专利名称：糖蛋白中去除/灭活朊病毒的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及治疗不孕症的糖基化蛋白质中的朊病毒去除/灭活的方法。
背景技术：
瓶病毒(proteinaceousinfectious particle ;缩写为 prion)是一种蛋白质，不含核酸，分子量33KD-35KD，抗蛋白酶的？冲％是其唯一(或主要)成分；它是宿主PrP基因编码的蛋白PrPe经翻译后修饰构象改变形成，在朊病毒病理发生中起主导作用，其复制和分离物(或毒株)的不同特性都由其自身和宿主PrPe相互作用决定，而不依赖于任何核酸。在病毒分类上，近年来已将与卫星因子和类病毒一同纳入亚病毒因子(subviral agents), 以与真病毒相区分。即正常生长的细胞膜糖蛋白PrPG(Cellular prion protein)仅通过构象改变错误折叠成非正常蛋白PrPsc (Scrapie form of prion protein),从而引起PrPsc的积聚，最终导致神经元的β_淀粉样变性，是一系列神经退化性疾病如人类的库鲁病(Kuru disease),致死性家族失眠症,人和动物的克-雅氏症(Creutzfel-Jacob diseases,CJD),人和动物的传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform encephalopathies,TSE),牛海绵状脑病(Bovine Spongiform encephalopathies, BSE,俗称疯牛病)，以及羊、猫或其他动物的瘙痒症等的主因。朊病毒具有和一切已知传统病原体不同的特性。它对物理化学因素有非常强的抵抗力，常规的烹饪甚至高压蒸汽消毒134-138 18分钟也不能使之完全失活；对UV254nm抵抗力比常规病毒高40-200倍；对离子辐射和超声抵抗力也很强；在371^^20%的福尔马林处理18小时，0. 35%福尔马林处理3个月也不能使之完全失去活性，室温下10% -20%福尔马林溶液中可存活18个月。朊病毒不被多种核酸酶灭活，在电子显微镜下 看不到病毒颗粒。朊病毒不形成包涵体，不含非宿主蛋白；不诱生干扰素，对干扰素亦不敏感。免疫抑制剂和免疫增强剂不能改变朊病毒病的发生和发展过程。因此，使用现有的手段很难将其除去。朊病毒的传播途径包括食用动物肉骨粉饲料、牛骨粉汤；医源性感染，如使用脑垂体生长激素、促性腺激素和硬脑膜移植、角膜移植、输血等。朊病毒存在变异和跨种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、羊等反刍动物，未知的潜在宿主可能很广，传播的潜在危险性不明，很难预测和推断。朊病毒可感染多个器官，已知的主要为脑髓，但在潜伏期内除中枢神经系统外，各种组织器官均有感染，且感染多途径，除消化道外，神经系统、血液均可感染，预防难度大，人畜一旦发病，6个月至I年全部死亡，100%的死亡率。治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质，包括绒毛膜促性腺激素(HCG)、绝经期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)，其中绝经期促性腺素是含有卵泡刺激素和黄体生成素且两者成一定比例(I 0.1-1)的混合物。临床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特定妇女(孕期或绝经期)的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。
由于这类治疗不孕症的糖蛋白药物可以从特定妇女(孕期或绝经期)的尿液中提取出来，很可能存在包括朊病毒在内的大量各种类型的病毒，如果不能有效去除这些病毒就无法保证药品的安全性。目前血制品药物的工艺过程中所使用的针对性的病毒去除/灭活的多个步骤的组合，比如热处理、低PH处理、表面活性剂处理等，对上述糖基化蛋白质药物不完全适合，因为此类糖基化蛋白质药物对热和低PH的耐受性很差，容易失去活性。按照ICH Q5A生物制品病毒安全性评估的规程，要求工艺过程中应有2步或2步以上的步骤的组合，并且至少有一步的病毒去除/灭活率大于104，才能被认为是安全有效的病毒去除/灭活方法。因此，本领域迫切需要开发出适合治疗不孕症的糖基化蛋白质的去除/灭活朊病毒的工艺，以获得安全有效的药物。
发明内容
本发明旨在提供一种去除和/或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法。在本发明的第一方面，提供了一种去除和/或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法，所述的方法由下述步骤构成(a)将含糖蛋白的溶液进行微孔膜过滤；(b)将含糖蛋白的溶液进行纳滤膜过滤或超滤膜过滤；和(C)将含糖蛋白的溶液进行阴离子交换层析；所述步骤顺序为(a)至(b)至(C)或(C)至(a)至(b)。在上述方法中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合；所述绒毛膜促性腺激素是人绒毛膜促性腺激素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人绒毛膜促性腺激素或其变体；所述绝经期促性腺素是人绝经期促性腺素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人绝经期促性腺素或其变体；所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人卵泡刺激素或其变体；所述黄体生成素是人黄体生成素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人黄体生成素或其变体。在上述方法中，步骤(a)中所述微孔膜选自孔径为O. 1-1 μ m的过滤膜；更佳地为O. 1-0. 45 μ m的过滤膜。在上述方法汇总，步骤(b)中所述纳滤膜选自孔径为I-IOOnm的纳滤膜；更佳地为10-50nm的纳滤膜。在上述方法中，步骤(b)中所述超滤膜选自孔径为1000道尔顿以上的超滤膜；更佳地为100000道尔顿以上的超滤膜。在上述方法中，步骤(C)中所述阴离子交换层析在PH5-10的条件下进行；更佳地，步骤(c)中所述阴离子交换层析在PH6-8的条件下进行。在上述方法中，步骤(C)中所述阴离子交换层析的树脂的骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和/或其衍生物的交联物；步骤(C)中所述阴离子交换层析的树脂的活性基团选自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基；更佳地，步骤(C)中所述阴离子交换层析的树脂选自DEAE Sephadex A50、Q Sepharose FF或DEAE、Sepharose FF0在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括由上述的方法获得的糖蛋白以及药学上可接受的载体。据此，本发明提供了一种适合治疗不孕症的糖基化蛋白质的去除/灭活朊病毒的工艺，从而能够获得安全有效的药物。
具体实施例方式虽然现有技术中已存在一些去除和/或灭活蛋白质中病毒的方法，但是同样的方法对于不同的病毒，会产生无法预料的结果，有时甚至会适得其反。鉴于此，发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现可通过微孔膜过滤、纳滤膜或超滤膜技术以及阴离子交换层析这3个步骤的适当组合，来达到去除/灭活糖基化蛋白质中的朊病毒的目的，从而在温和条件下去除/灭活朊病毒，并且保留了目标物-糖基化蛋白质的活性。在此基础上，发明人完成了本发明。在探索过程中，发明人注意到，采用合适的微孔膜过滤技术，以及纳滤膜或超滤膜技术，不但可以截留朊病毒颗粒，而且可以让目标物从膜上滤过，可以达到将目标物和病毒分离的目的。另外，发明人在试验过程中意外发现，只要控制好适当的条件，可以通过阴离子层析将朊病毒和目标物分离，从而达到将目标物中的病毒去除的目的。通过上述3个步骤的组合，可以有效地去除/灭活朊病毒，从而获得安全可靠的产品O定义如本文所用，“糖蛋白”和“糖基化蛋白质”可以互换使用，都是选自下述的一种或多种混合绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteotropic hormone, LH)、绝经期促性腺素(human menopausal gonadotropin, HMG)。术语“卵泡刺激素”和“FSH”可互换使用，都是指一类用于促进精子或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体。在天然情况下由垂体前叶分泌，也可从绝经期妇女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。本发明中的FSH可采用本领域常用的任何方式获得，例如天然产生、通过重组技术获得或合成，其中的杂质包括LH或CG。在本发明的一个实施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其变体，优选人尿来源的卵泡刺激素或是重组的人卵泡刺激素。可用于本发明中的含有FSH且包含作为杂质的LH和/或CG的原料可为未经任何预纯化步骤的原料、经预纯化步骤去除了部分杂质的原料、或经预纯化步骤而基本上只含FSH和杂质LH和/或CG的原料。优选在采用本发明的方法纯化FSH前，采用本领域常规方法对原料FSH进行初步纯化，以分离除LH或CG以外的其它杂质。如本文所用，术语“黄体生成激素”和“LH”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然LH具有相同或相似结构和功能的激素。如本文所用，“绝经期促性腺素”、“尿促性素”和“HMG”可以互换使用，都是指一类由垂体产生的糖蛋白激素或其变体，含有FSH和LH两种活性成分。HMG可以是重组的绝经期促性腺素或其变体、或是人尿来源的绝经期促性腺素或其变体。其中FSH和LH的生物效价比例在I : O. 1-3范围，更佳的在I : O. 3-1范围。类似地，术语“绒毛膜促性腺激素”和“CG”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然CG具有相同或相似结构和功能的激素。本发明提供的去除和/或灭活蛋白质中的朊病毒的方法除了用于糖蛋白，也可用于糖蛋白组合物，所述的糖蛋白组合物包括糖蛋白和药学上/食品学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。所述的“药学上可接受的载体”可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解齐ij、润滑剂、助流齐 、泡腾齐 、润湿剂或乳化剂、矫味剂、PH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。方法本发明提供的去除和/或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法由微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理步骤组成，其顺序是微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理；或是阴离子交换层析处理、微孔膜处理、和纳滤膜或超滤膜处理。所述的步骤是微孔膜处理、纳滤膜或超滤膜处理和阴离子交换层析处理。所述的微孔膜处理是将糖蛋白浓度为10-100毫克/毫升(较佳地为15-40毫克/毫升，更佳地为20-30毫克/毫升)的溶液通过微孔膜，去除和/或灭活朊病毒。所述微孔膜选自孔径为O. I-Iym的细菌过滤膜；较佳地所述微孔膜选自孔径为O. 1-0. 45 μ m的细菌过滤膜。所述溶液PH5-10，较佳地为pH6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或Tris缓冲液等。所述的纳滤膜或超滤膜处理是将糖蛋白浓度为10-100毫克/毫升(较佳地为15-40毫克/毫升，更佳地为20-30毫克/毫升)的溶液通过纳滤膜或超滤膜，去除和/或灭活朊病毒。所述纳滤膜选自孔径为I-IOOnm的纳滤膜；较佳地所述纳滤膜选自孔径为10-50nm的纳滤膜。所述超滤膜选自孔径在1000道尔顿以上的超滤膜；较佳地所述超滤膜选自孔径在100000道尔顿以上的超滤膜。所述溶液PH5-10，较佳地为pH6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或Tris缓冲液等。所述的阴离子交换层析处理是将糖蛋白浓度为15-60毫克/毫升(较佳地为20-40晕克/晕升,更佳地为25-35晕克/晕升)的溶液通过阴尚子交换树脂，使得朊病毒被吸附在树脂上，而糖蛋白随着洗脱液流出，从而去除和/或灭活朊病毒。所述溶液PH5-10，较佳地为PH6-8，所用缓冲液可以是磷酸盐、醋酸盐或Tris缓冲液等。可以使用本领域常规的阴离子交换树脂，例如但不限于，DEAE Sephadex A50,Q Sepharose FF或DEAE SepharoseFF。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于I、本发明提供的方法安全、高效。2、本发明提供的方法条件温和，适合于工业化生产。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。朊病毒原溶液的制备将受到朊病毒感染的动物的脑组织用高速匀浆器混匀I分钟，然后在含O. 5%十二烷基肌酸钠的磷酸缓冲液中进行六次超声波混匀，每次15秒，得到均匀的脑组织匀浆。将脑组织匀浆在0°C培养30分钟，然后再次进行超声波混匀(共三次，每次15秒)。将匀浆在4°C，4500Xg条件下离心30分钟，弃去颗粒物，取上清液，用含O. 5%十二烷基肌酸钠的磷酸缓冲液稀释到最终浓度为10% (w/v)，即为朊病毒原溶液，保存在-80°C ±15°C待用。实施例I将50ml ρΗ7· 8±0· I的磷酸缓冲液冷却到12°C ±2°C，然后加入到O. 6g DEAESephadex A_50中。将溶液在12°C ±2°C保持至少15小时以使树脂充分溶胀。将溶胀好的树脂悬浊液装在XK16柱中，使最终床层体积为15ml。将蠕动泵的管中充满pH7. 0±0. I的醋酸钠缓冲液，然后接在柱上。用上述缓冲液平衡至少5个柱体积(75ml)，控制流速在O. 17-0. 18ml/min。如果需要可在柱的流出口测定流速，调整泵速以控制流速。收集并测量流出液的PH，直到确定其与进口缓冲液pH值相同。关闭蠕动泵和柱出口，直到上柱样品准备完毕。在12°C ±2°C 25ml平衡缓冲液(醋酸钠缓冲液，ρΗ7. 0±0· I)中，边搅拌边加入750mg HCG粗制品(上海天伟生物制药有限公司提供，免疫效价4855IU/mg)。样品在12°C ±2°C持续搅拌适当时间，以确保HCG充分溶解。然后测量溶解液的pH，如果与平衡缓冲液不符，可用醋酸或氢氧化钠溶液调节，作为样品溶液，保持在12°C ±2°C。将朊病毒原溶液用超声波混匀3次，每次15秒，然后在4°C，4500Xg条件下离心30分钟，弃去颗粒物，取上清液，依次用孔径为O. 45 μ m，O. 2 μ m和O. I μ m的滤膜进行预过滤，作为朊病毒溶液。将25ml样品溶液边搅拌边加入朊病毒溶液2. 5ml，混匀后，取样1ml，测定初始病毒加入量以及HCG免疫效价。将20mL加入病毒的样品溶液以O. 17-0. 18ml/min的流速通过层析柱，同时开始收集流出液。当上样结束后，用平衡缓冲液洗柱，流速控制在O. 10-0. llml/min。收集到50ml流出液时停止收集，作为收集液。混匀后取样1ml，测定病毒残留量以及HCG免疫效价。上述实验平行做2份，分别为实验A、实验B。 病毒去除率的计算病毒去除率=Iogltl病毒加入量X上样体积-Iogltl病毒残留量X收集体积效价收率的计算效价收率％ =(上样体积X上样溶液的免疫效价)+ (收集体积X收集溶液的免疫效价)X 100%病毒去除结果
序号~ 效价收率％病毒去除率(Iogltj)^
~952736
~972 59结果表明，对朊病毒而言，病毒去除率大于102，可以认为这一步骤对提高HCG药物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到达ICH要求的大于IO4的安全有效的标准；另外从HCG的效价收率可以看出整个过程对HCG的活性没有任何影响，说明此步骤不会使HCG失活。实施例2除样品为750mg HMG粗制品(上海天伟生物制药有限公司提供)夕卜，其它步骤与实施例I 一致。病毒去除结果
序号~ 效价收率％病毒去除率(Iogltj)^
~982TT9
~962Λ9结果表明，对朊病毒而言，病毒去除率大于102，可以认为这一步骤对提高HMG药物安全性、去除朊病毒有一定的作用，但是尚未到达ICH要求的大于IO4的安全有效的标准；另外从HMG的效价收率可以看出整个过程对HMG的活性没有任何影响，说明此步骤不会使HMG失活。对照例I除平衡液为pH4. 0±0. I的醋酸钠缓冲液之外，样品及步骤都与实施例I 一致。病毒去除结果
权利要求
1.一种去除和/或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法，其特征在于，所述的方法由下述步骤构成 (a)将含糖蛋白的溶液进行微孔膜过滤； (b)将含糖蛋白的溶液进行纳滤膜过滤或超滤膜过滤； (c)将含糖蛋白的溶液进行阴离子交换层析； 所述步骤顺序为(a)、(b)、和(C)或(c)、(a)、和(b)。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述绒毛膜促性腺激素是人绒毛膜促性腺激素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人绒毛膜促性腺激素或其变体；所述绝经期促性腺素是人绝经期促性腺素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人绝经期促性腺素或其变体；所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人卵泡刺激素或其变体；所述黄体生成素是人黄体生成素或其变体，选自人尿来源的和/或重组的人黄体生成素或其变体。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述微孔膜选自孔径为O.1-1 μ m的过滤膜；更佳地为O. 1-0. 45 μ m的过滤膜。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述纳滤膜选自孔径为I-IOOnm的纳滤膜；更佳地为10-50nm的纳滤膜。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述超滤膜选自孔径为1000道尔顿以上的超滤膜；更佳地为100000道尔顿以上的超滤膜。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述阴离子交换层析在PH5-10的条件下进行。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述阴离子交换层析在PH6-8的条件下进行。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述阴离子交换层析的树脂的骨架介质包括琼脂糖，葡聚糖，纤维素，苯乙烯和二乙烯基苯的交联物，丙烯酸和/或其衍生物的交联物。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(C)中所述阴离子交换层析的树脂的活性基团选自二乙基季胺、或二乙基氨基乙基。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(C)中所述阴离子交换层析的树脂选自 DEAE Sephadex A50> Q Sepharose FF 或 DEAE Sepharose FF。
12.—种药物组合物，其特征在于，它包括权利要求1-11任一所述的方法获得的糖蛋白以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了一种去除和/或灭活糖蛋白中的朊病毒的方法，所述的方法选自下述步骤的一种或多种，并且所述步骤的顺序可以任意交换(a)将含糖蛋白的溶液进行微孔膜过滤；(b)将含糖蛋白的溶液进行纳滤膜过滤或超滤膜过滤；(c)将含糖蛋白的溶液进行阴离子交换层析。
文档编号C07K1/18GK102675414SQ201110055149
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者季斌, 季晓铭, 洪云海, 郭照晔, 高霄梁 申请人:上海天伟生物制药有限公司