专利名称：文蛤微卫星标记的检测方法
技术领域：
本发明涉及文蛤DNA分子遗传标记技术，涉及一种文蛤微卫星标记的检测方法。
背景技术：
文蛤是广盐性贝类，分布于中国、朝鲜、日本等亚洲国家。文蛤具有极高的营养价值和经济价值，已成为我国大量出口的重要鲜活水产品之一。由于文蛤养殖具有投资小、见效快、效益高等优点，得到了很大发展。为合理利用和保护文蛤野生种质资源，一些学者利用同工酶技术、RAPD技术以及AFLP技术研究了文蛤的遗传结构及其遗传多样性(林志华等，《大连水产学院学报》，2009，第6期，525-530页；沈怀舜等，《海洋学报》，2003，第25期，97-102页;赫崇波等，《中国水产科学》，第2期，215-221页)。然而由于同工酶标记、RAPD标记和AFLP标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低，RAro标记的稳定性不 好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随即分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。目前，文蛤微卫星标记开发滞后，标记数量不足，限制了该物种分子遗传学研究的发展。所以，迫切需要获取微卫星标记以进行文蛤遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种文蛤微卫星标记的检测方法。为实现上述目的，本发明采用技术方案为文蛤微卫星标记的检测方法首先利用文蛤EST序列获取微卫星标记的微卫星核心序列，并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而检测文蛤个体的基因型，及在此微卫星位点的遗传变异，获得文蛤该位点的遗传多态性图谱；所述特异性引物为正链5’ -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3’，负链5， -AGCATTCACGACACCAACAT-3，。所述使用微卫星核心序列两端设计的特异性引物序列时的退火温度为58°C。所述PCR扩增参数为100ng待测不同地理群体或群体内文蛤个体的基因组DNA, 10XPCR Buffer, 2. 5 μ L ;Mg2+，I. 5mmol/L ；rTaq (5U/ μ L)，0. 2 μ L ；dNTP (lOmmol/L)，
0.5 μ L ;上述正反向引物(10 μ mol/L)，各O. 5 μ L ;加双蒸水补体系到25 μ L。所述PCR扩增为94°C预变性5min，30个循环，72°C延伸lOmin，4°C保存。所述PCR扩增为94°C变性40s，58°C退火40s，72。。延伸50s。所述非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，将PCR扩增反应产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察，如果某一微卫星位点在不同个体中可以扩增出大小不同的片段，即认为这个位点是多态性位点，因此在不同个体间获得的多态性等位基因，就是本位点的遗传变异图谱。本发明所具有的优点，本发明可快捷的获得微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其他分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出文蛤每个个体的基因型；而应用于不同地理群体或文蛤群体内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
图I是本发明实施例提供的获得微卫星标记MM33945对文蛤30个个体的检测图谱(编号1-30是文蛤的30个个体)。
具体实施例方式
下面通过实施例详细叙述本发明。首先提取文蛤新鲜组织中的基因组DNA并稀释备用；再利用文蛤EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对文蛤不同地理或文蛤群体内个体的基因组DNA进行PCR检测，对PCR产物进行8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得文蛤的遗传多态性图谱。实施例II.利用信息学分析方法，获得一个含有微卫星序列的EST MM33945，具体过程如下使用 MicroSAtellite (MISA, http://pgrc. ipk-gatersleben. de/misa)软件对已有的文蛤幼虫转录组EST序列进行查找，筛选含有微卫星的序列，确认为微卫星的条件是两碱基重复> 12bp、三碱基重复> 15bp、四碱基和五碱基重复> 20bp，六碱基重复> 24bp，从找到的微卫星序列中筛选出具有足够侧翼序列可用于引物设计的序列MM33945，其序列为AATTTCTATCATTAATGGAAGGCGATCATGACTCTTATAGGGAAACGCTGGCAAATTATCACAGATGGTAGGGATCTAGTACTATCCCAGGAACGATTGTTAGGTAAATTGCCTGTATTTAACGGATATAATGTTAAAAAACGGGTGCTTAACTTCTAAATTGTAATACGTACATGTACTTACAAAGTATATATATATATATATATATAGACATACTATGTTGGTGTCGTGAATGCTGAAAGTTTATTTTGCCATCACAATACCAGTACTTTTACTTCTTTTTATCCT其中，微卫星核心序列为TATATATATATATATATATATA2.根据获得的上述序列，设计的MM33945微卫星引物序列为正链5，-TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3，，负链5’ -AGCATTCACGACACCAACAT-3，，使用该引物时的退火温度为58°C。3.提取文蛤基因组DNA，将其稀释为50ng/ μ L，每个PCR反应中加入2 μ L，反应总体积为25μ L。PCR扩增的加样参数每个PCR反应总体积为25μ L，包括IOOng文蛤基因组DNA, 10XPCR buffer, 2. 5μ L ；Mg2+, I. 5mmol/L ；rTaq (5U/μ L), 0. 2 μ L ；dNTP (lOmmol/L)，
0.5μ L ;上述正反向引物(ΙΟμπιοΙ/L)，各O. 5yL ;加双蒸水补体系到25 μ L0使用该引物时设置PCR的程序参数为94°C预变性5min，30个循环(94°C变性40s，58°C退火40s，72°C延伸 50s)，72°C延伸 10min，4°C保存。4. PCR扩增反应产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，在凝胶成像系统下观察记录成像结果，结果显示MM33945微卫星位点在不同个体中可以扩增出大小不同的片段，即这个位点是多态性位点，因此在不同个体中由多态性等位基因组成的基因型，就获得了文蛤MM33945微卫星标记的遗传变异图谱。实施例2I.文蛤基因组DNA的提取对来自文蛤山东群体的30个个体(编号1-30)分别取30mg新鲜组织，剪切成尽可能小的碎片，加入到I. 5ml Eppendorf管中，再加入细胞裂解液(10mmol/LTris-Cl (pH8. 0),0. lmmol/L EDTA (pH8. 0) ,0. 5% (m/V) SDS) 500 μ L 和 20mg/ml 的蛋白酶 K5 4 1^，轻轻摇匀，371过夜。然后再裂解好的样品中加入600 μ L酚、氯仿和异戊醇混合液(酹氯仿异戍醇体积比25 24 I),晃动20min后12000rpm离心IOmin,取上清液。再加入酚、氯仿和异戊醇混合液，重复上述操作2次。再取上清液加入2倍体积冷却无水乙醇和上清液1/10体积的3mmol/L的醋酸钠，12000rpm离心IOmin,弃上清液,保留DNA沉淀，再用70%乙醇洗涤2次，待乙醇挥发完全后，以TE缓冲液溶解DNA，4°C保存。
2.微卫星引物的设计在文蛤EST序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两侧设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星核心序列两端的特异性引物序列为正链，正链5’ -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3’，负链5’ -AGCATTCACGACACCAACAT-3’，使用该引物的退火温度为58°C。3. PCR扩增首先加样，加样参数如下:待测文蛤基因组DNA(50ng/yL)，2yL;10XPCR Buffer, 2. 5μ L ；Mg2+(25mmol/L)，I. 5μ L ；rTaq (5U/μ L), 0. 2 μ L ;dNTP (lOmmol/L)，0. 5 μ L ;上述正反向引物(10 μ mol/L)，各0· 5 μ L ;加双蒸水补体系到25 μ L。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为94°C预变性5min，30个循环(94°C变性40s，58°C退火 40s，72°C延伸 50s)，72。。延伸 10min，4°C保存。4. PCR产物的检测PCR产物的检测步骤为，各取5 μ LPCR扩增反应产物，在90V电压下，进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳3h，取下凝胶在浓度为0. 5 μ L/ml的EB染液中染色IOmin后，，在凝胶成像系统下观察记录成像结果，在不同个体中获得的由多态性等位基因组成的基因型，即为获得的文蛤的MM33945微卫星标记的遗传变异图谱(参见图I)。
权利要求
1.文蛤微卫星标记的检测方法，其特征在于首先利用文蛤EST序列获取微卫星标记的微卫星核心序列，并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而检测文蛤个体的基因型，及在此微卫星位点的遗传变异，获得文蛤该位点的遗传多态性图谱； 所述特异性引物为正链5’ -TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3’，负链5， -AGCATTCACGACACCAACAT-3，。
2.按权利要求I所述的文蛤微卫星标记的检测方法，其特征在于所述使用微卫星核心序列两端设计的特异性引物序列时的退火温度为58°C。
3.按权利要求I所述的文蛤微卫星标记的检测方法，其特征在于所述PCR扩增参数为100ng待测不同地理群体或群体内文蛤个体的基因组DNA，IOXPCR Buffer, 2. 5 μ L ；Mg2+，I. 5mmol/L ;rTaq(5U/y L)，0· 2μ L ;dNTP(10mmol/L)，0· 5μ L ;上述正反向引物(10 μ mol/L),各0. 5 μ L ;加双蒸水补体系到25 μ L。
4.按权利要求I或3所述的文蛤微卫星标记的检测方法，其特征在于所述PCR扩增为94°C预变性5min，30个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
5.按权利要求4所述的文蛤微卫星标记的检测方法，其特征在于所述PCR扩增为94°C变性 40s，58°C退火 40s，72。。延伸 50s。
全文摘要
本发明涉及文蛤DNA分子遗传标记技术，涉及一种文蛤微卫星标记的检测方法。首先利用文蛤EST序列获取微卫星标记的微卫星核心序列，并在其序列两端设计特异性引物并进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而检测文蛤个体的基因型，及在此微卫星位点的遗传变异，获得文蛤该位点的遗传多态性图谱；所述特异性引物为正链5’-TCCCAGGAACGATTGTTAGG-3’，负链5’-AGCATTCACGACACCAACAT-3’。本发明可快捷地获得文蛤微卫星标记基因座位的多态性图谱，方法简便、准确，进而可快速获得不同地理群或文蛤群体内个体间遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等。
文档编号C12Q1/68GK102851357SQ20121011274
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘保忠, 卢霞, 王鸿霞 申请人:中国科学院海洋研究所