述的额外疫苗组分脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)抗原，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)抗原，粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原，百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)抗原，破伤风梭菌(Clostridium tetani)抗原，白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)抗原，B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B (Hib))抗原，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抗原，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)抗原，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae；手几原，淋病奈瑟球菌(Neiserria gonorrfioeae)饥J京，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原，苍白密螺旋体(Treponemapallidum)抗原，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)抗原，幾肠球菌 nterococcus faecalis)抗原，屎肠球菌(Enterococcus faecium)抗原，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原，腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)抗原，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)抗原,其他大肠杆菌抗原,炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)抗原，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原，立克次体(Rickettsia)抗原，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原,肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)抗原，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗原，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原，牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原和克雷伯菌(Klebsiella)抗原。
19.ー种免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段包含的某氨基酸序列含有 (a)选自SEQID NO 77-95的氨基酸序列； (b)与SEQID NO 77-95相比有1-10个单氨基酸改变； (c)与SEQID NO 77-95中任ー项的序列相同性至少85% ;或 (d)采用逐对比对算法与SEQID NO 77-95中任ー项比对时，从N末端向C末端移动的各X个氨基酸的窗口中具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中X为30而y为0. 75， 其中所述免疫原性多肽的毒性低于大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白，且其中所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。
20.如权利要求19所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少10个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少20个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少25个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少30个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少33个氨基酸。
21.如权利要求19或20所述的免疫原性多肽片段，其特征在干，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少125个氨基酸，不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少150个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少175个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸，不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少210个氨基酸或不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少217个氨基酸。
22.如权利要求19-21中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有选自SEQ ID NO:ト19的氨基酸序列。
23.如权利要求19-22中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分离、纯化或重组的。
24.如权利要求19-23中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，还包括佐剂。
25.编码权利要求19-22中任一项所述免疫原性多肽片段的多核苷酸。
26.ー种大肠杆菌细胞，其含有编码权利要求19-22中任一项所述免疫原性多肽片段的质粒。
27.ー种疫苗组分，其含有权利要求19-23中任一项所述的免疫原性多肽片段。
28.—种含有权利要求27所述疫苗组分的疫苗。
29.如权利要求28所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。
30.如权利要求28或权利要求29所述的疫苗，其还包含选自下述的额外疫苗组分脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)抗原，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)抗原，粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原，百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)抗原，破伤风梭菌(Clostridium tetani)抗原，白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)抗原，B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B (Hib))抗原，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抗原，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)抗原，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae；手几原，淋病奈逮球菌(Neiserria gonorrfioeae)饥J京，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原，苍白密螺旋体(Treponemapallidum)抗原，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)抗原，幾肠球菌(^Enterococcus faecalis)抗原，屎肠球菌(Enterococcus faecium)抗原，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原，腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)抗原，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)抗原,其他大肠杆菌抗原,炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)抗原，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原，立克次体(Rickettsia)抗原，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原,肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)抗原，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗原，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原，牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原和克雷伯菌(Klebsiella)抗原。
31.ー种免疫原性多肽片段，其含有的某氨基酸序列包含 (a)选自SEQID NO 20-57的氨基酸序列； (b)与SEQID NO 20-57相比有1-10个单氨基酸改变； (c)与SEQID NO 20-57中任ー项的序列相同性至少85% ;或 (d)采用逐对比对算法与SEQID NO 20-57中任ー项比对时，从N末端向C末端移动的各X个氨基酸的窗口中具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中X为30而y为0. 75， 其中所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。
32.如权利要求31所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽不含有大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少100个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少300个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少400个氨基酸，大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少600个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少758个氨基酸；或不含有大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少100个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少200个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少300个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少400个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少500个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少600个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少700个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少750个氨基酸或大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少760个氨基酸。
33.如权利要求31或权利要求32所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有选自SEQ ID NO :ト19的氨基酸序列。
34.如权利要求31-33中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白还含有缺失，该缺失使所述免疫原性多肽的溶解度相对大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白有提高。
35.如权利要求34所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述缺失是去除N-末端氨基酸至gly-ser区的几乎全部，去除N-末端富脯氨酸重复的全部或部分，或两者都去除。
36.如权利要求34所述的免疫原性多肽片段，其中所述缺失是去除与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少10个氨基酸，与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少20个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少30个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少38个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少40个氨基酸，与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少50个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少60个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少70个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少80个氨基酸,与大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白相比最N-末端的至少90个氨基酸或与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白相比最N-末端的至少94个氨基酸。
37.如权利要求31-36中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分离、纯化或重组的。
38.如权利要求31-37中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，还包括佐剂。
39.编码权利要求31-36中任一项所述免疫原性多肽片段的多核苷酸。
40.ー种大肠杆菌细胞，其含有编码权利要求31-36中任一项所述免疫原性多肽片段的质粒。
41.ー种疫苗组分,其含有权利要求37的免疫原性多肽。
42.ー种含有权利要求42所述疫苗组分的疫苗。
43.如权利要求42所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。
44.如权利要求42或权利要求43所述的疫苗，其还包含选自下述的额外疫苗组分脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)抗原，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)抗原，粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原，百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)抗原，破伤风梭菌(Clostridium tetani)抗原，白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)抗原，B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B (Hib))抗原，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抗原，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)抗原，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae；手几原，淋病奈逮球菌(Neiserria gonorrfioeae)饥J京，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原，苍白密螺旋体(Treponemapallidum)抗原，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)抗原，幾肠球菌(^Enterococcus faecalis)抗原，屎肠球菌(Enterococcus faecium)抗原，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原，腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)抗原，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)抗原,其他大肠杆菌抗原,炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)抗原，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原，立克次体(Rickettsia)抗原，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原,肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)抗原，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗原，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原，牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原和克雷伯菌(Klebsiella)抗原。
45.ー种免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段包含的某氨基酸序列含有 (a)选自SEQID NO 77-95的氨基酸序列； (b)与SEQID NO 77-95相比有1-10个单氨基酸改变； (c)与SEQID NO 77-95中任ー项的序列相同性至少85% ;或 (d)采用逐对比对算法与SEQID NO 77-95中任ー项比对时，从N末端向C末端移动的各X个氨基酸的窗口中具有至少X y个相同的比对氨基酸，其中X为30而y为0. 75， 其中所述免疫原性多肽在对象中引起与大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。
46.如权利要求31所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少10个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少20个氨基酸,大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少25个氨基酸，大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最N-末端的至少30个氨基酸,大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最N-末端的至少33个氨基酸。
47.如权利要求31或46所述的免疫原性多肽片段，其特征在干，所述免疫原性多肽片段不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少125个氨基酸，不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少150个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少175个氨基酸,不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少200个氨基酸，不含大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白最C-末端的至少210个氨基酸或不含大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白最C-末端的至少217个氨基酸。
48.如权利要求31-47中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有选自SEQ ID NO:ト19的氨基酸序列。
49.如权利要求31-48中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，所述免疫原性多肽片段是分离、纯化或重组的。
50.如权利要求31-49中任一项所述的免疫原性多肽片段，其特征在于，还包括佐剂。
51.编码权利要求31-48中任一项所述免疫原性多肽片段的多核苷酸。
52.ー种大肠杆菌细胞，其含有编码权利要求31-48中任一项所述免疫原性多肽片段的质粒。
53.ー种疫苗组分，其含有权利要求31-49中任一项所述的免疫原性多肽片段。
54.—种含有权利要求53所述疫苗组分的疫苗。
55.如权利要求54所述的疫苗，所述疫苗还包含佐剂。
56.如权利要求54或权利要求55所述的疫苗，其还包含选自下述的额外疫苗组分脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)抗原，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)抗原，粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)抗原，百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)抗原，金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)抗原，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)抗原，破伤风梭菌(Clostridium tetani)抗原，白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)抗原，B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B(Hib))抗原，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)抗原，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)抗原，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae；手几原，淋病奈逮球菌(Neiserria gonorrfioeae) JnJ京，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原，苍白密螺旋体(Treponemapallidum)抗原，杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)抗原，幾肠球菌(^Enterococcus faecalis)抗原，屎肠球菌(Enterococcus faecium)抗原，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)抗原，腐生性葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)抗原，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)抗原,其他大肠杆菌抗原,炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)抗原，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原，立克次体(Rickettsia)抗原，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)抗原,肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原,霍乱弧菌(Vibrio cholerae)抗原，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhi)抗原，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)抗原，牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原和克雷伯菌(Klebsiella)抗原。
57.ー种含免疫原性多肽片段的免疫原性组合物，所述免疫原性多肽片段含有的某氨基酸序列包含与SEQ ID NO 77-95至少达90 %的序列相同性，其中所述免疫原性多肽片段不含有大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白C-末端的180个氨基酸，或者不含有大肠杆菌AcfD (orf3526)蛋白N-末端的200个氨基酸。
58.如权利要求57所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述大肠杆菌AcfD(orf3526)蛋白具有选自SEQ ID NO 1-19的氨基酸序列。
59.如权利要求57或权利要求58所述的免疫原性组合物，其还包含佐剂。
60.如权利要求59所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂包含(a)1-12%体积的可代谢油，和(b)0. 2% -2. 5%重量的乳化剤，所述可代谢油和所述乳化剂以含油滴水包油乳剂形式存在，基本上所有油滴的直径小于I微米。
61.如权利要求59所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂包含(a)4-5%体积的角鲨烯，和(b)约I %的包含聚氧こ烯去水山梨糖醇单油酸酯和去水山梨糖醇三油酸酯的乳化剤，其中所述角鲨烯和所述乳化剂以含油滴的水包油乳剂形式存在，基本上所有油滴的直径都小于I微米。
62.引起抵御大肠杆菌的免疫应答的方法，包括给予对象权利要求16-18、28-30、42-44和54-56中任一项所述的疫苗或权利要求57-61中任一项所述的免疫原性组合物。
全文摘要
已鉴定出致病性大肠杆菌‘AcfD前体’(orf3526)的脱毒变体，其在对象中引发与天然AcfD(orf3526)蛋白基本相似的免疫应答。所述脱毒变体可进一步修饰以使溶解度比天然AcfD(orf3526)蛋白有提高。
文档编号C07K14/245GK102770443SQ201080040618
公开日2012年11月7日 申请日期2010年7月16日 优先权日2009年7月16日
发明者D·G·莫里尔, L·塞里诺, M·R·丰塔纳 申请人:诺华有限公司