专利名称：一种文蛤多肽及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种文蛤多肽及其制备方法。
背景技术：
海洋生物的多样性、海洋环境的独特性以及海洋生物活性物质结构的新颖性使海洋成为创新药物与功能性/保健食品的资源宝库。自上世纪70年代以来，人们已经从海洋生物中分离出数万种新型活性物质，包括肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等多种类型。其中，肽类是数量最庞大的一类化合物。现已证明，多种海洋肽类具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗真菌、抗病毒及免疫调节等生理活性。恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。目前，肿瘤化疗技术已经有所进步，肿瘤患者生存时间明显延长，特别是对白血病、恶性淋巴瘤等的治疗有了突破，但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗还未能达到满意的效果，普遍存在着治疗有效率低、选择性差、毒副作用大、易产生肿瘤细胞耐药等问题。因此， 寻找高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物仍是药物治疗的当务之急。多肽类药物因其分子量小、活性高、毒性低等优点，日益引起国内外学者的广泛关注。Didemnin B是Rinehart小组于1981年从海鞘Trididemnum solidum中分离获得的具有抗病毒和细胞毒活性的环肽化合物，于1984年进入I期临床实验阶段，是第一个进入临床研究的海洋药物。药理研究结果表明，该化合物具有强烈的抗肿瘤活性，对L1210白血病细胞的IC5tl达到2ng/mL，同时其还具有显著的抗P388白血病和B16黑色素瘤活性。 Dolastatin 10是Pettit小组从软体动物海兔Dolabellaauricularia中分离获得的线性五肽，目前已开发了多种Dolastatins衍生物。Dolastatins类化合物能够抑制微管聚合， 促进其解聚，进而干扰肿瘤细胞的有丝分裂，是一类新型的海洋生物来源的肿瘤细胞生长抑制剂。体外实验发现，Dolastatin 10能诱导多株细胞发生凋亡。更令人感兴趣的是，近来发现作用于微管的药物能明显降低肿瘤血管的血流量，其中Dolastatin 10能降低肿瘤血管90 %的血流量。其具体机制尚不明了，可能与其影响肿瘤血管的微管功能有关，这无疑为实体瘤的治疗提供了新手段和新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种文蛤多肽及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种文蛤多肽所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa， 等电点为8. 85。所述文蛤多肽按如下步骤制备1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°C静置沉淀12小时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待
3)取步骤幻中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为 0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过Wienyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IM NaCl的缓冲液的洗脱峰， 待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的ReSOurCel5Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中 A 液为 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉淀。所述步骤1)中离心条件为lOOOOXg，离心20分钟。文蛤多肽的制备方法1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°C静置沉淀12小时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；3)取步骤2~)中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefast flow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为 0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过Wienyl Sepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IM NaCl的缓冲液的洗脱峰， 待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的ReSOurCel5Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中 A 液为 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉淀。所述步骤1)中离心条件为lOOOOXg，离心20分钟。本发明所具有的优点1、多肽类药物具有分子量小、无免疫原性、结构简单、活性高、毒性低等优点，因此在临床方面有很好的应用前景。
2、本发明从文蛤中提取多肽，其对多种肿瘤细胞具有很高抑制活性的物质。通过不断优化其为一分子量大小为15KDa的多肽类物质。用MTT比色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没有抑制作用。该多肽能够选择性抑制肿瘤细胞增殖的特点使其很有潜力成为新的抗癌药物。
图1为本发明实施例提供的文蛤多肽的SDS-PAGE电泳分析图。
具体实施例方式实施例1文蛤体液抗肿瘤多肽的制备(1)取新鲜文蛤，开壳收集其体液，经IOOOOXg离心20分钟，去除沉淀。按照硫酸铵沉淀剂用量表向上清中缓慢加入已研磨成细粉末状的硫酸铵至30%饱和度，4°C静置12 小时，IOOOOXg离心20分钟，分别收集沉淀和上清，再次向上清中加入硫酸铵至70%饱和度，4°C静置12小时，IOOOOXg离心20分钟，收集沉淀和上清，按上述方法再次向上清中加入硫酸铵至95%饱和度，4°C静置12小时，IOOOOXg离心20分钟，收集沉淀。(2)将活性组分所在的沉淀用纯水溶解，微滤以去除不溶物，然后过5KDa和50KDa 超滤膜将其按分子量划分成三部分。(3)取分子量在5_50KDa之间的活性部分对纯水透析，然后对缓冲液充分透析， 将透析好的样品过CM-kpharose fast flow阳离子交换柱，分别用含不同浓度0M、0. 1M、 0. 5M、2M的NaCl的缓冲液洗脱。所用缓冲液为0. 05M NaAc,pH5. 5缓冲液。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法检测各组份活性，发现活性组分位于含有0. IM NaCl的洗脱液中，将活性组份置于_20°C保存。(4)将步骤(3)中活性组分用含有2. 5M NaCl的缓冲液充分透析，将透析好的样品过Phenyl Sepharose 6fast flow疏水柱，分别用含不同浓度2M、1M、0M的NaCl的缓冲液洗脱。所用缓冲液为0.05M NaAc，pH5. 5缓冲液。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，用MTT比色法检测各组份活性，发现活性组分位于含有IM NaCl的洗脱液中，将活性组份置于_20°C保存。(5)将步骤(4)中活性组分用A液溶解后，用快速蛋白液相色谱(FPLC)的 Resource 15Q阴离子交换柱进行分离，采用梯度洗脱方法进行活性组分洗脱。洗脱液为A 液和B液，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的100%，B液以每分钟1.5%的速率上升，流速为lml/min。将各洗脱峰对纯水透析，冷冻干燥，各取少量用适量纯水溶解，用BCA法测定蛋白浓度后，MTT比色法检测各组份活性，发现当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性组分，将活性组分置于_20°C保存。所用A液为0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B液为IMNaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。(6)将步骤(5)中活性组分用A液溶解，经高效液相色谱(HPLC) C-18反相柱检测纯度。洗脱液为Α液为0. l%TFA+99. 9%超纯水，B液为0. l%TFA+99. 9%乙腈，进行梯度洗脱。起始浓度为A液90%，B液10%，B液浓度每分钟上升1 %，流速为0. 5ml/min,当B液占总洗脱液体积的43. 5%时出现洗脱峰。洗脱峰为单一峰，说明该组分为单一组分。此组分N-末端序列测定为IDEIQNTGGGTNFR，等电点由等电聚焦电泳测定为PI = 8. 85。(7)将此单一组分进行SDS-PAGE鉴定。取此单一组分进行电泳，用分子量范围在 14. 4-116KDa的蛋白Marker作为对照。5%的浓缩胶采用80V电压，15%的分离胶采用120V 电压。电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液进行染色。6小时后，用脱色液脱色直至蛋白质条带清晰可见。结果发现在MKDa左右有单一的蛋白条带(参见图1)。实施例2 文蛤多肽体外抑制肿瘤细胞活性抗肿瘤活性实验人肺癌细胞(AM9)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人宫颈癌上皮细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HCT-116)、人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-I)可用来评价抗肿瘤药物的活性强弱，操作简便，重现性好。实验方法(MTT法)四氮唑盐(MTT)是一种能接受氢原子的染料。活细胞的线粒体中与NADH有关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜(formazan)，而死细胞则没有此功能。Formazan结晶的生成量与活细胞数成正比，该结晶的DMSO溶液在570纳米处有最大吸收峰，所以，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。各种细胞株按照常规方法传代培养。取对数生长期的细胞，调节细胞密度至 5X IO4个细胞/毫升，按每孔180微升接种于96孔细胞培养板中，于37°C，5%二氧化碳的培养箱中培养Mh。样品为上述实施例制备所得的文蛤多肽，其设定5个浓度梯度，即为 15，30，45，60，75 μ g/ml，每个浓度设四个平行孔。阳性对照组为5-FU，阴性对照组为不含样品的培养基。每孔各加样品或对照20微升。培养48小时后，每孔各加入浓度为5mg/ml 的MTT 50微升，继续培养4小时，除去上清液。每孔各加入DMSO 150微升，在微量震荡器上震荡15分钟，至结晶完全溶解后，用酶标仪测定各孔在570纳米处的吸光值(0D值)。取四个平行孔的平均OD值按公式= (0D_对照-OD样/OD_对照X 100%计算样品对细胞增殖的抑制率aR%)。实验结果显示，活性组分在45ug/ml浓度时能够强烈抑制人肺癌细胞(AM9)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人宫颈癌上皮细胞(Hela)、人结肠癌细胞(HCT-116)、 人乳腺癌细胞(MCF-15)、人胰腺癌细胞(ASPC-I)的增殖，抑制率达到40%-80%，但是对人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)、鼠成纤维细胞(OTH/3T;3)都没有抑制作用，说明该物质能够选择性的抑制肿瘤细胞的增殖。
权利要求
1.一种文蛤多肽，其特征在于所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa，等电点为8. 85。
2.按权利要求1所述的文蛤多肽，其特征在于所述文蛤多肽按如下步骤制备1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°C静置沉淀12小时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；3)取步骤幻中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefastflow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用； 所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的ReS0UrCel5Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中 A 液为 0. 02M Tris，ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris，ρΗ9· 0。
3.按权利要求2所述的文蛤多肽，其特征在于所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和度 ’离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉淀。
4.按权利要求2或3所述的文蛤多肽，其特征在于所述步骤1)中离心条件为 10000 X g，离心20分钟。
5.一种权利要求1所述的文蛤多肽的制备方法，其特征在于文蛤多肽按如下步骤制备1)取新鲜文蛤体液，离心，上清进行硫酸铵分级沉淀，每次在4°c静置沉淀12小时；2)将步骤1)中所得活性成分沉淀用水溶解，分别用50KDa和5KDa超滤膜过滤，待用；3)取步骤幻中分子量在5_50KDa之间的活性部分过CM-kpharosefastflow阳离子交换柱，用分别含浓度为0M、0. 1M、0. 5M或2M的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为0. IM NaCl的缓冲液的洗脱峰，待用；所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5缓冲液；4)将步骤幻所得活性组分过WienylSepharose 6fast flow疏水柱，用分别含浓度为 2. 5M、2M、1M或OM的NaCl的缓冲液洗脱，收集含浓度为IMNaCl的缓冲液的洗脱峰，待用； 所述缓冲液为0. 05M NaAc, pH5. 5的缓冲液；5)将步骤4)所得洗脱组分用快速蛋白液相色谱(FPLC)的ReS0UrCel5Q阴离子交换柱进行分离，洗脱液为A液和B液，进行梯度洗脱，起始洗脱液中A液占总洗脱液体积的 100%，B液以每分钟1. 5%的速率上升，流速为lml/min，当B液占总洗脱液体积的5. 5%时出现活性组分，即为N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa的单一组分文蛤多肽，其中 A 液为 0. 02M Tris, ρΗ9· 0，B 液为 IM NaCl,0. 02Μ Tris, ρΗ9· 0。
6.按权利要求5所述的文蛤多肽，其特征在于所述步骤1)中上清进行硫酸铵分级沉淀，即为将新鲜文蛤体液离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至30%饱和度 ’离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度；离心，收集上清液，向上清中缓慢加入硫酸铵至95%饱和度，离心收集沉淀。
7.按权利要求5或6所述的文蛤多肽，其特征在于所述步骤1)中离心条件为 10000 X g，离心20分钟。
全文摘要
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种文蛤多肽及其制备方法，所述文蛤多肽N-末端序列为IDEIQNTGGGTNFR，其分子量为15KDa。制备将文蛤体液经过硫酸铵分级沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、反相层析后获得一种分子量为15KDa的多肽。本发明还涉及该多肽在预防和/或治疗恶性肿瘤的用途。本发明从文蛤中提取多肽，其对多种肿瘤细胞具有很高抑制活性。通过不断优化其为一分子量大小为15KDa的多肽类物质。用MTT比色法检测其抗肿瘤活性，发现该化合物能显著抑制多种肿瘤细胞的生长，但对正常细胞没有抑制作用。该多肽能够选择性抑制肿瘤细胞增殖的特点使其很有潜力成为新的抗癌药物。
文档编号C07K14/435GK102161699SQ20111003654
公开日2011年8月24日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者刘明, 林秀坤, 王惠, 王翠翠, 程林友, 郑兰红 申请人:中国科学院海洋研究所